ES2602044T3 - Nuevo péptido señal, y su utilización para la producción de proteínas recombinantes - Google Patents

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Abstract

Utilización de un péptido señal para la producción de un polipéptido recombinante de interés en un sistema de expresión, comprendiendo dicho péptido señal al menos 12 aminoácidos de fórmula (I): (X1)iX2X3X4SX5X6X7, en la que: - X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, i es igual a 0 o 1, - X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos seleccionados entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp, - X3 es un péptido que contiene de 3 a 5 aminoácidos, comprendiendo dicho péptido al menos 3 leucinas, contiguas, - X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, Met, - X5 es Ala o Val, - X6 es Gln, Asn o His, - X7 es Ala o Cys, con la condición de que: - cuando dicho péptido señal procede de un precursor natural de una proteína determinada, dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína, pudiendo cualquier polipéptido de interés estar enlazado a uno de dichos 30 péptidos señales para ser segregado en el medio extracelular.

Description

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Más particularmente, esta secuencia nucleotídica es la secuencia siguiente (SEC ID Nº 4): 5'
atgcgatggagctggatcttcctgctgctgctgagcatcaccagcgccaacgcc-3'. Los ácidos nucleicos que codifican uno de los péptidos señales según la invención pueden ser añadidos en el extremo 5' de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés mediante cualquier método conocido por el experto en la materia, por ejemplo la técnica de PCR.
La solicitud divulga también un precursor de un polipéptido recombinante de interés, en el que el péptido señal comprende al menos 12 aminoácidos de fórmula (I): (X1)iX2X3X4SX5X6X7, en la que: -X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, i es igual a 0 o 1,
-X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos, -X3 es un péptido que contiene de 3 a 5 aminoácidos, comprendiendo dicho péptido al menos 3 leucinas, contiguas o no,
-X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, Met, -X5 es Ala o Val, -X6 es Gln, Asn o His, -X7 es Ala o Cys,
con la condición de que cuando dicho péptido señal procede de un precursor natural de una proteína determinada, dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína, y cuando el péptido señal es MAWVWTLLFLMAAAQSAQA, dicho polipéptido de interés no sea un anticuerpo anti-CD23, pudiendo cualquier polipéptido de interés estar enlazado a uno de dichos péptidos señales para ser segregado en el medio extracelular.
La presente invención tiene también por objeto un precursor de un polipéptido recombinante de interés, en el que un péptido señal comprende al menos 12 aminoácidos de fórmula (I): (X1)iX2X3X4SX5X6X7, en la que:
-X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, i es igual a 0 o 1, -X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos seleccionados entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp,
-X3 es un péptido que contiene de 3 a 5 aminoácidos, comprendiendo dicho péptido al menos 3 leucinas contiguas, -X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, Met, -X5 es Ala o Val, -X6 es Gln, Asn o His,
-X7 es Ala o Cys, con la condición de que cuando dicho péptido señal procede de un precursor natural de una proteína determinada, dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína, pudiendo cualquier polipéptido de interés estar enlazado a uno de dichos péptidos señales para ser segregado en el medio extracelular, y en particular en el que el péptido señal es uno de los péptidos señales de la invención tales como se han definido anteriormente.
En un modo de realización particular, un precursor según la invención comprende un péptido señal que responde a la fórmula III o a la fórmula IV descritas anteriormente, en las que X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 tienen los significados indicados en la fórmula III.
En una ilustración de la descripción, un precursor comprende un péptido señal que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: X1X2LnX4SAX6A, en la que: -X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, -X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos, -n es el número de leucinas, siendo n un número superior o igual a 3,
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-X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, -X6 es Gln o Asn. En un modo de realización particular, un precursor según la invención comprende un péptido señal que comprende
la secuencia de aminoácidos siguiente: X1X2LnX4SAX6A, en la que: -X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, -X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos seleccionados entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe,
Trp, -n es el número de leucinas, siendo n un número superior o igual a 3, -X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, -X6 es Gln o Asn.
En un modo de realización particularmente ventajoso, un precursor de un polipéptido de interés según la invención comprende un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos siguiente: MRWSWIFLLLLSITSANA (SEC ID nº 1).
En una ilustración descrita, un precursor comprende un péptido señal que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: X1X2X3X4SVHC, en la que: -X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos,
-X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos, -X3 es un péptido que comprende 3 leucinas no contiguas, entre las cuales 2 leucinas están separadas por otro aminoácido hidrófobo seleccionado entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp,
-X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln,
con la condición de que cuando dicho péptido señal proceda de un precursor natural de una proteína determinada, dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína. En una ilustración descrita, un precursor de un polipéptido de interés comprende un péptido señal que consiste en la
secuencia de aminoácidos siguiente: MRWSWIFLFLLSITASVHC (SEC ID Nº 2), con la condición de que dicho
polipéptido de interés sea diferente de la cadena gamma de un anticuerpo anti-AMHRII. En una ilustración descrita, un precursor comprende un péptido señal que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: X2X3X4SAQA, en la que:
-X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos,
-X3 es un péptido que comprende 3 leucinas non contiguas, entre las cuales 2 leucinas están separadas por otro aminoácido hidrófobo seleccionado entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp, Leu, -X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Met,
con la condición de que cuando dicho péptido señal proceda de un precursor natural de una proteína determinada,
dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína. En un modo de realización particularmente ventajoso, un precursor de un polipéptido de interés según la invención comprende un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos siguiente: MAWVWTLLFLMAAAQSAQA (SEC ID Nº 3), con la condición de que dicho polipéptido de interés sea diferente de la cadena gamma de un anticuerpo anti-CD5, y que dicho polipéptido de interés sea diferente de un anticuerpo anti-CD23.
En un modo de realización particularmente, tal precursor según la invención es un precursor de un polipéptido recombinante de interés seleccionado entre una hormona, una enzima, una cadena de inmunoglobulina, una inmunoglobulina entera o cualquier fragmento derivado de una inmunoglobulina, una proteína que interviene en la reacción inmunitaria tal como citoquinas, interleucinas, factores del complemento, una proteína quimérica, u otras proteínas terapéuticas tales como factores de coagulación, proteínas de la matriz extracelular o receptores solubles.
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(X1)iX2X3X4SX5X6X7,
en la que:
5 -X1 es un péptido que contiene de 3 a 6 aminoácidos, i es igual a 0 o 1,
-X2 es un péptido que contiene de 3 a 9 aminoácidos hidrófobos seleccionados entre Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp,
-X3 es un péptido que contiene de 3 a 5 aminoácidos, comprendiendo dicho péptido al menos 3 leucinas, contiguas,
-X4 es un péptido que contiene de 2 a 5 aminoácidos seleccionados entre Ala, Thr, Ser, Gln, Ile, Met,
15 -X5 es Ala o Val,
-X6 es Gln, Asn o His,
-X7 es Ala o Cys,
en el extremo 5’ de un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de interés, para obtener un ácido nucleico que codifique el precursor del mencionado polipéptido recombinante de interés, con la condición de que cuando dicho péptido señal proceda de un precursor natural de una proteína determinada, dicho polipéptido de interés sea diferente de dicha proteína,
25 -la clonación del ácido nucleico artificial obtenido en la etapa anterior a un vector de expresión, para obtener un vector capaz de expresar el precursor de dicho polipéptido recombinante de interés, y
-la transfección de una línea celular de eucariota superior por el vector de expresión que comprende dicha secuencia nucleotídica artificial y la expresión de dicha secuencia nucleotídica,
-la recuperación del polipéptido recombinante de interés segregado en el medio de cultivo.
La recuperación de un polipéptido recombinante se puede efectuar mediante cualquier método conocido por el
35 experto en la materia, por ejemplo la precipitación, la centrifugación, la elución por cromatografía. Esta etapa se puede asociar también a una etapa de purificación del polipéptido.
Un vector de expresión utilizado en dicho procedimiento según la invención puede ser cualquier vector de expresión conocido por el experto en la materia, por ejemplo un vector que permite expresar in vitro un polipéptido en una línea celular de eucariota superior en transfección transitoria o estable.
En un modo de realización particular del procedimiento de producción según la invención, la línea celular eucariota se selecciona entre las líneas celulares: SP2/0, (SP2/0-Ag 14), NS0, otros mielomas de rata como IR983F, líneas humanas como Namalwa, Wil-2, Jurkat, Molt-4, PER.C6, HEK293T/17, HEK293, HEK-293.2, Vero, Cos-1 o Cos-7,
45 BHK, CHO-K-1, CHO-Lec1, CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO DX B11 y CHO DG44 y otras líneas como EBx con, en particular, EB66K6H6, y P3X63Ag8.653, YB2/0, CHO-S y HEK-293F.
En un modo de realización particular del procedimiento de producción según la invención, el polipéptido recombinante de interés se selecciona entre una hormona, una enzima, una cadena de inmunoglobulina, una inmunoglobulina entera o cualquier fragmento derivado de una inmunoglobulina, una proteína que interviene en la reacción inmunitaria, tales como citoquinas, interleucinas, factores del complemento, una proteína quimérica, o cualquier otras proteínas terapéuticas, tal como factores de coagulación, proteínas de la matriz extracelular, receptores solubles.
55 En un modo de realización particular de la invención, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de anticuerpo recombinantes:
-la adición de un ácido nucleico que codifica el péptido señal MRWSWIFLLLLSITSANA en el extremo 5’ de un ácido nucleico que codifica una cadena de inmunoglobulina, para obtener un ácido nucleico que codifique el precursor de una cadena de inmunoglobulina,
-la clonación del ácido nucleico artificial obtenido en la etapa anterior a un vector de expresión, para obtener un vector capaz de expresar el precursor de una cadena de inmunoglobulina,
65 -la transfección de una línea celular de eucariota superior seleccionado de entre PER.C6, YB2/0, CHO-S y HEK 293, por el o los vectores de expresiones que comprenden dicha secuencia nucleotídica artificial y la expresión
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Figura 8A: la figura 8A muestra la recuperación de la viabilidad después de la transfección para el anti-CD20 unido respectivamente a su péptido señal natural (rombo), al péptido señal XXII49 (cuadrado), al péptido señal MB7 (triángulo), y al péptido señal 12G4 (cruz). El eje de las ordenadas representa el porcentaje de viabilidad. El eje de las abscisas representa los días post-transfección. Los resultados son la media sobre los tres Pools estables.
Figura 8B: la figura 8A muestra la recuperación de la viabilidad después de la transfección para el anti-Rh(D) unido respectivamente a su péptido señal natural (rombo), al péptido señal XXII49 (cuadrado), al péptido señal MB7 (triángulo), y al péptido señal 12G4 (cruz). El eje de las ordenadas representa el porcentaje de viabilidad. El eje de las abscisas representa los días post-transfección. Los resultados son la media sobre los tres Pools estables.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y métodos
1.1 Péptidos señales analizados
Se seleccionan por los inventores siete péptidos señales procedentes respectivamente de una cadena polipeptídica que lleva naturalmente un péptido señal para analizar el poder secretor de estos 7 diferentes péptidos señales.
Estas 7 cadenas polipeptídicas son respectivamente la cadena gamma de un anticuerpo anti-AMHRII (12G4, I-3673 CNCM) la cadena gamma de un anticuerpo anti-CD5 (XXII49, dato no publicado), la cadena gamma de un anticuerpo anti-RhD (D29, FR 2861078), la cadena gamma de un anti-receptor LDL (5E5, I-3488 CNCM), la cadena kappa de un anticuerpo anti-CD20 (Cat13, proveedor: DSMZ, ref. ACC 474), la cadena α del receptor TCR de linfocito T2 (HAVT20, número de acceso Genbank H32536) y la eritropoyetina humana (EPO, número de acceso Genbank AAI43226).
El poder secretor de un péptido señal se aprecia según dos aspectos, a saber la capacidad de direccionamiento y la capacidad para ser escindido.
Descripciones y predicciones del poder secretor de un péptido señal son analizadas previamente (Emanuelsson et al., Nature Protocols 2, 953-971 (2007)).
Los péptidos señales (PS) se han sometido en el algoritmo SeñalP V3.0 en forma de proteína de fusión PS/cadena ligera del anticuerpo anti-Rh(D) T125 (FR2807767).
1.2 Construcción de los vectores de expresión para la evaluación de PS sobre la expresión de la cadena ligera del anticuerpo anti-Rh(D) T125
El método es idéntico para cada PS, se descompone en dos series de PCR. Una primera PCR se efectúa con los cebadores P1 y P2, que permiten la síntesis de las 40 a 50 bases de PS y la integración del sitio NheI en 5' de la secuencia. Se realiza una segunda PCR en paralelo con los cebadores P3 y P2_Kappa_XbaI y como matriz el plásmido RSV-int_KT125 2stp. Permitirá a continuación la unión entre PS y la cadena kappa e integrar en 3' el sitio de clonación XbaI. Se efectúa después una tercera PCR. Esta PCR de ensamblaje se realiza con los cebadores P1 y P2_Kappa_XbaI (Figura 1).
A fin de limitar los errores de incorporación de nucleótidos, la enzima Proofreading (proofstart Taq, Qiagen) se utiliza para la amplificación de ADN, y el número de ciclos es limitado.
Las PCR son realizadas en las siguientes condiciones:
Activación de enzima 94°C, 5 min.
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Extensión final 72°C 2 min. Los cebadores utilizados son los siguientes:
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(12G4)/kappa(T125)
P1_12G4 (SEC ID Nº 5) 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGCGATGGAGCTGGATCTT-3' P2_12G4 (SEC ID Nº 6) 5'-CACTTGCAGTTATTGACAGGAGGAAGAGAAAGATCCAGCT-3' P3_12G4 (SEC ID Nº 7) 5'-ACTGCAAGTGTCCATTGCGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
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* Para la construcción de la cadena de fusión PS(XXII49)/kappa(T125)
P1_XXII49 (SEC ID Nº 8) 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTT-3' P2_XXII49 (SEC ID Nº 9) 5'-CACTTTGGGCAGCTGCCATCAGGAATAGCAAGGTCCACAC-3' P3_XXII49 (SEC ID Nº 10) 5'-GCCCAAAGTGCCCAAGCAGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(D29)/kappa(T125)
P1_D29 (SEC ID Nº 11) 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGAGCTTGGGCTGAGCTG-3' P2_D29 (SEC ID Nº 12) 5'-ACACCTCTTAAAAGAGCAACGAGAAAAACCCAGCTCAGCCC-3' P3_D29 (SEC ID Nº 13) 5'-TTAAGAGGTGTCCAGTGTGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(5E5)/kappa(T125)
P1_5E5 (SEC ID Nº 14) 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGGTTGGAGCTGTATCAT-3' P2_5E5 (SEC ID Nº 15) 5'-ACACCTGTAGCTGTTGCTACCAGAAAGAAGATGATACAGCTC-3' P3_5E5 (SEC ID Nº 16) 5'-AGCTACAGGTGTGCACTCCGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(CAT13)/kappa(T125)
P1_CAT13 (SEC ID Nº 17): 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC-3' P2_CAT13 (SEC ID Nº 18): 5'-CATTATGACTGAAGCACTGATTAGCAGGAAGCTGAAAATCTGCAC-3' P3_CAT13 (SEC ID Nº 19): 5'-CTTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(EPO)/kappa(T125)
P1_EPO(H) (SEC ID Nº 20): 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTG-3' P2_EPO(H) (SEC ID Nº 21): 5'-CAGAGGGAGCGACAGCAGGGACAGGAGAAGCCACAGCCAGGCAGGA-3' P3_EPO(H) (SEC ID Nº 22): 5'-TCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3'
* Para la construcción de la cadena de fusión PS(HAVT20)/kappa(T125)
P1_HAVT20 (SEC ID Nº 23): 5'-CTCTTGCTAGCGCCGCCACCATGGCATGCCCTGGCTTCCTGT-3' P2_HAVT20 (SEC ID Nº 24): 5'-AATTCAAGACAGGTGGAGATCACAAGTGCCCACAGGAAGCCAG-3' P3_HAVT20 (SEC ID Nº 25): 5'-CCTGTCTTGAATTTTCCATGGCTGCCATCCGGATGACCCAGTCTC-3' P2_KAPPA_Xba1 (SEC ID Nº 26): 5'-GCGAGCTCTAGAGTTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3'
El vector RSV-int_KT125 2stp está digerido por NheI y XbaI. Se elimina un fragmento de 725 bases, que corresponde a la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ligera de T125. Se recupera un fragmento de 5028 bases. El producto de PCR así preparado está también digerido por NheI y XbaI. Los fragmentos después de la digestión se recuperan y se purifican por Nuleospin® Extract (Clonetech). El producto de PCR así digerido se clona entre los sitios NheI y XbaI en el vector de expresión RSV-int KT125-2stp en lugar de la cadena ligera ya presente. La inserción correcta del producto PCR se verifica mediante una PCR con la ayuda de dos cebadores: P1 y P2_KAPPA_Xba1. Se debe obtener un amplicón de aproximadamente 750 a 760 bases que sigue a los péptidos señales, cuando el vector se ha construido correctamente. La inserción correcta del producto PCR en el vector está también verificada por la secuenciación utilizando el cebador 2BGHPA representada por la secuencia SEC ID Nº 27 (5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3').
1.3 Construcción de los vectores de expresión para la evaluación de PS sobre la expresión de los anticuerpos antiRh(D) T125 y anti-CD20
En base al mismo principio que anteriormente (sección 1.2), los PS del anti-AMHRII, del anti-CD5, y de PS artificial MB7 son añadidos a las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-Rh(D) T125 y anti-CD20 por PCR de ensamblaje (Tabla 3), PCR convencional (Tabla 2) o simple clonación (Tabla 1) de los fragmentos generados en la primera parte de estudio según las tablas siguientes:
Tabla 1
Cadenas
Vector final
Nombre
Vector Enzima1 Enzima2 Tamaño (pb) nombre
K_WT_R593
RSV_int_KT125_2STP Nhel Xbal 725 WT_R593
K_XXII49_R593
RSV_PSG_XXII49_KT125 Nhel Xbal 722 XXII49_R593
K_AMHRII_R593
RSV_PSG_AMHRII_KT125 Nhel Xbal 722 AMHRII_R593
Tabla 2
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en suspensión previamente centrifugadas y recogidas a 1E6 c/ml en F17 293 EM e incubado a 200 rpm a 37°C, 8% de CO2. Se recogen los sobrenadantes a D+5 para la evaluación del porcentaje de molécula segregada en el medio.
1.5 Transfección estable
5 Las evaluaciones son realizadas en pools de transfectantes («transfección en pool estable») con el fin de comparar las diferentes construcciones en base a un nivel de expresión promedio en un gran número de transfectantes (varios miles).
10 En YB2/0, se realizan las transfecciones en pool estables de la siguiente manera:
Las células deben tener un crecimiento estabilizado, y ser descongeladas durante al menos 4 semanas en medio EMS + 5% SVF en flask F150 (80ml). Las células son trasplantadas la víspera a 2E5 cv/ml en medio EMS + 5% SVF.
15 El día de la electroporación, las células son electroporadas por Gene Pulser Xcell (BioRad) con un voltaje de 230V y una capacidad de 960 µF en cubetas (Biorad) de 4 mm con 5E6 cv (csp 500 µl de tampón de electroporación del kit electrobuffer (Ozyme) que contiene el ADN plasmídico linealizado). Después de la electroporación, se realiza la dispersión en placas de 24 pocillos (P24) (25000 células/pocillo) en medio EMS + 5% SVF.
20 En D+3: Puesta en medio selectivo para obtener las concentraciones finales siguientes: EMS + 5%SVF + G418 1g/1
+ rojo de fenol 1%.
A D+7: Renovación de las placas con el medio correspondiente.
25 A D+10: Cuando los pocillos han desarrollado bien, se realizan 3 pools de 8 pocillos P24, se trasplantan las células a 2E5 cv/ml en F25 y se realiza una producción máxima (Prod. max. a D+7), se recoge y evalúa el sobrenadante en FastElysa.
En PER.C6, las células parentales utilizadas son unas células PERC6SF adaptadas en medio Permab
30 (ThermoFisher) y cultivadas durante 3 semanas bajo agitación a 100 rpm. Dos días antes de la electroporación, las células trasplantadas se pasan a 5E5 cv/ml por un cambio completo del medio Permab. El día de la electroporación, cada pool se prepara mediante 5 electroporaciones en unas cubetas de 4mm para 6E6 cv con 8 µg de ADN plasmídico linealizado. Las células son electroporadas por Gene Pulser Xcell (BioRad) según las instrucciones del fabricante.
35 48 horas después de la transfección, se añade la presión de selección (G418 a 125 µg/ml) a las células que son mantenidas en cultivo durante aproximadamente 4 a 5 semanas adaptando el volumen de cultivo para mantener una concentración de 3E5 cv/ml a cada paso. Después de una caída de viabilidad celular hasta un 20%, las células se pasan a condición agitada. Cuando la viabilidad alcanza aproximadamente el 50% y al 85%, se efectúa una
40 evaluación de la productividad del pool sobre unos cultivos en “batch” a D+7.
Para cada construcción, se efectúan 3 pool diferentes por línea celular y se analizan. Las producciones en pool son expresadas en ng/ml.
45 1.6 Evaluación del porcentaje de proteína recombinante segregada
La evaluación del porcentaje de cadena kappa libre del anticuerpo anti-Rh(D) T125 así como la producción de IgG1 de anti-CD20 o de anti-Rh(D) T12 se determinan mediante la técnica Enzima-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
50 La cadena kappa libre presente en el sobrenadante de cultivo se captura durante 2h por un anticuerpo de cabra antikappa humano (Caltag Lab) que es absorbido sobre unas placas de 96 pocillos. El anticuerpo capturado se revela después por un anti-kappa humano de cabra biotenilado (Pierce) y después se añade estreptavidina acoplada con peroxidasa (Pierce). Entre cada etapa, se efectúan 4 lavados para eliminar las proteínas poco reactivas que no entran en el complejo. La revelación se realiza por adición del sustrato de la enzima, el PD (Sigma) y detención de la
55 reacción por HCl 1N. La lectura se realiza por espectrofotómetro a 492nm. La concentración de anticuerpo se determina en comparación con una escala patrón.
Las IgG1 producidas en transfección transitoria y estables son evaluadas mediante el kit Fast ELYSA (RD-biotech) según las instrucciones del proveedor. La lectura de la densidad óptica se realiza con espectrofotómetro a 450nm.
60 La concentración de anticuerpo se determina en comparación con una escala patrón contenida en el kit.
La comparación se efectúa entre la cadena kappa del anticuerpo anti-Rh(D) T125 segregada por los péptidos señales según la invención y la segregada por su péptido señal natural.
La comparación se efectúa también entre el anticuerpo anti-Rh(D) T125 o el anticuerpo anti-CD20 producido con la ayuda de al menos uno de los péptidos señales según la invención y el producido por los péptidos señales naturales de cada uno de los anticuerpos respectivamente.
5 El péptido señal natural de la cadena ligera del anticuerpo anti-Rh(D) T125 está codificado por el ácido nucleico SEC ID Nº 30 (atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggctcccaggtgccagatgt).
El péptido señal natural de la cadena pesada del anticuerpo anti-Rh(D) T125 está codificado por el ácido nucleico SEC ID Nº 31 (atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgt).
10 El péptido señal natural de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 está codificado por el ácido nucleico SEC ID Nº 32 (atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcttcagtcataatgtccagagga).
El péptido señal natural de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 está codificado por el ácido nucleico SEC ID 15 Nº 33 (atgggattcagcaggatctttctcttcctcctgtcagtaactacaggtgtccactcc).
Ejemplo 2: Evaluación in vitro de los péptidos señales sobre la secreción de una cadena ligera de anticuerpo
El poder secretor de estos 7 péptidos señales se ensaya in vitro en transfección transitoria en las líneas PER.C6, 20 CHO-S, YB2/0. El método de transfección transitoria está descrito en la parte anterior (véase la parte 1.2).
2.1 Efecto de 7 péptidos señales en la línea PER.C6
Los resultados obtenidos a partir de las 4 transfecciones transitorias realizadas sobre 4 semanas diferentes permiten 25 observar unas diferencias significativas entre los PS.
Se realiza una comparación múltiple para los promedios (ng/ml) de producción de cadena ligera de Ig obtenidas con los diferentes péptidos señales en la línea PER.C6 (Tabla 4). El método actualmente utilizado para discriminar entre los promedios es el procedimiento de las diferencias significativas mínimas de Fisher (LSD). Unos ensayos de las
30 múltiples extensiones se efectúan con el método 95,0% LSD. Estos pares tienen unas diferencias estadísticamente significativas a nivel de confianza del 95,0%.
Tabla 4
Efectivo
Promedio Grupo homogéneo
EPO_h
16 3828,92 X
PSK_CAT13
16 3834,16 X
HAVT20
16 3985,15 X
PSG_12G4
16 4468,87 XX
PSG_5E5
16 5207,61 XX
PSG D29
16 5563,95 X
PSG_XXII49
16 5696,46 X
35 Dos grupos homogéneos son identificados utilizando unas columnas de X. En cada columna, los niveles que contienen unas X forman un grupo de promedios en el interior de los cuales no hay diferencias estadísticamente significativas. Los péptidos señales de las cadenas pesadas de los anticuerpos XXII49 y D29 son significativamente más eficaces en la producción de la cadena ligera de Ig (anti-Rh(D)) que los PS del anticuerpo Cat13 (anti-CD20), de HAVT20, y de EPO.
40 Se mantienen las diferencias de producción obtenidas entre los diferentes PS. Sin embargo, los PS de las cadenas pesadas del anticuerpo XXII49 y del anticuerpo D29 se destacan de las otras en la línea PER.C6, con una ligera ventaja para el del anticuerpo XXII49. Los tres peores péptidos son los del anticuerpo Cat13, de HAVT20, y de EPO.
45 2.2 Efecto de 7 péptidos señales en la línea YB2/0
Los resultados obtenidos a partir de las 5 transfecciones realizadas en 5 semanas diferentes permiten observar unas diferencias significativas entre los PS.
50 Se realiza una comparación múltiple para los promedios (ng/ml) de producción de cadena ligera de Ig obtenidos con los diferentes péptidos señales en la línea YB2/0 (Tabla 5). El método actualmente utilizado para discriminar entre los promedios es el procedimiento de las diferencias significativas mínimas de Fisher (LSD). Unos ensayos múltiples de las extensiones son efectuados con el método 95,0% LSD. Estos pares tienen unas diferencias estadísticamente significativas a nivel de confianza del 95,0%.
55 Tabla 5
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