ES2609697T3 - Mutantes de FAD-2 y plantas con alto contenido de ácido oleico - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína delta-12 desaturasa (FAD2), teniendo dicha proteína FAD2 una sustitución de aminoácidos en la posición 108 con respecto a una proteína FAD2 de tipo silvestre, en donde la dicha proteína FAD2 de tipo silvestre está representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoácido en la posición 108 se cambia a un ácido Aspártico.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCION

Mutantes de FAD-2 y plantas con alto contenido de acido oleico

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a plantas, semillas y productos derivados de las mismas, en particular a plantas de Brassica, productos de semillas derivadas de las mismas, que tienen secuencias mutantes que confieren un alto perfil de acido oleico al aceite de semilla.

Mas particularmente, la presente invencion se refiere a secuencias mutantes de acido graso delta-12 desaturasa, tambien denominadas aqul como secuencias de FAD2, en tales plantas que confieren un alto perfil de acido oleico sobre el aceite de semilla.

Antecedentes

La Delta-12 de acido graso desaturasa (tambien conocida como desaturasa oleica u oleato desaturasa) esta involucrada en la conversion enzimatica de acido oleico en acido linoleico.

Las variedades con alto nivel de acido oleico (posiblemente combinado con bajo nivel de acido linolenico) se buscan para muchas aplicaciones diferentes (aplicaciones de alimentos, aplicaciones de salud, aplicaciones de biodiesel y muchas otras).

Las semillas mutantes que proveen un aceite que presentaba un alto contenido de acido oleico (contenido de acido oleico mayor que 70% en peso con base en el peso total de acidos grasos presentes en el aceite) previamente descritas en la literatura tenlan un valor agronomico muy pobre y/o tenlan malas caracterlsticas de ralz, y/o una capacidad de rendimiento muy baja, vease, por ejemplo, el documento WO98/56239.

Todavla existe la necesidad por material que tenga un alto contenido estable de acido oleico (posiblemente combinado con un bajo contenido estable de acido linolenico) a lo largo de los lugares y a lo largo de los anos, con tambien buenos rendimientos agronomicos y con morfologla de semilla oleaginosa de colza normal. En particular, las plantas no deben tener fasciacion y deben tener un desarrollo normal de las ralces.

Resumen de la invencion

El asunto objeto de la presente invencion se muestra en las reivindicaciones.

Una molecula de acido nucleico preferida de la invencion comprende (o consiste de) un acido nucleico de SEQ ID NO 1, 5, 11 o 12, su forma complementaria o su forma de ARN.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender o consistir de una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90% e incluso mas preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO 1 o 11, o con la forma

complementaria o forma de ARN del mismo, que codifica una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de

aminoacidos en la posicion 108 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender o consistir de una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90% e incluso mas preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO 5 o 12, o con la forma

complementaria o forma de ARN del mismo, que codifica una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de

aminoacidos en la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre.

Mas particularmente, dicha protelna FAD2 de tipo silvestre comprende (o consiste de) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8.

Tambien es objeto de la presente invencion un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 o mas nucleotidos de una molecula de acido nucleico de acuerdo con la invencion, comprendiendo dicho fragmento el codon mutado que corresponde a dicha sustitucion de aminoacido en la posicion 108 y/o codon mutado que corresponde a dicha sustitucion de aminoacidos en la posicion 118.

Dichos fragmentos se pueden usar como cebadores, sondas y/o marcadores seleccionables.

Una protelna FAD2 preferida de la invencion comprende (o consiste de) una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 2 o 6.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Otro objeto de la presente invencion es un vector que comprende una molecula de acido nucleico que codifica una protelna FAD2 mutante de acuerdo con la invencion.

Otro objeto de la presente invencion es una celula huesped que comprende un vector de la invencion y/o una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna FAD2 mutante de acuerdo con la invencion.

Otro objeto de la presente invencion es una planta transformada de forma estable con un vector de la invencion.

Una planta que se va a transformar puede seleccionarse del grupo que consiste de cultivos productores de aceite, mas particularmente, de girasol, soja, algodon, malz y/o semillas de colza.

Otro objeto de la presente invencion es una planta o una parte de planta o una semilla que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 108 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Mas en particular, una planta o una parte de planta o una semilla de acuerdo con la invencion contiene (o expresa) una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 108 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Otro objeto de la presente invencion es una planta o una parte de planta o una semilla que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Mas particularmente, una planta o una parte de planta o una semilla de acuerdo con la invencion contiene (o expresa) una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Otro objeto de la presente invencion es una planta o una parte de planta o una semilla que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 108 y una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Mas particularmente, una planta o una parte de planta o una semilla de acuerdo con la invencion contiene (o expresa) una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a 108 y una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Otro objeto de la presente invencion es una planta o una parte de planta o una semilla que contiene una primera secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 108 y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD-2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 con respecto a una protelna FAD-2 de tipo silvestre.

Mas particularmente, una planta o una parte de planta o una semilla de acuerdo con la invencion contiene (o expresa) dos protelnas FAD-2, una que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a 108 y la otra que tiene una sustitucion de aminoacidos en o que corresponde a la posicion 118 en relacion con una protelna FAD- 2 de tipo silvestre.

Preferiblemente, dicho aminoacido sustituido en o que corresponde a la posicion 108 es acido aspartico (que reemplaza una Glicina en una protelna FAD2 de tipo silvestre).

El aceite vegetal obtenido a partir de semillas de la presente invencion comprende mas de (aproximadamente) 72%, 75%, 80% u 85% de acido oleico con base en el peso total de los acidos grasos presentes en el aceite de colza.

Preferiblemente, dicho aceite comprende ademas menos de (aproximadamente) 4%, 3.5%, 3%, 2%, 1% o 0.5% de acido linolenico.

Los productos de la invencion se pueden aplicar a productos alimenticios o de pienso que contienen y/o se preparan con una planta, una parte de planta, una semilla y/o un aceite vegetal como se ha descrito anteriormente.

Breve descripcion de la figura

La figura 1 corresponde a la lista de secuencias de la presente invencion.

Descripcion detallada de la invencion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Las plantas de la presente invencion, mas particularmente las plantas de Brassica, preferiblemente las variedades de Brassica napus, proveen un aceite que tiene un contenido de acido oleico superior al 70% en peso, con base en el peso total de acidos grasos presentes en el aceite.

En el contexto de la presente invencion, una parte o producto de una planta pretende abarcar una hoja, cotiledon, vastago, peclolo, tallo, semilla o cualquier otro tejido o fragmento de tejido de dicha planta.

En el contexto de la presente invencion, el termino “progenie” se refiere a descendientes directos e indirectos, genotipia y derivados de una planta o plantas de la invencion e incluye la primera, segunda, tercera y/o generaciones subsecuentes, que pueden producirse por autocruce, cruce con plantas con el mismo o diferentes genotipos, y pueden ser modificados por rango de tecnicas de ingenierla genetica adecuadas.

En particular, la invencion se basa en novedosas moleculas de acido nucleico aisladas que codifican novedosas formas variantes de protelna FAD2 que tienen un aminoacido sustituido en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) y/o un aminoacido sustituido en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por SEQ ID NO 4 y/o SEQ ID NO 8.

Una molecula de acido nucleico aislada de la invencion contiene al menos una mutacion, dando como resultado una sustitucion, preferiblemente una sustitucion de acido aspartico por glicina, en (o que corresponde a) la posicion 108 y/o dando como resultado una sustitucion, preferiblemente una sustitucion de fenilalanina por leucina, en (o que corresponde a) la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por SEQ ID NO 4 y/o SEQ ID NO 8.

Dicha (s) mutacion (es) altera (n) la funcionalidad del producto del gen FAD2 resultante, por lo que el nivel de acido oleico se modifica, preferiblemente se incrementa, en plantas que expresan la secuencia o secuencias mutantes, en comparacion con el nivel correspondiente en plantas que expresan la(s) secuencia(s) de tipo silvestre.

En el marco de la presente invencion, excepto que se especifique otra cosa, el termino "en la posicion 108" debe entenderse que designa la posicion de aminoacido 108 en una protelna FAD2 de tipo silvestre representada por la SEQ ID NO 4 y/o la SEQ ID NO 8, sino tambien como referencia al aminoacido que corresponde a dicha posicion en una protelna FAD2 de tipo silvestre que tendrla una secuencia de aminoacidos diferente debido a eliminaciones o aminoacidos adicionales en el polipeptido.

Del mismo modo, el termino "en la posicion 118" debe entenderse como designando la posicion de aminoacido 118 en una protelna FAD2 de tipo silvestre representada por SEQ ID NO 4 y/o SEQ ID NO 8, sino tambien como referencia al aminoacido que corresponde a dicha posicion en una protelna FAD2 tipo silvestre que tendrla una secuencia de aminoacidos diferente debido a eliminaciones o aminoacidos adicionales en el polipeptido.

El termino "que corresponde a la posicion" tal como se utiliza aqul significa que una posicion no solo esta determinada por el numero de los aminoacidos precedentes. La posicion de un aminoacido dado de acuerdo con la presente invencion puede variar debido a eliminaciones o aminoacidos adicionales en el polipeptido. Por lo tanto, bajo una "posicion correspondiente" de acuerdo con la presente invencion, debe entenderse que el o los aminoacidos a los que se hace referencia pueden diferir en el numero indicado, pero todavla tiene o tienen aminoacidos vecinos similares en la secuencia lineal.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender (o consistir de) una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 3, 5, 7, 9, 10 o 12, en donde el codon que codifica el aminoacido en la posicion 108 tiene al menos una mutacion (o esta mutado) para codificar un aminoacido diferente de la glicina y para codificar un acido aspartico en la posicion 108 de acuerdo con una protelna FAD2 de la invencion.

Una molecula de acido nucleico preferida de la invencion comprende (o consiste de) una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 1 u 11.

Una molecula de acido nucleico preferida de la invencion comprende (o consiste de) una secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO 5 o 12.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender (o consistir de) una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 1, 3, 7, 9, 10 u 11, en donde se ha eliminado el codon que codifica el aminoacido en la posicion 118.

Se apreciara por el experto en la tecnica que las secuencias de acidos nucleicos de las SEQ ID NO 1 a 12 (es decir, SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11 y 12) no son las unicas secuencias que pueden usarse para proveer una protelna FAD2 de la invencion. Tambien se contemplan cualesquiera moleculas de acido nucleico que tienen diferentes secuencias pero que, debido a la degeneracion del codigo genetico, codifican una protelna FAD2 que comprende

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

una sustitucion de un aminoacido en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) y/o una sustitucion de un aminoacido en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a la secuencia de aminoacidos de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

En particular, una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender (o consistir de) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90% e incluso mas preferiblemente al menos 95%, 96% 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 12 (es decir, SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11 y 12), o con la forma complementaria o forma de ARN de la misma, que codifica una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en la posicion 108 y/o 118 en relacion con una protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

Mas particularmente, una molecula de acido nucleico de la invencion exhibe una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80%, se divulga que preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90% e incluso mas preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11 y 12, o con la forma complementaria o forma de ARN de la misma y codifica una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de un acido aspartico por una glicina en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) y/o una sustitucion de una fenilalanina por una leucina en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede derivarse de variedades de Brassica napus, tales como MSP05, MSP06, MSP07, MSP11 y/o 28DHS.059.

Mas particularmente, una molecula de acido nucleico de la invencion tiene una mutacion en la posicion 1540 (tambien denominada como SNP1540) de la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 11, que causa un cambio en el codon genetico de GGC a GAC, dando como resultado una sustitucion de un aminoacido en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) con respecto a la secuencia de aminoacidos de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

Una molecula de acido nucleico aislada de la invencion que contiene dicha mutacion SNP1540, que da como resultado una sustitucion del acido aspartico por glicina en la posicion 108, altera la funcionalidad del producto del gen FAD2 resultante, por lo que el nivel de acido oleico se incrementa en plantas que expresan la secuencia mutante, en comparacion con el nivel correspondiente en la planta que expresa la secuencia de tipo silvestre.

En el marco de la invencion, el termino "SNP1540" se refiere al polimorfismo de nucleotido unico que corresponde a dicha mutacion en la posicion 1540 del acido nucleico de SEQ ID NO 11, y puede referirse tambien a la mutacion correspondiente en cualquier molecula de acido nucleico que codifica una protelna FAD2 de la invencion que tiene un aminoacido sustituido en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) con respecto a la protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

Se contempla cualquier fragmento de una molecula de acido nucleico de la invencion de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 100 o mas nucleotidos que comprende dicha SNP1540.

Las moleculas de acido nucleico derivadas de variedades de Brassica napus, tales como MSP05, MSP11 y/o 28DHS.059 tienen una mutacion (SNP1590) que da como resultado una sustitucion de un aminoacido en la posicion 118 de la secuencia de tipo silvestre FAD2, tal como representado por la SEQ ID NO 8.

Mas particularmente, una molecula de acido nucleico tiene una mutacion en la posicion 1590 (tambien denominada como SNP1590) de la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 12, que provoca un cambio en el codon genetico de CTT a TTT, dando como resultado una sustitucion de un aminoacido en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a la secuencia de aminoacidos de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

Una molecula de acido nucleico aislada que contiene dicha mutacion SNP1590, da como resultado una sustitucion de la fenilalanina por la leucina en la posicion 118, altera la funcionalidad del producto del gen FAD2 resultante, por lo que el nivel de acido oleico se incrementa en la planta que expresa la secuencia mutante, en comparacion con el nivel correspondiente en la planta que expresa la secuencia de tipo silvestre.

En el marco de la invencion, el termino "SNP1590" se refiere al polimorfismo de nucleotido unico que corresponde a dicha mutacion en la posicion 1590 del acido nucleico de SEQ ID NO 12, y puede referirse tambien a la mutacion correspondiente en cualquier molecula de acido nucleico que codifica una protelna FAD2 de la invencion que tiene un aminoacido sustituido en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a la protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Se divulgan fragmentos de una molecula de acido nucleico de la invencion de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 100 o mas nucleotidos que comprenden dicha SNP1590.

Tambien se contempla cualquier fragmento de una molecula de acido nucleico de la invencion de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 100 o mas nucleotidos que comprenden dicha SNP1540 y dicha SNP1590.

Se divulga cualquier fragmento de una molecula de acido nucleico de la invencion de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 100 o mas nucleotidos y que comprende al menos una mutacion que da como resultado una protelna FAD2 de acuerdo con la invencion.

En otras palabras, tambien se divulga cualquier fragmento de una molecula de acido nucleico de la invencion de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 o mas nucleotidos y que comprende al menos una mutacion en el codon que codifica dicho aminoacido en la posicion 108 (o que corresponde a la posicion 108) y en el codon que codifica dicho aminoacido en la posicion 118 (o que corresponde a la posicion 118) con respecto a la protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por la SEQ ID NO: 4 u 8.

Tales fragmentos se pueden usar como cebadores, como sondas y/o como marcadores.

Los fragmentos de acido nucleico de la invencion pueden usarse como marcadores en mapeo genetico de plantas y programas de reproduccion genetica.

Tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP), deteccion de polimorfismo de amplificacion aleatoria (RAPD), reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o marcadores de replicacion de secuencia autosostenida (3SR).

Pueden usarse tecnicas de reproduccion asistida por marcadores para identificar y seguir una planta de acuerdo con la invencion o su progenie, tambien objeto de la invencion, durante el proceso de reproduccion.

Las tecnicas de reproduccion asistida por marcadores pueden utilizarse ademas o como alternativa a otros tipos de tecnicas de identification

Un ejemplo de reproduccion asistida por marcadores es el uso de cebadores de PCR que amplifican especlficamente una molecula de acido nucleico de la invencion.

La invencion provee por lo tanto metodos para el analisis de segregation y selection de cruces geneticos que involucran plantas que tienen secuencias de acidos nucleicos de la invencion.

Un metodo puede involucrar, por ejemplo, determinar la presencia en un genoma de alelos FAD2 particulares que contienen al menos una mutacion que da como resultado una sustitucion (preferiblemente una sustitucion de acido aspartico por glicina) en (o que corresponde a) la posicion 108 y/o que da como resultado una sustitucion (preferiblemente una sustitucion de la fenilalanina por la leucina) en (o que corresponde a) la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por las SEQ ID NO 4 u 8.

Tal determination puede lograrse, por ejemplo, con un rango de tecnicas, tales como la amplificacion por PCR, la toma de huellas de ADN, la toma de huellas de ARN, la transferencia en gel y el analisis por RFLP, los ensayos de protection de nucleasa, la secuenciacion del fragmento de acido nucleico relevante, la generation de anticuerpos (monoclonales o policlonal), o metodos alternativos adaptados para distinguir la protelna producida por los alelos relevantes de otras variantes/formas de esa protelna o del tipo silvestre.

Mas particularmente, tales fragmentos pueden usarse en el metodo de seleccion asistida por marcadores para rasgos de alto oleico en plantas, preferiblemente en especies de Brassica, mas particularmente en variedades de Brassica napus.

Las secuencias de nucleotidos recombinantes pueden comprender una o mas secuencias reguladoras adyacentes. enlazadas operativamente a una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion. Tales secuencias reguladoras adyacentes se originan preferiblemente a partir de organismos homologos

Sin embargo, dichas secuencias reguladoras adyacentes tambien se pueden originar de organismos heterologos.

Dichas secuencias reguladoras adyacentes son secuencias especlficas tales como promotores, potenciadores, secuencias de senal de secretion y/o terminadores.

Otro aspecto de la invencion esta relacionado con un vector que comprende una molecula de acido nucleico de la invencion, posiblemente enlazada operativamente a una o mas secuencias reguladoras adyacentes que se originan de organismos homologos o heterologos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En el presente contexto, se define "vector" como cualquier constructo bioquimica que puede usarse para la introduccion de una secuencia de nucleotidos (por transduccion, transfeccion, transformacion, infeccion, conjugacion, etc.) en una celula.

Ventajosamente, un vector de acuerdo con la invencion se selecciona del grupo que consiste de plasmidos (incluyendo plasmidos replicativos e integradores), virus, fagemidos, cromosomas, transposones, liposomas, veslculas cationicas o una mezcla de los mismos. Dicho vector puede comprender ya una o mas secuencias reguladoras adyacentes, lo que permite la expresion de dicha molecula de acido nucleico y su transcripcion en un polipeptido de la invencion.

La invencion se refiere tambien a un polipeptido FAD2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en (o que corresponde a) la posicion 108 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, tal como una protelna FAD2 de tipo silvestre representada por SEQ ID NO 4 u 8.

Mas particularmente, un polipeptido FAD2 de la invencion comprende (o consiste de) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 6 que comprende ademas una sustitucion de acido aspartico por glicina en la posicion 108.

Un polipeptido FAD2 preferido de la invencion comprende (o consiste de) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 2.

Un polipeptido FAD2 preferido divulgado comprende (o consiste de) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 6.

La presente invencion tambien abarca cualquier fragmento de una protelna FAD2 de la invencion que tiene una actividad de delta-12 oleato desaturasa y que comprenden dichas sustituciones en la posicion (108).

Las moleculas de acido nucleico, moleculas de acido nucleico recombinantes y/o vectores de la persente invencion son utiles para transformar plantas objetivo y, por lo tanto, para conferir un producto genico de FAD2 alterado, por lo que el nivel de acido oleico se modifica, preferiblemente aumentado, en planta que expresa un FAD2 mutante de la Invencion, en comparacion con el nivel correspondiente en la planta que expresa la secuencia de tipo silvestre.

La presente invencion tambien esta relacionada con una celula huesped transformada, o celula huesped recombinante, que contiene (o que tiene incorporado) una o mas de las secuencias de nucleotidos y/o vectores de acuerdo con la invencion.

En el presente contexto, una "celula huesped transformada" o "celula recombinante", tambien denominada "transformante", es una celula que tiene incorporada una o mas de las secuencias de nucleotidos y/o vectores de acuerdo con la invencion. La celula huesped transformada puede ser una celula en la que dichos vectores y/o dichas secuencias nucleotldicasse introducen mediante transformacion genetica, preferiblemente por medio de recombination homologa, o por cualquier otro metodo bien conocido utilizado para obtener un organismo recombinante.

Se contempla por la presente invencion cualquier metodo mediante el cual se pueda incorporar la novedosa secuencia al genoma del huesped.

Mas particularmente, se contempla por la presente invencion cualquier metodo mediante el cual se pueda incorporar la nueva secuencia en el genoma huesped, y heredarse de manera estable por su progenie.

Actualmente existe un amplio rango de tecnicas conocidas para conseguir la transformacion directa o indirecta de plantas superiores con ADN exogeno.

La transformacion de las celulas vegetales puede medirse mediante el uso de vectores. Un metodo comun para lograr la transformacion es el uso de Agrobacterium tumefaciens para introducir un gen extrano en la celula de la planta objetivo.

Los virus de plantas tambien proveen un posible medio para la transferencia de ADN exogeno.

Tambien puede emplearse la captation directa de celulas vegetales. Tlpicamente, los protoplastos de la planta objetivo se colocan en cultivo en presencia de las moleculas de acido nucleico que se van a transferir, y un agente que promueve la captacion de dichas moleculas de acido nucleico por protoplastos. Los agentes utiles a este respecto son polietilenglicol o fosfato de calcio.

Alternativamente, la captacion de moleculas de acido nucleico puede estimularse por electroporation. En este metodo, se utiliza un impulso electrico para abrir poros temporales en una membrana celular de protoplastos, y dichas moleculas de acido nucleico en la solution circundante son entonces atraldas dentro de la celula a traves de los poros. De forma similar, la microinyeccion puede emplearse para suministrar dichas moleculas de acido nucleico directamente en una celula, y preferiblemente directamente en el nucleo de la celula.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En estas tecnicas, la transformation se produce en una celula vegetal en cultivo. Subsecuente al evento de transformation, las celulas vegetales pueden regenerarse a plantas enteras.

Las tecnicas para la regeneration de plantas maduras a partir de callos o cultivos de protoplastos son bien conocidas.

Tambien estan disponibles metodos alternativos que no necesariamente requieren el uso de celulas aisladas y, por lo tanto, tecnicas de regeneracion de plantas, para lograr la transformacion. Estos metodos se denominan generalmente metodos "ballsticos" o de "aceleracion de partlculas", en los que las moleculas de acido nucleico recubiertas de partlculas metalicas son propulsadas a las celulas vegetales mediante una carga de polvora o una descarga electrica. De esta manera, las celulas vegetales en el cultivo o los organos o celulas reproductoras de plantas, por ejemplo polen, se puede transformar establemente con las moleculas de acido nucleico de interes.

La presente invention se puede aplicar a la transformacion de virtualmente cualquier tipo de planta, monocotiledoneas o dicotiledoneas.

Las plantas adecuadas para ser transformadas son preferiblemente cultivos productores de aceites, tales como girasol, soja, algodon, malz, etc., preferiblemente especies de Brassica, mas preferiblemente variedades de Brassica napus.

En un aspecto de la invencion, una planta comprende al menos una secuencia codificante de FAD2 de la invencion.

Una planta de la invencion puede comprender una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 5 o una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 12.

Preferiblemente, una planta de la invencion comprende una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 11 o una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 1, tal como MSP06 o MSP07.

En otro aspecto de la invencion, una planta comprende dos secuencias codificadoras de FAD2 de la invencion.

En particular, una planta de la invencion comprende una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 11 y una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 12, tal como MSP05, MSP11 o 28DHS.059.

Preferiblemente, una planta de la invencion comprende una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 1 y una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO 5, tal como MSP05, MSP11 o 28DHS.059.

La variedad MSP06 se mantiene como deposito de patente del Tratado de Budapest con NCIMB bajo el numero de acceso NCIMB 41367 hecho el 22 de diciembre de 2005.

La variedad MSP07 se mantiene como deposito de patente del Tratado de Budapest con NCIMB bajo el numero de acceso NCIMB 41368 hecho el 22 de diciembre de 2005.

28DHS.059 se mantiene como deposito de patente del Tratado de Budapest con NCIMB bajo el numero de acceso NCIMB 41364 hecho el 22 de diciembre de 2005.

La variedad MSP05 se mantiene como deposito de patente del Tratado de Budapest con NCIMB bajo el numero de acceso NCIMB 41233 hecho el 9 de julio de 2004.

La variedad MSP11 se mantiene como deposito de patente del Tratado de Budapest con NCIMB bajo el numero de acceso NCIMB 41234 hecho el 9 de julio de 2004.

Tambien se divulga un metodo para producir llneas de plantas oleicas elevadas que comprende:

(a) cruzar una primera planta con una segunda planta que tiene al menos un gen FAD2 mutante de acuerdo con la invencion, (b) obtener semillas del cruce de la etapa (a), c) cultivar plantas fertiles a partir de tales semillas; (d) obtener semillas de progenie de las plantas de la etapa (c) y (e) identificar aquellas semillas entre la progenie que tienen alto contenido de acido oleico.

En otro aspecto, la invencion provee un metodo para incrementar el contenido de acido oleico de plantas, mas particularmente de plantas de Brassica, y preferiblemente de plantas de Brassica napus, que comprende las etapas de:

(a) inducir mutagenesis en al menos algunas celulas de una planta, mas particularmente de una planta de Brassica, y preferiblemente de una planta de Brassica napus que tiene un contenido de acido oleico de menos del 70%;

(b) regenerar plantas a partir de al menos una de dichas celulas mutagenizadas; y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(c) seleccionar plantas regeneradas que tienen una secuencia de acidos nucleicos de la invencion y/o que expresan una protelna FAD2 de la invencion.

Preferiblemente, las semillas obtenidas a partir de dichas plantas proveen un aceite que tiene un contenido de acido oleico de mas de 70% en peso, mas preferiblemente de mas de 75% en peso, con base en el peso total de acido graso presente en el aceite.

El aceite vegetal obtenido de al menos una planta de acuerdo con la invencion comprende mas de (aproximadamente) 70%, 72%, 75%, 80%, u 85% de acido oleico.

Mas particularmente, un aceite vegetal obtenido preferiblemente de al menos una especie de Brassica de la invencion, mas preferiblemente de al menos una variedad de Brassica napus de acuerdo con la invencion, comprende mas de (aproximadamente) 70%, 72%, 75%, 80%, o 85% de acido oleico. Dicho aceite puede comprender ademas menos de (aproximadamente) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% o 0,5% de acido linolenico, con base en el peso total de los acidos grasos presentes en el aceite.

Preferiblemente, dicho aceite comprende mas de (aproximadamente) 70%, 72%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% o 90% preferiblemente entre (aproximadamente) 70% y (aproximadamente) 90%, mas preferiblemente entre (aproximadamente) 72% y (aproximadamente) 89% de acido oleico. Dicho aceite puede comprender ademas menos de (aproximadamente) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1%, o 0.5%, preferiblemente entre (aproximadamente) 4% y (aproximadamente) 0.4% de acido linolenico, con base en el peso total de los acidos grasos presentes en el aceite.

De acuerdo con una realizacion preferida, dos variedades dobles bajas de semilla de colza de invierno (ENVOL y LIBERATOR) fueron sometidas a un tratamiento con Metano Sulfonato de Etilo (EMS) en 1992. El tratamiento con EMS se realizo al 2.5% y 5% durante 4h u 8h.

La generacion M1 se cultivo en un invernadero despues de 8 semanas de vernalizacion en una camara de crecimiento y luego se cosecho en julio del 93.

Las semillas M1 fueron sembradas en el campo en septiembre del 93, ensacadas al inicio de la floracion y las semillas M2 cosechadas en julio del 94.

Las semillas M2 fueron sembradas en septiembre del 94, ensacadas al inicio de la floracion y las semillas M3 cosechadas en julio del 95.

Las progenies fueron entonces analizadas para determinar la composition de acidos grasos usando un metodo analltico con base en cromatografla de gases, como se conoce comunmente en esta area de la tecnologla.

Se mantuvieron todas las progenies que mostraban un contenido oleico superior al 68%.

La progenie seleccionada fue replantada en el campo en septiembre de 1995, ensacada en abril y luego cosechada en julio de 1996.

En esta etapa, las progenies fueron sometidas a tamizaje para obtener buenas caracterlsticas agronomicas y morfologicas, tales como buena capacidad de germination, buen vigor de otono, buena resistencia al invierno, buen sistema de enraizamiento, buena resistencia a la pata negra y la mancha clara de la hoja, as! como excelente resistencia al hospedaje.

El material que era demasiado alto y tardlo fue eliminado, as! como el material que muestra fuerte fasciacion

El analisis de la progenie restante se realizo de nuevo mediante cromatografla de gases para seleccionar individuos con niveles de acido oleico superiores al 68%. Todos estos individuos fueron plantados en el campo en septiembre de 1996-1997.

Una progenie llamada MUT 152-96 parecla particularmente interesante en terminos de caracterlsticas agronomicas y morfologicas, as! como por su contenido de acido oleico. Se cultivo en aislamiento durante la temporada de cultivo de septiembre de 1996-1997. Las progenies mas interesantes en terminos de caracterlsticas agronomicas y morfologicas fueron seleccionadas para el ensacado y el cruce.

El cruzamiento se realizo con variedades dobles bajas de semilla de colza de invierno que tienen un perfil convencional de acidos grasos (es decir, acido oleico por debajo del 70%) o con bajo contenido de acido linolenico (es decir, menos de aproximadamente 3.5%) con el fin de desarrollar llneas con alto contenido de acido oleico asociadas con bajo contenido de acido linolenico (HOLL).

El material avanzo en la reproduction de pedigrl, autopolinizacion hasta al menos la generacion F7.

5

10

15

20

25

30

En todas las generaciones se aplico una fuerte presion de seleccion contra la fasciacion y para el desarrollo normal de la planta y el sistema normal de enraizamiento.

Se monitorizo la composicion de acidos grasos en cada generacion y se mantuvo solamente material con contenido de acido oleico superior al 75% y contenido de acido linolenico inferior al 3.5%.

Se obtuvieron las siguientes variedades HOLL mediante este proceso: MSP05, MSP06, MSP07, MSP11, 28 DHS 059.

Las variedades dobles bajas con perfiles convencionales de acidos grasos utilizados en este trabajo fueron BRISTOL, CAPITOL, CAPVERT, VIVOL y CAIMAN y estas se han multiplicado o mantenido utilizando el mismo esquema de mantenimiento descrito aqul anteriormente para las llneas HOLL

Se utilizo semilla basica para la determinacion del contenido de acidos grasos en ensayos - pequenos ensayos de investigation (6 a 12 m2) o ensayos de desarrollo (500 m2) y para el trabajo de secuenciacion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Las semillas se trituraron en una primera solution que consistla en metanol (800 ml), trimetil pentano (200 ml) y 5 g de NaOH. Se utilizaron aproximadamente 3 ml de solucion para aproximadamente 10 g de semillas (en otras palabras, aproximadamente 10 a 50 semillas para 1 ml de solucion).

La extraction se realizo durante 20 minutos y posteriormente se anadio una segunda solucion, que consistla de trimetilamina (900 ml) y propanol, 2- (100 ml), en el mismo volumen que la primera solucion.

La solucion resultante se sometio a vortex y se dejo reposar hasta la formation de una fase superior.

La fase superior fue muestreada y transferida a viales.

Se inyecto un microlitro de la misma en un cromatografo de gases (Fisons de termoelectron con un columna DB3 - 30 metros con un diametro de 0.25 mm y un espesor de 25 micrometres). El tiempo de ejecucion fue de aproximadamente 4 min.

Los resultados del contenido de acido oleico se resumen en la tabla 1

Tabla 1

Variedades

Contenido de acido oleico (% en peso) Apreciacion

MSP05

78,1-81,9 Muy alto

MSP06

75,6-78,5 Alto

MSP07

76,7-79,4 Alto

MSP11

80,2-83,9 Muy alto

28DHS059

83,8-84,9 Muy alto

BRISTOL

61,4-65,7 Normal

VIVOL

60,8-63,2 Normal

CAPVERT

58,9-65,9 Normal

CAIMAN

61,9-64,0 Normal

CAPITOL

59,7-64,6 Normal

El contenido de acido oleico se basa en el peso total del acido graso en el aceite extraldo.

Ejemplo 2

Los materiales vegetales utilizados para la secuenciacion son:

- llneas mutantes con mayor contenido en acidos grasos oleicos: MSP05, MSP06, MSP07, MSP11 y 28DHS.059; y

- variedades de tipo silvestre con contenido normal de acido oleico: Bristol, Capital, Vivol, Capvert y Caiman.

5

10

15

20

25

30

35

40

Todas estas ilneas se cultivaron en una camara de crecimiento y los cotiledones y tallos se recolectaron de plantas de 7 dlas de edad.

Los tejidos vegetales se secaron por congelacion y se utilizaron para la extraccion de ADN.

El ADN se aislo con kits de ADN de Qiagen Plant (Qiagen INC.-USA, Valencia CA).

La PCR se realizo con el protocolo TaqGold (AB Biosystem, Inc,).

La mezcla de reaccion incluye 2.5 pl de regulador 10x, 0.2 pl de TaqGold, 0.2 pl de dNTP (25 mM), cebadores de 2 pl (5 pM) y 10 pl de plantilla de ADN (2ng/pl) y 10.1 pl de H2O.

Los ciclos de PCR fueron los siguientes: 94°C 5 min; 8 ciclos de 94°C 40 seg, 62°C 40 seg, 72°C 1 min, 94°C 40 seg, 60°C 40 seg, 72°C 1 min, 94°C 40 seg, 58°C 40 seg, 72°C 1 min, 94°C 40 seg, 56°C 40 seg, 72°C 1 min; 3 ciclos de 94°C 40 seg, 55°C 40 seg, 72°C 1 min; mantener a 72°C durante 7 min.

Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 1%.

Para la secuenciacion, se retiraron 5 pl de productos de PCR a un nuevo tubo y 1 pl de Exonucleasa I (dilucion 1:50) y 1 pl de Fosfatasa Alcalina de Camaron (dilucion 1: 5).

La mezcla se incubo a 37°C durante 20 minutos y luego a 80°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas.

Se anadieron 40 pl de H2O y se usaron 6 pl como plantilla con 1 pl de cebador de secuenciacion.

La secuenciacion se realizo en Analizador de ADN 3730 (Applied Biosystems).

Las secuencias se ensamblaron y alinearon usando el programa SeqMan II de LaserGene (DNASTAR, INC, Madison, WI).

Ejemplo 3

Se descargaron del Genebank (NCBI) cuatro secuencias genicas de delta-12 oleato desaturasa de Brassica napus (FAD2), 4684997, 46399190, 8705228 y 4092878. Estas secuencias se utilizaron como interrogantes en BLAST contra la base de datos de secuencias de Monsanto.

Utilizando los programas "blastn" (NCBI), se obtuvieron una serie de resultados de alta puntuacion. Todas las secuencias de exito fueron descargadas y reensambladas con el programa SeqmanII (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, EE.UU.).

Se identificaron dos transcriptos distintos y se designaron como Fad2-1 (SEQ ID NO 9) y Fad2-2 (SEQ ID NO 10). Fad2-1 y Fad2-2 comparten una alta homologla de secuencia, con un 97% de identidad de secuencia.

Para identificar mutaciones causales asociadas con alto contenido de acido oleico en las llneas mutantes y sus progenies, se disenaron cebadores especlficos de locus anidados para cubrir todas las secuencias.

El extremo 3' de un cebador estaba siempre situado en un nucleotido que diferenciaba Fad2-1 de Fad2-2 excepto aquellos situados en los extremos 5' y 3' de las secuencias consenso donde no habla nucleotido diferencial entre los dos genes.

Los cebadores tambien se disenaron de tal manera que un amplicon se solaparan con otro para asegurar la cobertura completa de toda la secuencia. Estos cebadores se dispusieron y se usaron para generar amplicones especlficos de locus en mutantes y tipos silvestres. Los resultados de secuenciacion indicaron que todos los cebadores de PCR especlficos de locus se comportaron como se esperaba.

Las secuencias pertenecientes al mismo gen se ensamblaron en conjunto utilizando el programa SeqManII.

Las secuencias genomicas de consenso de los genes Fad2-1 y Fad2-2 mutados estan representadas respectivamente por SEQ ID NO 11 y 12.

La Tabla 2 resume las caracterlsticas de la secuencia de ambos genes Fad2-1 y Fad2-2.

Tabla 2

Caracterlsticas

Posicion de FAD2-1 Posicion de FAD2-2

Gen

1 - 2614 1 - 2666

5

10

15

20

25

30

35

5' UTR

1 - 1217 1 - 1238

Exon

1 - 108 1 - 111

Intron

109 - 1213 112 - 1234

Exon

1214 - 2614 1235 - 2619

CDS

1218 - 2372 1239 - 2393

3'UTR

2373 - 2614 2394 - 2666

Las caracterlsticas se basan en las secuencias genomicas de consenso de multiples lecturas en diferentes genotipos.

Ambos genes Fad2-1 y Fad2-2 tienen un intron cada uno.

Los tamanos de intrones son ligeramente diferentes entre dos genes. Para Fad2-1, el intron se extiende 1105 pb a partir de la posicion 109 a 1213, mientras que para Fad2-2, el intron consiste en 1123 pb a partir de la posicion 112 a 1234 en las secuencias de consenso.

El intron se encuentra en la region 5'UTR.

Los codones de iniciacion de traduccion putativos estan situados en 1218 y 1239 para genes Fad2-1 y Fad2-2, respectivamente.

Los codones de terminacion de traduccion estan situados en 2370-2372 y 2391-2393, respectivamente para Fad2-1 y Fad2-2.

Las secuencias 3'UTR son 247 pares de bases para los genes Fad2-1 y 273 pares de bases para los genes Fad2-2.

Se encontro una mutacion de transicion en la posicion 1540 (denominada SNP1540) del gen FAD2-1 (como se representa por SEQ ID NO 11), que causo un cambio en el codon genetico de GGC a GAC, dando como resultado una alternacion del residuo de aminoacido de Glicina a Acido aspartico.

Dado que la Glicina y el Acido aspartico tienen propiedades muy diferentes en terminos de hidrofobicidad, cargas y polaridad, etc., la mutacion provoca un cambio radical en la funcion de la enzima en las llneas mutantes.

Tambien se han descrito secuencias de aminoacidos altamente conservadas entre las desaturasas de acido graso delta-12 de plantas y las desaturasas de acido graso delta-15 de plantas (Patente de los Estados Unidos US6872872B1). Entre otros, uno de los motivos de secuencia de aminoacidos conservados mencionados es AHECGH. El SNP1540 paso a situarse en el mismo motivo. El "G" en el motivo fue mutado a un "D". Debido a que las regiones conservadas usualmente implicaban una signification funcional o estructural, la mutacion en esta region conservada ha causado efectos adversos sobre la enzima FAD2-1, dando como resultado un alto contenido de acido oleico en las llneas mutantes MSP11, MSP05, MSP06, MSP07 y 28DHS.059.

Una mutacion puntual en la posicion 1590 (denominada SNP1590) del gen FAD2-2 (como se representa por la SEQ ID NO 12) causo un cambio de residuo de aminoacidos de leucina (CTT) a fenilalanina (TTT).

Tanto la leucina como la fenilalanina son de naturaleza hidrofoba y comparten algunas propiedades comunes de aminoacidos, pero la fenilalanina contiene un grupo aromatico rlgido grande en la cadena lateral que causa algun cambio en la funcion de la enzima.

Por otra parte, en combination con la mutacion SNP1540, esta mutacion causa el efecto mas visible en el fenotipo.

La combinacion de diferentes alelos en estas mutaciones creo un gradiente en el contenido oleico como se observo en diferentes llneas mutantes (vease tabla 1).

Tres llneas mutantes, MSP11, MSP05 y 28DHS.059, portaron mutaciones dobles en SNP1540 y SNP1590. Dado que ambas mutaciones eran mutaciones de sentido contrario, las funciones del gen FAD2 se ven severamente afectadas, dando omo resultado mayor contenido de acido oleico entre las llneas mutantes.

El contenido oleico para MSP05 fue menor que los otros dos mutantes. Esto se debio a que el contenido oleico se obtuvo a partir de datos de un solo ano que podrlan estar sujetos a variaciones debido al efecto ambiental.

5

10

15

20

25

Dos ilneas mutantes, MSP06 y MSP07, portaron una unica mutacion puntual en SNP1540. Puesto que son menos severos que los mutantes dobles, el contenido oleico para estas dos llneas estaba ligeramente por debajo de los mutantes dobles.

En resumen, los datos de secuencia indicaron fuertemente que estas mutaciones en Fad2-1 y Fad2-2 estan altamente asociadas con contenidos oleicos en diferentes llneas mutantes.

La combination de diferentes alelos explica todas las variaciones fenotlpicas del contenido oleico en el material vegetal obtenido.

La identification de las variaciones de la secuencia causal es crucial para disenar los ensayos de diagnostico especlficamente para cada alelo mutante.

El conocimiento de la asociacion entre variaciones de secuencia y fenotipos puede permitir disenar ensayos de marcadores para predecir con precision el contenido de acido oleico en plantas sin necesidad de analisis qulmico en humedo del contenido de acidos grasos.

Listado de secuencias

<110> Monsanto S.A.S.

<120> Mutantes de FAD-2 y plantas con alto contenido de acido oleico

<130> BP.MST0.07B/WO <160> 12

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211 > 1155 <212> ADN <213> Brassica napus <220>

<221> CDS <222> (1)..( 1155)

<400> 1

Claims (25)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   Reivindicaciones

   1. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna delta-12 desaturasa (FAD2), teniendo dicha protelna FAD2 una sustitucion de aminoacidos en la posicion 108 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, en donde la dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoacido en la posicion 108 se cambia a un acido Aspartico.
2. 2. Una molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en donde dicha protelna FAD2 es una protelna FAD2 de Brassica, mas particularmente una protelna FAD2 de Brassica napus.
3. 3. Una molecula de acido nucleico que comprende un acido nucleico de SEQ ID NO 1, u 11, su forma complementaria o forma de ARN.
4. 4. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90 e incluso mas preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO 1 u 11, o con la forma complementaria o la forma de ARN del mismo, que codifican una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en la posicion 108 con con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, en donde dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoacido en la posicion 108 se cambia a un acido Aspartico.
5. 5. Un fragmento de al menos 20 nucleotidos de una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho fragmento el codon mutado que corresponde a dicha sustitucion de aminoacidos en la posicion 108.
6. 6. Una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en la posicion 108, o que corresponde a la posicion 108, con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre tal como la protelna FAD2 de tipo silvestre representada por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 4 u 8 y en donde dicho aminoacido en la posicion 108 se cambia a un acido Aspartico.
7. 7. Una protelna FAD2 que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 2.
8. 8. Un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. 9. Una celula huesped que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 8.
10. 10. La celula huesped de la reivindicacion 9 que comprende ademas una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna delta-12 oleato desaturasa (FAD2), teniendo dicha protelna FAD2 una sustitucion de aminoacidos en la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, en donde la dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoacido en la posicion 118 es una fenilalanina.
11. 11. Una planta transformada de forma estable con un vector de la reivindicacion 8.
12. 12. Una planta de la reivindicacion 11, en donde dicha planta que se va a transformar se selecciona del grupo que consiste de cultivos productores de aceite.
13. 13. Una planta de la reivindicacion 12, en donde dichos cultivos productores de aceite son de girasoles, soja, algodon, malz y/o semilla de colza.
14. 14. Una semilla derivada de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 8.
15. 15. Progenie derivada de una planta o una parte de planta o una semilla de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 y que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 9.
16. 16. Un metodo para potenciar el contenido de acido oleico en una planta que comprende transformar una planta con el vector de la reivindicacion 8.
17. 17. Utilizacion de fragmentos de al menos 20 nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5 como cebadores, sondas y/o marcadores seleccionables.

    5

    10

    15

    20

    25
18. 18. Un metodo de seleccion asistida por marcadores de plantas de especies Brassica usando una molecula de acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
19. 19. Un kit de ensayo que comprende un primer recipiente que contiene una molecula de acido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
20. 20. El kit de ensayo de la reivindicacion 19 que comprende ademas un fragmento de al menos 20 nucleotidos de una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna FAD2, teniendo dicha protelna FAD2 una sustitucion de aminoacidos en la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, comprendiendo dicho fragmento el codon mutado que corresponde a dicha sustitucion de aminoacidos en la posicion 118, en donde dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8 y en donde dicho aminoacido en la posicion 118 es una fenilalanina.
21. 21. Un metodo para producir llneas de plantas con alto contenido oleico que comprende:

    (a) inducir mutagenesis en al menos algunas celulas de una planta, mas particularmente de una planta de Brassica y preferiblemente de una planta de Brassica napus que tiene un contenido de acido oleico inferior al 70%;

    (b) regenerar plantas a partir de al menos una de dichas celulas mutagenizadas; y

    (c) seleccionar plantas regeneradas que tienen una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o que expresa una protelna FAD2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8.
22. 22. El metodo de la reivindicacion 21, que comprende ademas la etapa de seleccionar plantas regeneradas que tienen una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna delta-12 oleato desaturasa (FAD2), teniendo dicha protelna FAD2 una sustitucion de aminoacidos en la posicion 118 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, en donde la dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoacido en la posicion 118 es una fenilalanina.
23. 23. Una planta que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna FAD2 que tiene una sustitucion de aminoacidos en la posicion 108 con respecto a una protelna FAD2 de tipo silvestre, en donde dicha protelna FAD2 de tipo silvestre esta representada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 4 u 8, y en donde dicho aminoacido en la posicion 108 se cambia a un acido Aspartico.
24. 24. La planta de la reivindicacion 23, en donde la protelna FAD2 comprende SEQ ID NO 2.
25. 25. La planta de la reivindicacion 24 que codifica ademas una segunda protelna FAD2 que comprende SEQ ID NO 6.

    SEQ ID NO 1

    ATGGGTGCAGGTCGAACAATCCAAOTaTCTCCTCCCTCCAAAAAOTCTGAAACCGACAACATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTG tttcaaacgctcgatccctcgctctttctcctacctcatctgggacatcatcatagcctcctgcttctactacgtcgccaccacttacttccctctcctccctcaccctctctcctacttcgcctggcctc TCTACTGGGCCTGCCAGGGCTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGACCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTGGACGACACCGTCGGCCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTC GTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCC TTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCTTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGGAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACA ACGACCGTGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTcTCTACCGCTACGCTGCTGTCCAAGGAGXTGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTTCCTCTTCTGATT gtcaacgggttcttagttttgatcacttacttgcagcacacgcatccttccctgcctcactatgactcgtctgagtgggattggttgaggggagctttggccaccgttgacagagactacggaatcttgaa CAAGGTCTTCCACAATATCACGGACACGCACGTGGCGCATCACCTGTTCTCGACCATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACGAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGA cgcccgtggttaaggcgatgtggagggaggcgaaggagtgtatctatgtggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggtgtgttctggtacaacaataagttatga

    SEQ ID NO 2

    MGAGGRJ-tQVSPPSKKSETDNIKRVPCETPPFTVGELKKAIPPHCFXRSIPRSFSYLZV.TlIIIASCFyYVATTYFPLiPHPLSYFAWPLWACQGC\rLTGVWVIAHECDHHAFSDYQVn>DDTVGLIFHSFLL VPYPSWKYSHRjmHSMTGSLERDEVFVPK3WSDIKMYGKYLHNPLGRTVMLTVOFTIX;wPLYlAFSVSGRFYDGGFACHFHPNAPIYNDRERLQXYISDAGXLAVCYGLYRYAAVQGVASMVCrYGVPLLI VNGrLVLITYLOHTHPSLPHYDSSEWDWXAGALATVDRDYGXljNKVPHNITDTKVAKHLPSTMPHYHAMEATKAXKPIIjGEYYQFDGTPVVKAMWREAKEcrYVEPDRQGEKKGVFWYIWIKL

    SEQ ID NO 3

    ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAAAAGTCTGAAACCGACAACATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTG XTrCAAACGCTCGATCCCTCGCTCXTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCrCCTCCCTCACCCTCTCTCCTACTTCGCCTGGCCTC TCTACTGGGCCTGCCAGGGCTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTGGACGACACCGTCGGCCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTC gtcccttacttctcctggaagtacagtcatcgacgccaccattccaacactggctccctcgagagagacgaagtgtttgtccccaagaagaagtcagacatcaagtggtacggcaagtacctcaacaaccc tttgggacgcaccgtgatgttaacggttcagttcactctcggctggcctttgtacttagccttcaacgtctcggggagaccttacgacggcggcttcgcttgccatttccaccccaacgctcccatctaca ACGACCGTGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTcTCTACCGCTACGCTGCTGTCCAAGGAGTTGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTrCCTCTTCTGATT GTCAACGGGTTCTTAGTTTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTATGACTCGTCTGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCCACCui igacagagactacggaatcttgaa caaggtcttccacaatatcacggacacgcacgtggcgcatcacctgttctcgaccatgccgcattatcacgcgatggaagctacgaaggcgataaagccgatactgggagagtattatcagttcgatggga cgccggtggttaaggcgatgtggagggaggcgaaggagtgtatctatgtggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggtgtgttctggtacaacaataagttatga

    SEQ ID NO 4

    MGAGGRMOVSPPSKKSETDNIKRVPCETPPFXVGELKKAIPPHCFKRSIPRSFSYHWDIIIASCFYYVATrYFPLLPHPl.SYFAWPLYWACQGCVLTGVWVXAHECGHHAFSDYOWLDDTVaLIFHSFl.L VPYFSWKYSH3ZRHHSNTGSLSRDEVFVPKKKSDIKWYGKYLNWPLGRTVMLTVQFTLGWPLYIiAFNVSGRPYDGGFACHFHPNAPXYNDRERIjQXYISDAGII.AVCYGLYRYAAVQGVASMVCFYGVPLI*I VUGFL.VLITYIyQHTHPSLPHYDSSEWDWLRGALAT'/DRDYGILNKVFHNITDTHVATOt.FSTMPHYHAMEATKAIKPILGEYYOFDGTPWKAMWREAKECIYVBPDRQGEKKGVFVrYNNKl.

    SEQ ID NO 5

    atgggtgcaggtggaagaatgcaagtgtctcctccctccaagaagtctgaaaccgacaccatcaagcgcgtaccctgcgagacaccgcccttcactgtcggagaactcaagaaagcaaxcccaccgcactg tttcaaacgctcgatccctcgctctttctcctacctcatctgggacatcatcatagcctcctgcttctactacgtcgccaccacttacttccctctcctccctcaccctctctcctacxtcgcctggcctc tctactgggcctgccaagggtgcgtcctaaccggogtctgggtcatagcccacgagtgcggccaccacgccttcagcgactaccagtggxtctgacgacaccgtcggtctcatcxtccactccttcctcctc gtcccttacttctcctggaagtacagtcatcgacgccaccattccaacactggctccctcgagagagacgaagtgtttgtccccaagaagaagtcagacatcaagtggtacggcaagtacctcaacaaccc tttgggacgcaccgtgatgttaacggttcagttcactctcggctggccgttgtacttagccttcaacgtctcgggaagaccttacgacggcggcttcgcttgccatttccaccccaacgctcccatctaca acgaccccgagcgtctccagatatacatctccgacgctggcatcctcgccgtctgctacggtctcttccgttacgccgccgcgcagggagtggcctcgatggtctgcttctacggagtcccgcxtctgatt GTCAATGGTTTCCTCGTGTTGATCACTTACTl’GCAGCACACG CATC CTTCCCTGCCTCACTACGATTCGTCCGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCTACCGTTGACAGAGACTACGG AATCTTGAA CAAGGTCTTCCACAATATTACCGACACGCACGTGGCGCATCATCTGTTCTCCACGATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACCAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGA cgccggtggttaaggcgatgtggagggaggcgaaggagtgtatctatgtggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggtgtgttctggtacaacaataagttatga

    SEQ ID NO 6

    MGAGGRMQVSPPSKXSETiyriKRVFCETPPFTVGEGJUUU:PPHCFKRSIPRSFSYLIWDIIIASCFYYVATTYFP&I.PHPI»SYFAWPI,YWACQGCVLTGVWVIAHECGHHAFSDYQWFi;DrVGI.IFHSFLI. VPYFSWEYSHRRHHSNTCSI^RDEVF'VFKKXSDIKWYGXYXJXNPLGRTVMLTVQFTLGWPLYIiAFNV'SGRPYDGGFACHFHPNAPIYMDRERLOIYISDAGIIAVCYGLFRYAAAQGVASWVCFYGVPIjLI VNGFLVIjITYLQHTHPSLPHYDSSEWDWLRGALATVDRDYGILKKVFHNITDTHVAHHLFSTMPHYHAMKATKAIKPILGEYYOFDGTPVVBAMWREAXECIYVBPDRQGEKKGVFWYNNKI/

    SEQ ID NO 7

    ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCrCCTCCCTCCAAGAAGTCTGAAACCGACACCATCAAGeGCGTACCCTGCCAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTG TTrCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCTCCCTCACCCTCXCTCCTACTTCGCCTGGCCTC tctactgggcctgccaagggtgcgtcctaaccggcgtctgggtcatagcccacgagtgcggccaccacgccttcagcgactaccagtggcttgacgacaccgtcggtcxcatcttccactccttcctcctc GTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCC TTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCGTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGAAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACA ACGACCGCGAGCGXCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTTCCGTTACGCCGCCGCGCAGGGAGTGGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTCCCGCTTCTGATT GTCAATGGTTTCCTCGTGTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTACGATTCGTCCGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCnTGGCTACCGTTGACAGAGACTACGGAATCTTGAA CAAGGTCTTCCACAATATTACCGACACGCACGTGGCGCATCATCTGTTCTCCACGATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACCAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTrCGATGGGA CGCCGGTGGTTAAGGCGATGTGGAGGGAGGCGAAGGAGTGTATCTATGTGGAACCGGACAGGCAAGGTGAGAAGAAAGGTGTGTTCTGGTACAACAATAAGTTATGA

    SEQ ID NO 8

    NGAGGRKQVSPPSiaCSETDTIKRVPCETPPFTVGEIJCKAIPPHCFKRSIPRSFSYIiIWDXIl'ASCFYYVATTYFPLLPHPLSYFAWPLYWACQGCVLTGVWVIAHECGHHAFSDYQWIJJDTVGIilFHSFLt vpyfswkyshkrhhsntgsi,erdevfvpkkksdtfwygkylnhplgrtvmltvqfti/3wplylafnvsgrpydggfachfhpnapiyndrerlqiyisdagxlavcyglfryaaaqgvasmvcfygvplli VNGFLVLITYiQHTHPSLPHYDSSEWDVJLRGALATVDRDYGIlJJKVFHNITDTHVAHHXJSTMEHYHAMEATKAIKPILGEYYQFDGrPVVKAMWREAlCECIYVEPDRQGEKKGVFWYinillX

    SEQ ID NO 9

    GAGAACcAGAGAGATTCATTACCAAAGAGATAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGGAGACAGAGAGAGAGTTTGAGGAGGAGCTTCTTCGTAGGGTTCATCGi-l ATI AAGGI TAAM i \_ i l ukTCCtCGCG IAGG l CAGCCAGCTCAAGAAACATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAAAAGTCTGAAACCGACAACATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAA GCAATCCCACCGCACTGTTTCAAACGCTCGATCCCTCGCTCnTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCXCCCTCACCCTCTCTC CTACTTCGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAGGGCTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTGGACGACACCGTCGGCCTCATCT TCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGC aagtacctcaacaaccctttgggacgcaccgtgatgttaacggttcagttcactctcggctggcctttgtacttagccttcaacgtctcggggagaccttacgacggcggcttcgcttgccatttccaccc CAACGCTCCCATCTACAACGACCGTGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTACCGCTACGCTGCTGTCCAAGGAGTTGCCTCGATGGTCTGC1IALG GAGTTCCTCTXCIGATTGTCAACGGGTTCTTAGTTTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTATGACTCGTCTGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCX'X'IGGCCACCGTTGACAGA GACTACGGAAX'CTrGAACAAGGTCTTCCACAATATCACGGACACGCACGTGGCGCATCACCTGTTCTCGACCATGCCGCATTATCATGCOATGGAAGCTACGAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTA ttatcagttcgatgggacgccggtggttaaggcgatgtggagggaggcgaaggagtgtatctatgtggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggtgxgttctggtacaacaataagttatgaagcaaag AAGAAACTGAACCrTTClCWTcCTATGAT'X'GICIXTGTIXAAGAAGCTATGnTCTGTTTCAATAATCtTTAA’rTAXCCATTTTGTTQTG'r'lTlCXGACAxmGGCTAAAATTATGTGATGrt'GGAAGTT

    SEQ ID NO 10 1

    GAGACAGAXTCATTACCAAAGAGATAGAGAAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGAGTTTGAGGAGGAGCTTCTTCGTAGGGTTCATCGTTATTAACGTTAAATCTTCACCCCCTACGTCAGCCA GCTCAAGAAACATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGXCXCCTCCCrCCAAGAAGTCTGAAACCGACACCATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTXCACXGXCGGAGAACTCAAGAAAGCAATC CCACCGCACTGTrrCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCrGCTTCTACTACGTCGCCACCACXTACXTCCCTCTCCrCCCTCACCCTCTCTCCTACTT CGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAAGGGTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCAXAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTTGACGACACCGTCGGTCTCATCTTCCACT CCTXCCXCCTCGXCCCXXACXTCXCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCXCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTITGXCCCCAAGAAGAAGXCAGACATCAAGXGGTACGGCAAGIAC CrCAACAACCCTTrGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCXGGCCGTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGAAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGC tcccatctacaacgaccgcgagcgtctccagatatacatctccgacgctggcatcctcgccgtctgctacggtctcttccgttacgccgccgsscagggagtggcctcgatggtctgcttctacggagtcc cgcxxcxgatxgxcaaiggxtxccxcgxgxxgaxcacxxacttgcagcacacgcaxcctxcccxgccxcacxacgaxxcgxccgagxgggaxtggxxsaggggagctttggctaccgtxgacagagacxac ggaaxcttgaacaaggtctxccacaaxaxxaccgacacgcacgxggcscaxcatctgxicxccacgatgccgcaxiaxcacgcgaxggaagcxaccaaggcgataaagccgaxactgggagagxatiaica gtxcgaxgggacgccggxggxxaaggcgaxgxggagggaggcgaaggagxgxatcxatgxggaaccggacaggcaaggtgagaagaaaggxgxgttcxggxacaacaaxaagttaxgaggatrraagaaac TGAACCTTXCTCTTCCXAXGATTGTCTXTGTTTAAGAAGCTATGTTTCXGTTTCAATAAXCTTAATTAXCCATTXTGTTGXGTTTTCXGACATXTTGGCTAAAATrAXGTGAXGXTGGAAGTTAGTGXCXA

    SEQ ID NO 11

    AGAGAGAGAAGAGAGGAGACAGAGAGAGAGirrGAGGAGGAGCTTCTXCGTAGGGXTCAXCGrXATTAACGITAAATCTTCAtCCCCCCCXACGTCAGCCAGCTCaAGGXCCCm'CTXCTTCCATTXCTT CxcATTTTTACGTTGTTTTCAATCTTGGTCTGXTCrTXXCTTATCGCTrXXCTGXXCXATCXAXCATTXTTGCATTTCAGTCGATXTATXTCTAGATCrGTTAATAXTXAXIGCATTAAACTAXAGATCTG GICTXGATTCXCTGTTTTCATGXGTGAAAXCXTGAXGCXGTCTTAACCAXTAATCTGATXAXAXXGICXAXACCGXGGAGAAXAXGAAAXGTXGCAtXXTCATTTGTCCGAAXACAAACIGXXTGACTXTC AATCGTTTXXAAAAXTAXAXAXAXAHTriGATGGGTTGGXGGAGXXGAAAAATCACCAXAGCAGXCXCACGTCCTGGTCTTAGAAATAXCCTTCCTATTCAAAGXXAXATAXAXXXGXXXACTTTXGXTT TAGATCTGGACCXGAGACATGTAAGXACAXATTXGTrGAATCXTTGGGTAAAAAACXXAXGTCXCXGGGXAAAATTTGCTGAGAGAXXTGACCGATXCCTAXXGGCXCTGGAXXCXGXAGXTACCXAAXAC AIGAAAAAGTXXCAXXXGGCCXATGCXCACXXCAXGCXXAXAAACXXXIXCXXGCAAAXTAATXGGAXXAGAXGCXCCXXCAXAGAXXCAGAXGCAATAGATTTGCAXGAAGAAAAXAATAGGATXCAXGA XAGTAAAAAAGAXTGTATTTTTGTTTGTTTGTTTATGTTTAAAAGTCXAXAXGXTGACAAXAGAGXTGCTATCAACXGXTXCATXXAGGTTXATGTTTXTGTCAAGXTGCXTATTCXAAGAGACAXXGXGA xxatgacxxgtcxxctcxaacgxagtttagxaaxaaaagacgaaagaaatxgaxaxccacaagaaagagaxgxaagcxgxaacgxaxcaaaxctcaxxaaxaacxagxagxaxtctcaacgctaxcgxtta

    ATXAACXXTGAGXCXXTGCXTTTGGXXTAXGCAGAAACATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGXGTCXCCTCCCrCCAAAAAGXCTGAAACCGACAACAXCAAGCGCGXACCCXGCGAGACACCGCCCTXC ACXGXCGGAGAACXCAAGAAAGCAAICCCACCGCACTGIXTCAAACGCXCGAXCCCXCGCTCTXXCXCCXACCXCAXCXGGGACAXCAXCAXAGCCXCCTGCXXCXACTACGXCGCCACCACTXACXXCCC xcxcctccctcacccxcxcxccxacttcgcciggcctctcxactgggcctgccagggctgcgxccxaaccggcgtcxgggxcatagcccacgagxgcgaccaccacgccttcagcgacxaccagxggctgg ACGACACCGXCGGCCTCAXCXXCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACXXCXCCTGGAAGXACAGTCATCGACGCCACCAXXCCAACACXGGCTCCCXCGAGAGAGACGAAGTGXXTGXCCCCAAGAAGAAG XCAGACAXCAAGXGGXACGGCAAGTACCTCAACAACCCTXTGGGACGCACCGTGAXGXTAACGGTTCAGTrCACTCTCGGCTGGCCXTXGXACTTAGCCXXCAACGTCTCGGGGAGACCTTACGACGGCGG CTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACAACGACCGTGAGCGXCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGXcXCXACCGCXACGCTGCTGTCCAAGGAGTTG CCXCGATGGTCXGCXTCXACGGAGTTCCTCXXCXGAXTGXCAACGGGXXCTTAGTTTTGAXCACTXACTXGCAGCACACGCATCCTXCCCTGCCXCACXATGACXCGTCTGAGTGGGATrGGTTGAGGGGA GCTTXGGCCACCGTTGACAGAGACXACGGAATCTTGAACAAGGTCTTCCACAAXATCACGGACACGCACGTGGCGCATCACCXGTXCXCGACCAXGCXGCAXTATCACGCGAXGGAAGCXACGAAGGCGAT aaagccgatactgggagagxattaxcagtxcgatgggacgccggtggxxaaggcgatgxggagggaggcgaaggagtgiatctaigxggaaccggacaggcaaggxgagaagaaaggigigxtctggiaca ACAAXAAGTTAXGAAGCAAAGAAGAAACXGAACCTTTCTCAXCTATGATTGXCXTTGTXTTAAGAAGCXAXGXTTCTGTTXCAAXAATCTTTAAXTAXCCAXXXTGTXGXGXTrXCXGACAx 11 igGCXAA aaxtatgxgatgttggaagttagxgxctaaaatgxcxtgtgtctgxaxtgttcxxcttcxcatcgcxgttatgtxtgggatcgtxgaaatgtgactitcggacxagxgaaxcttgttcxcgaact

    imagen1