ES2602083T3 - Reactivos de conjugación - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula general:**Fórmula** en la que cada X representa independientemente una cadena polimérica; p representa un número entero de 1 a 6; Y representa un grupo amida; y Z representa o bien -CH.(CH2L)2 o -C(CH2L)(>= CH2), en la que cada L representa independientemente un grupo saliente.

Description

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DESCRIPCION
Reactivos de conjugacion
La presente invencion se refiere a reactivos de conjugacion innovadores para conjugar poUmeros a protemas y peptidos, y a un procedimiento innovador para producir nuevos conjugados.
Numerosas moleculas terapeuticamente activas, por ejemplo, protemas, no poseen las propiedades requeridas para conseguir eficacia en el uso medico clmico. Por ejemplo, numerosas protemas nativas no son buenos medicamentos puesto que tras la administracion a pacientes, existen varios inconvenientes intrmsecos que incluyen: (1) las protemas son digeridas por numerosas endo- y exopeptidasas presentes en sangre o tejidos; (2) casi todas las protemas son inmunogenicas en cierta medida; y (3) las protemas pueden excretarse rapidamente por ultrafiltracion renal y por endocitosis. Algunas moleculas que podnan encontrar utilidad como agentes terapeuticos activos en medicamentos son sistemicamente toxicas o carecen de biodisponibilidad y farmacocinetica optimas. Cuando las protemas se depuran de la circulacion sangumea, por lo general, estas tienen que administrarse con frecuencia rapidamente al paciente. La administracion frecuente aumenta aun mas el riesgo de toxicidad, en especial toxicidades inmunologicamente derivadas. A menudo, resulta diffcil conseguir una dosis terapeuticamente eficaz, por lo que la eficacia se ve comprometida. Por lo tanto, la rapida depuracion es un problema de eficacia y un problema de seguridad.
Los polfmeros sinteticos solubles en agua, en particular, polialquilenglicoles, son ampliamente utilizados para conjugar moleculas terapeuticamente activas, tales como protemas. Estos conjugados terapeuticos han demostrado que alteran la farmacocinetica favorable al prolongar el tiempo de circulacion y disminuir la velocidad de depuracion, disminuir la toxicidad sistemica, y en varios casos, muestran una mayor eficacia clmica. El procedimiento para conjugar covalentemente polietilenglicol, PEG, a protemas se conoce comunmente como "PEGilacion".
Es importante para la eficacia optimizada y para asegurar la consistencia dosis a dosis que el numero de moleculas polimericas conjugadas por protema sea identico para cada molecula, y que cada molecula polimerica se conjugue espedficamente de modo covalente al mismo resto de aminoacido en cada molecula de protema. La conjugacion no espedfica en sitios en una molecula de protema da como resultado una distribucion de productos de conjugacion y, frecuentemente, una protema no conjugada, que produce una mezcla compleja que resulta difmil y costosa de purificar.
El documento WO 2005/007197 describe una serie de reactivos de conjugacion innovadores que pueden utilizarse para reaccionar con grupos nucleofilos en una protema produciendo un conjugado de protema-polfmero. Estos reactivos encuentran utilidad particular por su capacidad para conjugarse con atomos de azufre obtenidos a partir de un enlace disulfuro en una protema proporcionando conjugados de tioeter, y asimismo pueden utilizarse para conjugarse con otros nucleofilos, por ejemplo, con dos residuos de histidina, por ejemplo, dos residuos de histidina presentes en una etiqueta de polihistidina unida a una protema, segun se describe en el documento WO 2009/047500.
Para algunos usos, es deseable conjugar dos cadenas polimericas a una protema, ya que las propiedades estericas de un conjugado que contiene una cadena sencilla de un peso molecular dado pueden ser significativamente diferentes de las propiedades de un conjugado que contiene, por ejemplo, dos cadenas, teniendo cada una de estas la mitad de su peso molecular. Se conocen reactivos capaces de dicha conjugacion. En consecuencia, por ejemplo, el documento US 5.932.462 (Harris) divulga reactivos capaces de conjugar dos cadenas de PEG a protemas. Cong y col., Bioconjugate Chemistry 23 (2012), pags. 248-263), divulgan asimismo un reactivo capaz de conjugar dos cadenas de PEG a protemas, espedficamente, el reactivo PEG-bis-sulfona se muestra como reactivo 3 de la Fig. 1, pag. 249. En el reactivo de Cong, dos cadenas de PEG se unen a posiciones diferentes en un grupo fenilo que actua como enlazador al grupo que reacciona con la protema funcional del reactivo. El reactivo de Cong es capaz de conjugar dos cadenas de PEG, por ejemplo, a dos atomos de azufre obtenidos a partir de un enlace disulfuro en una protema, o dos residuos de histidina presentes en una etiqueta de polihistidina unida a una protema, que proporciona conjugacion mejorada en comparacion con los reactivos de Harris.
Los inventores han descubierto un reactivo innovador capaz de conjugar dos cadenas polimericas a una protema, que muestra propiedades mejoradas sobre el reactivo conocido de Cong.
En conformidad, la presente invencion proporciona un compuesto de formula general:
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en la que cada X representa independientemente una cadena polimerica; p representa un numero entero de 1 a 6; Y representa un grupo amida; y Z representa o bien -CH.(CH2L)2 o -C(CH2L)(=CH2), en el que cada L representa
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independientemente un grupo saliente.
Los reactivos de formula I contienen dos cadenas polimericas X. Cada poUmero X puede ser, por ejemplo un poli(alquilenglicol), una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, por ejemplo poli(acriloil morfolina), un polimetacrilato, una polioxazolina, un alcohol polivimlico, una poliacrilamida o polimetacrilamida, por ejemplo, policarboximetacrilamida, o un copoUmero de HPMA. Adicionalmente, el polfmero puede ser uno que es susceptible a la degradacion enzimatica o hidrolftica. Dichos poKmeros, por ejemplo, incluyen poliesteres, poliacetales, poli(ortoesteres), policarbonatos, poli(iminocarbonatos), y poliamidas, tales como poli(aminoacidos). Un poKmero puede ser un homopolfmero, un copoUmero aleatorio o un copolfmero estructuralmente definido como un copolfmero en bloque. Por ejemplo, puede ser un copolfmero, por ejemplo un copolfmero en bloque, obtenido a partir de dos o mas oxidos de alquileno, o de poli(oxido de alquileno) y, o bien un poliester, poliacetal, poli(ortoester), o un poli(aminoacido). Los denominados Pluronics son una clase importante de copolfmeros en bloque de PEG. Estos se obtienen a partir de bloques de oxido de etileno y oxido de propileno. Los polfmeros polifuncionales que pueden utilizarse incluyen copolfmeros de divinileter anhndrido maleico y estireno anhndrido maleico.
Igualmente pueden utilizarse polfmeros presentes de forma natural, por ejemplo polisacaridos, tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidon, celulosa, glicogeno, poli(acido siaKlico) y derivados de los mismos. Una protema puede utilizarse como el polfmero. Esto permite la conjugacion de una protema, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, a una segunda protema, por ejemplo una enzima u otra protema activa. Ademas, si se utiliza un peptido que contiene una secuencia catalftica, por ejemplo, un sitio aceptor de O-glicano para glicosiltransferasa, se permite la incorporacion de un sustrato o una diana para la reaccion enzimatica posterior. Poli(aminoacido)s, tales como acido poliglutamico o poliglicina tambien puede utilizarse, al igual que polfmeros hnbridos obtenidos a partir de monomeros naturales, tales como sacaridos o aminoacidos y monomeros sinteticos, tales como oxido de etileno o acido metacnlico.
Preferentemente, cada polfmero utilizado en la presente invencion es un polfmero sintetico hidrofilo o soluble en agua. Si un polfmero es un poli(alquilenglicol), este es preferentemente uno que contiene unidades C2 y/o C3, y es en concreto un poli(etilenglicol) (PEG). Excepto cuando el contexto requiera lo contrario, cualquier referencia a un polfmero en la presente memoria descriptiva ha de entenderse como la inclusion de una referencia espedfica a PEG.
Un polfmero puede estar opcionalmente derivatizado o funcionalizado en cualquier forma deseada. Los grupos reactivos pueden estar vinculados al extremo terminal del polfmero o al grupo terminal, o en la cadena polimerica por enlazadores colgantes; en tales casos, el polfmero es, por ejemplo, una poliacrilamida, polimetacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato, o un copolfmero de antndrido maleico. Tales polfmeros funcionalizados ofrecen una oportunidad adicional para preparar conjugados multimericos (es decir, conjugados en los que el polfmero se conjuga a mas de una molecula). Por ejemplo, un polfmero puede llevar una o mas moleculas de farmaco a cualquier punto a lo largo de su longitud, por ejemplo a su extremo terminal. Si se desea, el polfmero puede acoplarse a un soporte solido utilizando procedimientos convencionales.
Las dos cadenas polimericas X pueden ser identicas o diferentes. Espedficamente, cada X puede representar el mismo polfmero qrnmico, o un polfmero qrnmico diferente. Por ejemplo, cada X puede representar una cadena de PEG, o una X puede representar una cadena de PEG y la otra X puede representar un polfmero diferente, por ejemplo un PVP o una cadena proteica.
Cada polfmero X puede contener una cadena lineal simple, o puede poseer morfologfa ramificada compuesta por numerosas cadenas pequenas o grandes. En general, una cadena polimerica se inicia o termina por medio de un grupo terminal adecuado, y se conecta al otro extremo de la cadena en el resto de la molecula de formula I. Por ejemplo, una cadena de pEg puede poseer un grupo terminal seleccionado entre alcoxi, por ejemplo, metoxi, ariloxi, carboxi o hidroxilo. Cuando se ramifica la cadena, cada extremo terminal de rama libre contendra el grupo terminal.
Cada cadena polimerica X puede poseer cualquier peso molecular adecuado, y cada cadena polimerica X puede poseer un peso molecular identico o diferente al igual que la otra. Por ejemplo, cada cadena puede poseer un peso molecular de al menos 5, 10, 15, 20, 30, o 40 kDa. Generalmente, el peso molecular maximo preferente de cada cadena es 60 kDa. Cuando un conjugado tiene por objeto dejar la circulacion y penetrar en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de la inflamacion causada por cancer, infeccion o enfermedad autoinmunitaria, o por traumatismo, puede resultar ventajoso utilizar un conjugado en el que el peso molecular total de los polfmeros (X + X) se encuentre en el intervalo de 2.000-30.000 g/mol. Para aplicaciones en las que el conjugado tiene por objeto permanecer en la circulacion puede resultar ventajoso utilizar un peso molecular total mayor de polfmero, por ejemplo en el intervalo de 20.000-75.000 g/mol.
P representa un numero entero de 1 a 6, por ejemplo 1, 2 o, especialmente, 3.
Los reactivos de la presente invencion contienen un grupo amida, Y, conforme se dibuja en la formula I, puede ser - CO-NR'- o, preferentemente, -NR'-CO-, en el que R' representa un grupo alquilo C1-4, por ejemplo un grupo metilo, o, especialmente, un atomo de hidrogeno. Este grupo puede vincularse al grupo fenilo mostrado en la formula I en cualquier posicion, pero se halla preferentemente en la posicion para con respecto al grupo -CO.Z. El grupo fenilo de
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formula I puede llevar, si se desea, sustituyentes adicionales, aunque no esta sustituido preferentemente.
Un grupo saliente L puede representar, por ejemplo -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, o -O0, en el que R posee el significado dado anteriormente, y 0 representa un arilo sustituido, especialmente un grupo fenilo que contiene al menos un sustituyente aceptor de electrones, por ejemplo -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, - COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NRCO2R, -NO, -NHOH, -NROH,- C=N-NHCOR, -C=N-NRCOR, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, por ejemplo cloro o, especialmente, bromo o yodo, - C=CR, -C=CR2 y -C=CHR, en el que cada R posee independientemente uno de los significados dados anteriormente. Los grupos alquilo o aril sulfonilo son particularmente grupos salientes preferentes, con fenilsulfonilo o, en especial, tosilo, siendo especialmente preferente. Cuando dos Ls estan presentes, estas pueden ser grupos diferentes, pero preferentemente forman parte del mismo grupo.
Excepto cuando se indique lo contrario, los sustituyentes que pueden estar presentes en cualquier arilo opcionalmente sustituido, por ejemplo grupo fenilo o heteroarilo presente en un compuesto de formula I incluyen, por ejemplo, uno o mas de los sustituyentes identicos o diferentes seleccionados entre alquilo (preferentemente alquilo C1-4, especialmente metilo, opcionalmente sustituido con OH o CO2H), -CN, -NO2, CO2R, -CoH, -CH2OH, -COR, - OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, - NHCOR, -NRCOR, NHCO2R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N- NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, por ejemplo fluor o cloro, -CeCR, -C=CR2 y - C=CHR, en el que cada R posee independientemente uno de los significados dados anteriormente. Los sustituyentes preferentes, si estan presentes, incluyen, por ejemplo CN, NO2, -OR, -OCOR, -SR, -NHCOR, - NR.COR, -NHOH y -NR.COR.
Reactivos especialmente preferentes segun la invention poseen las formulas:
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imagen3
o
En estos reactivos, X es preferentemente polietilenglicol, especialmente polietilenglicol terminado en metoxi, es decir, CH3O-(CH2CH2O)m - en el que m es el numero de unidades de oxido de etileno en el PEG. Ademas, en estos reactivos, cada L es preferentemente un grupo tosilo, en consecuencia:
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Los compuestos de formula I pueden utilizarse para la conjugacion a una protema o peptido. Para mayor comodidad, el termino "protema" se utilizara en toda la presente memoria descriptiva, y salvo que el contexto requiera lo contrario, el uso del termino "protema" ha de entenderse como inclusive de una referencia al peptido.
Por consiguiente, la invencion proporciona ademas un procedimiento de preparacion de un conjugado poKmero, que comprende reaccionar un compuesto de formula general I con una protema o un peptido. Los conjugados resultantes poseen la formula general:
X
X—C H2—C H-C H2—O—(CH2)p—Y
en la que X, p e Y poseen los significados dados anteriormente, y, o bien cada Pr1 y Pr2 representa una molecula de protema o un peptido distinta, o bien Pr1 y Pr2 representan conjuntamente una unica protema o un peptido unico Pr unido en dos puntos distintos, en consecuencia:
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imagen7
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Preferentemente Pr y Pr representan conjuntamente una unica protema unida a dos atomos de azufre obtenidos a partir de un enlace disulfuro en una protema, o a dos residuos de histidina presentes en una etiqueta de polihistidina unida a una protema (es decir, los conjugados resultantes poseen la formula general IV (a)).
En el reactivo de formula I, Z representa o bien -CH.(CH2L)2 o -C(CH2L)(=CH2). Estos dos grupos son qmmicamente equivalentes entre sf. Si un reactivo de formula I en la que Z representa -CH.(CH2L)2, es decir, un reactivo de formula la:
imagen8
se utiliza para reaccionar con una protema en un procedimiento de acuerdo con la invencion, la reaccion continua por la perdida de un grupo saliente L, y la formacion resultante de un reactivo de formula I en la que Z representa - C(CH2L)(=CH2), es decir, un reactivo de formula lb:
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Este reactivo reacciona con un nucleofilo, por ejemplo un residuo de cistema, histidina o lisina, en la protema. Posteriormente, el grupo saliente L restante se pierde, y la reaccion con un segundo nucleofilo (ya sea en una segunda molecula de protema o en la misma molecula de protema al igual que el primer nucleofilo) se produce para formar el conjugado deseado. Por lo tanto, el procedimiento de la invencion puede llevarse a cabo utilizando un
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compuesto de formula la como material de partida, en cuyo caso se forma in situ un compuesto de formula lb, o puede utilizarse un compuesto preformado de formula lb como material de partida.
La reaccion de conjugacion de acuerdo con la invencion puede llevarse a cabo en las condiciones de reaccion descritas en los documentos WO 2005/007197 y WO 2009/047500. El procedimiento puede llevarse a cabo por ejemplo en un disolvente o mezcla de disolvente en la cual todos los reactivos son solubles. Por ejemplo, la protema puede dejarse reaccionar directamente con el reactivo de conjugacion polimerica en un medio de reaccion acuoso. Este medio de reaccion tambien puede ser tamponado, dependiendo de los requisitos de pH del nucleofilo. El pH optimo para la reaccion sera generalmente de al menos 4,5, generalmente entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,5, de manera preferente aproximadamente 6,0 a 7,5. Las condiciones de reaccion optimas dependeran por supuesto de los reactivos espedficos empleados.
Las temperaturas de reaccion comprendidas entre 3-37 °C son generalmente adecuadas cuando se utiliza un medio de reaccion acuoso. Las reacciones llevadas a cabo en medios organicos (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona), se llevan a cabo, en general, a temperaturas que oscilan hasta temperatura ambiente.
Cuando la union a la protema se realiza a traves de dos atomos de azufre obtenidos a partir de un enlace disulfuro en la protema, el procedimiento puede llevarse a cabo reduciendo el siguiente enlace disulfuro in situ en el cual el producto reducido reacciona con el reactivo de formula I. Preferentemente, el enlace disulfuro se reduce y se elimina cualquier exceso de agente reductor, por ejemplo por cambio del tampon, antes de introducir el reactivo de conjugacion. El disulfuro puede reducirse, por ejemplo, con ditiotreitol, mercaptoetanol o tris-carboxietilfosfina utilizando procedimientos convencionales.
La protema puede conjugarse eficazmente utilizando un equivalente estequiometrico o un ligero exceso de reactivo de conjugacion I. No obstante, tambien es posible llevar a cabo la reaccion de conjugacion con un exceso de estequiometna del reactivo de conjugacion, y esto puede ser deseable para algunas protemas. El exceso de reactivo puede eliminarse facilmente, por ejemplo por cromatograffa de intercambio ionico, durante la purificacion posterior del conjugado.
Los compuestos de formula general I, en la que Z representa -CH.(CH2L)2 pueden prepararse por cualquier reaccion de un compuesto de formula general I
X
I
X—C H 2—C H-C H 2-0—(CH2)p—NH 2
(III)
con un compuesto de formula general
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o reaccionando un compuesto de formula general
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con un compuesto de formula general
imagen12
Z
En ambos casos, se forma un grupo amida. Como se conoce adecuadamente en la materia, el grupo CO2H que se hace reaccionar para formar el grupo amida, se activa adecuadamente para facilitar la reaccion, por ejemplo por formacion de un ester activo, un cloruro de acilo, o un anlddrido, o directamente con amina mediante un agente de activacion, tal como una carbodiimida.
5 Como se ha explicado previamente, los compuestos de formula general I en la que Z representa -C(CH2L)(=CH2) pueden prepararse eliminando un grupo saliente L a partir del compuesto correspondiente de formula general I en la que Z representa un grupo -CH.(CH2L)2.
El producto inmediato del procedimiento de acuerdo con la invencion es un conjugado que aun contiene el grupo ceto CO unido al anillo fenilo en la formula I, es decir, un conjugado de formula II, especialmente Ila, anterior. Sin 10 embargo, el procedimiento de la invencion es reversible en condiciones adecuadas. Esto puede ser deseable en algunas aplicaciones, por ejemplo, en aquellas en las que se requiere una rapida liberacion de la protema, pero en otras aplicaciones, la liberacion rapida de la protema puede no ser deseable. Por lo tanto, puede ser deseable estabilizar los conjugados reduciendo el grupo ceto para dar un resto que previene la liberacion de la protema, generalmente un grupo hidroxilo OH, aunque la aminacion reductora tambien es una posibilidad, al dar un grupo 15 amina CH.NH2, CH.NHR o CH.NR2, en el que cada R posee independientemente el significado dado anteriormente. Si se desea, estos grupos pueden reaccionar adicionalmente, por ejemplo un grupo hidroxi puede convertirse en un grupo eter CH.OR por reaccion con un agente de eterificacion; un grupo ester cH.O.C(O)R puede obtenerse por la reaccion de un grupo hidroxi con un agente de acilacion; o una amida CH.NHC(O)R o CH.N(C(O)R)2 puede formarse por acilacion de una amina. Por consiguiente, el procedimiento segun la invencion puede comprender la etapa 20 adicional de reducir el grupo ceto en el conjugado. Se prefiere particularmente el uso de un borohidruro, por ejemplo borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borohidruro de potasio o triacetoxiborohidruro de sodio, como agente reductor. Otros agentes reductores que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo cloruro de estano (II), alcoxidos, tales como alcoxido de aluminio, e hidruro de litio y aluminio.
Los conjugados que pueden prepararse por el procedimiento de la presente invencion son innovadores, y por lo 25 tanto forman parte de la presente invencion per se. Los conjugados innovadores de acuerdo con la presente invencion poseen la formula general:
imagen13
en la que X, p e Y poseen los significados dados anteriormente, A representa un grupo CO, CHOH, CH.NH2, CH.NHR, CH.NR2, CH.OR CH.O.C(O)R, CH.NHC(O)R, o CH.N(C(O)R)2, en el que cada R posee el significado dado 30 anteriormente, y, o bien cada Pr1 y Pr2 representa una molecula de protema o peptido distinta o bien tanto Pr1 como Pr2 representan conjuntamente una unica protema o un peptido unico unido a dos puntos distintos. Los conjugados preferentes poseen la formula general:
imagen14
en la que X, p, Y y A poseen los significados dados anteriormente, y Pr representa una protema unica o un peptido 35 unico unido a dos puntos distintos.
Por supuesto, es posible conjugar mas de un reactivo de conjugacion de formula I a una protema, en la que la protema contiene suficientes puntos de fijacion adecuados. Por ejemplo, en una protema que contiene dos enlaces disulfuro diferentes, o en una protema que contiene un enlace disulfuro y tambien lleva una etiqueta de polihistidina, es posible conjugar dos moleculas del reactivo de formula I por molecula de protema.
40 Las protemas adecuadas que pueden conjugarse con el procedimiento de la invencion incluyen, por ejemplo peptidos, polipeptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, enzimas, citoquinas, quimiocinas, receptores, factores sangumeos, hormonas peptfdicas, toxinas, protemas de transcripcion, o protemas multimericas.
A continuacion se detallan algunas protemas espedficas que pueden conjugarse utilizando la presente invencion. Las enzimas incluyen enzimas espedficas de carbohidratos, enzimas proteolfticas y similares, por ejemplo, las 45 oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas divulgadas en el documento US 4.179.337. Enzimas espedficas de interes incluyen asparaginasa, arginasa, adenosina desaminasa, superoxido dismutasa, catalasa, quimotripsina, lipasa, uricasa, bilirrubina oxidasa, glucosa oxidasa, glucuronidasa, galactosidasa,
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glucocerebrosidasa, glucuronidasa, y glutaminasa.
Las protemas sangumeas incluyen albumina, transferrina, Factor VII, Factor VIII o Factor IX, factor de von Willebrand, insulina, HACT, glucagen, somatostatina, somatotropinas, timosina, hormona paratiroidea, hormonas pigmentarias, somatomedinas, eritropoyetina, hormona luteinizante, factores de liberacion hipotalamicos, hormonas antidiureticas, prolactina, interleucinas, interferones, por ejemplo IFN-a o IFN-p, factores estimulantes de colonias, hemoglobina, citoquinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, gonadotropina corionica, hormona estimulante del folmulo, hormona estimulante del tiroides y activador del plasminogeno tisular.
Otras protemas de interes son las protemas alergenas divulgadas por Dreborg y col. Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315-365 ya que tienen una alergenicidad reducida cuando se conjugan con un polfmero, tal como poli(oxido de alquileno) y por ello, son adecuadas para su uso como inductores de tolerancia. Entre los alergenos divulgados se encuentran el antfgeno E de ambrosia, veneno de abeja, alergenos de acaros y similares.
Son de interes glicopolipeptidos, tales como inmunoglobulinas, ovoalbumina, lipasa, glucocerebrosidasa, lectinas, activador del plasminogeno tisular e interleucinas glicosiladas, interferones y factores estimulantes de colonias, asf como inmunoglobulinas, como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas.
Son de particular interes protemas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de union al receptor y al ligando utilizados en medicina clmica con fines de diagnostico y terapeuticos. El anticuerpo puede utilizarse solo o puede conjugarse ("cargarse") covalentemente con otro atomo o molecula, tal como un radioisotopo o un farmaco citotoxico/antiinfeccioso. Para la vacunacion pueden utilizarse epttopos para producir un conjugado de polfmero inmunogenico-protema.
Protemas particularmente preferentes incluyen fragmentos de anticuerpos, por ejemplo fragmento Fab de IgG, e interferones, tales como IFN-a, IFN-p e IFN de consenso.
La protema puede derivatizarse o funcionalizarse, si se desea. En particular, antes de la conjugacion, la protema, por ejemplo, una protema nativa, puede haberse hecho reaccionar con varios grupos de bloqueo para proteger grupos sensibles al respecto; o puede haberse conjugado previamente con uno o mas polfmeros u otras moleculas, bien mediante el procedimiento de la presente invencion o bien utilizando un procedimiento alternativo. En una realizacion preferente de la invencion, se contiene una etiqueta de polihistidina, que puede orientarse selectivamente por el reactivo de conjugacion de acuerdo con la invencion.
La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende un conjugado de acuerdo con la invencion junto con un transportador farmaceuticamente aceptable, y tambien contiene opcionalmente un principio activo adicional ademas del conjugado de acuerdo con la invencion; un conjugado de acuerdo con la invencion para su uso en terapia; y el uso de un conjugado de acuerdo con la invencion en un procedimiento para la fabricacion de un medicamento. La invencion encuentra utilidad en un procedimiento para tratar un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad farmaceuticamente eficaz de un conjugado o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion.
Se ha descubierto que los reactivos de conjugacion de la presente invencion son extremadamente utiles, son capaces de una conjugacion espedfica muy eficiente en el sitio con respecto a las protemas, los conjugados resultantes innovadores demuestran un alto nivel de estabilidad. Como se ilustra en los ejemplos siguientes, se obtiene eficacia mejorada de manera espectacular en el reactivo conocido comparable de Cong y col, Bioconjugate Chemistry 23 (2012), pags. 248-263.
Los dibujos adjuntos ilustran los resultados obtenidos en los siguientes Ejemplos:
La Figura 1 ilustra el gel de SDS-PAGE obtenido en el Ejemplo 2.
Las Figuras 2, 3 y 4 ilustran los geles de SDS-PAGE obtenidos en el Ejemplo 3.
La Figura 5 ilustra el gel SDS-PAGE obtenido en el Ejemplo 4.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invencion.
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Ejemplo 1: Preparacion del reactivo de PEG 1
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La amina de PEG bifurcado 3 de 40 (2x20) kDa (MPEG es CH3O.CH2CH2O)m-) se adquirio en NOF CORPORATION (SUNBRIGHT GL2-400 PA, lote: M7D902). El ester NHS del acido 4-[2,2-b/s[(p-toMlsulfonil)metil] acetil]benzoico, 4 se preparo de acuerdo con Brocchini y col. Nat. Protoc. 2006, 1(4), 2241-2252.
A un matraz de fondo redondo de una boca que contiene una barra de agitacion magnetica, se anadio la amina de PEG bifurcado 3 (300 mg) y tolueno (8 ml). La solucion homogenea resultante se evaporo a presion reducida utilizando un evaporador rotatorio durante 2 h para formar un residuo solido. El residuo se disolvio en diclorometano (15 ml), el matraz se sello con un septum y la mezcla se agito en atmosfera de argon. A la solucion se anadio un enlazador activado 4 (27 mg), el matraz se volvio a sellar con un septum y la reaccion se agito a ta durante la noche. El septum se elimino y la porcion volatil se elimino por evaporacion a presion reducida utilizando un evaporador rotatorio. Se anadio acetona (20 ml) al residuo y el solido se disolvio con calentamiento moderado (30 °C). La solucion resultante se filtro a traves de un algodon hidrofilo no absorbente en un tubo Falcon de 50 ml. El enfriamiento de la solucion en un bano de hielo seco dio como resultado un precipitado denso. La centrifugacion (9 °C, 4.000 rpm) durante 30 min sedimento el precipitado. El sobrenadante se decanto y el sedimento se disolvio de nuevo en acetona (20 ml) a 30 °C. La precipitacion, sedimentacion y decantacion se realizaron como se ha descrito previamente. Un tercer ciclo de precipitacion y sedimentacion con acetona se llevo a cabo y tras haber decantado el sobrenadante, el sedimento se congelo a -80 °C y a continuacion se seco hasta una masa constante a alto vacfo para dar el reactivo de PEG 1 como un solido blanquecino (227 mg). RMN 1H (CDCI3): 6 (ppm) 2,49 (s, 6H), 3,38 (s, 6H), 3,45-3,86 (m), 4,33 (m, 1H), 7,36 (AA'BB', 4H), 7,64 (AA'BB', 2H), 7,68 (AA'BB', 4H), 7,83 (AA'BB', 2H).
Ejemplo 2: Comparacion de la reactividad de los reactivos de PEG 1 y 2 con un fragmento Fab de IgG humana
En este ejemplo, el reactivo de PEG 1 del Ejemplo 1 se comparo con el siguiente reactivo, el reactivo de PEG 2, en el cual mPeG es CH3O.(CH2CH2O)m-1-CH2CH2-, de Cong y col, supra.:
imagen16
Una solucion de fragmento Fab de IgG humana, (4,0 mg, 0,909 ml), Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. n.° 009-000-007)) se diluyo en 4,95 ml con 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA). A la solucion del fragmento Fab, se anadio DTT 1,0 M (50 pl) para dar una concentracion final de DTT de 10 mM con el fin de reducir el enlace disulfuro intercatenario para que se produzca de este modo la PEGilacion. La solucion resultante se mezclo moderadamente y a continuacion se dejo a 4 °C durante 1 h. La solucion de Fab reducida era el tampon cambiado en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de
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NaCI y 20 mM de EDTA) que utiliza columnas de desalacion PD-10. La solucion Fab reducida se dividira en partes iguales en dos porciones (3,5 ml, ~2 mg). Dos reactivos de PEG: el reactivo de PEG 1 y el reactivo de PEG 2, se disolvieron en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA) en 20 mg/ml. A la primera porcion de la solucion Fab, se anadio reactivo de PEG 1 (75 pl, 1,5 mg) y a la segunda porcion de la solucion Fab, se anadio el reactivo de PEG 2 (75 pl, 1,5 mg). Ambas reacciones se mezclaron moderadamente y despues se dejaron a 4 °C durante 20 h. Tras un periodo de 20 h, las mezclas de reaccion cruda se analizaron por SDS-PAGE. El gel se tino con InstantBlue™ y la imagen se capto empleando un aparato IMAGEQUANT™ LAS 4010. El resultado se muestra en la Figura 1. En la Figura 1, el carril M indica niveles proteicos de Novex; el carril 1 indica el fragmento Fab de IgG humana, el carril 2 indica el producto PEGilado del reactivo de PEG 2 a las 20 h; y el carril 3 indica el producto PEGilado del reactivo de PEG 1 a las 20 h. A partir del analisis por SDS-PAGE, se puede observar que, mientras los dos reactivos de PEG 1 y 2 se conjugaron con exito al fragmento Fab, la eficacia de la conjugacion para el reactivo de PEG 1 era del 26 %, mas del doble de la del reactivo de PEG 2 (10 %).
Ejemplo 3: Comparaciones de estabilidad de conjugados de IFN a-2a preparados con reactivos de PEG 1 y 2.
Preparacion de conjugados: Una solucion de IFN a-2a (6,5 mg, 0,845 mg/ml) se preparo en 50 mM de tampon fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA). La solucion de protema se diluyo con tampon (313 jl) y despues se anadio 1,0 mM de una solucion de DTT en agua (187,5 ml) para dar una concentracion de DTT final de 25 mM y un volumen de reaccion de 7,5 ml. Una vez realizado el mezclado suave, la reaccion se dejo a temperatura ambiente durante 30 min. La protema reducida era tampon cambiado en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA) que utiliza columnas PD-10. La solucion de protema eluida se centrifugo (3.000 g, 4 °C, 5 min) y luego el sobrenadante se cuantifico por mediciones de absorbancia de rayos UV a 280 nm (0,532 mg/ml). La solucion de protema se diluyo a 0,10 mg/ml con tampon. PEGs 1 y 2 se disolvieron en 20 mg/ml en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 (que contiene 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA). Dos viales se cargaron cada uno con IFN a-2a reducido (2,5 mg, 24,8 ml); se anadio al primer vial el reactivo de PEG 1 (4,9 mg, 0,245 ml), y se anadio al segundo vial el reactivo de PEG 2 (4,9 mg, 0,245 ml). Las reacciones se mezclaron moderadamente y luego se dejaron a 4 °C durante 18 h. Cualquier protema reducida en las mezclas de reaccion final se oxido mediante la adicion secuencial de 5 mg/ml de sulfato de cobre (12,18 jl) y a continuacion 50:50 (mM) de GSH/GSSG (0,25 ml). La reaccion de reoxidacion se llevo a cabo a 4 °C durante la noche. Las mezclas de reaccion se diluyeron x4 con 100 mM de acetato de sodio, pH 4 y despues se purificaron por cromatograffa de intercambio cationico (Macrocap™ SP) utilizando una elucion en gradiente escalonado de 100 mM de acetato de sodio, pH 4 (NaCl 1,0 M) con los conjugados deseados eluyendose a NaCl 0,60-0,65 M.
Comparacion de estabilidad 1. Pruebas de resistencia para conjugados de IFN a-2a preparados con reactivos de PEG 1 y 2: Para cada una de las muestras de IFN a-2a PEGiladas con 1 y 2 (TFS esterilizado por filtracion), se prepararon cuatro viales. Cada vial se cargo con 20 jl de conjugado en una concentracion de 200 jg/ml. Dos viales de cada una de las muestras de ensayo conteman 10 mM de DTT. Un vial con DTT y un vial sin DDT se calentaron a 50 °C durante 1 h. Los viales restantes se calentaron a 90 °C durante 10 min. Las muestras (junto con la protema no conjugada y el conjugado sin resistencia) se analizaron por SDS-PAGE - los geles se tineron con InstantBlue™, la imagen se capto utilizando un aparato IMAGEQUANT™ LAS 4010 y los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3 para PEG 1 -IFN a-2a y PEG 2-IFN a-2a, respectivamente. En las Figuras 2 y 3, el carril M indica niveles de protema de Novex; el carril 1 indica un IFN a-2a; el carril 2 indica PEG-IFN a-2a; el carril 3 indica PEG-IFN a-2a, - 50 °C, 1 h; el carril 4 indica PEG-IFN a-2a, - 50 °C, DTT, 1 h; el carril 5 indica PEG-IFN a-2a, - 90 °C, DTT, 10 min; y el carril 6 indica PEG-IFN a-2a, - 90 °C, DTT, 10 min.
Las Figuras 2 y 3 muestran que los dos conjugados ensayados eran estables a 50 °C durante 1 h. Sin embargo, tras calentarlos a 50 °C durante 1 h en presencia de 10 mM de DTT, se observa mucha mas protema libre y agregacion para el conjugado preparado con el reactivo de PEG 2. La tension termica a 90 °C durante 10 minutos dio lugar a la liberacion de la protema libre para el conjugado PEGilado con 2, pero no para el conjugado PEGilado con 1.
Comparacion de estabilidad 2. Estudios de estabilidad acelerada, d^a 28, 40 °C, para conjugados de IFN a-2a PEGilados con reactivos de PEG 1 y 2. Las soluciones de las dos muestras de ensayo se prepararon en TFS esterilizado por filtracion (que contiene NaN3 al 0,01 % (p/v)) en una concentracion de protema de 200 jg/ml. Para cada PEG 1 -IFN a-2a y PEG 2-IFN a-2a, se cargaron cuatro viales con 100 pl de muestra de ensayo. Un vial de cada muestra se congelo inmediatamente a -80 °C (t = 0 dfas). Los tres restantes se sellaron con parafilm® y a continuacion se almacenaron a 40 °C. A los 7, 14 y 28 dfas se retiro una muestra de almacenamiento y se congelo a -80 °C hasta la complecion del estudio. Las muestras de ensayo se descongelaron rapidamente en un bano de agua regulado por un termostato a 37 °C y se analizaron por SDS-PAGE (tenidas con InstantBlue™ e imagenes captadas utilizando un aparato IMAGEQUANT™ LAS 4010) y el resultado se muestra en la Figura 4, en la cual el carril M indica niveles de protema de Novex; el carril 1 indica IFN a-2a (1 jg); el carril 2 indica PEG 2-IFN a-2a, dfa 0; el carril 3 indica PeG 2-IFN a-2a, dfa 7; el carril 4 indica PEG 2-IFN a-2a, dfa 14; el carril 5 indica PEG 2-IFN a-2a, dfa 28; el carril 6 indica PEG 1 -IFN a-2a,dfa 0; el carril 7 indica PEG 1 -IFN a-2a, dfa 7; el carril 8 indica PEG 1-IFN a-2a, dfa 14; el carril 9 indica PEG 1-IFN a-2a, dfa 28. En la Figura 4, puede apreciarse claramente que PEG 2-IFN a-2a es menos estable que PEG 1-IFN a-2a con mas protema libre y menos conjugado restante en cada intervalo de tiempo.
Ejemplo 4: Conjugacion de IFN-p-1b con el reactivo de PEG 1.
Al IFN-p-1b reducido con disulfuro (9,5 mg, 0,3 mg/ml), en pH 7,3, se anadio una solucion de reactivo de PEG 1 (1,7 ml, 20 mg/ml) en pH 7,3. La solucion resultante se dejo incubar a 22 °C durante 4 h, con lo cual la mezcla de reaccion cruda se analizo por SDS-PAGE. El gel se tino con InstantBlue™ y la imagen se capto utilizando un 5 aparato IMAGEQUANT™ LAS 4010. El resultado se muestra en la Figura 5. En la Figura 5, en el carril M se encuentran los niveles de protema de Novex; el carril 1 es el IFN-p-1b de partida; el carril 2 es el IFN-p-1b reducido y el carril 3 es la mezcla de reaccion del reactivo de PEG 1 con IFN-p-1b. A partir del analisis por SDS-PAGE, puede apreciarse que la PEGilacion de IFN-p-1b se produjo con exito con un nivel visible de la banda del producto con el nivel de protema de 110 kDa.
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Claims (14)

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    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula general:
    imagen1
    en la que cada X representa independientemente una cadena polimerica; p representa un numero entero de 1 a 6; Y representa un grupo amida; y Z representa o bien -CH.(CH2L)2 o -C(CH2L)(= CH2), en la que cada L representa independientemente un grupo saliente.
  2. 2. Un compuesto segun la reivindicacion 1, en el que cada X representa un poli(alquilenglicol), polivinilpirrolidona, poliacrilato, polimetacrilato, polioxazolina, alcohol polivinflico, poliacrilamida, polimetacrilamida, copoKmero de HPMA, poliester, poliacetal, poli(ortoester), policarbonato, poli(iminocarbonato), poliamida, o polisacarido.
  3. 3. Un compuesto segun la reivindicacion 1, en el que cada X representa poli(etilenglicol).
  4. 4. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Y representa -NH-CO-.
  5. 5. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que p es 3.
  6. 6. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada L representa independientemente -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, o -O0, en los que R representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, arilo o alquilarilo, y 0 representa un grupo arilo sustituido que contiene al menos un sustituyente aceptor de electrones.
  7. 7. Un compuesto segun la reivindicacion 6, en el que cada L representa independientemente fenilsulfonilo o tosilo.
  8. 8. Un compuesto segun la reivindicacion 1, que tiene la formula:
    imagen2
    imagen3
  9. 9. Un compuesto segun la reivindicacion 8, en el que cada X representa independientemente polietilenglicol de formula CH3O-(CH2CH2O)m- en la que m es el numero de unidades de oxido de etileno en X.
    o
  10. 10. Un compuesto de formula general:
    imagen4
    en la que X, p e Y tienen los significados dados en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, A representa un grupo CO, CHOH, CH.NH2, CH.NHR, CH.NR2, CH.OR CH.O.C(O)R, CH.NHC(O)R, o CH.N(C(O)Rk en los que cada R representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, arilo o alquilarilo, y cada uno de Pr1 y Pr2 representa una molecula de protema o de peptido separada o ambos Pr1 y Pr2 representan conjuntamente una unica protema o 5 un peptido unido a dos puntos separados.
  11. 11. Un compuesto segun la reivindicacion 10, que tiene la formula general:
    imagen5
    en la que X, p, Y y A tienen los significados dados en la reivindicacion 10, y Pr representa una protema unica o peptido unico unido a dos puntos separados.
    10 12. Un compuesto segun la reivindicacion 11, en el que Pr representa una protema unica o un peptido unico unido a
    dos atomos de azufre obtenidos a partir de un enlace disulfuro en dicha protema o peptido, o a dos residuos de histidina presentes en una etiqueta de polihistidina unida a dicha protema o peptido.
  12. 13. Un compuesto segun la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, en el que Pr representa un fragmento Fab de IgG, INF-a, IFN-p, o IFN de consenso.
    15 14. Un procedimiento de preparacion de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que
    comprende la reaccion de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con una protema o un peptido; y opcionalmente, la reduccion del grupo ceto en el conjugado resultante.
  13. 15. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable, y que contiene asimismo opcionalmente un principio activo
    20 adicional.
  14. 16. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composicion segun la reivindicacion 15, para su uso en terapia.
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