CN102639554A - 包括通过分散的方式清洗的步骤的处理血浆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及处理血浆的方法，所述方法包括：乙醇沉淀血浆或血浆组分的步骤，回收沉淀物的步骤，清洗所述沉淀物的步骤，回收清洗的血浆糊并且使得所述清洗的血浆糊可以溶解的步骤。

Description

包括通过分散的方式清洗的步骤的处理血浆的方法
技术领域
本发明涉及处理血浆的方法，所述方法包括乙醇沉淀血浆或血浆组分的步骤，回收沉淀物的步骤，清洗所述沉淀物的步骤回收清洗的血浆糊并且溶解所述清洗的血浆糊的步骤。
背景技术
纤维蛋白原是血液凝固所必需的蛋白质，这是因为其聚合为不可溶的纤维蛋白(在控制血液凝固的反应的级联之后形成)，导致封闭引起流血的血管伤口的凝块的形成。因此凝块的形成对于停止流血来说是必不可少的。此外，伤口位点处形成的纤维蛋白形成确保组织修复(愈合)的纤维状网络。
先天性纤维蛋白原缺陷可导致严重的病变。为了治疗这些缺陷，必须使得有纤维蛋白原浓缩物可用，该纤维蛋白原浓缩物能够提供给进行治疗的患者。其他的病变也可通过提供纤维蛋白原来治疗，尤其是在大量失血(手术、外伤等)的情况下或在弥散性血管内凝血(DIC)之后。
同样，可通过作为主要成分的包含纤维蛋白原的凝血酶和凝血因子XIII(FXIII)活化的生物胶被有效地用于临床应用例如皮肤移植、神经或动脉缝合中的组织修复，如例如专利EP 0 305 243、FR 2 448 900和FR 2 448 901中所描述的。
这些产品中凝血因子XIII或转谷氨酰胺酶的存在通过产生使纤维蛋白不可溶的互相交错(intercatenary)的共价键而有助于稳定纤维蛋白。在一些实例中，这些产品使用相当复杂的产生纤维蛋白原的方法来获得，其需要外源加入纯化的凝血因子XIII以使得它们可以实现它们的治疗功能。
因此，提供纤维蛋白原、生物胶和凝血因子XIII的浓缩物，尤其是用于治疗目的，需要产生不仅充分地从各种类型的污染物例如伴随的或共沉淀的蛋白质、抗体或蛋白酶纯化而且另外从病毒的观点来看也是安全的这些产物的纯化技术。
从血浆分离富含纤维蛋白原的任选地包含FXIII的组分是已知的并且最初描述于Cohn和Nitschmann(Cohn et al，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946和Kistleret al，Vox Sang.，7，1962，414-424)的著作中。近年来的方法将不同来源的血浆的沉淀技术与过滤、层析、病毒失活等技术组合。例如，专利和专利申请EP 0 359593、US 5 099 003、EP 0 305 243、FR 2 448 900和FR 2 448 901已经提及的。
然而，似乎本领域中大多数已知的方法包括不同生产链以及因此产生纤维蛋白原、生物胶的浓缩物或组合物或者富含纤维蛋白原并含有其他伴随蛋白质例如凝血因子FXIII、凝血因子VIII、纤连蛋白、血管假性血友病因子等的浓缩物或组合物的不同方法的使用。大多数已知方法因此不太适于在工业水平上应用，尤其是当对生物胶、纤维蛋白原和凝血因子XIII的需求同时存在时。当感兴趣的蛋白被预期用于治疗用途且必须对其进行病毒和其他不期望的污染物(例如蛋白酶传染性因子)的失活和/或去除时，这些纯化方法在工业规模上的复杂性实施进一步增加。
专利申请EP 1 739 093描述了从包含纤维蛋白原和凝血因子的溶解的血浆组分分离XIII纤维蛋白原蛋白质、凝血因子XIII和生物胶并产生所述蛋白的冷冻干燥的浓缩物制剂的单一的方法。申请EP 1 739 093中描述的方法特别地包含在截留生物胶的条件下将溶解的血浆组分在弱碱型阴离子交换柱上层析纯化，特异洗脱这一胶，通过加入至少一种化学剂沉淀剂沉淀FXIII而从纤维蛋白原分离FXIII，回收纯化的纤维蛋白原上清液所得的溶液并将重置于溶液中的纤维蛋白原溶液、生物胶溶液和FXIII的溶液渗滤，之后将所述溶液冷冻干燥的步骤。专利申请EP 1 739 093中描述的方法还可包括至少一个病毒失活处理步骤和/或除去病毒和污染物的步骤，所述处理选自化学病毒失活处理、纳米过滤和用于病毒失活的干热处理。然而，本领域已知的方法中使用的重悬技术不够安全。事实上，本领域中已知的这些方法中，在重悬时发生的剪切现象可导致感兴趣的蛋白质的降解。因此有对于能够减少感兴趣的蛋白质降解并增加所提取的蛋白质的纯度的技术改进的强烈需求。
发明内容
发明人惊讶地发现在例如专利申请EP 1 739 093的方法中用作原料的溶解的血浆组分的最初制备阶段中通过分散实行清洗步骤与仅描述了通过重置于悬浮液中的清洗步骤的本领域中的方法相比带来了清洗品质上的显著提高。由此产生了通过分散实行清洗步骤导致在溶解的血浆组分中以及随后例如来自实行申请EP 1 739 093的方法所产生的纤维蛋白原和生物胶的浓缩物中纤维蛋白原纯度上的增加。
使用本发明所获得的好处不限于仅有的申请EP 1 739 093的方法主题，还将由使用乙醇组分(Cohn组分I)的方法获得。
因此本发明涉及处理血浆的方法，所述方法包括步骤：
a)血浆或血浆组分的乙醇沉淀；
b)回收步骤a)形成的沉淀物；
c)通过分散清洗所述沉淀物；
d)回收清洗的血浆糊；以及
e)将所述清洗的血浆糊溶解。
步骤c)的通过分散的清洗优选地使用转子/定子型分散器进行。有利地，所用的分散器是内嵌式分散器，步骤b)的沉淀物被进料至分散器的轴向入口而清洗的产物通过分散器的径向出口排出。
本发明的方法还可包括另外的步骤：
f)用氢氧化铝处理所述溶解的血浆糊和/或低温处理所述溶解的血浆糊；以及
g)通过将步骤f)获得的上清液澄清和/或灭菌过滤获得可溶的血浆组分。
本发明的方法可最终包括另外的步骤：
h)在截留生物胶的条件下，将步骤g)的可溶的血浆组分在用碱性pH值的预定离子强度的缓冲液预先平衡的弱碱型的阴离子交换型的树脂上层析纯化，通过增加所述缓冲液的离子强度洗脱所述生物胶；
i)通过加入至少一种化学剂沉淀FXIII将FXIII从在步骤h)获得的全部或部分生物胶的洗脱液中沉淀；
j)回收相应于步骤i)的上清液的纯化的纤维蛋白原的溶液；以及
k)将重置于溶液中的纤维蛋白原和/或生物胶和/或FXIII的溶液渗滤，之后将所述溶液冷冻干燥。
因此，包括通过分散实行清洗步骤的申请人所公开的方法允许获得冷冻干燥的、高度纯化的、基本上不含共纯化的蛋白质和不期望的污染物的纤维蛋白原、凝血因子XIII和/或生物胶的浓缩物。事实上，与如本领域中所描述的仅通过重置于悬浮液中来清洗相比，经由分散的清洗步骤产生对包含感兴趣的蛋白尤其是纤维蛋白原的初始血浆组分的更好的清洗并且带来本发明的整个随后步骤中这些化合物的纯度上的显著增加。
因此通过分散实行清洗步骤以简单、快速和低成本的方法带来更高的纯度并确保工业水平上原材料的增加的成本收益。因此使得生物胶、凝血因子XIII和/或纤维蛋白原的生产显著优化，同时减少了相关的生产成本。
本发明的方法还允许从优选地包含纤维蛋白原和凝血因子XIII的血浆原料获得冷冻干燥并且高度纯化的蛋白质，同时与至少一种病毒失活处理和/或病毒以及其他的不期望的污染物(例如聚合物、聚集物或蛋白酶传染性因子)的清除处理保持相容。
附图说明
单个的图1是转子/定子分散器的图示说明。
本发明实施方案的详细描述
因此本发明涉及处理血浆的方法，所述方法包括步骤：
a)血浆或血浆组分的乙醇沉淀；
b)回收步骤a)形成的沉淀物；
c)通过分散清洗所述沉淀物；
d)回收清洗的血浆糊；
e)将所述清洗的血浆糊溶解。
本发明的方法可使用多种来源的血浆原料以及尤其是来自包含纤维蛋白原和凝血因子XIII的来源的血浆原料来实行。因此这一方法可使用Cohn的分馏法用冷乙醇直接从血浆实行(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946和Kistler等人，Vox Sang.，7，1962，414-424)。
有利地，本发明的方法的步骤b)和d)通过离心来进行。
就本发明而言，术语“分散”是指乙醇沉淀物的颗粒的分离和它们在由清洗缓冲液形成的介质中均质的或基本上均质的分布。这一分散与本领域中所描述的重悬的方法不同，尤其在于后者方法没有允许颗粒均质分布。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法的步骤c)经由分散的清洗步骤使用转子/定子型分散器来进行。转子/定子型分散器通常包含至少一个有齿的转子和至少一个有齿的定子，形成具有高剪切速度的组件。产物(在本文中是与清洗缓冲液混合的乙醇沉淀物)进入带齿转子的槽和通过定子环的槽的叶片之间的分散区域，泵送作用由机器本身保证。内部转子环增加产物的通过速度，定子环导致其突然制动，加速产物的精细分散。剪切槽中强烈的湍流将固体颗粒有效地研磨并分散为均质分布。转子和定子的几何形状可适于产物的分散条件。
所述分散器在唯一的附图中说明。
因此分散器，尤其是内嵌式转子/定子分散器，允许乙醇沉淀在清洗缓冲液中非常精细的均质或基本上均质的分散而获得均质或基本上均质的溶液并由此有助于除去更大比例的蛋白污染物。
尽管本领域中已知转子/定子分散器用于制备乳液、悬浮色素、将去污剂加入溶液，用于快速制造胶体溶液和用于将粉末以及其他类似产物均质化的用途，但是应注意的是，就血浆蛋白质的纯化方法而言没有描述过所述分散器的用途。
已广为人知的是分散器的使用导致溶液或所制备的悬浮液的加热并且所述分散器不能用于温控箱。因此看来可能到本发明为止，用于制备血浆产物的方法中分散器的使用都被认为将带来温度的增加由此导致血浆蛋白质的降解。
然而，申请人惊奇地观察到分散器的使用减少了分散所需的时间并且实际上降低了其加热。因此，与现有的技术上预先形成的观点相反并且令人惊讶地，分散器的使用就其不会产生产物的任何降解而言被证明非常适于用于纯化血浆蛋白质的方法。
此外，申请人还观察到分散器的使用带来污染蛋白质的质量上的显著降低。
在一个优选的实施方案中，使用嵌入式分散器进行本发明的方法的步骤c)的经由分散的清洗步骤。在这一特定的实例中，优选地转子/定子型的分散器与实行纯化方法所需要的其他工业设备安装在相同的生产线上。因此，步骤b)的沉淀物优选地与清洗缓冲液一起被进料至内嵌式分散器的轴向入口而符合乙醇沉淀物在清洗缓冲液中基本上均质分散的清洗产物向嵌入式分散器的径向出口排出。
嵌入式分散器的使用还提供了对无菌的每一种保证，这是因为机器被设计为简单拆下并容易清洗的并且可以整合到CIP系统(原位清洁)中。
如上文所描述的，本发明的方法的步骤c)使用分散器清洗乙醇沉淀物导致获得乙醇沉淀物在所使用的清洗缓冲液中均质或基本上均质的悬浮液(匀浆)、这一均质或基本上均质的悬浮液可通过能够检定悬浮液中不存在结块的目视检验来表征。
在一个特定的实施方案中，使用装配有抗絮凝叶片型的搅拌装置的箱进行本发明的步骤c)。这一搅拌装置允许形成初级分散，其形成抗絮凝的糊但是其不是均质的。搅拌装置与内嵌式分散器偶联，允许形成二级分散产生精细并均质的悬浮液。
在一个优选的实施方案中，步骤b)进行的沉淀物的回收和/或步骤d)进行的血浆糊的回收通过离心来完成。优选地，步骤d)的血浆糊的回收通过使用喷射离心来获得。在这一特定的实例中，步骤c)通过分散清洗的沉淀物通过喷嘴的方式放入工业离心机中，所述喷嘴的直径相对于悬浮液中的颗粒的大小来标定。在一个优选的实施方案中，喷嘴离心机是Sharpless AS 16型或者WestfaliaSeparator型，具有相对于所使用的分离器(2至4mm)标定的特定的喷嘴。
在步骤c)经由分散清洗允许获得清洗缓冲液中包含非常精细的乙醇沉淀物颗粒的悬浮液。结果，所形成的基本上均质的悬浮液就其有利地避免了离心喷嘴的堵塞而言被证明是非常适于喷嘴离心机使用的。
在一个优选的实施方案中，血浆糊的溶解在包含0.06-0.18M氯化钠、0.005-0.02M柠檬酸三钠和0.02-0.08M精氨酸，pH 7.3至7.5的缓冲液中进行。
在一个优选的实施方案中，乙醇沉淀形成的沉淀物用由0.5-1.5M甘氨酸、0.01-0.1M柠檬酸三钠和5.0-8.0％(v/v)乙醇，pH6.7-6.9的混合物组成的缓冲液通过分散来清洗。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括另外的步骤：
f)用氢氧化铝处理所述溶解的血浆糊和/或低温处理所述溶解的血浆糊；以及
g)通过将步骤f)获得的上清液澄清和/或灭菌过滤获得可溶的血浆组分。
在步骤f)加入氢氧化铝特别地确保不期望的蛋白质例如凝血因子II(FII)、VII(FVII)、IX(FIX)和X(FX)的消除。从对溶解的血浆糊的处理获得的上清液，在本申请中也称为“可溶的血浆组分”，通过至少一次澄清和/或灭菌过滤来纯化。可溶的血浆组分还可经历深度过滤以便截留氢氧化铝。
澄清过滤允许去除不可溶的污染颗粒。澄清和灭菌过滤通常使用例如0.8至0.1μm的滤器进行。有利地，以采用纤维素纤维的0.65μm滤器上过滤的形式进行至少一次澄清过滤。在一个优选的实施方案中，使用0.2μm的滤器进行至少一次灭菌过滤。
步骤g)之后获得的可溶的血浆组分可被直接使用或者当需要时其可被冷冻直到实行任选的另外的纯化步骤。
实行包含经由分散的清洗步骤的用于处理血浆的方法有利地使得所获得的可溶血浆组分中纤维蛋白原的纯度为至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％。
清洗步骤期间内嵌式分散系统的使用特别地增加在可溶血浆分离阶段纤维蛋白原的富集。这一技术允许就在清洗步骤的内嵌分散和纤维蛋白原富集时以及由此后续步骤中悬浮液的均质性以及没有感兴趣的蛋白质经历任何降解而言获得确定并且可重复的结果。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的用于处理血浆的方法包括另外的步骤：
h)在截留生物胶的条件下，将步骤g)的可溶的血浆组分在用预定离子强度且碱性pH值的缓冲液预先平衡的弱碱型的阴离子交换型的树脂上层析纯化，通过增加所述缓冲液的离子强度洗脱所述生物胶；
i)通过加入至少一种化学剂沉淀FXIII将FXIII从全部或部分生物胶的洗脱液中沉淀；
j)回收相应于步骤i)的上清液的纯化的纤维蛋白原的溶液；以及
k)将重置于溶液中的纤维蛋白原和/或生物胶和/或FXIII的溶液渗滤，之后将所述溶液冷冻干燥。
可溶血浆组分的层析纯化(步骤h))可针对以与弱碱型阴离子交换基团连接的天然或合成聚合物、树脂或凝胶为基础的任何基质进行，例如DEAE。这一类型的常规层析载体可以DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-Trisacryl LS、FractogelTSK-DEAE 650M或S、DEAE-Macroprep(Bio-Rad，France)等商品名获得。
阴离子交换柱的平衡缓冲液具有预定的离子强度并且必须具有碱性的pH值。离子强度通常小于0.2的值并且优选地其位于从0.06至0.2，特别地0.08至0.15的值的范围内。
这优选地通过加入碱金属或碱土金属或其混合物的无机盐(最优选地方式碱金属的无机盐，特别地氯化钠)来调节。
选择平衡缓冲液的最大pH值以避免所讨论的产物的任何降解，也就是说，其为约10。
有利地，pH位于高于7并直到9，优选地7.5至8.2的值的范围内。
作为实例，这一缓冲液于pH值7.9-8.1由氯化钠组成，具有0.06M的浓度并且可最优选地还包括0.011M的优选浓度的柠檬酸三钠。同样可能的是使用以氯化钠或者碱金属或碱土金属的无机盐为基础并且包含对于感兴趣的产物来说非变性的其他生物可相容的化合物的任何其他的缓冲液。
当可溶的血浆组分已经被用于阴离子交换柱时，操作条件是使得生物胶被截留在载体上。
在一个优选的实施方案中，在生物胶的洗脱步骤之前，本发明的方法可包括使用所述平衡缓冲液直到去除蛋白质和非截留的污染物的阴离子交换柱清洗步骤。这一清洗步骤，经由载体上清洗缓冲液的渗透，允许包含纤维蛋白原的溶液中存在的蛋白质例如免疫球蛋白G(IgG)、A(IgA)和M(IgM)以及白蛋白通过进入滤液，而污染物(例如化学的病毒失活剂)则不被交换柱截留或仅被交换柱弱截留。清洗时间通过在280nm的波长测量滤液的光密度(OD)来确定。事实上，对应基线的OD值是有效去除上文所提到的化合物的良好指示。
在一个优选的实施方案中，所使用的清洗缓冲液对应于柱的平衡缓冲液并且优选地由0.02-0.1M氯化钠和0.005-0.02M柠檬酸三钠形成，pH 7.8-8.2。
当返回基线后，通过增加pH值优选地设置为7.4-7.6的平衡或清洗缓冲液的离子强度进行生物胶的洗脱。选择这一离子强度的值以便获得生物胶的有效洗脱同时注意这一值没有破坏所讨论的产物的性质。
有利地，洗脱缓冲液的离子强度的值在0.5和1.3之间，特别地在0.9和1.1之间。离子强度上的这一增加通过加入上文定义的任何盐或盐的混合物尤其是氯化钠来获得。洗脱缓冲液还可包含其他的赋形剂例如包含柠檬酸三钠(10至12g/l)、赖氨酸(1至5g/l)、甘氨酸(1至5g/l)、Tris盐(2至5g/l)、精氨酸(25至50g/l)和异亮氨酸5至15g/l)的称为混合物A的成分的混合物。
洗脱液中的蛋白质浓度通常为4g/l级。
所获得的生物胶洗脱液的量的至少一部分之后可经历预期将伴随纤维蛋白原的FXIII分离的处理。
这一分离经由通过向步骤h)的洗脱液加入沉淀化学剂导致FXIII的沉淀来进行，可能地以适当浓度的水溶液的形式加入以获得凝血因子XIII的沉淀。
优选地，沉淀化学剂是含有1M的柠檬酸盐例如柠檬酸钠尤其是柠檬酸三钠的水溶液。
所形成的FXIII的沉淀物之后从高度富含纤维蛋白原的上清液分离。
在一个优选的实施方案中，FXIII的沉淀物可经由通过5μm滤器的过滤来回收。
由此回收的FXIII的沉淀物之后被重置于溶液中，优选地在水或缓冲液中。在一个优选的实施方案中，FXIII的沉淀物溶解于包含10至12g/l柠檬酸三钠、1至5g/l赖氨酸、1至5g/l甘氨酸、2至5g/l Tris、25至50g/l精氨酸和5至15g/l异亮氨酸的混合物，调节至6.9和7.1之间的pH值的缓冲液中，以便凝血因子XIII的浓度相应于比正常血浆的活性高约100倍的活性。
在这一方面中，FXIII的沉淀物可被溶解例如以便其具有约1至5g全蛋白/l的浓度。
根据本发明，生物胶的溶液(即从步骤h)获得的生物胶的洗脱液)和纤维蛋白原的溶液(富含纤维蛋白原的上清液)可有利地通过超滤来浓缩，直到内含物通常包含15和25g之间的全蛋白/l，使用本领域技术人员已知的常规测量确定。
所获得的，任选地浓缩的，纤维蛋白原、凝血因子XIII和生物胶的三种溶液之后经历渗滤步骤。
渗滤步骤允许除去所使用的任何过量的无机盐以获得具有不超过0.2M的离子强度的溶液并除去重置于溶液中的沉淀物中存在的沉淀剂。应当注意的是生物胶洗脱所需的大量存在的无机盐可对冷冻干燥以及经由干热的病毒失活的过程的功效以及对适合的纳米滤器的病毒截留能力具有有害影响。
渗滤步骤还可被用于一方面掺入足够的赋形剂例如稳定剂和/或保护剂以使得纤维蛋白原、FXIII和生物胶可以干燥加热而无变性的风险并且另一方面使得冷冻干燥物可以在通常3至8分钟内迅速溶解。
在一个优选的实施方案中，渗滤缓冲液含有混合物A(包含10至12g/l柠檬酸三钠、1至5g/l赖氨酸、1至5g/l甘氨酸、2至5g/l Tris、25至50g/l精氨酸和5至15g/l异亮氨酸的混合物)并且具有6.9-7.1的pH值。
有利地，包含混合物A的渗滤缓冲液与用于从阴离子交换树脂洗脱生物胶的缓冲液一样。在这一优选的实施方案中，渗滤和本发明的方法的实行被由此简化并且优化。
根据需要可使用不同组成的渗滤缓冲液，只要它们满足上文列出的标准。上文提及的超滤步骤也可在所述方法的这一阶段在相同的条件下实行。
任选地通过超滤浓缩的渗滤的溶液按照常规方法和常用条件冷冻干燥，即在-40℃和-30℃之间冷冻干燥约48小时。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括例如至少一个病毒失活和/或病毒及污染物(诸如蛋白酶传染性因子)的去除处理的步骤。这一处理可选自由化学病毒失活处理、纳米过滤和干热病毒失活形成的组。
当病毒失活处理是化学处理时，其有利地相当于溶剂-去污剂处理，按照专利EP 0 131 740中描述的方法。所使用的病毒失活化学剂优选地相当于Tween-TnBP的混合物，和更优选地Triton(辛苯昔醇)-TnBP的混合物，其通常的浓度分别为0.3％(v/v)和1％(w/v)。经由化学处理的病毒失活可被整合至所述方法的任何阶段，但是其明智地在步骤h)的层析纯化之前进行。以这一方式，层析纯化将有助于有效去除失活剂。
在所述方法的一个优选的实施方案中，还可提供超滤步骤以除去病毒，尤其是无包膜的病毒和其他外源污染物，除了上文描述的化学病毒失活处理之外还使用所述步骤。纳米过滤可有利地在具有35nm和/或15nm的孔隙率的滤器上进行，尽管就过滤时间和病毒截留的功效被优化而言其他的纳米滤器可被使用。
纳米过滤有利地在从步骤h)获得的洗脱液上或当可用时在重置于溶液中的纤维蛋白原、生物胶或FXIII的渗滤的溶液上进行(在其冷冻干燥之前)。
应当注意的是，为了有效的实行，纳米过滤技术需要控制影响回收的所过滤的化合物的产量同时避免滤器的堵塞以及各种病毒和污染物的通过的物理化学参数。这些参数，例如离子强度、溶液的pH值和过滤操作条件，强加了特定的实行条件，这些特定的实行条件还取决于待过滤溶液中存在的化合物的类型。
对于化学层析的化学参数和渗滤的化学参数的明智的选择使得纳米过滤可以进行而不破坏性能水平。
最后，干热病毒失活处理有利地在冷冻干燥步骤之后获得的纤维蛋白原、生物胶和FXIII的冷冻干燥物上进行，使用80℃72小时的常规条件以将未通过上文的两个病毒失活和/或病毒去除步骤中的至少一个失活和/或去除的无包膜的病毒失活。
干燥加热的冷冻干燥物之后可在与临床使用相容的水性介质优选地在注射用水中重构或者直接通过静脉途经注射。
因此，本方法的实行产生生物胶的和纤维蛋白原的高度纯化的浓缩物的冷冻干燥物，它们各自的纤维蛋白原含量相对于总蛋白质含量为约80％-90％。
不使用内嵌式分散器，纤维蛋白原含量相对于总蛋白质含量为70％和77％之间(参见表A)。
此外，生物胶和纤维蛋白原的浓缩物中凝血因子的活性分别为约5U/ml和约1.5U/ml。
所获得的凝血因子XIII的浓缩物不含污染物蛋白质并且根据需要具有根据重置于溶液中的FXIII沉淀物的浓度和/或超滤之后获得的浓度获得的在从约30U/ml至约700U/ml，优选地从100U/ml至400U/ml的值的范围内的活性。
此外，本发明的方法中至少一种病毒失活处理步骤和/或病毒和污染物的去除步骤的存在使得能够用本发明的方法获得适于医疗用途的生物胶、纤维蛋白原和凝血因子XIII的浓缩物。
下列实施例说明本发明的一个实施方案但并不限制其范围。
实施例
使用不含冷冻沉淀物的12001的人类血浆。这一血浆在本领域技术人员已知的条件下按照Cohn法经历乙醇沉淀，以使所讨论的血浆中乙醇的浓度是8％(v/v)并且由此获得的混合物的温度为-3℃至-5℃。
之后将由此获得的上清液和沉淀物离心。获得8和12kg之间的乙醇沉淀物，其形成Cohn粗制组分I。
Cohn粗制组分I被重新悬浮并且用3001的“Blombach”缓冲液(B，
Figure BPA00001562611300132
M：Purification of human and bovine fibrinogen(人类和牛纤维蛋白原的纯化).Ark Kem 10：415-443，1956)清洗，所述“Blombach”缓冲液由1M甘氨酸、0.055M柠檬酸三钠和6.5％乙醇(v/v)的混合物形成，pH值6.8。
使用Z66型内嵌式分散系统(Ystral)进行清洗。
在具有标定为3mm的喷嘴的Sharpless AS 16离心机上离心之后，回收约8kg的清洗的血浆糊(Cohn纯化组分I)，其于37℃的温度溶解于由0.12M氯化钠、0.010M柠檬酸三钠和0.05M精氨酸的混合物形成的pH值7.4的60l缓冲液中。
之后由此获得的溶解的血浆糊于25℃和6.9-7.1的pH值经历使用108g每kg血浆糊的比率的氧化铝凝胶的处理。
一旦使用氧化铝凝胶的处理结束，溶液经历使用0.65μm纤维素纤维(Seitz，type K700)的滤器的深度透镜过滤和使用0.2μm滤器的灭菌过滤。
根据EP 0 131 740中描述的方法，这一溶液然后在Tween-TnBP(其分别浓度为0.3％(v/v)和1％(w/v))存在的条件下受到通过溶剂-去污剂进行的第一次病毒失活处理。
表A将实行包含经由内嵌式分散的清洗步骤的方法(例如上文描述的)获得的纤维蛋白原、蛋白质的浓度以及纤维蛋白原的纯度与其中在内嵌式分散系统不存在的条件下进行清洗步骤的相似方法的那些相比较。
应当注意的是，表A中给出的结果对应于分别从用于不包括经由分散的任何清洗步骤的所述方法的2个不同批次的血浆获得的平均值和包含经由分散的清洗步骤的方法的3个不同批次的血浆获得的平均值。除了在清洗乙醇沉淀时使用转子/定子型内嵌式分散器之外，表A中描述的方法是完全相当的(包括所使用的所有缓冲液和温度)
表A-生产过程中的对照结果
Figure BPA00001562611300141
显而易见的是用内嵌式分散器获得的结果就纤维蛋白原的纯度总是显著高于使用常规清洗系统获得的纯度而言是明显较高的。因此，看起来所用的内嵌式分散器的功效有助于改进清洗步骤并由此增加所述方法的这一阶段的纤维蛋白原纯度。因此内嵌式分散器使得能够随着乙醇沉淀物在清洗缓冲液中非常精细的分散而获得更均质的溶液，并因此有助于除去更大比例的污染物。还很重要而应当注意的是溶液的病毒检验没有显示可堵塞清洗步骤之后的步骤中的离心机喷嘴的任何附聚物
此外，在从所述方法的这一第一部分获得的可溶血浆组分中测量不同污染物蛋白质的浓度。这些结果概括于下文表B中。
表B
Figure BPA00001562611300151
从表B中给出的结果清楚地看出经由内嵌式分散的清洗步骤允许除去显著较高数目的伴随纤维蛋白原的共纯化的蛋白(污染物蛋白)。
之后将稀释的可溶血浆组分注射至用由0.06M氯化钠和0.011M柠檬酸三钠组成的调节至8.0的pH值130-150毫渗透摩尔/kg的重量渗透摩尔浓度的缓冲液预先平衡的，用Macropep DEAE阴离子交换凝胶(Bio-Rad，France)填充的色谱柱中。在这些条件下，形成生物胶的纤维蛋白原和凝血因子XIII被载体截留。通过使用相同缓冲液进行几次连续的清洗，较弱截留或未被截留在载体上的蛋白、以及Tween和TnBP随滤液中被去除。
当于280nm测量的OD降为基线值的值时，将用包含1M氯化钠和由柠檬酸三钠(11.2g/l)，赖氨酸(2.0g/l)，glycine(2.0g/l)，Tris salt(2.40g/l)，精氨酸(40g/l)和异亮氨酸(10g/l)组成的混合物A’的调节至7.5的pH值＞2000的毫渗透摩尔/kg的重量渗透摩尔浓度的洗脱缓冲液进行纤维蛋白原和凝血因子XIII的洗脱，形成生物胶。
将由此回收的纯化的生物胶的洗脱液经历35nm和1m2表面积的PLANOVA滤器(Asahi-Japan)上的纳米过滤，以便除去可能没有被上文的溶剂-变性剂处理失活的病毒。所述方法的这一阶段全蛋白的含量为约4.0g/l溶液。
分离50％体积的生物胶洗脱液并且将1M柠檬酸三钠加入剩余体积的洗脱液以沉淀凝血因子XIII。
确保所有的凝血因子XIII被沉淀后，通过在5μm Sartopure滤器(Sartorius-France)上过滤来分离并回收沉淀物。
将由此回收的FXIII沉淀物在注射用水中重置于溶液中至约1g/l的比例。
生物胶的溶液(洗脱液)和纤维蛋白原的溶液通过在5m2表面积的BiomaxMillipore 100kDa滤器上超滤来浓缩以使每种溶液的蛋白质含量达到15g/l。
上文浓缩的溶液和FXIII溶液经历渗滤，在与超滤所用的那些相同的滤器上，对pH值6.9-7.1，590-610毫渗透摩尔/kg的重量渗透摩尔浓度的上文定义的混合物A’进行，其同样使得可以除去氯化钠。
在0.45-0.2μm的滤器上进行灭菌过滤之后，取样100ml的各种渗滤的溶液并且放在玻璃瓶中以便在-40℃和-30℃之间进行冷冻干燥48小时。
将所获得的纤维蛋白原、生物胶和凝血因子XIII的冷冻干燥物经历经由干燥加热至80℃72小时的最后的病毒失活步骤并贮存直到随后的医疗应用。

Claims (11)

1.一种处理血浆的方法，所述方法包括步骤：
a)血浆或血浆组分的乙醇沉淀；
b)回收步骤a)形成的沉淀物；
c)通过分散清洗所述沉淀物；
d)回收清洗的血浆糊；以及
e)将所述清洗的血浆糊溶解。
2.根据权利要求1所述的处理血浆的方法，其中，步骤c)的所述通过分散清洗使用转子/定子型分散器进行。
3.根据权利要求1或2所述的处理血浆的方法，其中步骤c)的所述通过分散清洗使用内嵌式分散器进行，步骤b)的所述沉淀物被进料至所述分散器的轴向入口而清洗的产物在所述分散器的径向出口排出。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的处理血浆的方法，其中步骤b)的所述沉淀物的回收和/或步骤d)的所述血浆糊的回收通过离心来进行。
5.根据权利要求4所述的处理血浆的方法，其中步骤d)的所述血浆糊的回收使用喷嘴离心机来进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的处理血浆的方法，其中步骤c)清洗的所述产物是基本上均质的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的处理血浆的方法，所述方法包括另外的步骤：
f)用氢氧化铝处理所述溶解的血浆糊和/或低温处理所述溶解的血浆糊；
g)通过将步骤f)获得的上清液澄清和/或灭菌过滤获得可溶的血浆组分。
8.根据权利要求1至7中的一项所述的处理血浆的方法，其中步骤c)的所述通过分散清洗用由0.5-1.5M甘氨酸、0.01-0.1M柠檬酸三钠和5.0-8.0％(v/v)乙醇的混合物构成的pH值6.7-6.9的缓冲液进行。
9.一种处理血浆的方法，所述方法包括根据权利要求1至8所述的方法并包括另外的步骤：
h)在截留生物胶的条件下，将步骤g)的所述可溶的血浆组分在用碱性pH值的预定离子强度的缓冲液预先平衡的弱碱型的阴离子交换型的树脂上层析纯化，通过增加所述缓冲液的离子强度洗脱所述生物胶；
i)通过加入至少一种化学剂沉淀FXIII将FXIII从在步骤h)获得的全部或部分生物胶的洗脱液中沉淀；
j)回收相应于步骤i)的上清液的纯化的纤维蛋白原的溶液；以及
k)将重置于溶液中的纤维蛋白原和/或生物胶和/或FXIII的溶液渗滤，之后将所述溶液冷冻干燥。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括至少一个病毒失活处理步骤和/或病毒和污染物的去除步骤，所述处理选自由化学病毒失活处理、纳米过滤和经由干燥加热的病毒失活处理形成的组。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括在渗滤步骤k)之前或在所述步骤之后在冷冻干燥之前进行的浓缩超滤步骤。
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