KR20150032558A - 접합 시약 - Google Patents

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KR20150032558A
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안토니 갓윈
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폴리테릭스 리미티드
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Abstract

본 발명은 일반 화학식 1의 화합물을 제공한다: 여기서 각각의 X는 독립적으로 중합체 사슬을 나타내고; p는 정수 1 내지 6을 나타내며; Y는 아미드기(amide group)를 나타내고; Z는 -CH.(CH2L)2 또는 -C(CH2L)(=CH2) 각각을 나타내며, 여기서 각각의 L은 독립적으로 이탈기(leaving group)이다. 상기 화합물은 중합체의 단백질 접합 시약으로 유용하며, 얻어진 접합체는 신규한 것으로 본 발명의 일부를 형성한다.

Description

접합 시약{Conjugation Reagents}
본 발명은 단백질 및 펩티드 중합체 접합을 위한 신규한 접합 시약(novel conjugation reagents), 및 새로운 접합체 생산을 위한 새로운 과정에 관한 것이다.
예를 들면 단백질과 같은 다양한 치료적 활성 분자들은 임상 의료용에서 효능을 달성하기 위해 요구되는 특성들을 가지지 않는다. 예를 들면, 많은 천연 단백질들은 다음과 같은 본래의 문제점이 있는 환자에게 투여할 수 있기 때문에 좋은 약을 만들지 않는다: (1) 단백질은 혈액 및 조직에 존재하는 많은 엔도(endo-) 및 엑소 펩티다아제(exo-peptidases)에 의해 분해된다; (2) 거의 모든 단백질은 어느 정도의 면역원성(immunogenic)이다; 및 (3) 단백질은 신장 한외여과(kidney ultrafiltration) 및 세포 이물 흡수(endocytosis)에 의해 빠르게 분비될 수 있다. 의약품에서 활성 치료제로써 유용성을 찾을 수 있는 몇몇 분자들은 전신적으로 독성이거나 최적의 생체 이용률(bioavailability) 및 약물동태학(pharmacokinetics)이 부족하다. 혈액 순환으로부터 신속하게 단백질이 제거될 때, 이들은 전형적으로 환자에게 자주 투여되어야 한다. 잦은 투여는 독성, 특히 면역학적으로 유도된 독성을 더욱 증가시킨다. 종종 치료학적 유효한 양을 얻기가 어렵기 때문에 효율이 제대로 발휘되지 못한다. 따라서 신속한 제거(clearance)는 효능 및 안전 문제의 쟁점이다.
수용성 합성 중합체, 특히 폴리알킬렌 클리콜(polyalkylene glycols)은 단백질과 같은 치료적 활성 분자를 접합하는데 널리 사용된다. 이러한 치료적 접합체는 순환시간을 연장하고 제거율을 감소시키고, 전신적 독성을 감소시키고, 몇몇의 경우 임상적 효능을 증가시키는 것에 의해 바람직하게 약물동태학을 변경하도록 나타난다. 공유결합 폴리에틸렌 글리콜, PEG 단백질의 과정은 흔히 “PEG화(PEGylation)”로 알려져 있다.
단백질 당 접합된 중합체 분자의 수는 각각의 분자와 동일하고, 각각의 중합체 분자는 특이적으로 각자의 단백질 분자에서 동일한 아미노산 잔기에 공유결합하는 것은 효율을 최적화하고 일관적 주입량을 보장하기 위해 중요하다. 접합 생산물의 분포 결과에서 단백질 분자를 따른 사이트에서 비특이적인 접합 및, 자주 접합되지 않은 단백질은 정제가 어렵고 비싼 복합 혼합물을 얻었다.
WO 2005/007197에서는 단백질-중합체 결합을 생산하기 위한 단백질에서 친핵성기(nucleophilic groups)와 함께하는 반응에 사용될 수 있는 새로운 접합 시약의 시리즈를 개시한다. 이러한 시약은 티오에테르(thioether) 접합체를 수득하는 단백질의 이황화(disulfide) 결합으로부터 유래한 황 원자(sulfur atoms)와 함께 결합할 수 있는 능력에 대한 특별 유용성을 나타내었으며, 또한 다른 친핵성, 예를 들어 두 개의 히스티딘(histidine) 잔기, 예를 들어 WO 2009/047500에 개시된 바와 같이 단백질에 부착된 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)에 존재하는 두 개의 히스티딘 잔기와 함께 접합할 수 있다.
예를 들어, 주어진 분자량의 단일 사슬을 포함하는 접합체의 입체 특성이 예를 들면 각각 분자량의 절반을 가진 두 사슬을 포함하는 접합체의 특성으로부터 크게 상이할 수 있기 때문에, 두 개의 중합체 사슬이 단백질에 접합하는 것이 바람직하다. 이러한 접합이 가능한 시약은 알려져 있다. 따라서, US 5,932,462 (Harris)의 예는 두 PEG 사슬이 단백질에 접합하는 것이 가능한 시약을 개시한다. Cong 등(Bioconjugate Chemistry 23 (2012), pp. 248-263)은 또한, 특히 도 1, 249 페이지의 시약 3에서 보여준 PEG-비스-술폰(PEG-bis-sulfone) 시약과 같이 단백질에 두 개의 PEG 사슬의 접합이 가능한 시약을 개시한다. Cong의 시약에서, 두 PEG 사슬은 시약의 활성기의 기능적 단백질의 링커(linker)로써 작용하는 페닐기(phenyl group)에서 다른 위치에 부착된다. Cong의 시약은 예를 들면, 단백질에서 이황화 결합으로부터 유래한 두 개의 황 원자, 또는 Harris 시약과 비교하여 향상된 접합을 제공하는 단백질에 부착된 폴리히스티딘 태그에 존재하는 두 히스티딘 잔기에 두 PEG 사슬의 접합을 가능하게 한다.
본 발명자들은 알려진 Cong의 시약을 넘어 향상된 특성을 보여주는 단백질에 두 중합체 사슬의 접합이 가능한 새로운 시약을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 하기 일반 화학식 1의 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pct00001
여기서 각각의 X는 독립적으로 중합체 사슬(polymer chain)을 나타내고; p는 1에서 6의 정수를 나타내고; Y는 아미드기(amide group)을 나타내고; 및 Z는 -CH.(CH2L)2 또는 -C(CH2L)(=CH2)를 나타내고, 여기서 L은 각각 독립적으로 이탈기(leaving group)를 나타낸다.
상기 화학식 1의 시약은 두 중합체 사슬 X를 포함한다. 각 중합체 X의 일례로는, 폴리(알킬렌 클리콜)(poly(alkylene glycol)), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 예를 들어 폴리(아크릴로일 몰폴린(poly(acryloyl morpholine)), 폴리메타크릴레이드(polymethacrylate), 폴리옥사졸린(polyoxazoline), 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 또는 폴리메타크릴아미드(polymethacrylamide), 예를 들면 폴리카복시메타크릴아미드(polycarboxymethacrylamide), 또는 HPMA 공중합체(copolymer)일 수 있다. 또한, 상기 중합체는 효소적 또는 가수분해에 민감할 수 있다. 예를 들면, 상기 중합체는 폴리에스테르(polyesters), 폴리아세탈(polyacetals), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho esters)), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리(이미노 카보네이트)(poly(imino carbonates)), 및 폴리(아미노산)(poly(amino acids))과 같은 폴리아미드(polyamides)를 포함한다. 중합체는 호모폴리머(homopolymer), 랜덤 공중합체(random copolymer), 또는 블록 공중합체(block copolymer)와 같이 구조적으로 정의된 공중합체일 수 있다. 예를 들면, 둘 또는 그 이상의 알킬렌 옥사이드(alkylene oxides)로부터 유도된, 또는 폴리(알킬렌 옥사이드)(poly(alkylene oxide)) 및 둘 다 폴리에스테르(polyester), 폴리아세탈(polyacetal), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)), 또는 폴리(아미노산)(poly(amino acid))로부터 유도된 공중합체, 즉 블록 공중합체일 수 있다. 소위 플루로닉(Pluronics)은 PEG 블록 공중합체의 중요한 클래스이다. 이러한 것은 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 및 프로필렌 옥사이드(propylene oxide) 블록으로부터 유도된다. 사용될 수 있는 다기능성 중합체(Polyfunctional polymers)는 디비닐에테르-말레산 무수물(divinylether-maleic anhydride) 및 스티렌-말레산 무수물(styrene-maleic anhydride)의 공중합체를 포함한다.
자연적으로 일어나는 공중합체는 예를 들어 키틴(chitin), 덱스트란(dextran), 덱스트린(dextrin), 키토산(chitosan), 전분(starch), 셀룰로오스(cellulose), 글리코겐(glycogen), 폴리(시알릭산)(poly(sialylic acid)) 및 이들로부터의 유도체와 같은 다당류(polysaccharides)가 사용될 수 있다. 단백질은 중합체로써 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 항체 또는 항체 조각과 같은 하나의 단백질이 예를 들어, 효소 또는 다른 활성 단백질과 같은 두 번째 단백질에 결합(conjugation)을 허용한다. 또한, 예를 들면 글리코실트렌스퍼라제(glycosyltransferase)를 위한 O-글리칸 수용체 사이트(O-glycan acceptor site)와 같이 촉매 서열을 포함하는 펩티드를 사용하는 경우에도 후속 효소 반응을 위한 기질 또는 타겟의 혼합(incorporation)을 허용한다. 폴리글루타민산(polyglutamic acid) 또는 폴리글리신(polyglycine)과 같은 당류(saccharides) 또는 아미노산(amino acids)과 같은 천연 단량체(natural monomers) 및 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 또는 메타크릴산(methacrylic acid)과 같은 합성 단량체(synthetic monomers)로부터 유도된 혼성 중합체(hybrid polymers)일 수 있는 폴리(아미노산)들이 사용될 수 있다.
본 발명에서 바람직하게 사용되는 각 중합체는 친수성(hydrophilic) 또는 수용성(water-soluble) 합성 중합체이다. 중합체가 폴리(알킬렌 클리콜)(poly(alkylene glycol))인 경우, 이는 C2 및/또는 C3 단위를 함유하는 것이 바람직하며, 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이다. 문맥상 요구되는 경우를 제외하고, 본 명세서 상의 중합체에 대한 어느 참조(reference)는 PEG에 대한 특정 참조를 포함함으로써 이해되어야 한다.
중합체는 임의로 어떠한 원하는 방식으로 유도되고 작용기화(functionalised)될 수 있다. 반응기는 중합체 말단 또는 말단 그룹에서 연결될 수 있으며, 또는 펜던트 링커(pendent linkers)를 통해 중합체 사슬을 따라갈 수 있는데; 이러한 경우, 상기 중합체는 예를 들어 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리메타크릴아미드(polymethacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 또는 말레산 무수물 공중합체(maleic anhydride copolymer)이다. 이러한 기능화된 중합체는 다량 결합체(multimeric conjugates) 준비(여기서, 결합체는 중합체가 하나 이상의 분자에 결합된 것)를 위한 추가의 기회를 제공한다. 예를 들면, 중합체는 이의 말단에서 그 길이에 따라 어떤 지점에서 하나 이상의 약물 분자를 전달할 수 있다. 필요하다면, 상기 중합체는 통상의 방법을 이용하여 고체 지지대에 연결될 수 있다.
두 중합체 사슬 X는 동일하거나 상이할 수 있다. 구체적으로, 각 X는 동일한 화학 중합체, 또는 상이한 화학 중합체일 수 있다. 예를 들어, 각 X는 PEG 사슬을 나타내거나, 하나의 X는 PEG 사슬을 나타내고 다른 X는 상이한 중합체, 예를 들면 PVP 또는 단백질 사슬을 나타낼 수 있다.
각각의 중합체 X는 단일 직쇄(linear chain)를 포함할 수도 있고, 작거나 큰 많은 사슬로 이루어진 형태의 분지형(branch)을 가질 수 있다. 일반적으로, 중합체 사슬은 적절한 말단 그룹에 의해 개시되거나 종결되며, 화학식 1의 분자의 나머지 사슬의 다른 말단에서 연결되어 있다. 예를 들면, PEG 사슬은 알콕시(alkoxy), 즉 메톡시(methoxy), 아릴록시(aryloxy), 카복시(carboxy) 또는 하이드록실(hydroxyl)로부터 선택되는 말단기를 가질 수 있다. 사슬이 분지형(branch)이 되는 경우, 각 자유 분지 말단은 말단기를 운반한다.
각 중합체 사슬 X는 임의의 적합한 분자량을 가질 수 있으며, 각각의 중합체 사슬 X는 다른 것과 비교하여 동일하거나 상이한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어 각 사슬은 적어도 5, 10, 15, 20, 30 또는 40 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일반적으로, 각 사슬의 바람직한 최대 분자량은 60 kDa이다. 접합체가 조직을 순환하고 침투하려는 경향이 있는 경우, 예를 들어 악성 종양(malignancy), 감염 또는 자가 면역 질환(autoimmune disease), 또는 외상(trauma)에 의해서 유발된 염증 치료에서 사용되기 위해, 중합체(X+X)의 총 분자량이 2000 - 30,000 g/mol 범위에 있는 접합체 사용이 유리할 수 있다. 순환 중 유지하고자 하려는 접합체에서의 적용에 있어서, 복합체의 높은 총 분자량, 예를 들면 20,000 - 75,000 g/mol의 범위에서 사용하는 것이 유리할 수 있다.
p는 1 내지 6의 정수이며, 예를 들어 1, 2이고 또는, 특히 3이다.
본 발명의 시약은, 상기 화학식 1에서 개시된 바와 같이 R'은 C1 - 4알킬기, 예를 들어 메틸기 또는, 특히 수소 원자(hydrogen atom)인 -CO-NR'- 또는, 바람직하게 -NR'-CO-인 아미노기 Y를 포함한다. 상기 작용기는 화학식 1의 임의의 위치에서 나타낸 페닐기에 연결될 수 있지만, 바람직하게는 -CO.Z기에 관련된 파라(para) 위치이다. 상기 화학식 1의 페닐기는 원한다면 추가적인 치환기를 운반할 수 있으나, 바람직하게는 치환되지 않는다.
이탈기(leaving group) L은 예를 들어 -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(halogen), 또는 -OØ를 나타내고, 여기서 R은 상기 언급한 바와 같으며, Ø는 적어도 하나의 전자 회수 치환체(electron withdrawing substituent), 예를 들면 -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NRCO2R, -NO, -NHOH, -NROH, -C=N-NHCOR, -C=N-NRCOR, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(halogen), 예를 들어 염소(chlorine) 또는, 특히, 브롬(bromine) 또는 요오드(iodine), -C=CR, -C=CR2 및 -C=CHR를 포함하는 치환된 아릴(aryl), 특히 페닐기를 나타내며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 상기 주어진 의미를 갖는다. 알킬 또는 아릴 술포닐(sulfonyl)기는 특히 페닐술보닐(phenylsulfonyl) 또는, 특히 바람직한, 토실(tosyl)과 함께 이탈기로 바람직하다. 두 L들이 존재하는 경우, 이것은 상이한 작용기일 수 있으나 바람직하게는 동일한 작용기이다.
명시된 경우를 제외하고, 화학식 1의 화합물에서 추가적으로 치환된 아릴, 예를 들어 페닐, 또는 헤테로아릴(heteroaryl)기에 존재하는 치환체는 예를 들어 각각의 R은 독립적으로 상기 주어진 의미를 갖는, 알킬(바람직하게 C1 - 4알킬, 특히 OH 또는 CO2H에 의해 선택적으로 치환된 메틸), -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NRCO2R, -NO, -NHOH, -NROH, -C=N-NHCOR, -C=N-NRCOR, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(halogen), 예를 들어 염소(chlorine) 또는, 특히, 브롬(bromine) 또는 요오드(iodine), -C=CR, -C=CR2 및 -C=CHR로부터 선택된 동일하거나 상이한 하나 이상의 치환체를 포함한다. 바람직한 치환체의 경우, 예를 들어 CN, NO2, -OR, -OCOR, -SR, -NHCOR, -NR.COR, -NHOH 및 -NR.COR를 포함한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 시약은 하기의 화학식을 가진다:
Figure pct00002
또는
Figure pct00003

상기 시약에 있어서, 바람직하게 X는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 특히 메톡시 말단(methoxy-terminated)의 폴리에틸렌 글리콜, 즉 PEG에서 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 단위 수가 m인 CH3O-(CH2CH2O)m- 이다. 게다가, 상기 시약에서, 바람직하게 각각의 L은 토실(tosyl)기이다. 따라서 하기와 같다:
Figure pct00004
또는
Figure pct00005

화학식 1의 화합물은 단백질 또는 펩티드 접합에 사용될 수 있다. 편의상, 용어 "단백질(protein)"은 본 명세서 전반에 걸쳐 사용될 수 있으며, 특별한 경우를 제외하고, 상기 용어 "단백질"의 사용은 펩티드에 대한 참조로써 포함하여 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드와 함께 일반 화학식 1의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 중합 접합체(polymer conjugate)의 준비를 위한 공정을 제공한다. 생성된 접합체(resulting conjugates)는 하기의 일반 화학식을 가진다:
[화학식 2]
Figure pct00006

여기서 X, p 및 Y는 상기와 동일한 의미를 가지고, Pr1 및 Pr2각각은 분리된 단백질 또는 펩티드 분자를 나타내거나, Pr1 및 Pr2 모두가 두 개의 포인트에서 결합된 단일 단백질 또는 펩티드를 나타내며, 따라서 하기와 같다:
[화학식 2a]
Figure pct00007

바람직하게는 Pr1 및 Pr2 모두가 단백질 또는 펩티드에서 이황화(disulfide) 결합으로부터 유래한 두 개의 황 원자(sulfur atoms), 또는 단백질 또는 펩티드에 부착된 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)에 존재하는 두 개의 히스티딘 잔기에 부착된, 단일 단백질 또는 펩티드를 나타낸다(즉, 결과 접합체는 하기 화학식 4a를 가진다).
상기 화학식 1의 시약에 있어서, Z는 -CH.(CH2L)2 또는 -C(CH2L)(=CH2) 모두를 나타낸다. 상기 두 작용기는 각각 서로에게 화학적으로 동일하다. Z가 -CH.(CH2L)2 를 나타내는 화학식 1의 시약, 즉 하기 화학식 1a의 시약은 하기와 같고:
[화학식 1a]
Figure pct00008

상기 화학식은 하나의 이탈기를 잃고, Z가 -C(CH2L)(=CH2)를 나타내는, 화학식 1의 시약의 결과를 형성하는 상기 작용 과정인 본 발명에 따르는 공정에서 단백질과 작용하는데 사용되며, 즉 하기 화학식 1b의 시약과 같다:
[화학식 1b]
Figure pct00009

상기 시약은 하나의 친핵제(nucleophile), 예를 들면 단백질 내의 시스테인(cysteine), 히스티딘(histidine) 또는 라이신(lysine) 잔기와 함께 반응한다. 이어서, 나머지 이탈기 L은 손실되고, 원하는 접합체를 형성하기 위해 두 번째 친핵체(단백질의 두 번째 분자 또는 첫 번째 친핵체와 같은 단백질 분자 모두)와의 반응이 일어난다. 따라서, 본 발명의 공정은 시작 물질로써 화학식 1a의 화합물을 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서 화학식 1b의 화합물의 경우 동일 반응계(in situ) 내에서 형성되거나 시작 물질로써 사용될 수 있는 화학식 1b의 화합물을 미리 형성한다.
본 발명에 따른 상기 결합 반응은 WO 2005/007197 및 WO 2009/047500에 개시된 반응 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 공정은 예를 들어, 모든 반응물이 용해되는 용매 또는 용매 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 수용성 반응 배지에서 중합체 결합 시약과 함께 직접적으로 반응할 수 있다. 상기 반응 배지는 친핵체의 pH 조건에 따라 완충(buffered)될 수 있다. 상기 반응의 최적 pH는 일반적으로 적어도 4.5이며, 전형적으로 약 5.0에서 약 8.5 사이이고, 바람직하게는 약 6.0 내지 7.5이다. 상기 최적 반응 조건은 물론 사용되는 특정 반응물에 따라 달라진다.
수용성 반응 배지를 사용하는 경우, 반응 온도는 3-37℃가 일반적으로 적절하다. 유기 배지(예를 들면, THF, 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone))에서 수행되는 반응은 전형적으로 주변 온도에서 수행된다.
단백질 결합이 상기 단백질의 이황화 결합으로부터 유도된 두 개의 황 원자를 통한 것인 경우, 상기 공정은 화학식 1의 시약과 환원된 생산물의 반응에 따른 이황화 결합의 환원을 통해 수행될 수 있다. 바람직하게 상기 이황화 결합은 환원되고 과도한 환원제는 예를 들어 결합 시약이 도입되기 전 버퍼 교환을 통해 제거된다. 상기 이황화는 통상적인 방법을 통하여 예를 들어, 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에탄올(mercaptoethanol), 또는 트리스-카복실데틸포스핀(tris-carboxyethylphosphine)과 함께 환원될 수 있다.
상기 단백질은 결합 시약 1의 화학적으로 동량 또는 약간의 과량을 이용하여 효과적으로 결합될 수 있다. 그러나, 결합 시약의 화학적으로 과도한 양을 통한 결합 반응 수행은 가능하며, 몇 단백질에 있어서 이것을 바람직할 수 있다. 과도한 시약은 예를 들어 결합체의 후속 정제 과정 중, 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)에 의해 쉽게 제거될 수 있다.
Z가 -CH.(CH2L)2를 나타내는 일반 화학식 1의 화합물은 각각 하기 일반 화학식 3의 화합물과
[화학식 3]
Figure pct00010
하기 일반 화학식 4의 화합물과 반응하거나
[화학식 4]
Figure pct00011
또는 하기 일반 화학식 5의 화합물과
[화학식 5]
Figure pct00012
하기 일반 화학식 6의 화합물과 반응함으로써 제조된다.
[화학식 6]
Figure pct00013
상기 두 경우 모두, 아미드기를 형성한다. 공지된 바와 같이, 상기 아미드기를 형성하기위해 반응하는 CO2H기는 예를 들어, 활성 에스테르(active ester), 아실 클로라이드(acyl chloride), 또는 무수물(anhydride)의 형성에 의해, 또는 카보디이미드(carbodiimide)와 같은 활성화제의 사용에 의해 직적접으로 아민(amine)과 반응하여 적절하게 반응을 촉진한다.
전술한 바와 같이, Z가 -C(CH2L)(=CH2)를 나타내는 일반 화학식 1의 화합물은 Z가 -CH.(CH2L)2기를 나타내는 일반 화학식 1의 화합물에 상응하는 이탈기 L을 제거함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 즉각적인 생산물은 여전히 화학식 1, 즉 화학식 2, 특히 상기의 화학식 2a의 접합체의 페닐 고리에 부착된 케토기(keto) CO를 포함하는 접합체이다. 그러나, 본 발명의 공정은 적절한 환경 하에서 가역적(reversible)이다. 이는 예를 들면 단백질의 빠른 방출이 요구되는 몇몇의 적용에 있어서 바람직할 수 있지만, 다른 적용에서는 단백질의 빠른 방출이 바람직하지 않을 수 있다. 각각의 R은 독립적으로 상기의 의미를 가지는 아민기 CH.NH2, CH.NHR 또는 CH.NR2를 제공하여 환원성의 아민화(reductive amination)가 가능함에도 불구하고, 전형적으로 수산기 OH인 단백질의 방출을 막는 모이어티(moiety)를 수득한 케토기의 환원에 의한 접합체의 안정화가 바람직할 수 있다. 상기 작용기는 필요하다면 예를 들어, 수산기가 에테르화제(etherifying agent)와의 반응에 의한 다른 작용기 CH.OR로 변환될 수 있고; 에테르기 CH.O.C(O)R는 아실화제(acylating agent)와 수산기와의 반응에 의해 얻어질 수 있고; 또는 아미드 CH.NHC(O)R or CH.N(C(O)R)2는 아민(amine)의 아실화(acylation)에 의해 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 공정은 접합체에서 케토기의 환원 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 환원제로써 예를 들어 수소화붕소 나트륨(sodium borohydride), 시아노수소화붕소 나트륨(sodium cyanoborohydride), 수소화붕소 칼륨(potassium borohydride) 또는 트리아세톡시수소화붕소 나트륨(sodium triacetoxyborohydride) 수소화붕소(borohydride)의 사용은 특히 바람직하다. 사용될 수 있는 다른 환원제는 예를 들면 염화제일주석염화주석(tin(II) chloride), 알루미늄 알콕시트(aluminium alkoxide)와 같은 알콕사이드(alkoxides), 및 수소화 알루미늄 리튬(lithium aluminium hydride)를 포함한다.
본 발명의 공정에 의해 제조될 수 있는 접합체는 신규하며, 따라서 본 발명 자체의 일부분을 형성한다. 본 발명에 따른 신규한 접합체는 하기의 일반 화학식 2b를 가진다:
[화학식 2b]
Figure pct00014
여기서 X, p 및 Y는 상기 제시된 의미를 가지고, A는 CO, CHOH, CH.NH2, CH.NHR, CH.NR2, CH.OR CH.O.C(O)R, CH.NHC(O)R, 또는 CH.N(C(O)R)2를 나타내며, 여기서 각각의 R은 상기 제시된 의미를 가지며, Pr1 및 Pr2 각각 모두는 분리된 단백질 또는 펩티드 분자를 나타내거나 또는 Pr1 및 Pr2 모두 같이 두 개의 분리된 지점에서 접합된 단일 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 접합체는 하기 일반 화학식 2c를 가진다:
[화학식 2c]
Figure pct00015
여기서 X, p, Y 및 A는 상기 제시된 의미를 가지며, Pr은 두 개의 분리된 지점에서 접합된 단일 단백질 또는 펩티드를 나타낸다.
물론, 상기 단백질이 충분하고 적합한 접착지점을 포함할 때, 단백질에 접합되는 화학식 1의 하나 이상의 접합 시약이 가능하다. 예를 들어, 두 개의 상이한 이황화 결합(disulfide bond)을 포함하는 단백질에서, 또는 하나의 이황화 결합 및 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)를 운반하는 단백질에서, 단백질 분자당 화학식 1 시약의 두 분자를 접합하는 것이 가능하다.
본 발명의 공정을 이용하여 접합될 수 있는 적절한 단백질은 예를 들어, 펩티드(peptides), 폴리펩티드(polypeptides), 항체(antibodies), 항체 조각(antibody fragments), 효소(enzymes), 사이토카인(cytokines), 케모카인(chemokines), 수용체(receptors), 혈액 인자(blood factors), 펩티드 호르몬(peptide hormones), 독소(toxin), 전사 단백질(transcription proteins), 또는 다중체 단백질(multimeric proteins)이 포함된다.
이어서, 본 발명을 이용하여 접합될 수 있는 몇몇 특정 단백질을 제공한다. 효소는 탄수화물 특정 효소(carbohydrate-specific enzymes), 단백질분해 효소(proteolytic enzymes) 등, 예를 들어 US 4,179,337에 개시된 산화환원효소(oxidoreductases), 전이효소(transferases), 가수분해효소(hydrolases), 리아제(lyases), 이성화효소(isomerases) 및 리가아제(ligases)를 포함한다. 관심있는 특정 효소는 아스파라긴 분해효소(asparaginase), 아르기닌 분해효소(arginase), 아데노신데아미나아제(adenosine deaminase), 과산소 디뮤타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 키모트립신(chymotrypsin), 지방 분해효소(lipase), 요산 분해효소(uricase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase), 포도당 산화효소(glucose oxidase), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 갈락토시아제(galactosidase), 글루코세르브로시다아제(glucocerbrosidase), 글루크로니다아제(glucuronidase), 및 글루타미나아제(glutaminase)를 포함한다.
혈액 단백질은 알부민(albumin), 트렌스페린(transferring), Factor VII, Factor VIII 또는 Factor IX, 본빌레브란트인자(von Willebrand factor), 인슐린(insulin), ACTH, 글루카겐(glucagen), 소마토스타틴(somatostatin), 소마토트로핀(somatotropins), 티모신(thymosin), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 색소 호르몬(pigmentary hormones), 소마토메딘(somatomedins), 에리트로포이데틴(erythropoietin), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone), 시상하부 방출인자(hypothalamic releasing factors), 항이뇨 호르몬(antidiuretic hormones), 프로락틴(prolactin), 인터루킨(interleukins), 인터페론(interferons), 예를 들어 IFN-α 또는 IFN-β, 콜로니 자극인자(colony stimulating factors), 헤모글로빈(haemoglobin), 사이토카인(cytokines), 항체(antibodies), 항체 단편(antibody fragments), 융모막 성 생식선 자극 호르몬(chorionicgonadotropin), 난포 자극 호르몬(follicle-stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone) 및 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator)를 포함한다.
관심있는 다른 단백질은 폴리(알킬렌 옥사이드)(poly(alkylene oxide))와 같은 중합체와 접합 될 때 감소된 알레르기성을 가지고 결과적으로 내성 유도제로써 사용하기 적합한 Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315-365에 개시된 알레르겐(allergen) 단백질이다. 상기 개시된 알레르겐 중 돼지풀(Ragweed) 항원 E, 꿀벌 독(honeybee venom), 진드기(mite) 알레르겐 등이 있다.
면역글로불린(immunoglobulins), 난알부민(ovalbumin), 리파아제(lipase), 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 렉틴(lectins), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator) 및 글리코실화된 인터루킨(glycosilated interleukins), 인터페론(interferons) 및 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors)와 같은 글리코폴리펩티드(Glycopolypeptides)는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이의 단편과 같은 면역글로불린(immunoglobulins)으로서 관심의 대상이다.
특정한 관심의 대상은 진단 및 치료 목적으로 임상 의학에서 사용되는 수용체 및 리간드 결합 단백질 및 항체 및 항체 단편이다. 상기 항체는 단독으로 사용되거나 방사성 동위원소(radioisotope) 또는 세포독성/항감염약물과 같은 다른 원자 또는 분자와 함께 공유 접합(“부하(loaded)”)될 수 있다. 면역원성 중합체-단백질 접합체를 생산하기 위해 에피토브(Epitopes)는 백신접종(vaccination)에 사용될 수 있다.
특히 바람직한 단백질은 항체 단편, 예를 들어 IgG Fab 단편 및 IFN-α, IFN-β 및 컨센서스(consensus) IFN과 같은 인터페론을 포함한다.
상기 단백질은 원하는 경우 유도될 수 있거나 기능화될 수 있다. 특히, 단백질, 예를 들어 천연 단백질의 사전 접합은 민감성 기능기 상의 보호를 위해 다양한 차단 기능기와 함께 반응될 수 있다; 또는 본 발명의 공정 또는 대안적인 공정 모두를 이용하여 하나 이상의 중합체 또는 다른 분자들과 함께 사전에 접합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 접합 시약에 의해 표적화될 수 있는 폴리히스티딘 태그를 포함한다.
본 발명은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명에 따른 접합체를 포함하고, 추가적으로 본 발명의 접합체에 활성 성분을 또한 선택적으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하고; 치료에 사용하기 위한 상기 본 발명에 따른 접합체를 제공하고; 약제 제조과정에 사용하기 위한 상기 본 발명의 공정에 따른 접합체의 사용을 제공하며; 본 발명에 따른 접합체의 약학적으로 유효한 양 또는 약학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 접합 시약은 높은 수준의 안정성을 보여주는 신규한 접합체 결과물인 단백질의 높은 효울의 부위 특이적 접합이 가능하고 매우 유용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하기 실시예에 설명된 바와 같이, Cong et al, Bioconjugate Chemistry 23 (2012), pp. 248-263의 알려진 시약과 비교하여 극적으로 향상된 효율을 얻었다.
첨부하는 도면은 하기 실시예에서 얻어진 결과를 나타낸다:
도 1은 실시예 1에서 얻어진 SDS-PAGE gel을 나타낸다.
도 2, 3 및 4는 실시예 3에서 얻어진 SDS-PAGE gel을 나타낸다.
도 5는 실시예 4에서 얻어진 SDS-PAGE gel을 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명은 예시한다.
실시예 1: PEG 시약 1의 제조
Figure pct00016
40(2x20) kDa의 분기된(bifurcated) PEG 아민(amine) 3(MPEG가 CH3O.CH2CH2O)m-인)는 NOF CORPORATION(SUNBRIGHT GL2-400 PA, lot: M7D902)로부터 구입하였다. 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)메틸] 아세틸]벤조산-NHS 에스테르(4-[2,2-bis[(p-tolylsulfonyl)methyl] acetyl]benzoic acid-NHS ester) 4는 Brocchini et al . Nat. Protoc. 2006, 1(4), 2241-2252에 따라서 제조되었다.
자기 교반 막대(magnetic stirrer bar)를 포함하는 바닥이 둥글고 단일 목이 있는 플라스크에, 분기된 PEG 아민 3(300 mg) 및 톨루엔(toluene, 8 ml)을 첨가하였다. 생성된 균질한 용액을 고체 잔류물을 남기기 위해 2시간 동안 회전 증발기를 사용하여 감압하에 증발시켰다. 잔류물은 디클로로메탄(dichloromethane, 15 mL)에 용해시켰으며, 상기 플라스크는 격막(septum)으로 밀봉하고 아르곤(argon) 하에 혼합물을 교반하였다. 상기 용액에 활성 링커 용액 4 (27 mg)를 첨가하였으며, 상기 플라스크는 격막으로 재밀봉하고 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 격벽을 제거하고 휘발성 부분은 회전 증발기를 사용하여 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 아세톤(20 ml)은 상기 잔류물에 첨가하고 상기 고형물은 부드럽게 데워서(30℃) 용해시켰다. 생성된 상기 용액은 50 ml 팔콘튜브에 비 흡수 탈지면(non-absorbent cotton wool)을 통해 여과하였다. 상기 용액을 드라이 아이스 통에서 냉각시켜 두꺼운 침전물을 생성하였다. 상기 침전물을 30분간 원심분리(-9℃, 4000 rpm)하여 침강시켰다. 상기 상층액은 옮기고 펠렛을 다시 30℃ 상에서 아세톤(20 mL)에 용해시켰다. 상기 서술한 바와 같이 침전(Precipitation), 침강)(sedimentation) 및 분리(decanting)를 수행하였다. 아세톤 침전 및 침강의 세 번째 사이클을 수행한 후 상층액을 분리하여, 상기 펠렛은 -80℃에서 동결시킨 후 회백색 고체(227 mg)의 PEG 시약 1을 제공하여 높은 진공 하에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 1H NMR (CDCl3): δ(ppm) 2.49 (s, 6H), 3.38 (s, 6H), 3.45-3.86 (m), 4.33 (m, 1H), 7.36 (AA'BB', 4H), 7.64 (AA'BB', 2H), 7.68 (AA'BB', 4H), 7.83 (AA'BB', 2H).
실시예 2: 인간 IgG , Fab 단편과 함께 PEG 시약 1 및 2의 활성 비교
본 실시예에서, 실시예 1의 PEG 시약 1은 Cong 등의 문헌의 다음과 같은 시약, MPEG가 CH3O.(CH2CH2O)m-1-CH2CH2-인 PEG 시약 2와 비교하였다.:
Figure pct00017
인간 IgG, Fab 단편 용액(4.0 mg, 0.909 mL, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No. 009-000-007)은 50 mM 인산 나트륨(sodium phosphate, pH 7.4)(150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는) 4.95 mL로 희석하였다. 상기 Fab 단편 용액에, PEG화(PEGylation)가 발생할 수 있도록 사슬 간의 이황화물 결합을 환원시키기위해 DTT 최종 농도가 10 mM이 되도록 1.0 M DTT (50 ㎕)를 첨가하였다. 생성된 용액을 부드럽게 혼합한 다음 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 상기 환원된 Fab의 용액은 PD-10 탈염 컬럼을 이용하여 50 mM 인산 나트륨(pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는)으로 버퍼 교환하였다. 환원된 Fab 용액은 동등하게 두 영역(3.5 mL, ~2 mg)으로 나뉘었다. 두 개의 PEG 시약: PEG 시약 1 및 PEG 시약 2, 는 20 mg/mL에서 50 mM 인산 나트륨(pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는)으로 용해시켰다. Fab 용액의 첫 번째 영역에, PEG 시약 1 (75 ㎕, 1.5 mg)을 첨가하고 Fab 용액 두 번째 영역에, PEG 시약 2 (75 ㎕, 1.5 mg)을 추가하였다. 두 반응은 부드럽게 혼합하였으며 4℃에서 20시간 동안 정치시켰다. 20시간 후 조질(crude)의 반응 혼합물은 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 젤은 InstantBlue™로 염색되었으며 IMAGEQUANT™LAS 4010 장비를 이용하여 이미지화하였다. 상기 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, lane M은 Novex Protein Standards를 나타내며; lane 1은 인간 IgG, Fab 단편을 나타내고; lane 2는 20시간에서 PEG 시약 2의 PEG화 생산물을 나타내고; 및 lane 3은 20시간에서 PEG 시약의 PEG화 생산물을 나타낸다. SDS-PAGE분석으로부터 보이는 바와 같이, PEG 시약 1 및 2가 성공적으로 Fab 단편에 접합되는 동안, PEG 시약 1의 접합효율은 PEG 시약 2 접합 효율(10%)의 두 배 이상인 26%를 나타내었다.
실시예 3: PEG 시약 1 및 2와 함께 제조된 IFN α-2a 접합체의 안정성 비교
접합체의 제조: IFN α-2a (6.5 mg, 0.845 mg/mL)의 용액은 50 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는)에서 제조되었다. 상기 단백질 용액은 버퍼(313 μL) 및 물에 용해된 1.0 mM DTT 용액으로 희석되었으며 최종 DTT 농도가 25 mM 및 반응 부피가 7.5 mL이 되도록 첨가하였다. 부드럽게 혼합한 후, 상기 반응은 실온에서 30분 동안 정치하였다. 상기 환원된 단백질은 PD-10 컬럼을 이용하여 50 mM 인산 나트륨(pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는)으로 버퍼 교환하였다. 상기 용리된 단백질 용액은 원심분리(3000 g, 4℃, 5 분)한 후 상층액은 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 정량하였다(0.532 mg/mL). 상기 단백질은 버퍼와 함께 0.10 mg/mL로 희석되었다. PEG 1 및 2는 50 mM 인산 나트륨(pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는)으로 20 mg/mL로 용해시켰다. 두 튜브는 각각 환원된 IFN α-2a(2.5 mg, 24.8 mL)로 대전되었다; PEG 시약 1 (4.9 mg, 0.245 mL)을 첫 번째 튜브에 첨가하고 주 번째 튜브에 PEG 시약 2(4.9 mg, 0.245 mL)을 첨가하였다. 상기 반응은 부드럽게 혼합한 후 4℃에서 18시간 동안 정치하였다. 최종 반응 혼합물에서 모든 환원된 단백질은 순차적으로 5 mg/mL의 황산구리(copper sulfate(12.18 ㎕)) 및 그리고 50:50 (mM) GSH/GSSG (0.25 mL)를 첨가함으로써 산화된다. 상기 재산화 반응(reoxidation reaction)은 4℃에서 밤새 수행되었다. 상기 반응 혼합물은 100 mM의 아세트산 나트륨(sodium acetate), pH 4로 x4로 희석되었으며 0.60-0.65 M NaCl에서 용출되는 목적 접합체와 함께 100 mM 아세트산 나트륨 pH 4(1.0 M NaCl)의 단계적 구배 용출을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography(Macrocap™ SP))에 의해 정제되었다.
안정성 비교 1. PEG 시약 1 및 2와 함께 제조된 IFN α-2a 접합체를 위한 응력( stress ) 테스트: PEG 시약 1 및 2와 함께 PEG화 된 IFN α-2a 샘플(멸균된 PBS로 필터된) 각각을 위해, 네 개의 튜브를 준비하였다. 각각의 튜브는 200 μg/mL의 농도에서 접합체 20 μL로 부하(loaded)되었다. 각 실험 샘플마다 두 개의 튜브는 10 mM DTT 를 함유하였다. DTT를 가진 하나의 튜브 및 DTT가 없는 하나의 튜브는 50℃에서 1시간 동안 가열되었다. 상기 남아있는 튜브는 90℃에서 10분 동안 가열되었다. 상기 샘플(비접합 단백질 및 비응력 접합체)은 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며, 상기 젤은 InstantBlue™로 염색되었고 IMAGEQUANT™ LAS 4010 장비를 이용하여 이미지화되었으며, 상기 결과는 PEG 1-IFN α-2a 및 PEG 2-IFN α-2a 각각을 도 2 및 3에 나타내었다. 도 2 및 3에서, lane M은 Novex Protein Standards를 나타내고; lane 1은 IFN α-2a를 나타내고; lane 2는 PEG-IFN α-2a을 나타내며; lane 3은 PEG-IFN α-2a - 50℃, 1 시간; lane 4는 PEG-IFN α-2a - 50℃, DTT, 1 시간; lane 5는 PEG-IFN α-2a - 90℃, DTT, 10 분; 및 lane 6은 PEG-IFN α-2a - 90℃, DTT, 10 분을 나타낸다.
도 2 및 3은 1시간 동안 50℃에서 안정한 접합체 모두를 나타낸다. 그러나, 10 mM DTT의 존재 하에서 50℃에서 1시간 동안 가열 후, 상당한 자유 단백질 및 응집이 PEG 시약 2와 함께 제조된 접합체에서 관찰되었다. 90℃에서 10분 동안의 열 응력(Thermal stress)은 PEG 시약 1과 함께 PEG화 된 접합체가 아닌, PEG 시약 2와 함께 PEG화 된 접합체의 자유 단백질 방출 결과를 나타내었다.
안정성 비교 2. PEG 시약 1 및 2와 함께 28일 째 40℃에서, PEG 화 된 IFN α-2a 접합체를 위한 가속화된 안정성 시험. 두 개의 시험 샘플 용액은 200 μg/mL 의 단백질 농도에서 멸균된 PBS(0.01% (w/v) NaN3를 포함하는)로 필터하여 만들었다. PEG 1-IFN α-2a 및 PEG 2-IFN α-2a의 네 개의 튜브 각각은 시험 샘플 100 μL로 부하하였다. 각 샘플의 하나의 튜브는 즉시 -80℃(t = 0 days)에서 동결시켰다. 나머지 세 개는 파라필름(parafilm®)으로 밀봉하였으며 40℃에 저장하였다. 7, 14 및 28일째에서 샘플은 저장소로부터 꺼내어 본 실험이 완료될 때까지 -80℃에서 동결하였다. 상기 시험 샘플은 37℃의 온도 조절 수조에서 급히 녹였으며 SDS-PAGE(InstantBlue™ stained and imaged using an IMAGEQUANT™ LAS 4010 instrument)로 분석하였고 상기 결과는 도 4에 나타내었으며, lane M은 Novex Protein Standards; lane 1은 IFN α-2a (1 μg); lane 2는 PEG 2-IFN α-2a, Day 0; lane 3은 PEG 2-IFN α-2a, Day 7; lane 4는 PEG 2-IFN α-2a, Day 14; lane 5는 PEG 2-IFN α-2a, day 28; lane 6은 PEG 1-IFN α-2a, Day 0; lane 7은 PEG 1-IFN α-2a, Day 7; lane 8은 PEG 1-IFN α-2a, Day 14; lane 9는 PEG 1-IFN α-2a, Day 28를 나타낸다. 도 4에서, 각 시점에서 많은 자유 단백질 및 적은 접합체가 남아있는 것을 보아 PEG 2-IFN α-2a는 PEG 1-IFN α-2a에 비해 안정성이 낮다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 4: PEG 시약 1과 함께 IFN -β-1b 의 접합
pH 7.3의 환원된 IFN-β-1b (9.5 mg, 0.3 mg/mL) 이황화를 pH 7.3의 PEG 시약 1(1.7 mL, 20 mg/mL)에 첨가하였다. 생성된 용액은 22℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 조질의 반응 혼합물은 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 젤은 InstantBlue™로 염색하였고 IMAGEQUANT™ LAS 4010 장비로 이미지화 하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서, lane M 는Novex Protein Standards; lane 1은 개시 IFN-β-1b; lane 2는 환원된 IFN-β-1b 및 lane 3은 IFN-β-1b과 함께한 PEG reagent 1의 반응 혼합물이다. 상기 SDS-PAGE 분석으로부터 110 kDa의 단백질 기준(protein standard)에서 생성된 밴드의 강도가 나타남으로써 IFN-β-1b의 PEG화가 성공적으로 발생하였음을 명확하게 알 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기 일반 화학식 1의 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pct00018

    여기서 각각의 X는 독립적으로 중합체 사슬(polymer chain)을 나타내고; p는 1에서 6의 정수를 나타내고; Y는 아미드기(amide group)을 나타내고; 및 Z는 -CH.(CH2L)2 또는 -C(CH2L)(=CH2)를 나타내고, 여기서 L은 각각 독립적으로 이탈기(leaving group)를 나타낸다.
  2. 제 1항에 있어서, 각각의 X가 폴리(알킬렌 글리콜)(poly(alkylene glycol)), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리옥사졸린(polyoxazoline), 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리메타크릴아미드(polymethacrylamide), HPMA 공중합체(HPMA copolymer), 폴리에스터(polyester), 폴리아세탈(polyacetal), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리(이미노 카보네이트)(poly(imino carbonate)), 폴리아미트(polyamide), 또는 폴리사카라이드(polysaccharide)인 것인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 각각의 X가 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol))인 것인 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 -NH-CO-인 것인 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, p는 3인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 L은 독립적으로 -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(halogen), 또는 -OØ를 나타내고, 여기서 R은 수소원자(hydrogen atom) 또는 알킬(alkyl), 아릴(aryl) 또는 알킬-아릴기(alkyl-aryl group)를 나타내고, Ø는 적어도 하나의 전자 회수 치환체(electron withdrawing substituent)를 포함하는 치환된 아릴기(aryl group)를 나타내는 화합물.
  7. 제 6항에 있어서, 각각의 L은 독립적으로 페닐설포닐(phenylsulfonyl) 또는 토실(tosyl)을 나타내는 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, 하기 화학식을 가지는 화합물:
    Figure pct00019

    또는
    Figure pct00020
    .
  9. 제 8항에 있어서, 각각의 X는 독립적으로 화학식 CH3O-(CH2CH2O)m-의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 나타내며, 여기서 m은 X에서 에틸렌 옥사이드 단위(ethylene oxide units)를 나타내는 화합물.
  10. 하기 일반 화학식 2b의 화합물:
    [화학식 2b]
    Figure pct00021

    여기서 X, p 및 Y는 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에서의 의미를 가지고, A는 CO, CHOH, CH.NH2, CH.NHR, CH.NR2, CH.OR CH.O.C(O)R, CH.NHC(O)R, or CH.N(C(O)R)2 그룹을 나타내며, 각각의 R은 수소원자(hydrogen atom) 또는 알킬(alkyl), 아릴(aryl) 또는 알킬-아릴기(alkyl-aryl group)을 나타내며, 및 Pr1 및 Pr2각각은 분리된 단백질 또는 펩티드 분자 또는 Pr1 및 Pr2 모두가 두 개의 포인트에서 결합된 단일 단백질 또는 펩티드를 나타낸다.
  11. 제 10항에 있어서, 하기 화학식을 가지는 화합물:
    [화학식 2c]
    Figure pct00022

    여기서 X, p, Y 및 A는 제 10항의 의미를 가지며, 및 Pr은 두 개의 분리된 포인트에서 결합된 단일 단백질 또는 펩티드를 나타낸다.
  12. 제 11항에 있어서, Pr은 단백질 또는 펩티드에서 디설파이드(disulfide) 결합으로부터 유래한 두 개의 황 원자(sulfur atoms), 또는 단백질 또는 펩티드에 부착된 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)에 존재하는 두 개의 히스티딘 잔기에 부착된, 단일 단백질 또는 펩티드를 나타내는 화합물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, Pr은 lgG Fab 조각, INF-α, IFN-β, 또는 컨센서스(consensus) IFN인 화합물.
  14. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 화합물과 단백질 및 펩티드를 반응하는 단계; 및 추가적으로 생성된 접합체(resulting conjugate) 내에서 케토기(keto group)로 환원시키는 단계를 포함하는, 제 10항 내지 13항 중 어느 한 항의 화합물의 제조 방법.
  15. 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 추가적으로 포함되는 유효성분과 함께 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
  16. 치료에 사용하기 위한, 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제 15항의 조성물.
  17. 약학적으로 허용 가능한 양의 제 1항 내지 제 9항, 및 제 16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제 15항의 약학적 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법.

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