ES2606544T3 - Método para provocar la proliferación de células madre mediante la activación de la señalización de Notch - Google Patents

Método para provocar la proliferación de células madre mediante la activación de la señalización de Notch Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para aumentar la proliferación de células madre neurales que comprende una etapa de transfectar dichas células madre neurales con un gen que activa la señalización de Notch y cultivar las células madre neurales, en donde el gen codifica el NICD (Dominio IntraCelular Notch) que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 2, y la célula transfectada muestra una mayor proliferación comparado con la célula no transfectada.

Description

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Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas o trastornos incluyen enfermedades neurodegenerativas, lesiones del sistema nervioso central o disfunciones. Las enfermedades neurodegenerativas incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer u otra demencia, esclerosis múltiple (EM), esquizofrenia, degeneración macular, glaucoma, retinopatía diabética, neuropatía periférica, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Parkinson. Las lesiones del SNC incluyen, por ejemplo, los eventos cerebrovasculares como accidentes cerebrovasculares (por ejemplo, los accidentes cerebrovasculares hemorrágicos, accidentes cerebrovasculares isquémicos focales o accidentes cerebrovasculares isquémicos globales), isquemia ocular y trombosis de los senos de la duramadre; lesiones traumáticas del cerebro o de la médula espinal (por ejemplo, las lesiones causadas por cirugía del cerebro o de la médula espinal o los accidentes físicos); concusión; lesión inducida por drogas (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, drogas recreativas, y neurolépticos); cirugía de revascularización coronaria (CABG); e isquemia en el nacimiento del niño. Las disfunciones del SNC incluyen, por ejemplo, depresión, epilepsia, neurosis y psicosis.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a cualquier manera en la cual se mejoran los síntomas de una enfermedad o se alteran de otro modo de forma beneficiosa. El tratamiento también abarca el retraso del progreso de una enfermedad y la mejora, la paliación y la remisión (parcial o completa) de los síntomas. Además, el tratamiento puede significar una mayor posibilidad de supervivencia en comparación con la ausencia del tratamiento. El tratamiento también abarca medidas profilácticas además de las intervenciones terapéuticas. Los casos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos con enfermedades existentes y aquellos en los que se requiere la prevención. La mejora de las enfermedades significa la mejora o el retraso de los síntomas en comparación con la ausencia de tratamiento.
Se describe en este documento el uso de células madre, en particular células madre neuronales, un gen que activa la ruta de señalización de Notch, por ejemplo, el gen de NICD, para la preparación de un agente terapéutico celular. Las células madre y los efectos de las mismas son como se describen anteriormente.
Las células madre descritas en este documento se administran de una manera que se les permita injertarse o migrar al lugar del tejido deseado y reconstituir o regenerar la zona funcionalmente deficiente. Por ejemplo, las células madre neurales o las células madre de la cresta neural, en las que se introduce el gen de NICD y se activa la ruta de señalización de Notch, pueden ser trasplantadas directamente en los sitios del parénquima o intratecales del sistema nervioso central. Los trasplantes pueden hacerse utilizando una única suspensión o pequeños agregados a una densidad de 1x105 ~ 1,5x105 células por μl. El agente terapéutico celular descrito en este documento se puede administrar a una dosis de 104 ~ 1010 células/cuerpo, y preferiblemente 106 ~ 108 células/cuerpo, una vez o varias veces al día.
Sin embargo, debe entenderse que la dosificación real del ingrediente activo debe ser determinada considerando diversos factores relacionados, incluyendo la enfermedad a tratar, la vía de administración, la edad del paciente, el sexo y el peso, y la gravedad de la enfermedad.
Las células madre descritas en este documento se pueden proporcionar en forma de una composición farmacéutica para la administración en seres humanos. La composición farmacéutica descrita en este documento puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un agente no tóxico para una célula o sujeto que está expuesto a la composición. Los ejemplos del vehículo que se pueden utilizar descritos en este documento incluyen los conocidos en la técnica, incluyendo un agente tampón, un agente conservante, un analgésico, un agente solubilizante, un agente isotónico, una base, un excipiente, un agente lubricante, etc. La composición farmacéutica descrita en este documento se puede preparar en forma de diversas formulaciones de acuerdo con una técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, para preparaciones inyectables, se puede preparar en la forma de ampollas de dosis unitarias o recipientes de dosis múltiples. Para el principio general de las preparaciones medicinales de la composición farmacéutica descrita en este documento, se puede hacer referencia a la literatura conocida.
Además, se describe un método para el tratamiento de tumores, comprendiendo el método administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de células madre, particularmente células madre neurales, en las que la ruta de señalización Notch se activa. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad en la que las células madre descritas en este documento exhiben un efecto terapéutico en el sujeto. Tal como se utiliza en este documento, el término "sujeto" se refiere a mamíferos, particularmente animales, incluyendo seres humanos. El sujeto puede ser un paciente en necesidad de tratamiento. Las células madre descritas en este documento se pueden administrar hasta que se pueda obtener el efecto deseado entre los efectos descritos anteriormente. Además, estas células madre pueden administrarse a través de diferentes rutas de acuerdo con cualquier método convencional conocido en la técnica.
Se describe en este documento el uso de células madre para la preparación de agentes terapéuticos. Las células madre y los efectos de las mismas son como se describen anteriormente.
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madre neurales adultas pueden proliferaron en grandes cantidades para que puedan ser utilizadas como agentes terapéuticos celulares.
Ejemplo 5 comparativo: Construcción del lentivirus recombinante que expresaba c-MET
5- 1: Preparación de un vector viral recombinante
En primer lugar, un gen c-MET de la SEQ ID NO: 5 se amplificó a partir de células madre neurales por RT-PCR. El ARN total se extrajo de las células madre neurales del Ejemplo 1 usando el kit RNeasy (Qiagen), y después se trató con transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) para sintetizar ADNc que se utilizó a continuación como plantilla para la amplificación por PCR. El gen EmGFP (Invitrogen) se amplificó a partir de un vector pLenti6.3/V5-GW/EmGFP (Invitrogen) mediante PCR. Los cebadores utilizados para la amplificación de los dos genes contenían una secuencia CACC con el fin de iniciar la expresión de los aminoácidos en un vector de lentivirus. Específicamente, los cebadores tenían las siguientes secuencias:
Cebador directo: CACCGGTACCATGAAGGCCCCCGCTGTGC (SEQ ID NO: 7)
Cebador inverso: GCGGCCGCCTATGATGTCTCCCAGAAGGAGG (SEQ ID NO: 8)
La reacción de PCR se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min; 15 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min, hibridación a 60°C durante 30 seg, y amplificación a 72°C durante 3 min; amplificación final a 72°C durante 10 min. El producto de la PCR amplificado se clonó en un vector pENTR-D-TOPO (Invitrogen).
También, para la expresión estable del gen introducido en las células madre neurales, la región promotora del gen de la ubiquitina C humana (UbC) se amplificó por PCR a partir de un vector pLenti6/UbC/V5-DEST (Invitrogen). Los cebadores usados en esta amplificación PCR contenían las secuencias de las enzimas de restricción ClaI y SpeI para facilitar la clonación. La región del promotor amplificado anteriormente del gen UbC se clonó en un vector pGEM-T easy (Promega), y después se trató con las enzimas de restricción ClaI y SpeI, obteniendo así un fragmento del gen. Además, la región del promotor CMV de un vector pLenti7.3/V5-DEST (Invitrogen) se eliminó usando las mismas enzimas de restricción, obteniéndose así un fragmento del vector. A continuación, el fragmento del gen y el fragmento del vector fueron tratados con ligasa (Promega), obteniendo de este modo un vector de expresión insertado con el promotor UbC.
Para insertar un gen reportero, el vector se trató con una enzima de restricción KpnI para obtener un fragmento del vector, y un vector pSuper-retro (Oligoengine) se trató con la misma enzima de restricción para obtener un promotor de expresión antibiótico y un fragmento del gen. A continuación, el fragmento del gen y el fragmento del vector fueron tratados con ligasa (Promega), obteniendo de este modo un vector de expresión insertado con el promotor UbC. Los genes cMet y EmGFP se transfirieron al vector de expresión obtenido usando LR clonasa (Invitrogen), obteniendo de este modo un vector de expresión final.
Las estructuras del vector del lentivirus que expresaba c-MET y del vector del lentivirus que expresaba EmGFP preparados como se describe anteriormente se muestran en la figura 6A.
5-2: Preparación del vector lentiviral recombinante que expresa c-MET
Como una línea celular de empaquetamiento del virus, se utilizó la línea celular 293FT (Invitrogen). La línea celular 293FT fue co-transfectada con el vector que sobreexpresaba c-MET, construido en el Ejemplo 2-1, y con tres vectores asociados al empaquetamiento del virus (PLP-1, el PLP-2, y pLP/VSVG; Invitrogen), utilizando reactivo de lipofectamina (Invitrogen), induciendo así la producción del virus. Además, se utilizó el vector recombinante que expresaba EmGFP de la misma manera, lo que induce la producción de VIMS.
La recogida y la valoración de las partículas del lentivirus se realizaron de la misma manera que en los Ejemplos 2-2 y 2-3.
Ejemplo 6 comparativo: Infección de las células madre neurales mediante el lentivirus recombinante que expresa c-MET y selección de la línea celular infectada
Las células madre neurales fueron cultivadas en una placa de 24 pocillos, pretratados con poli-L-ornitina, a una concentración celular de 1x104 células/ml. Las células cultivadas se trataron con 6 g/ml de polibreno (Sigma). A continuación, las células se infectaron con el lentivirus recombinante que expresaba c-MET, preparado en el Ejemplo 2, en 1x103 unidades de transducción (TU).
A las 3 horas después del inicio de la infección, el medio que contenía el virus anterior fue sustituido por un medio fresco para el cultivo de células madre neurales, a continuación, las células se cultivaron durante 12 horas. Después del cultivo, se añadió 1 g/ml del antibiótico puromicina (Sigma) a las células, y la selección por el antibiótico se llevó a cabo durante 5 días.
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Ejemplo 7 comparativo: Examen de las características de las células madre neurales en las que se introduce el gen C-MET
7-1: Examen de las características de las células madre neurales en las que se introduce el gen C-MET
Para la línea de las células madre neuronales transfectadas con el lentivirus recombinante que expresaba c-MET, seleccionado en el Ejemplo 5, las características de las células madre neuronales transfectadas con el gen c-MET se examinaron de la manera que se describe en los Ejemplos 1 y 2.
Como resultado, como se muestra en la figura 6, se expresaron fuertemente Musashi, nestina, Sox2 y CD133, conocidas como proteínas marcadoras específicas de las células madre neurales (Fig. 6B).
7-2: Examen de la capacidad de las células madre neurales con el gen c-MET introducido para diferenciarse
Con el fin de confirmar si las células madre neurales adultas que sobreexpresaban c-MET obtenidas como se describió anteriormente tenían la capacidad de diferenciarse en células neuronales inferiores y si la capacidad de diferenciación se mantenía durante el período de subcultivo, las células se suspendieron en un medio Neurobasal-A (Gibco) o medio DMEM:F12 (Gibco) que contiene FBS, suplemento B27 (Gibco) y suplemento N2 (Gibco), y se cultivaron en una placa de cultivo de células pretratadas con poli-L-ornitina (Sigma) y laminina (Sigma). A continuación, las células se cultivaron durante 1-2 semanas en un cultivo con Neurobasal-A que contenía 10% de FBS (Gibco) o cultivo DMEM:F12 (Gibco) o un medio Neurobasal-A (Gibco) que contiene el factor de crecimiento neuronal (R&D), IBMX y dcAMP, induciendo así la diferenciación de las células. La expresión de proteínas marcadoras específicas de las células neuronales inferiores en las células diferenciadas se analizó mediante inmunohistoquímica de la misma manera que en el Ejemplo 1-3. Como resultado, se encontró que la capacidad de las células para diferenciarse se mantuvo durante el período del subcultivo (Fig. 6C). En la figura 6C, GFAP: un marcador específico de astrocitos; 04: un marcador específico de oligodendrocitos; y Tuji: un marcador específico de neuronas.
7-3: Examen de la capacidad de las células madre neurales con el gen c-MET introducido de proliferar
Para las células madre neuronales transfectadas con el lentivirus recombinante que expresaba c-MET o con el lentivirus recombinante que expresaba EmGFP, seleccionadas en el Ejemplo 5, se añadió HGF a un medio de cultivo celular a una concentración de 10-1.000 μg/ml para cada grupo celular. Entonces, las células se cultivaron en una placa de 24 pocillos, pretratados con poli-L-ornitina, a una concentración celular de 5 x 103 células/ml en un incubador de 5% de CO2 a 37°C. Para medir la capacidad de proliferar de las células, el medio se trató con la misma cantidad del reactivo CCK-8 (Dojindo). Después de 2-4 horas del cultivo de las células, el sobrenadante del cultivo se transfirió a una placa de 96 pocillos, y la absorbancia a una longitud de onda de 460 nm se midió utilizando un lector de placas de micropocillos.
Como resultado, como se muestra en la figura 7-A, la proliferación de las células fue significativamente mayor en la línea celular de que expresaba c-MET que en líneas celulares tipo salvaje y que expresaban EmGFP.
A continuación, se subcultivaron las células madre neurales, mientras que se observó la mismo proliferación. Se contó el número de células proliferadas, y los resultados se muestran en la figura 7-B. Como puede verse en la misma, el número acumulado de células totales fue significativamente mayor en la línea celular de que expresaba c-MET que en el grupo control.
A partir de tales resultados, se pudo ver que la activación de la ruta de señalización de c-MET/HGF aumentó significativamente la capacidad de las células madre neurales adultas a proliferar. Esto sugiere que las células madre neurales adultas pueden proliferar en grandes cantidades para que puedan ser utilizadas como agentes terapéuticos celulares.
En los ejemplos anteriores, las células madre en las que se activó la ruta de señalización de c-Met/HGF se prepararon mediante el tratamiento de las células transfectadas con genes c-Met con el ligando HGF. Sin embargo, será evidente para cualquier persona de experiencia ordinaria en la técnica que las células madre en las que se activa la ruta de señalización de c-Met/HGF se pueden preparar mediante la introducción del gen c-Met y el gen de HGF al mismo tiempo y expresando el gen de HGF en las células. La introducción del gen de HGF se puede lograr utilizando retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus Epstein-Barr, lentivirus o similares, como un vector, de una manera similar a la introducción del gen de c-MET.
Aplicabilidad Industrial
Según la presente invención, como resultado de la activación de la ruta de señalización Notch, pueden ser producidas en grandes cantidades células madre que tienen una excelente capacidad de proliferar. En particular, las células madre neurales que han sido difíciles de cultivar in vitro pueden proliferar en grandes cantidades, y por lo
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