ES2598007T3

ES2598007T3 - Procedimiento de tratamiento del plasma sanguíneo que comprende una etapa de lavado por dispersión

Info

Publication number: ES2598007T3
Application number: ES10787915.7T
Authority: ES
Inventors: Thierry Trusgnich
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2017-01-24
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: EP2501713A1; KR20120089750A; CN102639554A; FR2952641A1; US20130140237A1; IL219507A0; CA2780942A1; US9504714B2; WO2011061705A1; AR079054A1; EP2501713B1; BR112012011772A2; FR2952641B1; AU2010320508A1

Abstract

Procedimiento de tratamiento del plasma sanguíneo que comprende las etapas de: a) precipitación etanólica del plasma o de una fracción de plasma; b) recuperación del precipitado formado en la etapa a); c) lavado de dicho precipitado por dispersión que se realiza utilizando un dispersor de tipo rotor/estator; d) recuperación de una pasta plasmática lavada; y e) solubilización de dicha pasta plasmática lavada.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende una etapa de lavado por dispersion Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende las etapas de precipitacion etanolica del plasma o de una fraccion de plasma, de recuperacion del precipitado, de lavado de dicho precipitado, de recuperacion de una pasta plasmatica lavada, de solubilizacion de dicha pasta plasmatica lavada.

Estado de la tecnica

El fibrinogeno es una protema esencial de la coagulacion sangumea, ya que su polimerizacion en fibrina insoluble formada al final de la cascada de reacciones que controlan la coagulacion, conduce a la formacion de un coagulo que obtura la brecha vascular, responsable del sangrado. La colocacion del coagulo es asf esencial para asegurar la detencion del sangrado. Ademas, la fibrina formada a nivel de la herida constituye una red fibrilar que asegura la reparacion tisular (cicatrizacion).

Las deficiencias congenitas de fibrinogenos pueden conducir a graves patologfas. Para curar estas deficiencias, es necesario disponer de concentrados de fibrinogeno que pueden ser administrados a pacientes en tratamiento. Otras patologfas tambien se pueden curar con aportes de fibrinogeno, en particular en caso de perdidas masivas de sangre (cirugfas, traumatismos, etc.), o tras una coagulopatfa de consumo descompensado (CIVD).

Por otro lado, los pegamentos biologicos activables por la trombina, que contiene fibrinogeno como constituyente principal y de Factor XIII (FXIII), son eficazmente utilizados para la reparacion tisular durante usos clmicos, tales como injertos de piel, suturas nerviosas o arteriales, como se describe, por ejemplo, en las patentes EP 0 305 243, FR 2 448 900 y FR 2 448 901.

La presencia de Factor XIII o transglutaminasa en estos productos contribuye a estabilizar la fibrina por la creacion de enlaces covalentes intercatenarios, que la hacen insoluble. En algunos casos, estos productos son obtenidos segun unos procedimientos de produccion de fibrinogeno bastante complejos que necesitan un aporte exogeno de Factor XIII purificado, con el fin de que puedan realizar su funcion terapeutica.

En consecuencia, la provision de concentrados de fibrinogeno, de pegamentos biologicos, y de Factor XIII, en particular con fines terapeuticos, requiere unas tecnicas de purificacion que conducen a estos productos, no solo suficientemente purificados de contaminantes de naturaleza diversa, tales como las protemas acompanantes o coprecipitadas, los anticuerpos o las proteasas, sino ademas asegurados en el plano viral.

El aislamiento de fracciones enriquecidas en fibrinogeno, que contiene eventualmente FXIII, a partir del plasma, se conoce y se ha descrito inicialmente por lo trabajos de Cohn y Nitschmann (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 y Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Unos metodos mas recientes asocian unas tecnicas de precipitacion de diferentes fuentes de plasma y unas tecnicas de filtracion, de cromatograffa, de inactivacion viral, etc. Se pueden citar, a tttulo de ejemplo, las solicitudes de patentes EP 0 359 593, US 5 099 003, EP 0 305 243, FR 2 448 900 y FR 2 448 901.

Parece, no obstante, que la mayona de los procedimientos conocidos en el estado de la tecnica implican la utilizacion de cadenas de produccion distintas y, por lo tanto, de metodos diferentes para producir unos concentrados o unas composiciones de fibrinogeno, de pegamento biologico o enriquecido en fibrinogeno y que contiene otras protemas acompanantes como el FXIII, el factor VIII, la fibronectina, el factor von Willebrand, etc. La mayona de los procedimientos conocidos son, por lo tanto, poco adecuados para una realizacion a escala industrial, en particular cuando existe una necesidad conjunta de pegamento biologico, de fibrogeno y de factor XIII. La complejidad de realizacion de estos procedimientos de purificacion a escala industrial aumenta tambien cuando las protemas de interes estan destinadas a un uso terapeutico y deben ser sometidas a tratamientos de desactivacion y/o de eliminacion de los virus y otros contaminantes indeseables, como por ejemplo el prion.

La solicitud de patente EP 1 739 093 describe un procedimiento unico que permite separar las protemas fibrinogena, Factor XIII y pegamento biologico de una fraccion plasmatica solubilizada que comprende fibrinogeno y Factor XIII, y que conduce a la preparacion de concentrados liofilizados de dichas protemas. El procedimiento descrito en la solicitud EP 1 739 093 comprende en particular las etapas de purificacion cromatografica de una fraccion plasmatica solubilizada en un intercambiador de aniones de tipo base debil en condiciones que permiten la retencion del pegamento biologico, de elucion espedfica de este pegamento, de separacion de FXIII a partir de fibrinogeno por adicion de al menos un agente qmmico que precipita FXIII, de recuperacion de la solucion resultante de sobrenadante de fibrinogeno purificado y de diafiltracion de las soluciones de fibrinogeno, de pegamento biologico y de FXIII puesto de nuevo en solucion, seguida de una liofilizacion de dichas soluciones. El procedimiento descrito en la solicitud de patente EP 1 739 093 puede tambien comprender al menos una etapa de tratamiento de inactivacion

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viral y/o de eliminacion de virus y de contaminantes, siendo el tratamiento seleccionado entre el tratamiento qmmico de inactivacion viral, la nanofiltracion y el tratamiento termico de inactivacion viral en seco. Sin embargo, las tecnicas de re-suspension utilizadas en los procedimientos conocidos en el estado de la tecnica no son totalmente satisfactorias. En efecto, en estos procedimientos conocidos en el estado de la tecnica, el fenomeno de cizallamiento que se produce durante la re-suspension puede generar una degradacion de las protemas de interes Existe por lo tanto una alta necesidad de la realizacion de mejoras tecnicas susceptibles de disminuir la degradacion de las protemas de interes y aumentar el grado de pureza de las protemas extrafdas.

Resumen de la invencion

La solicitante ha descubierto, de manera sorprendente, que la puesta en practica de una etapa de lavado por dispersion durante la fase preliminar de preparacion de la fraccion plasmatica solubilizada utilizada como materia prima en el ambito del procedimiento, por ejemplo, de la solicitud EP 1 739 093, permite mejorar de manera significativa la calidad del lavado con respecto a los procedimientos del estado de la tecnica, que describen solo una etapa de lavado por re-suspension. Parece que la puesta en practica de una etapa de lavado por dispersion conduce a un aumento del grado de pureza del fibrinogeno en la fraccion plasmatica solubilizada y, posteriormente, en los concentrados de fibrinogeno y de pegamento biologico que resultan de la aplicacion del procedimiento, por ejemplo, de la solicitud EP 1 739 093.

Los beneficios obtenidos por la invencion no estan limitados al unico procedimiento objeto de la solicitud EP 1 739 093, sino que se obtendran con los procedimientos que utilizan la fraccion etanolica (fraccion I de Cohn).

La presente solicitud describe por lo tanto un procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende las etapas de:

a) precipitacion etanolica del plasma o de una fraccion de plasma;

b) recuperacion del precipitado formado en la etapa a);

c) lavado de dicho precipitado por dispersion;

d) recuperacion de una pasta plasmatica lavada; y

e) solubilizacion de dicha pasta plasmatica lavada.

El lavado por dispersion de la etapa c) es realizado, preferentemente, utilizando un dispersor de tipo roto/estator. Ventajosamente, el dispersor utilizado es un dispersor en lmea, siendo el precipitado de la etapa b) alimentado en la entrada axial del dispersor y siendo el producto lavado expulsado por la salida radial del dispersor.

El procedimiento de la solicitud puede tambien comprender las etapas adicionales de:

f) tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada por hidroxido de aluminio y/o tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada a baja temperatura; y

g) obtencion de una fraccion plasmatica soluble por filtracion clarificante y/o esterilizante del sobrenadante que resulta de la etapa f).

El procedimiento tal como se describe puede finalmente comprender unas etapas suplementarias de:

h) purificacion cromatografica de la fraccion plasmatica soluble de la etapa g) en una resina de tipo intercambiador de aniones de tipo base debil previamente equilibrado por un tampon de fuerza ionica predeterminada de pH basico, en condiciones que permiten la retencion del pegamento biologico, siendo dicho pegamento biologico eluido por aumento de la fuerza ionica de dicho tampon;

i) precipitacion de FXIII a partir de todo o parte del eluato de pegamento biologico obtenido en la etapa h) por adicion de al menos un agente qmmico que precipita el FXIII;

j) recuperacion de una solucion de fibrinogeno purificado que corresponde al sobrenadante de la etapa i); y

k) diafiltracion de las soluciones de fibrinogeno, y/o de pegamento biologico y/o de FXIII pueto de nuevo en solucion, seguida de una liofilizacion de dichas soluciones.

Asf, el procedimiento descubierto por la solicitante, que comprende la puesta en practica de una etapa de lavado por dispersion, permite asf obtener unos concentrados de fibrinogeno, de factor XIII y/o de pegamento biologico liofilizados, altamente purificados, sustancialmente desprovistos de protemas co-purificadas y de contaminantes indeseables. En efecto, la etapa de lavado por dispersion conduce a un mejor lavado de la fraccion plasmatica inicial

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que comprende las protemas de interes, y en particular el fibrinogeno, y conduce a una mejora significativa del grado de pureza de estos compuestos durante unas etapas ulteriores del procedimiento, con respecto a los lavados por simple re-suspension descritos en el estado de la tecnica.

La puesta en practica de una etapa de lavado por dispersion conduce, por lo tanto, a una pureza mas elevada, en un procedimiento simple, rapido y poco costoso, y asegura una rentabilizacion mejorada de la materia prima (plasma o fraccion de plasma) a escala industrial. Esto da como resultado una optimizacion significativa de la produccion de pegamento biologico, de Factor XIII y/o de fibrinogeno, reduciendo al mismo tiempo los costes de produccion asociados a ello.

El procedimiento de la invencion permite ademas obtener unos concentrados de protemas liofilizadas y altamente purificadas, a partir de una materia prima plasmatica que contiene preferiblemente fibrinogeno y Factor XIII, permaneciendo compatible con al menos un tratamiento de inactivacion y/o de eliminacion de los virus y de otros contaminantes indeseables (tales como unos polfmeros, unos agregados o unos priones).

Breve descripcion de los dibujos

La unica figura es una representacion esquematica de un dispersor roto/estator.

Descripcion detallada de modos de realizacion de la invencion

La presente invencion se refiere por lo tanto a un procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende las etapas de:

a) precipitacion etanolica del plasma o de una fraccion de plasma;

b) recuperacion del precipitado formado en la etapa a);

c) lavado de dicho precipitado por dispersion, utilizando un dispersor de tipo rotor/estator;

d) recuperacion de una pasta plasmatica lavada;

e) solubilizacion de dicha pasta plasmatica lavada.

El procedimiento de la invencion se puede realizar a partir de fuentes variadas de materia prima plasmatica, y en particular a partir de fuentes que contienen fibrinogeno y Factor XIII. Este procedimiento se puede realizar asf directamente a partir del plasma utilizando el metodo de fraccionamiento de Cohn, utilizando alcohol frio (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 y Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424).

Ventajosamente, las etapas b) y d) del procedimiento de la invencion se realizan por centrifugacion.

En el sentido de la presente invencion, el termino “dispersion” designa la separacion de las partmulas de precipitado etanolico y su distribucion homogenea o sustancialmente homogenea en el medio constituido por el tampon de lavado. Esta dispersion se distingue de los metodos de re-suspension descritos en el estado de la tecnica, en particular, por que estos ultimos no permiten distribuir las partmulas de manera homogenea.

Un dispersor de tipo rotor/estator comprende generalmente al menos un rotor y al menos un estator dentados, que forman un conjunto a gran velocidad de cizallamiento. El producto (aqu el precipitado etanolico mezclado con el tampon de lavado) penetra en la zona de dispersion entre las ranuras del rotor dentado y vuelve a salir por las ranuras de la corona del estator, asegurandose el efecto de bombeado por la maquina en sf. La corona interior del rotor aumenta la velocidad de paso del producto, la corona del estator la frena bruscamente, favoreciendo la dispersion final del producto. Las fuertes turbulencias en la ranura de cizallamiento trituran y dispersan con eficacia las partmulas solidas en una distribucion homogenea. La geometna del rotor y del estator puede ser adaptada a las condiciones de dispersion del producto. Tal dispersor esta representado en la unica figura.

El dispersor, en particular rotor/estator y en particular en lmea, permite por lo tanto obtener una solucion homogenea o sustancialmente homogenea, con una dispersion muy fina, homogenea o sustancialmente homogenea del precipitado etanolico en el tampon de lavado, y contribuye asf a la eliminacion de una proporcion mas elevada de contaminantes proteicos.

Aunque la utilizacion de dispersores de tipo rotor/stator es conocido en el estado de la tecnica para la preparacion de emulsiones, para la puesta en suspension de pigmentos, para la incorporacion de detergentes en una solucion, para la fabricacion rapida de soluciones coloidales y para la homogeneizacion de polvos y otros productos similares, conviene sin embargo senalar que la utilizacion de tales dispersores no esta descrita en el ambito de procedimientos de purificacion de protemas plasmaticas.

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En efecto, se sabe que la utilizacion de un dispersor provoca un calentamiento de la solucion o de la suspension preparada, y que tal dispersor no puede ser utilizado en un recipiente termostatado. En consecuencia, parece probable, a fecha de la presente invencion, considerar que la utilizacion de un dispersor en el ambito de procedimientos de preparacion de productos plasmaticos conducina a un aumento de la temperatura, provocando asf la degradacion de las protemas plasmaticas.

Ahora bien, la solicitante ha observado de manera sorprendente que la utilizacion de un dispersor reduce el tiempo necesario para la dispersion y disminuye en realidad el calentamiento de esta ultima. Asf, a diferencia del prejuicio tecnico en vigor, y de manera sorprendente, la utilizacion de un dispersor se muestra particularmente apropiada en el ambito de un procedimiento de purificacion de protemas plasmaticas, en la medida en la que no genera degradacion ninguna del producto.

Por otro lado, la solicitante ha observado tambien que la utilizacion de un dispersor conduce a una disminucion significativa de la cantidad de protemas contaminantes.

En un modo de realizacion preferido, la etapa de lavado por dispersion de la etapa c) del procedimiento de la invencion se lleva a cabo utilizando un dispersor en lmea. En este caso particular, el dispersor de tipo rotor/estator, esta montado en la misma lmea de produccion que los otros elementos industriales requeridos para llevar a cabo el procedimiento de purificacion. El precipitado de la etapa b) se encuentra por lo tanto suministrado, preferiblemente con el tampon de lavado, en la entrada axial del dispersor en lmea y el producto lavado, que corresponde a una dispersion sustancialmente homogenea del precipitado etanolico en el tampon de lavado, se expulsa a la salida radial del dispersor en lmea.

La utilizacion de un dispersor en lmea ofrece ademas todas las garantias de asepsia, ya que la maquina esta disenada para un desmontaje simple y una limpieza facil, y se puede integrar en un sistema NEP (limpieza en el lugar).

Como se ha discutido anteriormente, el lavado del precipitado etanolico por un dispersor durante la etapa c) del procedimiento de la invencion conduce a la obtencion de una suspension homogenea o sustancialmente homogenea (un homogeneizado) del precipitado etanolico en el tampon de lavado utilizado. Esta suspension homogenea o sustancialmente homogenea se puede caracterizar por un control visual que permite verificar la ausencia de aglomerado en la suspension.

En un modo de realizacion particular, la etapa c) de la presente invencion se realiza utilizando un recipiente equipado con un movil de agitacion de tipo pala defloculadora. Este movil de agitacion permite realizar la dispersion primaria, que conduce a una pasta defloculada pero no homogenea. El movil de agitacion esta acoplado a un sistema de dispersion en lmea, que permite realizar la dispersion secundaria que conduce a una suspension fina y homogenea.

En un modo de realizacion preferido, la recuperacion del precipitado efectuada en la etapa b) y/o la recuperacion de la pasta plasmatica efectuada en la etapa d) se llevan a cabo por centrifugacion. Preferiblemente, la recuperacion de la pasta plasmatica en la etapa d) se efectua por utilizacion de una centrifugadora de inyeccion. En este caso particular, el precipitado lavado por dispersion de la etapa c) se introduce en una centrifugadora industrial mediante inyectores cuyo diametro esta calibrado en funcion del tamano de las partmulas en suspension. En un modo de realizacion preferido, la centrifugadora de inyeccion es una centrifugadora de tipo “Sharpless AS 16” o “westfalia separator”, que posee unos inyectores espedficos calibrados en funcion del separador utilizado (2 a 4 mm).

El lavado por dispersion de la etapa c) permite obtener una suspension que comprende partmulas muy finas de precipitado etanolico en el tampon de lavado. Esto da como resultado que la suspension sustancialmente homogenea formada demuestra ser particularmente muy adecuada para la utilizacion de una centrifugadora de inyectores, en la medida en la que previene ventajosamente la obstruccion de los inyectores de la centrifugadora.

En un modo de realizacion preferido, la solubilizacion de la pasta plasmatica se efectua en un tampon que comprende cloruro de sodio 0,06-0,18 M, citrato trisodico 0,005-0,02 M y arginina 0,02-0,08 M, a pH 7,3 a 7,5.

En un modo de realizacion preferido, el precipitado formado por la precipitacion etanolica se lava por dispersion con un tampon constituido de una mezcla de glicina 0,5-1,5 M, de citrato trisodico 0,01-0,1 M y de etanol 5,0-8,0% (v/v) a un pH de 6,7-6,9.

En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de la invencion comprende las etapas adicionales de:

f) tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada por hidroxido de aluminio y/o tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada a baja temperatura;

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La adicion de hidroxido de aluminio durante la etapa f) asegura en particular la eliminacion de las protemas indeseables, tales como los factores II (FII), VII (FVII), IX (FIX) y X (FX). El sobrenadante que resulta del tratamiento de la pasta plasmatica solubilizada, tambien designado “fraccion plasmatica soluble” en la presente solicitud, se purifica por al menos una filtracion clarificante y/o esterilizante. La fraccion plasmatica soluble puede tambien sufrir una filtracion en profundidad con el objetivo de permitir la retencion del hidroxido de aluminio.

La filtracion clarificante permite eliminar las partmulas contaminantes insolubles. Las filtraciones clarificante y esterilizante se llevan a cabo generalmente por la utilizacion de filtros, por ejemplo de 0,8 a 0,1 pm. Al menos una filtracion clarificante se realiza ventajosamente en forma de una filtracion sobre filtros de fibras de celuosa de 0,65 pm. En un modo de realizacion preferido, se efectua al menos una filtracion esterilizante sobre filtros de 0,2 pm.

La fraccion plasmatica soluble obtenida al final de la etapa g) se puede utilizar directamente o puede, cuando es necesario, ser congelada a la espera de la puesta en practica de eventuales etapas complementarias de purificacion.

La puesta en practica del procedimiento de tratamiento de plasma sangumeo que comprende una etapa de lavado por dispersion permite ventajosamente obtener un grado de pureza del fibrinogeno en la fraccion plasmatica soluble de al menos un 80%, preferentemente de al menos un 85%, mas preferiblemente de al menos un 90%.

La utilizacion de un sistema de dispersion en lmea durante la etapa de lavado mejora, en particular, el enriquecimiento de fibrinogeno en la fase de fraccion plasmatica soluble.

Esta tecnologfa permite obtener unos resultados conformes y reproducibles en terminos de homogeneidad de la suspension durante la dispersion en lmea y de enriquecimiento en fibrinogeno durante esta etapa de lavado y, a continuacion, en las etapas ulteriores, sin que la protema de interes sufra una degradacion.

En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo de la invencion comprende las etapas adicionales de:

h) purificacion cromatografica de la fraccion plasmatica soluble de la etapa g) en una resina de tipo intercambiador de aniones de tipo base debil previamente equilibrado por un tampon de fuerza ionica predeterminada de pH basico, en condiciones que permiten la retencion del pegamento biologico, siendo dicho pegamento eluido por aumento de la fuerza ionica de dicho tampon;

i) precipitacion de FXIII a partir de todo o parte del eluato de pegamento biologico por adicion de al menos un agente qmmico que precipita el FXIII;

k) diafiltracion de las soluciones de fibrinogeno y/o de pegamento biologico y/o de FXIII vuelto a poner en solucion, seguida de una liofilizacion de dichas soluciones.

La purificacion cromatografica de la fraccion plasmatica soluble (etapa h)) se puede efectuar en cualquier matriz a base de polfmero natural o sintetico, resina o gel, sobre la cual se injertan unos grupos intercambiadores de aniones de tipo base debil, tal como el DEAE. Los soportes cromatograficos clasicos de este tipo estan disponibles bajo las denominaciones DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE-Trisacryl LS, Fractogel TSK-DEAE 650 M o S, DEAE-Macroprep (Bio-Rad, Francia) etc.

El tampon de equilibrado del intercambiador de aniones presenta una fuerza ionica predeterminada y debe estar a un pH basico. La fuerza ionica es tfpicamente inferior al valor de 0,2 y, preferentemente, esta situada en el intervalo de valor que va de 0,06 a 0,2, en particular de 0,08 a 0,15.

Esta se ajusta preferentemente por adicion de sales inorganicas de metales alcalinos o alcalinoterreos o sus mezclas, de manera muy preferida de sales inorganicas de metales alcalinos, en particular de cloruro de sodio.

El valor maximo del pH del tampon de equilibrado se selecciona con el fin de evitar cualquier desnaturalizacion de los productos considerados, a saber aproximadamente 10.

Ventajosamente, el pH se situa en el intervalo de valores superiores a 7 hasta 9, preferentemente de 7,5 a 8,2.

A tftulo de ejemplo, este tampon esta compuesto de cloruro de sodio, a un pH de 7,9-8,1, cuya concentracion es de 0,06 M, y puede muy preferiblemente comprender ademas citrato trisodico, a una concentracion preferida de 0,011 M. Se puede utilizar cualquier otro tampon, a base de cloruro de sodio o de sales inorganicas de metales alcalinos o alcalinoterreos, que comprenda otros compuestos biologicamente compatibles y no desnaturalizantes para los productos de interes.

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Cuando la fraccion plasmatica soluble se ha aplicado sobre el intercambiador de aniones, las condiciones de realizacion son tales que el pegamento biologico se retiene sobre el soporte.

En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de la invencion puede comprender, previamente a la etapa de elucion del pegamento biologico, una etapa de lavado, con dicho tampon de equilibrado, del intercambiador de aniones hasta la eliminacion de las protemas y de los contaminantes no retenidos. Esta etapa de lavado permite, por percolacion del tampon de lavado sobre el soporte, el paso en el filtrado de las protemas presentes en la solucion que contiene fibrinogeno, tales como las inmunoglobulinas G (IgG), A (IgA) y M (IgM) y la albumina, y unos contaminantes no retenidos o debilmente retenidos por el intercambiador, como los agentes qmmicos de inactivacion viral. La duracion del lavado se determina por medicion de la densidad optica (DO) del filtrado a la longitud de onda de 280 nm. En efecto, un valor de DO que corresponde al de la lmea de base es una buena indicacion de la eliminacion efectiva de los compuestos citados anteriormente.

En un modo de realizacion preferido, el tampon de lavado utilizado corresponde al tampon de equilibrado de la columna y esta preferiblemente constituido de cloruro de sodio 0,02-0,1 M y de citrato sodico 0,005-0,02 M, a pH 7,8-8,2.

Despues del retorno a la lmea de base, la elucion del pegamento biologico se efectua por aumento de la fuerza ionica del tampon de equilibrado o de lavado, cuyo pH esta preferentemente fijado a 7,4-7,6. El valor de esta fuerza ionica se selecciona con el fin de obtener la elucion eficaz del pegamento biologico garantizando al mismo tiempo que este valor no altere las propiedades del producto considerado.

Ventajosamente, el valor de la fuerza ionica del tampon de elucion esta comprendido entre 0,5 y 1,3, en particular entre 0,9 y 1,1. Este aumento de la fuerza ionica se efectua por adicion de cualquier sal o mezcla de sales definidas anteriormente, en particular cloruro de sodio. El tampon de elucion puede ademas contener otros excipientes, tal como una mezcla de constituyentes, denominada mezcla A, que comprende el citrato trisodico (10 a 12 g/l), la lisina (1 a 5 g/l), la glicina (1 a 5 g/l), la sal tris (2 a 5 g/l), la arginina (25 a 50 g/l), y la isoleucina (5 a 15 g/l).

La concentracion de protemas en el eluato es generalmente del orden de 4 g/l.

Al menos una parte de la cantidad recogida del eluato de pegamento biologico puede despues ser sometida a un tratamiento destinado a separar el FXIII que acompana al fibrinogeno.

Esta separacion se realiza haciendo precipitar el FXIII por adicion en el eluato de la etapa h) de un agente qrnmico de precipitacion, que puede presentarse en forma de una solucion acuosa, a una concentracion apropiada para obtener la precipitacion del factor XIII.

De manera preferida, el agente qrnmico precipitante es una solucion acuosa a base de sales de citrato 1 M, tales como el citrato de sodio y, en particular, el citrato trisodico.

El precipitado de FXIII formado se separa despues del sobrenadante muy enriquecido en fibrinogeno.

En un modo de realizacion preferido, el precipitado de FXIII se puede recuperar por filtracion sobre unos filtros de 5 pm.

El precipitado de FXIII asf recuperado se vuelve a poner en solucion, preferentemente en agua o un tampon. En un modo de realizacion preferido, el precipitado de FXIII se disuelve en un tampon que comprende una mezcla de 10 a 12 g/l de citrato trisodico, de 1 a 5 g/l de lisina, de 1 a 5 g/l de glicina, de 2 a 5 g/l de Tris, de 25 a 50 g/l de arginina y de 5 a 15 g/l de isoleucina, ajustado a un pH comprendido entre 6,9 y 7,1, de manera que la concentracion en Factor XIII corresponda a una actividad aproximadamente 100 veces superior a la del plasma normal.

A este respecto, el precipitado de FXIII puede, por ejemplo, ser recogido de manera que su concentracion sea de aproximadamente 1 a 5 g de protemas totales/l.

Segun la invencion, las soluciones de pegamento biologico (es decir el eluato de pegamento biologico que resulta de la etapa h)) y de fibrinogeno (sobrenadante enriquecido en fibrinogeno) pueden ser ventajosamente concentradas por ultrafiltracion, hasta contenidos tfpicamente comprendidos entre 15 y 25 g de protemas totales/l, determinadas por mediciones clasicas conocidas por el experto en la materia.

Las tres soluciones de fibrinogeno, de Factor XIII y de pegamento biologico obtenidas, eventualmente concentradas, son despues sometidas a una etapa de diafiltracion.

La etapa de diafiltracion permite eliminar el exceso eventual, por un lado, de sal inorganica utilizada para obtener unas soluciones que tienen una fuerza ionica de como maximo 0,2 M y, por otro lado, de agente precipitante presente en el precipitado vuelto a poner en solucion. Cabe senalar que una presencia importante de sal inorganica,

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necesaria para la elucion del pegamento biologico, podna tener una influencia nefasta sobre la eficacia del proceso de liofilizacion y de la inactivacion viral por calentamiento termico en seco, asf como sobre la capacidad de retencion de los virus por un nanofiltro apropiado.

La etapa de diafiltracion puede tambien ser utilizada para incorporar unos excipientes adecuados, tales como unos estabilizantes y/o unos protectores, destinados a permitir, por un lado, un calentamiento en seco del fibrinogeno, del FXIII y de pegamento biologico sin riesgo de desnaturalizacion y, por otro lado, una solubilizacion rapida de los liofilizados, tfpicamente de 3 a 8 minutos.

En un modo de realizacion preferido, el tampon de diafiltracion contiene la mezcla A (que comprende una mezcla de 10 a 12 g/l de citrato trisodico, de 1 a 5 g/l de lisina, de 1 a 5 g/l de glicina, de 2 a 5 g/l de Tris, de 25 a 50 g/l de arginina y de 5 a 15 g/l de isoleucina), y esta a pH 6,9-7,1.

Ventajosamente, el tampon de diafiltracion que comprende la mezcla A es el mismo que el utilizado para eluir el pegamento biologico de la resina de intercambio de aniones. En este modo de realizacion preferido, la puesta en practica de la diafiltracion y del procedimiento de la invencion se encuentra, por lo tanto, simplificada y optimizada.

Tambien pueden ser utilizados unos tampones de diafiltracion de composicion diferente, en funcion de las necesidades, con la condicion de que cumplan los criterios enunciados anteriormente. La etapa de ultrafiltracion mencionada anteriormente puede tambien ser realizada en las mismas condiciones en esta fase del procedimiento.

Las soluciones diafiltradas, eventualmente concentradas por ultrafiltracion, son liofilizadas segun unos metodos clasicos y condiciones habituales, a saber entre -40°C y -30°C durante aproximadamente 48 horas.

En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de la invencion comprende al menos una etapa de tratamiento de inactivacion viral y/o de eliminacion de virus y unos contaminantes tales como, por ejemplo, el prion. Este tratamiento se puede seleccionar del grupo constituido por el tratamiento qrnmico de inactivacion viral; la nanofiltracion y el tratamiento termico de inactivacion viral en seco.

Cuando el tratamiento de inactivacion viral es un tratamiento qrnmico, corresponde ventajosamente a un tratamiento por disolvente-detergente, segun el metodo descrito en la patente EP 0 131 740. Los agentes qrnmicos de inactivacion viral utilizados corresponden preferiblemente a una mezcla de Tween-TnBP, y de manera mas preferida a una mezcla de Triton (octoxinol)-TnBP, cuyas concentraciones tfpicas son respectivamente del 0,3% (v/v) y del 1% (p/v). La inactivacion viral por tratamiento qrnmico puede estar integrada en una fase cualquiera del procedimiento, pero se lleva a cabo juiciosamente antes de la etapa h) de purificacion cromatografica. De esta manera, la purificacion cromatografica contribuira a la eliminacion eficaz de los agentes de inactivacion.

En un modo preferido de realizacion del procedimiento, se puede prever asimismo una etapa de nanofiltracion para eliminar los virus, en particular no revestidos, y otros contaminantes exogenos, pudiendo dicha etapa ser utilizada en complemento de la etapa de tratamiento qrnmico de inactivacion viral descrita anteriormente. La nanofiltracion puede ser realizada ventajosamente sobre unos filtros de una porosidad de 35 nm y/o de 15 nm, aunque se pueden utilizar otros filtros nanometricos en la medida en la que las duraciones de filtracion y la eficacia de retencion viral estan optimizadas.

La nanofiltracion se lleva a cabo ventajosamente o bien en el eluato que resulta de la etapa h), o bien, llegado el caso, en las soluciones diafiltradas de fibrinogeno, de pegamento biologico y/o de FXIII vuelto a poner en solucion, antes de la liofilizacion de estas ultimas.

Conviene senalar que la tecnica de nanofiltracion requiere, para una aplicacion eficaz, controlar los parametros fisicoqmmicos que influyen en el rendimiento de recuperacion de los compuestos a filtrar, y esto evitando la obstruccion del filtro y el paso de diversos virus y contaminantes. Estos parametros, tales como la fuerza ionica, el pH de la solucion, asf como las condiciones de realizacion de la filtracion, imponen unas condiciones espedficas de realizacion que dependen tambien de la naturaleza del o de los compuestos presentes en la solucion a filtrar.

La eleccion juiciosa de los parametros qrnmicos de la purificacion cromatografica y de los de diafiltracion permite por lo tanto realizar la nanofiltracion sin alterar sus rendimientos.

Finalmente, un tratamiento termico de inactivacion viral en seco se lleva a cabo ventajosamente en los liofilizados de fibrinogeno, de pegamento biologico y de FXIII obtenidos despues de la etapa de liofilizacion, segun unas condiciones clasicas a 80°C durante 72 horas, para inactivar unos virus no recubiertos que no habnan sido inactivados y/o eliminados por al menos una de las dos etapas de inactivacion viral y/o de eliminacion de los virus descritas anteriormente.

Los liofilizados calentados en seco pueden despues ser reconstruidos en un medio acuoso compatible con un uso clmico, preferentemente en agua purificada para inyeccion (PPI) y directamente inyectados por via intravenosa.

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As^ la puesta en practica del procedimiento conduce a liofilizados de concentrados de pegamento biologico y de fibrinogeno altamente purificados, cuyo contenido respectivo en fibrinogeno, con respecto al contenido total de protemas, es de aproximadamente del 85 al 90%.

Sin la utilizacion del dispersor en lmea, el contenido en fibrinogeno, con respecto al contenido total de protemas esta comprendido entre el 70 y el 77% (vease la tabla A).

Ademas, las actividades de Factor XIII en los concentrados de pegamento biologico y de fibrinogeno son, respectivamente, de aproximadamente 5 U/ml y de aproximadamente 1,5 U/ml.

El concentrado de Factor XIII obtenido esta desprovisto de protemas contaminantes y presenta una actividad, segun las necesidades, situada en el intervalo de valores que va de aproximadamente 30 U/ml a aproximadamente 700 U/ml, preferentemente de 100 U/ml a 400 U/ml, obtenida en funcion de la concentracion de recolocacion en solucion del precipitado de FXIII y/o de la obtenida despues de la ultrafiltracion.

Ademas, la presencia de al menos una etapa de tratamiento de inactivacion viral y/o de eliminacion de los virus y de contaminantes en el procedimiento de la invencion hace los concentrados de pegamento biologico, de fibrinogeno y de factor XIII susceptibles de ser obtenidos por este procedimiento apropiado para un uso terapeutico.

El ejemplo siguiente ilustra un modo de realizacion de la presente invencion, sin limitar, sin embargo, su alcance.

Ejemplo

Se utilizan 1200 l de plasma humano desprovisto de crioprecipitado. Este plasma se somete a una precipitacion etanolica por el metodo de Cohn, segun unas condiciones conocidas por el experto en la materia, de tal manera que la concentracion de etanol en el plasma considerado sea del 8% (v/v) y la temperatura de la mezcla asf obtenida sea de -3°C a -5°C.

El sobrenadante y el precipitado asf obtenidos son despues centrifugados. Se obtienen entre 8 y 12 kg de precipitado etanolico, que constituye la fraccion I de Cohn impura.

La fraccion I de Cohn impura se resuspende y se lava mediante 300 l de tampon “Blombach” (Blomback B, Blomback M: Purification of human and bovine fibrinogen. Ark Kem 10:415-443, 1956) constituido de una mezcla de glicina 1 M, de citrato trisodico 0,055 M y de etanol 6,5% (v/v), a un pH de 6,8.

El lavado se realiza mediante un sistema de dispersion en lmea de tipo Z66 (Ystral).

Despues de la centrifugacion sobre una centrifugadora Sharpless AS 16, con unos inyectores calibrados a 3 mm, se recuperan aproximadamente 8 kg de pasta plasmatica lavada (fraccion I de cohn purificada) que son disueltos a una temperatura de 37°C, en 60 l de tampon constituido de una mezcla de cloruro de sodio 0,12 M, de citratotrisodico 0,010 M y de arginina 0,05 M, de pH 7,4.

La pasta plasmatica solubilizada asf obtenida se somete despues a un tratamiento por tratamiento con gel de alumina, a razon de 108 g para 1 kg de pasta plasmatica, a una temperatura de 25°C y a un pH de 6,9-7,1.

Una vez efectuado el tratamiento con gel de alumina, la solucion se somete a filtraciones lenticulares de profundidad, por medio de filtros de fibras de celulosa (Seitz, type K700) de 0,65 micrones m y esterilizantes por unos filtros de 0,2 pm.

Esta solucion se somete despues a un primer tratamiento de inactivacion viral por disolvente-detergente en presencia de Tween-TnBP, de concentraciones respectivas del 0,3% (v/v) y 1% (p/v), segun el metodo descrito en el documento EP 0 131 740.

La tabla A compara la concentracion de fibrinogeno, de protemas y el grado de pureza del fibrinogeno obtenido durante la realizacion de un procedimiento que comprende una etapa de lavado por dispersion en lmea (tal como la descrita anteriormente), con los de un procedimiento similar en el que la etapa de lavado se realiza en ausencia de un sistema de dispersion en lmea. Conviene senalar que los resultados presentados en la tabla A corresponden a medias de valores obtenidos respectivamente a partir de 2 lotes de plasma diferentes para el procedimiento que no comprende etapa de lavado por dispersion, y de 3 lotes de plasmas diferentes para el procedimiento que comprende una etapa de lavado por dispersion. Con la excepcion de la utilizacion de un dispersor en lmea de tipo rotor/estator durante el lavado del precipitado etanolico, los procedimientos descritos en la tabla A son estrictamente comparables (incluso para el conjunto de los tampones y temperaturas utilizados).

Tabla A - Resultado de controles en curso de produccion


: Procedimiento que no comprende etapa de lavado por dispersion Procedimiento que comprende una etapa de lavado por dispersion en lmea


: Media de 2 lotes Media de 3 lotes

Materia prima plasmatica antes de la precipitacion etanolica: Volumen (l) 796 778

Protemas (g/l): 56 54,83

Fibrinogeno coagulable (g/l): 1,55 1,46

Pureza Fibrinogeno (%): 2,76 2,66

Pasta plasmatica solubilizada: Volumen (l) 53 54,33

Protemas (g/l): 21,25 17,83

Fibrinogeno coagulable (g/l): 15,15 15,9

Pureza Fibrinogeno (%): 71,29 89,17

Sobrenadante obtenido despues del tratamiento de la pasta plasmatica solubilizada por el hidroxido de aluminio: Volumen (l) 55 54

Protemas (g/l): 16,5 15,16

Fibrinogeno coagulable (g/l): 11,85 12,96

Pureza Fibrinogeno (%): 71,81 85,13

Fraccion plasmatica soluble despues de la filtracion clarificante y esterilizante: Volumen (l) 53,45 53,3

Protemas (g/l): 16 14,33

Fibrinogeno coagulable (g/l): 12,35 12,53

Pureza Fibrinogeno (%): 77,18 87.43

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Se demuestra claramente que los resultados obtenidos con el dispersor en lmea son significativamente superiores, en la medida en la que el grado de pureza del fibrinogeno es siempre significativamente mas elevado que el obtenido con el procedimiento que utiliza un sistema de lavado clasico. Se demuestra por lo tanto que la eficacia del dispersor en lmea utilizado, ha contribuido a la mejora de la etapa de lavado y, en consecuencia, al aumento de la 10 pureza del fibrinogeno en esta fase del procedimiento. El dispersor en lmea permite asf obtener una solucion mas homogenea, con una dispersion muy fina del precipitado etanolico en el tampon de lavado, y contribuye asf a la eliminacion de una proporcion mas elevada de contaminantes. Ademas, es importante senalar que el control visual de la solucion no pone en evidencia aglomerados susceptibles de obstruir los inyectores de las centrifugadoras en las etapas siguientes a la etapa de lavado.

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Por otro lado, las concentraciones de diferentes protemas contaminantes se han medido en la fraccion plasmatica soluble resultante de esta primera parte del procedimiento. Estos resultados se resumen en la tabla B siguiente:

Tabla B:

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: Media de 2 lotes Media de 3 lotes

Protemas totales: g/l 16,00 14,33

Protemas co-purificadas

Fibronectina: mg/l 746,75 607,8

IgG: mg/l 837,25 325,5

IgA: mg/l 92,35 83,81

igM: mg/l 257,75 114,9

C3c: 0,13 0,06

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C4: g/l 0,155 0,036

Plasminogeno: pg/l 69,68 53,25

FII: pU/l 743,8 578,1

Protemas co-purificadas: g/i 2,362 1,289

Protemas co-purificadas: % 14,76 8,99

Destaca claramente de los resultados presentados en la tabla B que la etapa de lavado por dispersion en lmea permiten eliminar un numero significativamente mas elevado de protemas co-purificadas (protemas contaminantes) que acompanan al fibrinogeno.

La fraccion plasmatica soluble diluida se inyecta despues en una columna cromatografica rellena de un gel intercambiador de aniones DEAE Macroprep (Bio-Rad-Francia), previamente equilibrada en tampon constituido de cloruro de sodio 0,06 M y de citrato trisodico 0,011 M, ajustado a un pH de 8,0 M, de osmolaridad de 130-150 mosmolkg-1. En estas condiciones, el fibrinogeno y el factor XIII, que constituyen el pegamento biologico, son retenidos por el soporte. Las protemas debilmente retenidas o no retenidas por el soporte son eliminadas en el filtrado, asf como los Tween y TnBP, por varios lavados sucesivos con el mismo tampon.

Cuando la DO, medida a 280 nm, ha vuelto a caer al valor del de la lmea de base, la elucion del fibrinogeno y del Factor XIII, que constituyen el pegamento biologico, se efectua por un tampon de elucion que contiene cloruro de sodio 1 M y una mezcla A' constituida de citrato trisodico (11, g/l), de lisina (2,0 g/l), de glicina (2,0 g/l), la sal tris (2,40 g/l), de arginina (40 g/l) y de isoleucina (10 g/l), ajustado a un pH de 7,5, de osmolaridad > 2000 mosmolkg-1.

El eluato de pegamento biologico purificado asf recuperado se somete a una nanofiltracion sobre unos filtros PLANOVA (Asahi - Japon) de 35 mm y de 1 m2 de superficie, a fin de eliminar los virus que no habnan sido inactivados por el tratamiento con disolvente-detergente anterior. El contenido en protemas totales en esta fase el procedimiento es de aproximadamente 4,0 g/l de solucion.

Se afsla el 50% del volumen del eluato de pegamento biologico y se anade una solucion de citrato trisodico 1 M al resto del volumen de eluato, para hacer precipitar el Factor XIII. Despues de asegurarse que todo el Factor XIII ha precipitado, este se afsla y se recupera por filtracion sobre unos filtros Sartopure (Sartorius - Francia) de 5 pm.

El precipitado de FXIII asf recuperado se vuelve a poner en solucion en agua purificada para inyeccion, a razon de aproximadamente 1 g/l.

Las soluciones de pegamento biologico (eluato) y de fibrinogeno, son concentradas por ultrafiltracion sobre unos filtros Biomax Millipore 100 kDa de 5 m2 de superficie, de manera que el contenido en protemas de cada una de las soluciones alcance 15 g/l.

Las soluciones concentradas anteriores y la solucion de FXIII son sometidas a una diafiltracion sobre los mismos filtros que los utilizados para la ultrafiltracion contra la mezcla A' definida anteriormente, de pH 6,9-7,1, de osmolaridad de 590-610 mosmolkg-1, lo que permite tambien la eliminacion del cloruro de sodio.

Despues de haber procedido a una filtracion esterilizante sobre filtros de 0,45-0,2 micrones m, se extraen 100 ml de las soluciones respectivas diafiltradas, y se colocan en frascos de vidrio para una liofilizacion realizada entre -40°C y -30°C durante aproximadamente 48 horas.

Los liofilizados de fibrinogeno, de pegamento biologico y de Factor XIII obtenidos se someten a una ultima etapa de inactivacion viral por calentamiento en seco a 80°C durante 72 horas y almacenados para una utilizacion terapeutica ulterior.

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende las etapas de:

a) precipitacion etanolica del plasma o de una fraccion de plasma;

b) recuperacion del precipitado formado en la etapa a);

c) lavado de dicho precipitado por dispersion que se realiza utilizando un dispersor de tipo rotor/estator;

d) recuperacion de una pasta plasmatica lavada; y

e) solubilizacion de dicha pasta plasmatica lavada.
2. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun la reivindicacion 1, en el que el lavado por dispersion de la etapa c) se realiza utilizando un dispersor en lmea, siendo el precipitado de la etapa b) alimentado en la entrada axial del dispersor y siendo el producto lavado expulsado en la salida radial del dispersor.
3. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la recuperacion del precipitado en la etapa b) y/o la recuperacion de la pasta plasmatica en la etapa d) se efectuan por centrifugacion.
4. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun la reivindicacion 3, en el que la recuperacion de la pasta plasmatica en la etapa d) se efectua por utilizacion de una centrifugadora de inyeccion.
5. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el producto lavado en la etapa c) es sustancialmente homogeneo.
6. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas adicionales de:

f) tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada por hidroxido de aluminio y/o tratamiento de dicha pasta plasmatica solubilizada a baja temperatura; y

g) obtencion de una fraccion plasmatica soluble por filtracion clarificante y/o esterilizante del sobrenadante que resulta de la etapa f).
7. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo segun una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el lavado por dispersion de la etapa c) se realiza con un tampon constituido de una mezcla de glicina 0,5-1,5 M, de citrato trisodico 0,01-0,1 M y de etanol 5,0-8,0% (v/v), a un pH de 6,7-6,9.
8. Procedimiento de tratamiento del plasma sangumeo que comprende el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7, y que comprende las etapas adicionales de:

h) purificacion cromatografica de la fraccion plasmatica soluble de la etapa g) en una resina de tipo intercambiador de aniones de tipo base debil previamente equilibrado por un tampon de fuerza ionica predeterminada de pH basico, en condiciones que permiten la retencion del pegamento biologico, siendo dicho pegamento biologico eluido por aumento de la fuerza ionica de dicho tampon;

i) precipitacion de FXIII a partir de todo o parte del eluato de pegamento biologico obtenido en la etapa h) por adicion de por lo menos un agente qmmico que precipita el FXIII;

j) recuperacion de una solucion de fibrinogeno purificado que corresponde al sobrenadante de la etapa i); y

k) diafiltracion de las soluciones de fibrinogeno, y/o de pegamento biologico y/o de FXIII vuelto a poner en solucion, seguida de una liofilizacion de dichas soluciones.
9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que comprende al menos una etapa de tratamiento de inactivacion viral y/o de eliminacion de virus y de contaminantes, siendo el tratamiento seleccionado del grupo constituido por el tratamiento qrnmico de inactivacion viral, la nanofiltracion y el tratamiento termico de inactivacion viral en seco.
10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que comprende una etapa de ultrafiltracion de concentracion efectuada previamente a la etapa de diafiltracion k) o posteriormente a dicha etapa, antes de la liofilizacion.