ES2607144T3 - Composiciones y métodos para incrementar la absorción de hierro - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en el incremento de la absorción de hierro cuando es ingerida por un ser humano o un animal, comprendiendo dicha composición hierro y péptidos, en la que: (a) los péptidos se obtienen de espinas dorsales y cabezas de salmón hidrolizadas enzimáticamente; (b) la composición es adecuada para ingestión humana o animal; y (c) los péptidos son más de un 50 % de la composición.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para incrementar la absorcion de hierro Campo

La presente invencion se refiere a un incremento de la absorcion de hierro. La presente invencion se refiere tambien a composiciones que comprenden hierro y peptidos obtenidas mediante hidrolisis enzimatica. La presente invencion se refiere tambien a promover que un ser humano o un animal ingieran peptidos obtenidos de vertebrados marinos enzimaticamente hidrolizados.

Antecedentes

El hierro es esencial para la fisiologia humana y animal. La insuficiencia de hierro en seres humanos y animales puede provocar una serie de enfermedades y trastornos, que incluyen anemia por deficiencia de hierro y retraso en el crecimiento.

La practica actual para proporcionar hierro adicional es mediante inyeccion.

Para seres humanos estan disponibles complementos de hierro en forma de pildora.

El documento JP 5229959 divulga una composition que acelera la absorcion de hierro que comprende ESP-2 y DAN-1 obtenidos de musculo de sardina, en lugar de los peptidos usados en la composicion de la presente invencion que se derivan de la espina dorsal y la cabeza de un salmon.

Sumario

La invencion proporciona:

1. Una composicion para su uso en el incremento de la absorcion de hierro cuando es ingerida por un ser humano o un animal, comprendiendo dicha composicion hierro y peptidos, en la que:

(a) los peptidos se obtienen de espinas dorsales y cabezas de salmon hidrolizadas enzimaticamente;

(b) la composicion es adecuada para ingestion humana o animal; y

(c) los peptidos son mas de un 50 % de la composicion.

2. La composicion para el uso de 1, en la que los pesos moleculares de los peptidos son de 3500 Daltons o inferiores.

3. La composicion para el uso de 1 o 2, en la que el hierro es mas de un 0,01 % de la composicion.

4. La composicion para el uso de cualquiera de 1 a 3, que comprende ademas aceite de pescado.

5. La composicion para el uso de cualquiera de 1 a 4, en la que la composicion es un complemento dietetico o un aditivo alimentario.

6. La composicion para el uso de cualquiera de 1 a 5, en la que menos del 50 % de los peptidos estan quelados al hierro. El animal es un mamifero o un ave.

7. La composicion de cualquiera de 1 a 6 para su uso en el tratamiento de un ser humano o un animal que tiene anemia por deficiencia de hierro o que esta en riesgo de tener anemia por deficiencia de hierro y que no tiene una dieta que este modificada debido a una enfermedad o trastorno.

Descripcion detallada

En un aspecto de la invencion, se proporcionan composiciones para incrementar la absorcion de hierro que comprenden peptidos obtenidos de proteinas de pescado hidrolizadas enzimaticamente.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "incrementar la absorcion de hierro" tiene el significado habitual en la tecnica. De acuerdo con esto, "incrementar la absorcion de hierro" incluye incrementar la absorcion intestinal de hierro al torrente sanguineo. Como ejemplo adicional, el termino incluye incrementar la captation o almacenamiento de hierro en las celulas o en las proteinas de transporte. El incremento de la absorcion de hierro se puede medir mediante varios medios conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, la absorcion de hierro se puede medir ensayando los niveles de transferrina o ferritina.

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Tal como se usa en el presente documento, el termino "hierro" tiene el significado habitual en la tecnica en el contexto del hierro que es ingerido por seres humanos o animales. De acuerdo con esto, el termino incluye hierro hemo, hierro no hemo, hierro elemental (tambien conocido como hierro reducido), hierro complejado, hierro quelado, sales de hierro y otras formas de hierro que son adecuadas para la ingestion humana o animal. Se puede obtener hierro para ingerir a partir de numerosas fuentes conocidas por experto en la materia. Por ejemplo, se puede obtener hierro para ingerir a partir de fuentes alimentarias animales, tales como carne roja, pescado o carne de ave. Tal tipo de hierro se denomina comunmente hierro hemo. Tambien se puede obtener hierro para ingerir a partir de fuentes alimentarias vegetales, tales como verduras y frutas. Tal tipo de hierro se denomina comunmente hierro no hemo. Tambien se puede obtener hierro para ingerir a partir de fuentes microbianas, por ejemplo, de algas verdes.

Tambien se puede obtener hierro para ingerir a partir de fuentes no organicas. Por ejemplo, sales de hierro ferrosas o ferricas son una fuente de hierro ingerible, por ejemplo, sulfato ferroso, fumarato ferroso, succinato ferroso, gluconato ferroso, lactato ferroso, glutamato ferroso, y glicina ferrosa. Asimismo, se puede usar polvo de hierro elemental como fuente de hierro ingerible. Adicionalmente, se puede obtener hierro de las mismas fuentes que los peptidos descritos en el presente documento. Por ejemplo, tanto el hierro como los peptidos se pueden obtener a partir de pescado, por ejemplo, de salmon del Atlantico norte (por ejemplo, Salmo salar y otros peces de este genero).

En un aspecto de la invencion, el hierro en las composiciones es mas del 0,01 % de la composicion. Por ejemplo, en el caso de una composicion que tiene un peso seco total de 1 kilogramo, el peso seco de hierro seria mayor de 100 miligramos. En un aspecto adicional de la invencion, el porcentaje de hierro es mas del 10 % de la composicion total. En un aspecto adicional de la invencion, el porcentaje de hierro en la composicion es del 0,01 % al 10 % de la composicion total y en un aspecto adicional, el porcentaje de hierro es mas del 0,05 %, mas del 0,1 %, y mas del 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 % de la composicion total.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "peptidos" tiene el significado habitual en la tecnica.

De acuerdo con esto, peptidos incluyen peptidos dimericos, peptidos multimericos y polipeptidos. En un aspecto de la invencion, los pesos moleculares de los peptidos son inferiores a 60 000 Daltons. En un aspecto adicional de la invencion, un 100 % o al menos un 90 % de los peptidos tienen un peso molecular inferior a 10 000 Daltons. En otro aspecto de la invencion, al menos un 70 % de los peptidos tienen un peso molecular inferior a 5000 Daltons. En otro aspecto de la invencion, al menos un 50 % de los peptidos tienen un peso molecular inferior a 1000 Daltons. En otro aspecto de la invencion, el 100 % de los peptidos tienen un peso molecular de 3500 Daltons o inferior.

En un aspecto de la invencion, la cantidad de peptidos en las composiciones es mas del 50 % de la composicion. En otro aspecto de la invencion, la cantidad de peptidos es mas del 75 %, mas del 90 % o mas del 99 % de la composicion. De modo alternativo, en otro aspecto de la invencion, la cantidad de peptidos es mas del 50-99 % de la composicion o mas de cualquier porcentaje entero entre el 50 y el 99 %. De acuerdo con esto, en un ejemplo no limitante, un aspecto de la invencion incluye una composicion que tiene un peso seco total de 1 kilogramo, en el que el peso seco total de peptidos en la composicion es mayor de 500 gramos, es decir, mas del 50 % del peso seco total de la composicion. En otro aspecto de la invencion, el porcentaje se basa en la cantidad calorica. De acuerdo con esto, como ejemplo no limitante, un aspecto de la invencion incluye una composicion que tiene un contenido calorico total de 1000 calorias en la que el contenido calorico de los peptidos es superior a 500 calorias, esto es, mas del 50 % del contenido calorico total de la composicion.

Tal como se usa en el presente documento, el termino hidrolisis enzimatica de proteinas tiene el significado habitual en la tecnica. De acuerdo con esto, la invencion incluye peptidos que resultan de una hidrolisis parcial.

Con respecto a los aspectos de la hidrolisis enzimatica de la invencion, diversas enzimas para la hidrolisis de proteinas (conocidas tambien en la tecnica como enzimas proteoliticas o proteasas) estan disponibles para el experto en la materia. Por ejemplo, se pueden usar endopeptidasas y/o exopeptidasas. Adicionalmente, se pueden usar las siguientes enzimas o combinaciones de las siguientes enzimas: Alcalase®, Neutrase®, Protamex®, Flavourzyme® (todas disponibles en Novozymes), Pescalase® (disponible en Gistbrocades de Holanda) y Promo 31® (disponible en Biocatalysts Ltd. de Gales). Un ejemplo de una combinacion de enzimas que se puede usar es una mezcla de dos enzimas Alcalase® y Neutrase® en una relacion 1:9 a 1:1.

Metodos adicionales de hidrolisis enzimatica son conocidos en la tecnica.

Ademas, descripciones de hidrolisis enzimaticas y aminoacidos de pescado obtenidos mediante hidrolisis enzimatica se encuentran, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada en Estados Unidos, numero de publicacion: US 2005/0037109 A1 de Soerensen et al.

Ademas de los peptidos y el hierro, las composiciones de la invencion pueden incluir tambien compuestos tales como vitaminas, minerales, nitrogeno no proteico, carbohidratos u otros compuestos asociados a la hidrolisis enzimatica.

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En un aspecto adicional de la invention, las composiciones incluyen Kpidos ademas de los peptidos y el hierro. Por ejemplo, se pueden usar aceites de pescado en combination con los peptidos a fin de incrementar la absorcion de hierro en seres humanos y animales. En un aspecto adicional de la invencion, se puede usar aceite de pescado obtenido de la misma fuente que los peptidos de pescado. En otro aspecto de la invencion, sin embargo, se evitan los aceites con altos niveles de acidos grasos oxidados ya que la oxidation de los acidos grasos disminuye generalmente la palatabilidad. En un aspecto adicional de la invencion, el nivel de insaturacion en los lipidos usados esta por debajo de una cantidad predeterminada.

En un aspecto adicional de la invencion, el hierro o los peptidos, o la combinacion de los dos, son complementos dieteticos o aditivos alimentarios. El termino "complemento dietetico" o "aditivo alimentario" se refiere al significado habitual que tienen estos terminos en la tecnica. De acuerdo con esto, un complemento dietetico o un aditivo alimentario significa que los peptidos o el hierro se obtienen de una fuente aparte de la dieta humana o animal. Asimismo, un complemento dietetico o un aditivo alimentario se procesan frecuentemente de un modo distinto o separadamente de la comida o alimento y se envasa con frecuencia en envases separados de la comida o alimento. Los complementos dieteticos o aditivos alimentarios pueden tener tambien una composition quimica diferente. Por ejemplo, el hierro como complemento dietetico o aditivo alimentario esta normalmente en forma de sulfato ferroso en comparacion con el hierro encontrado en la comida o alimento que esta normalmente en forma de hierro hemo de la carne. Se puede formular un alimento de prescription para mascotas (para un animal de compania) de acuerdo con la presente invencion. Tal alimento de prescripcion normalmente es para mascotas de edad avanzada cuya absorcion nutricional llega ser problematica.

Aparte de a los seres humanos, particularmente aquellos que padecen o estan en riesgo de padecer una anemia situacional (en la que existen problemas nutricionales, por ejemplo), se pueden proporcionar las composiciones de la presente invencion a otros animales. Tales animales incluyen animales de production tales como cerdos {y otros porcinos), pollos (y aves de corral), vacas y ganado (bovinos) y otros de tales animales. Son de particular interes animales que tienen o estan en riesgo de tener una anemia situacional, tal como cerditos destetados y otros animales en edad de crecimiento o en desarrollo tales como los enumerados anteriormente (terneros, por ejemplo). La formulation de la presente invencion puede ser apetitosa para tales animales incluso aunque el pescado no sea parte de su dieta natural (al contrario que los visones, por ejemplo, los cuales comen pescado de modo natural).

En un aspecto adicional de las composiciones de la invencion, menos del 50 % del hierro esta quelado a los peptidos. En un aspecto adicional, el porcentaje de quelacion del hierro a los peptidos es de menos de un 50 % a un 0 % y, en otro aspecto, menos de cualquier porcentaje entero entre el 50 % y el 1 %.

Con respecto a la composicion de la invencion, se pueden calcular las cantidades de diversos modos alternativos, por ejemplo, peso/volumen (p/v), volumen/peso (v/p), volumen/volumen (v/v) o peso/peso (p/p). Ademas, las cantidades se pueden calcular basandose en los porcentajes caloricos. Tal como se usa en el presente documento, las cantidades y los porcentajes incluyen tales cantidades y porcentajes medidos mediante cualquier metodologia que pueda ser aplicada razonablemente por el experto en la materia. Por ejemplo, una composicion que tiene mas de un 50 % de peptidos, tal como se ha expuesto en el presente documento, incluye composiciones que tienen mas de un 50 % de peptidos basandose en el peso seco de los peptidos con respecto al peso seco de la composicion total, asi como a composiciones que tienen un 50 % de peptidos basandose en otras metodologias de calculo conocidas por el experto en la materia, tal como el peso de los peptidos con respecto al volumen de la composicion total (p/v) en el caso de una composicion liquida. De acuerdo con esto, en otro aspecto de la invencion, la cantidad de peptidos, medida mediante cualquiera de los metodos de calculo mencionados anteriormente, es mas del 50 %. Lo anterior se aplica a todas las cantidades y los porcentajes expuestos en el presente documento, que incluyen las cantidades y los porcentajes de peptidos, hierro y peptidos quelados.

En otro aspecto de la invencion, las composiciones de la invencion no contienen cantidades significativas de compuestos tales como el oxido de trimetilamina, que inducen la formation de hidratos de oxido de hierro cristalinos insolubles, lo cual puede inhibir la absorcion de hierro.

Las composiciones de la invencion se dirigen al incremento de la absorcion de hierro en un ser humano o un animal. En un aspecto de la invencion, se promueve que un ser humano o un animal ingieran los peptidos. En un aspecto adicional de la invencion, los peptidos se ingieren conjuntamente con el hierro o separadamente. En otro aspecto, el hierro se ingiere un tiempo razonable antes o despues de la ingestion de los peptidos. En un aspecto adicional, el hierro se ingiere menos de 24 horas antes o despues de la ingestion de los peptidos. En un aspecto adicional de la invencion, el hierro se ingiere de menos de 24 horas a menos de 1 hora (y cualquier intervalo de horas entremedias) antes o despues de la ingestion de los peptidos.

En un aspecto de la invencion, las composiciones de la invencion mejoran enfermedades y trastornos que resultan de la insuficiencia de hierro en un ser humano o un animal. El mas comun de estos trastornos es quizas la anemia por deficiencia de hierro. La anemia es un trastorno que se caracteriza por una deficiencia de globulos rojos. La anemia por deficiencia de hierro es una anemia que esta causada por una cantidad inadecuada de hierro. La deficiencia de hierro puede ser el resultado de cantidades inadecuadas del hierro ingerido, una absorcion inadecuada de hierro, perdida de sangre o una combinacion de los mismos.

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La anemia por deficiencia de hierro tambien es comun en seres humanos o animales durante periodos de crecimiento, tales como la infancia o el destete. Tambien se ha encontrado anemia por deficiencia de hierro en razas de ganado que tienen una elevada relacion de crecimiento con respecto a la alimentacion.

La anemia por deficiencia de hierro se puede distinguir de muchas otras anemias. Por ejemplo, la anemia por deficiencia de hierro es diferente de la anemia resultante de trastornos malignos, inflamatorios o infecciosos cronicos, tales como la artritis o el cancer. Mas especificamente, las anemias siguientes son distintas de la anemia por deficiencia de hierro: anemia hipocromica, anemia microcitica, clorosis, anemia sideroblastica hereditaria, anemia sideroblastica idiopatica adquirida, aplasia de eritrocitos, anemia megaloblastica, tal como anemia perniciosa, anemia por deficiencia de vitamina B12 y anemia por deficiencia de acido folico, anemia aplasica, anemias hemoliticas, tales como anemia hemolitica autoinmune, anemia hemolitica microangiopatica, y hemoglobinuria paroxistica nocturna.

Asimismo, en otro aspecto de la invencion, la anemia por deficiencia de hierro no incluye la anemia resultante de fallo renal, funcion renal disminuida o dialisis.

Tal como se ha mencionado anteriormente, los peptidos ingeridos incrementan la absorcion del hierro en seres humanos o animales. En un aspecto adicional de la invencion, los peptidos ingeridos incrementan sustancialmente la absorcion del hierro en un ser humano o un animal. En aspectos adicionales de la invencion, la absorcion de hierro se incrementa en una cantidad significativamente estadistica y en un aspecto adicional la absorcion se incrementa en un 50 % hasta mas de un 100 %. En un aspecto adicional, la absorcion de hierro se incrementa en un porcentaje que es mayor que cualquier porcentaje entero entre el 50 % y el 100 %. Tal como se ha mencionado anteriormente, un incremento de la absorcion de hierro se puede evaluar midiendo la transferrina o la ferritina o mediante otros metodos conocidos por el experto en la materia.

Con referencia a otros aspectos de las composiciones de la invencion, el termino "ingerir" tiene el significado habitual en la tecnica. La ingestion normal se efectua por la boca. No obstante, se pueden usar tambien otros metodos de ingestion tal como mediante un tubo nasogastrico. Asimismo, ademas de la ingestion, en un aspecto adicional de la invencion, se pueden administrar complementos de hierro por via intravenosa.

En un aspecto adicional de la invencion, la ingestion la efectua un ser humano o un animal con una dieta proteica normal. El termino "normal" en el presente documento tiene el significado habitual en la tecnica en el contexto de normal frente a una dieta que ha sido modificada debido a una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, un ser humano o un animal que padece una disfuncion renal no tiene con frecuencia una dieta proteica normal debido a que tal sujeto no puede metabolizar adecuadamente las proteinas.

La expresion "adecuado para ingestion humana o animal" se refiere al significado habitual en la tecnica de esta expresion. Por ejemplo, "adecuado para ingestion humana o animal" se refiere a una cantidad aceptable, para la seguridad humana o animal, de patogenos y toxinas (en el caso de toxinas, por ejemplo, mercurio y otros metales pesados).

Por ejemplo, es conocido por el experto en la materia que los niveles de determinados patogenos han de estar por debajo de una cantidad predeterminada para que una composicion sea adecuada para ingestion humana o animal. Por ejemplo, en el contexto de los microorganismos patogenos, y en un aspecto de la invencion, la cantidad de determinados patogenos (como es conocido por el experto en la materia) debe estar por debajo de una Dosis minima infectiva (DMI). La DMI se refiere al numero minirno de microorganismos patogenos capaces de causar una enfermedad. Por ejemplo, la DMI para Vibrio cholerae, un contaminante microbiano patogeno encontrado en alimentos derivados de pescado, es de 106. De acuerdo con esto, en un aspecto de la invencion, las composiciones del presente documento contienen Vibrio cholerae por debajo de su DMI.

Ademas del Vibrio cholerae, los siguientes patogenos son conocidos por el experto en la materia y en un aspecto adicional de la invencion, las composiciones que contienen cantidades de estos patogenos por debajo de sus respectivas DMI. Salmonella spp., Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes, otras cepas de Vibrios, y varias cepas de E coli.

Analogamente, en otro aspecto de la invencion, las composiciones contienen un nivel de virus, protozoos y parasitos patogenos tal que las composiciones se consideran adecuadas para la ingestion humana o animal.

Asimismo, metodos para conseguir los niveles reducidos deseados de patogenos son conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, coccion, enfriamiento, irradiacion (por ejemplo de rayos X o rayos gamma), calentamiento, calentamiento a presion, congelamiento o una combinacion de estos son conocidos por el experto en la materia por ser seguros y eficaces para reducir los niveles de patogenos de las composiciones que van a ser ingeridas por seres humanos o animales.

Como otro ejemplo, es conocido por el experto en la materia que la reduccion del tamano (peso molecular) de los peptidos en una composicion es un modo comun de minimizar el riesgo de infeccion por priones. De acuerdo con

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esto, en un aspecto de la invencion, los peptidos tienen los pesos moleculares expuestos anteriormente.

La anterior description y los ejemplos que siguen a continuation no limitan las composiciones descritas en el presente documento y solamente sirven para ilustrar diversas realizaciones no limitantes.

Ademas, en el presente documento, el uso del singular no tiene un significado limitante.

Por ejemplo, la descripcion de "una composition" o "la composition" no significa que limite la invencion a una sola composition. Esto es, se entiende que una composicion en el presente documento, cuando se combina con otras composiciones, estan aun dentro del alcance de la presente invencion, a menos que se exponga explicitamente lo contrario en el presente documento.

Adicionalmente, las siguientes palabras se deben interpretar tal como sigue a menos que se exponga explicitamente otro significado. Las palabras "incluye", "incluyen", o "que incluye” o “que incluyen" significan incluir, sin limitation. Las palabras "comprende", "comprenden" o "que comprende” o “que comprenden" significan incluir sin limitacion. La palabra "o" significa y/o.

Ejemplos

Para los Ejemplos 1 y 2, se recogio sangre de seis perros alimentados con un 20 % de hidrolizado de proteinas de salmon (SPH), seis perros alimentados con un 20 % de hidrolizado de proteinas de salmon y un 4,5 % peso/peso (p/p) de aceite de salmon (SPHO) y seis perros de control. Todos los perros se alimentaron con la dieta control que consistia en un 30 % de proteina de un derivado de ave y un 25 % de grasa, desde el dia uno hasta el dia catorce. Los perros no de control se alimentaron con el SPH y el SPHO desde el dia quince hasta el dia veintiseis solamente. Los seis perros de control se alimentaron con la dieta de control sin los aditivos alimentarios anteriores.

Los ejemplos 1 y 2 se centran en estudios del efecto fisiologico sobre una serie de ensayos in vitro. Los ejemplos descubren cambios de la concentration en plasma basados en marcadores enzimaticos. Los dos ensayos in vitro juntos investigan la presencia potencial de peptidos bioactivos de los alimentos con SPH y el SPHO que influyen en la concentracion de hierro almacenado en los sujetos alimentados. Los dos ensayos in vitro se dirigen a la transferrina y la ferritina. El primer ensayo (Ejemplo 1) se dirigen a la transferrina, el segundo ensayo (Ejemplo 2) se dirige a la ferritina.

Ejemplo 1

Se midieron los niveles de transferrina serica de los perros. El ensayo usado para medir los niveles de transferrina fue un ensayo de ELISA. Este ensayo es un inmunoensayo ligado a enzimas de dos sitios para medir la transferrina serica o plasmatica de los perros. La medicion de la transferrina serica tiene un valor particular en la identification de la eficacia de la absorcion de hierro, especialmente cuando se acopla a la medicion simultanea de los niveles de ferritina plasmatica.

La transferrina es una proteina que se une al hierro. La transferrina sirve para transportar el hierro hasta la medula osea y los organos de almacenamiento tisular, tal como el higado. La transferrina tambien participa en la regulation y el control de la absorcion de hierro y protege frente a la intoxication por hierro.

Los resultados de los ensayos de la transferrina se resumen en la Tablas 1 y 2.

TABLA 1: Concentracion de transferrina promedio corregida (mg/l)

Perro

1 2 3 4 5 6

SPHO

1,642 1,874 1,480 1,503 1,317 1,341

SPH

2,570 2,686 2,686 2,593 2,338 2,199

Control

2,988 4,449 4,148 3,591 3,243 2,709

TABLA 2: Concentracion de transferrina promedio corregida (mg/l)

Desviacion tipica Media Error tipico de la media

SPHO

0,223 1,526 0,091

SPH

0,221 2,512 0,090

Control

0,696 3,023 2,84

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Ejemplo 2

La ferritina es una protema que se une al hierro implicada en el almacenamiento de hierro. La ferritina se localiza en diversos tejidos, por ejemplo, hngado, bazo, medula osea y moco del intestino.

Los resultados de los ensayos de la ferritina se resumen en la Tablas 3 y 4.

TABLA 3: Concentracion de ferritina promedio corregida (mg/l)

Perro

1 2 3 4 5 6

SPHO

277,543 267,799 246,920 324,173 335,308 271,279

SPH

221,169 147,397 248,312 230,217 291,462 270,583

Control

113,294 131,389 265,711 298,422 146,701 141,829

TABLA 4: Concentracion de ferritina promedio corregida (mg/l)

Desviacion tipica Media Error tipico de la media

SPHO

38,457 287,171 15,700

SPH

55,441 234,857 22,634

Control

78,877 164,009 32,201

Discusion de los resultados

El uso de las concentraciones de transferrina y ferritina para afirmar la influencia del SPH y el SPHO sobre la absorcion de hierro. Los resultados muestran que el SPHO y el SPH incrementan las concentraciones de ferritina en plasma y disminuyen las concentraciones de transferrina en plasma. El incremento de la ferritina sugiere un incremento de la absorcion y/o la biodisponibilidad del hierro. Analogamente, la disminucion de la concentracion de transferrina sugiere una reduccion del transporte de hierro. La disminucion de la concentracion de transferrina sugiere tambien una reduccion de la necesidad de absorcion del hierro debida a (se hipotetiza) un incremento de la biodisponibilidad del hierro y/o un incremento de las concentraciones de ferritina unida al hierro. La disminucion de la concentracion de transferrina y el incremento de la concentracion de ferritina apoyan la conclusion de que la biodisponibilidad y la absorcion del hierro se incrementaron en los perros alimentados con SPHO y SPH con relacion a los perros control.

La disminucion de la concentracion de transferrina mostraba una significancia estadistica.

El incremento de la concentracion de ferritina mostraba una tendencia, pero tecnicamente no era estadisticamente significativa debido a la dispersion de los niveles de concentracion individuales a lo largo de los tres grupos de perros.

Ejemplo 3

Mediciones de la captacion del hierro por celulas Caco-2 usando PP1 SP Seco en comparacion con el producto de digestion de proteinas de carne, pollo, pescado y caseina.

Se sometieron a hidrolisis proteica cabezas y espinas dorsales de salmon, tras haber fileteado el salmon total, usando un proceso de fabricacion desarrollado por Green Earth Industries (GEI). Vease, por ejemplo, el documento US 2005/0037109. Este proceso da una fraccion proteica soluble en agua (SP), una fraccion proteica insoluble (NSP), una fraccion de aceite (FO) y una fraccion de espinas (CA). Estas fracciones se pueden separar entre si con particular atencion a la calidad global y las separaciones para la fraccion SP. La fraccion SP se aisla primero del proceso en forma de una solucion del 6-7 %, que se concentra hasta una suspension del 55-60 % en un evaporador de pelicula descendente de triple efecto. Este material parecido a la miel se seca posteriormente, usando un equipo de secado por pulverizacion, para dar un polvo de proteina amarillo palido (SP Seco).

Se alimento a los perros con el SP Seco en un estudio de digestibilidad y palatabilidad efectuado por GEI, y el plasma se recogio y se analizo. Este mostro un incremento significativo en ferritina y una disminucion en proteinas transferrina, lo que es indicativo de un incremento de la captacion del hierro en los animales que recibieron el SP Seco del ensayo y el SP Seco + la fraccion de aceite de salmon.

La absorcion de hierro por modelos animales (tales como perros o cobayas) ofrece una evaluacion directa y fisiologicamente relevante de la biodisponibilidad del hierro. Los presentes inventores demostraron tambien la captacion del hierro potencial del "SP Seco" usando un metodo in vitro de captacion de hierro por celulas Caco-2 ("Iron availability from Iron-Fortified Sprulina by an in-vitro digestion/Caco-2 Cell Culture Model". Jean-Max Rouanet et al., Journal of Agric, Food Chem. 49(3), 1625, (2001) para estimar rapidamente el incremento potencial de la

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captacion del hierro mediante la incorporation del SP Seco en la dieta.

Este estudio se emprendio para analizar el rendimiento del SP Seco para potenciar la captacion del hierro, en comparacion con la caseina, y proteinas de soja, carne, pollo y pescado tras un proceso de digestion peptica e intestinal simulada.

Este estudio con celulas Caco-2 combina la digestion peptica e intestinal simulada y la medicion de la captacion del hierro por una monocapa de celulas Caco-2.

La muestra PP1 SP Seco de hidrolizado de proteinas solubles se produjo bajo la supervision de Meatzyme B.V. y Green Earth LLC. La fraction de proteinas solubles se seco mediante pulverization y se recibio en Bombay, India, en buenas condiciones para el analisis quimico. La muestra PP1 SP Seco es un polvo amarillo palido amorfo con un ligero olor a pescado.

Las muestras de proteinas de carne (buey), pollo (muslo) y pescado (filete de atun) se adquirieron frescas y se trataron como sigue. Se elimino toda la grasa y tejido conectivo visible y se cortaron en finas rodajas. Tras hervirlas a fuego lento en agua desionizada durante 30 minutos, se retiraron las piezas, se enfriaron a 0 °C y se elimino la grasa visible adicional. Las piezas se homogeneizaron en una mezcladora con un minimo de agua, se liofilizaron y se pasaron a traves de un tamiz de 40 mallas para dar los polvos de proteina usados en el presente documento. La caseina se adquirio en la Parsi Dairy Farm Ltd. y se uso como tal.

La digestion in vitro de las cuatro fuentes de proteinas anteriores se llevo a cabo usando pepsina porcina y extracto biliar (para simular la digestion en el estomago) y pancreatina y extracto biliar (para simular la digestion intestinal) adquiridos en Sigma Aldrich y usados como tales en un procedimiento de digestion convencional. Se uso cloruro de hierro (111) marcado con 59Fe para preparar las concentraciones de hierro hasta 10 gmol/l en los homogeneizados.

El contenido de proteina inicial se midio tras solubilizar en hidroxido sodico 0,5 mol/l y se uso el kit de ensayo de proteinas Bio-Rad® DC.

El contenido de proteina digerida se midio como el precipitado solubilizado con TCA usando el mismo kit, en el que 20 ml de cada producto de digestion se diluyeron hasta 50 ml con agua desionizada y se hicieron reaccionar con 50 ml de acido trifluoroacetico 0,6 mol/l. Las muestras se centrifugaron y el precipitado se solubilizo en 0,5 mol/l y se midio como antes.

En este ensayo se uso una forma modificada del kit de ensayo de celulas Caco-2 de 24 x pocillos disponible en el mercado de Celsis In-vitro Technologies. El kit de Celsis se presembro en placas con celulas Caco-2 con filtros Corning Costar Transwell@. Los cultivos IVT de Caco-2 se consideran aceptables para estudios de transporte y cumplen los criterios de resistencia electrica transepitelial (TEER) de 1000 ohmios.

Se anadieron 1,5 ml de cada solution de proteinas post-digestion que contenian 10 gmol/l de 59Fe a cada uno de 12 pocillos, que contenian celulas Caco-2 normales en la camara inferior y las placas se incubaron a 37 °C durante dos horas antes de separar las capas.

Las celulas se extrajeron usando el procedimiento descrito por Celsis, y se reconto el 59Fe usando un contador gamma automatizado y se determino como la fraccion remanente en el sobrenadante tras la centrifugation.

Los parametros del contenido inicial (antes de la adicion del 59Fe) y la digestion estimada en porcentaje medida como la medicion de proteina precipitable con TCA se muestran en la Tabla 5 que sigue.

TABLA 5 - Analisis de los

homogeneizados de proteinas antes y despues de la digestion

Fuente

% Proteina Grasa cruda (mg/g) % humedad Hierro total % Digestion

Carne

84 % ± 2 % 110 ± 5 6,1 ± 0,2 0,84 ± 0,01 66 % ± 5 %

Pollo

88 % ± 1 % 90 ± 5 4,9 ± 0,2 0,65 ± 0,01 68 % ± 5 %

Pescado

94 % ± 1 % 40 ± 2 6,1 ± 0,2 0,13 ± 0,01 74 % ± 5 %

Caseina

92 % ± 1 % ND 5,8 ± 0,2 0,03 ± 0,01 88 % ± 5 %

SP Seco

93 % ± 0,5 % 36 ± 2 4,2 ± 0,2 0,007 ± 0,001 93 % ± 1 %

*El hierro total se midio en un espectrometro como un complejo Fe-fereno a 595 nm ("Ferene -a new spectrophotometric reagent for iron". D. D. Hennessy et al. Can. J. Chem. 62, P721, (1984).

Los resultados de la variation de la captacion de hierro entre diferentes fuentes de proteinas se muestran en la Tabla 6 a continuation. Las fuentes de proteina muscular (carne, pollo y pescado) mostraban captaciones de hierro

similares en las celulas Caco-2 bajo la membrana, mientras que la casema no mostro casi captacion, que era muy similar a la solucion tampon de control negativo (osmosis). El producto SP Seco mostraba una captacion de hierro significativamente mayor en comparacion con todas las otras fuentes de proteinas.

5 ______TABLA 6 - Captacion celular de hierro (nmol/mg proteina celular, tras 2 h de equilibracion).______

Solucion tampon

Carne Pollo Pescado Caseina SP Seco

0,015 ± 0,005

0,095 ± 0,005 0,070 ± 0,005 0,085 ± 0,005 0,025 ± 0,005 0,135 ± 0,005

El modelo Caco-2 se ha usado con exito para estudiar la captacion de farmacos en docenas de experimentos en la literatura. ("Intestinal absorption of 59Fe from neutron activated commercial oral iron (III) citrate and iron (III) hydroxide polymaltose complexes in man". (H. C. Heinrich Arzneim-Forsch/Drug.Res. 37, 105, (1987).) El ensayo modificado 10 usado en el presente documento se ha usado tambien para estudiar el enriquecimiento de alimentos no solo con hierro, sino tambien con elementos esenciales tales como zinc y vitamina D. Este modelo in vitro ha mostrado repetidamente una comparabilidad excelente con la absorcion humana en el intestino y, por tanto, los resultados mostrados en este estudio respaldan los resultados positivos del estudio del plasma en la alimentacion de perros mayores de Fahey. Se puede efectuar tambien un estudio de modelo animal usando cobayas, por ejemplo, para 15 estudiar adicionalmente el efecto de la alimentacion con SP Seco sobre el RGR (hemoglobina).

Es evidente a partir de este estudio que el producto de digestion de proteinas marinas - SP Seco - muestra un efecto positivo sobre la captacion del hierro en comparacion con las otras fuentes de proteina digerida ensayadas. El SP Seco mejoro la captacion de hierro en un 540 % respecto al control negativo de caseina y fue incluso un 40 % mayor 20 que el control positivo, el producto de digestion de proteinas de la carne. No se uso aceite de salmon (SO) en este experimento en absoluto y, por tanto, esta es una evidencia concluyente de que la fraccion de proteina potencia por si misma un incremento de la captacion del hierro.

Cabe senalar tambien que solamente se uso el hierro extrinseco anadido (10 mmol/l) para medir la captacion del 25 hierro en este experimento ya que no hay disponible un modo preciso para determinar la captacion de hierro intrinseco. Por tanto, los valores mostrados representan la captacion minima que habria ocurrido en cada producto de digestion, que es una asuncion similar a la hecha en los estudios humanos efectuados por Cook and Bjorn- Rasmussen.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composicion para su uso en el incremento de la absorcion de hierro cuando es ingerida por un ser humano o un animal, comprendiendo dicha composicion hierro y peptidos, en la que:

   (a) los peptidos se obtienen de espinas dorsales y cabezas de salmon hidrolizadas enzimaticamente;

   (b) la composicion es adecuada para ingestion humana o animal; y

   (c) los peptidos son mas de un 50 % de la composicion.

   10 2. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que los pesos moleculares de los peptidos son de 3500

   daltons o inferiores.
2. 3. La composicion para el uso de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el hierro es mas de un 0,01 % de la composicion.

   15
3. 4. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composicion comprende ademas aceite de pescado.
4. 5. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composicion es un 20 complemento dietetico o un aditivo alimentario.
5. 6. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que menos del 50 % de los peptidos estan quelados al hierro.

   25 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento de un ser humano o

   un animal que tienen anemia por deficiencia de hierro o que estan en riesgo de tener anemia por deficiencia de hierro y que no tienen una dieta que este modificada debido a una enfermedad o un trastorno.