KR20120089750A - 분산 수단에 의하여 세척하는 단계를 포함하는 혈장 처리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈장 또는 혈장 분획을 에탄올 침전시키고, 그 침전물을 회수하여 세척하고, 그 세척된 혈장 페이스트를 회수한 후 용해시키는 단계를 포함하는 혈장 처리 방법에 관한 것이다.

Description

분산 수단에 의하여 세척하는 단계를 포함하는 혈장 처리 방법{METHOD FOR TREATING BLOOD PLASMA INCLUDING A STEP OF WASHING BY MEANS OF DISPERSION}

본 발명은 혈장 또는 혈장 분획을 에탄올 침전시키고, 그 침전물을 회수하여 세척하고, 세척된 혈장 페이스트를 회수하여 용해시키는 단계들을 포함하는 혈장 처리 방법에 관한 것이다.

피브리노겐은 응고를 지배하는 일련의 반응 후에 형성되는 불용의 피브린에 이르기까지 중합되어, 출혈의 원인이 되는 혈관 상처를 폐색하는 혈전을 형성하도록 하기 때문에, 혈액 응고의 중추적 역할을 하는 단백질이다. 그러므로 혈전의 형성은 지혈에 주요한 역할을 한다. 더불어, 상처 부위에 형성된 피브린은 조직 치유(힐링)를 가능하게 하는 미소 섬유(fibrillar)의 네트워크를 형성한다.

선천적으로 피브리노겐이 결핍되면 심각한 병적 현상을 초래할 수 있다. 이 결핍을 치료하기 위해서는, 환자에게 치료를 행할 수 있는 상업적으로 구입가능한 피브리노겐 농축액을 확보할 필요가 있다. 특히, 대량의 혈액 손실(수술, 트라우마, 등) 또는 그에 따른 파종성 혈관내 응고(DIC)의 경우, 피브리노겐을 공급하여 다른 병적 현상을 치료할 수도 있다.

또한, EP 0 305 243, FR 2 448 900 및 FR 2 448 901 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 주성분으로 피브리노겐 함유 트롬빈에 의하여 활성화될 수 있는 생물적 글루, 및 인자 XIII(FXIII)은 임상 용도(예: 피부이식, 신경 또는 동맥 봉합) 내에서 조직 치유용으로 효율 좋게 사용된다.

이들 제품 내에 인자 XIII 또는 트랜스글루타미나제의 존재는 피브린을 불용으로 하는 인터커티너리 공유 결합의 생성을 통해 피브린의 안정화에 기여한다. 종종, 이들 제품은, 이들 제품의 치료적 기능을 수행할 수 있도록, 정제된 인자 XIII의 외인성 첨가를 요구하는 피브리노겐 복합 제조 방법을 이용하여 얻어진다.

결과적으로, 치료적 목적으로서의 피브리노겐 농축액, 생물학적 글루 및 인자 XIII을 제공하기 위해서는, 다양한 타입의 오염물(예: 동반 또는 공침 된 단백질, 항체 또는 프로테아제)을 충분히 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스 관점에서도 안전한 제품을 생성할 수 있는 정제 기법이 요구된다.

혈장으로부터 피브리노겐, 필요에 따라 FXIII을 함유하는 피브리노겐이 풍부한 분획의 단리는 공지되어 있고, Cohn과 Nitschmann의 연구에 의해 처음으로 기술되었다(Cohn et al , J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424). 더욱 최근의 기법은 다른 혈장 원(source)의 침전 기법에 여과, 크로마토그래피, 바이러스 불활성 등의 기법을 결합하는 것이다. 예를 들어, 특허 및 특허출원 EP 0 359 593, US 5 099 003, EP 0 305 243, FR 2 448 900 및 FR 2 448 901을 들 수 있다.

그러나, 종래 알려진 방법의 대부분은 개별 제품군의 사용과 관련이 있는 것으로, 피브리노겐의 농축액 또는 조성물을 제조하는 방법, 생물학적 글루의 농축액 또는 조성물의 제조 방법, 또는 피브리노겐이 풍부하고 이에 동반하는 기타 단백질(예: 인자 XIII, 인자 VIII, 피브로넥틴, von Willebrand 인자 등)을 함유하는 농축액 또는 조성물을 제조하는 다른 방법에 관한 것이다. 그러므로 종래 알려진 방법의 대부분은 생물학적 글루, 피브리노겐 및 인자 XIII에 대해 동시에 요구되는 경우에, 공업적 규모로 사용하기에 적합하지 않았다. 관심의 단백질을 치료 용도로 적용할 경우에는 공업적 규모로 이들 정제 방법들의 복합적 수행을 더욱 고정도로 행하여 바이러스 및 다른 소망하지 않는 오염물(예: 프리온)을 불활성화 및/또는 제거하여야 한다.

특허출원 EP 1 739 093에는 피브리노겐과 인자 XIII를 포함하는 용해된 혈장 분획으로부터 피브리노겐 단백질, 인자 XIII 및 생물학적 글루를 분리하고, 그 단백질의 동결건조 농축액을 제조하는 단일의 방법이 기재되어 있다. 특허출원 EP 1 739 093에는 용해된 혈장 분획을 약 염기 타입의 음이온 교환기 상에서, 생물학적 글루의 유지를 허용하는 조건 하에서 크로마토그래피 정제를 행하는 단계, FXIII을 침전시키는 적어도 하나의 화학 약품을 첨가하여 피브리노겐으로부터 FXIII을 분리하는 단계, 정제된 피브리노겐 상징액의 생성 용액을 회수하는 단계, 피브리노겐 용액, 생물학적 글루 용액 및 FXIII 용액을 투석여과하는 단계, 이어서 상기 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다. 특허출원 EP 1 739 093에는 적어도 하나의 바이러스 불활성화 처리 단계 및/또는 바이러스 및 오염물 제거 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있고, 여기서, 바이러스 불활성 처리는 화학적 바이러스 불활성 처리, 나노여과 및 건조 가열처리 중에서 선택된다. 그러나, 종래 알려진 방법에 사용된 재현탁(re-suspending) 기법은 완전히 만족하다고 볼 수 없다. 종래 알려진 방법에서는, 재현탁 시에 발생하는 전단(shearing) 현상에 의하여, 관심 단백질의 분해가 일어날 수 있다. 그러므로, 관심 단백질의 분해를 감소시키고 또 추출된 단백질의 순도를 향상시킬 수 있는 개선 방법이 강하게 요구된다.

본 출원인은 의외로, 예를 들어 특허출원 EP 1 739 093의 방법에서 원재료로 사용한 용해된 혈장 분획의 예비 제조 동안에, 세척 공정을 분산에 의하여 행하면, 세척 공정을 현탁액 교체에 의해서만 수행하는 종래의 방법에 비하여 세척의 질이 아주 향상됨을 알아냈다. 이로부터, 분산에 의하여 세척 공정을 수행하면, 예를 들어 특허출원 EP 1 739 093의 방법을 수행함으로써 얻어지는 용해된 혈장 분획 내 피브리노겐의 순도, 피브리노겐 농축액 내에서의 피브리노겐의 순도 및 생물학적 글루의 순도가 향상됨을 알았다.

본 발명에 의해 얻어지는 이점은 특허출원 EP 1 739 093의 하나의 방법에 국한되는 것이 아니며, 에탄올 분획(Cohn Fraction I)을 이용하는 방법들에서 얻어질 수 있다.

본 발명은

a) 혈장 또는 혈장 분획을 에탄올 침전시키는 단계;

b) 단계 a)에서 형성된 침전물을 회수하는 단계;

c) 상기 침전물을 분산에 의해 세척하는 단계;

d) 상기 세척된 혈장 페이스트를 회수하는 단계; 및

e) 상기 세척된 혈장 페이스트를 용해시키는 단계;

를 포함하는 혈장 처리 방법에 관한 것이다.

단계 c)의 분산에 의한 세척은 회전자/고정자 타입의 분산기를 사용하여 행하는 것이 바람직하다. 사용되는 분산기는 인라인 분산기이고, 단계 b)의 침전물은 그 분산기의 축 주입구로 공급되고 또 세척물은 그 분산기의 레디얼 배출구로 배출되는 것이 좋다.

본 발명의 방법은

f) 상기 용해된 혈장 페이스트를 수산화알루미늄으로 처리, 및/또는 그 용해된 혈장 페이스트를 저온에서 처리하는 단계;

g) 단계 f)로부터 생성된 상징액을 청징화(clarifying) 여과, 및/또는 멸균 여과 함으로써 가용 혈장 분획을 얻는 단계;

를 더 포함해도 좋다.

본 발명의 방법은

h) 소정의 염기 pH 이온 강도의 버퍼로 미리 평형화된 약 염기 타입의 음이온 교환 수지상에서, 단계 g)의 가용 혈장 분획을, 상기 버퍼의 이온 강도를 증가시킴으로써 용출되는 생물학적 글루(glue)의 유지를 허용하는 조건 하에서 크로마토그래피 정제를 행하는 단계;

i) FXIII를 침전시키는 적어도 하나의 화학 약품을 첨가함으로써, 단계 h)에서 얻어진 생물학적 글루 용출액의 전부 또는 일부로부터 FXIII의 침전을 행하는 단계;

j) 단계 i)의 상징액에 대응하는 정제된 피브리노겐 용액을 회수하는 단계; 및

k) 피브리노겐 용액 및/또는 생물학적 글루 용액 및/또는 용액에 재투입된 FXIII 용액을 투석여과(diafiltration)하고, 이어서 상기 용액을 동결건조하는 단계;

를 더 포함해도 좋다.

그러므로, 본 출원인이 발견한 방법, 즉 세척 단계를 분산에 의하여 수행하는 방법에 의해, 실질적으로 공 정제된 단백질 및 원치않는 오염물이 없고, 동결건조되고 또 고순도의 피브리노겐, 인자 XIII 및/또는 생물학적 글루의 농축액을 얻을 수 있다. 분산에 의해 세척 단계를 수행하면, 종래 기술인 단순한 현탁액 교체에 의한 세척에 비하여, 관심의 단백질(특히 피브리노겐)을 포함하는 초기 혈장 분획을 양호하게 세척할 수 있고, 또 이 방법의 이후 단계(이후 공정)를 거쳐 이들 화합물의 순도를 현격하게 향상시킬 수 있다.

분산에 의해 세척 단계를 수행하면, 간단하고, 신속하고, 그리고 저비용으로 고순도를 달성할 수 있으므로, 공업적 규모로 실시했을 때 원재료(혈장 또는 혈장 분획)에 대해 현격하게 비용을 절감할 수 있게 된다. 따라서, 제조 비용을 절감하면서, 생물학적 글루, 인자 XIII 및/또는 피브리노겐의 생산을 최적화할 수 있다.

또한 본 발명의 방법에 의하면, 적어도 하나의 바이러스 불활성 처리 및/또는 바이러스와 다른 원치않는 오염물(예: 중합체, 집합체 또는 프리온)의 제거와 양립을 유지하면서, 피브리노겐과 인자 XIII를 바람직하게 함유하는 혈장 원재료로부터 동결건조된 고순도의 단백질을 얻을 수 있다.

도 1은 회전자/고정자 분산기의 개략도.

본 발명은

a) 혈장 또는 혈장 분획을 에탄올 침전시키는 단계;

b) 단계 a)에서 형성된 침전물을 회수하는 단계;

c) 상기 침전물을 분산에 의해 세척하는 단계;

d) 상기 세척된 혈장 페이스트를 회수하는 단계; 및

e) 상기 세척된 혈장 페이스트를 용해시키는 단계;

를 포함하는 혈장 처리 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 다양한 혈장 원재료 원(source), 특히 피브리노겐 및 인자 XIII를 함유하는 원을 사용하여 수행할 수 있다. 그러므로 이 방법은 Cohn's 분획법에 의해, 혈장으로부터 냉 알코올을 사용하여 직접적으로 수행할 수 있다( Cohn et al , J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424).

본 발명 방법의 단계 b) 및 d)는 원심분리에 의해 행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 용어 <<분산>>은 에탄올 침전 입자를 분리하여 그들을 세척 버퍼에 의하여 형성된 매체 내에 균질하게 또는 실질적으로 균질하게 분포시키는 것을 의미한다. 이 분산은 종래 기술에 기술되어 있는 재현탁법과는 다른 것으로, 이들 재현탁법은 입자들이 균질하게 분포되지 않는다.

본 발명 방법의 단계 c)에서의 분산에 의한 세척 단계는 회전자/고정자 타입의 분산기를 사용하여 행하여진다. 회전자/고정자 타입의 분산기는 통상적으로 적어도 하나의 치형(toothed) 회전자와 적어도 하나의 치형 고정자를 포함하며, 고전단 속도를 갖는 조립체를 형성한다. 제품(여기서는 세척 버퍼와 에탄올 침전물과의 혼합물)은 치형 회전자의 슬롯 사이 분산 영역에 도입되고, 고정자 링의 슬롯을 거쳐 배출되며, 펌핑 효과는 그 기계 자체에 의하여 확보된다. 내부 회전자 링은 제품의 통과 속도를 증가시키며, 고정자 링은 속도를 급격히 제동하여 제품의 정밀 분산을 촉진한다. 전단 슬롯 내의 강한 난류(turbulence)는 고체상 입자를 분쇄하고 균질한 분포로 분산시킨다. 회전자와 고정자의 형상은 제품의 분산 조건에 따라 적합하게 채택할 수 있다.

분산기를 하나의 도면으로 예시하였다.

상기 분산기, 특히 인라인 회전자/고정자 분산기는 세척 버퍼 내에 에탈올 침전물을 아주 미세하고, 균질 또는 실질적 균질하게 분산시켜서 균질 또는 실질적으로 균질한 용액을 형성할 수 있게 하므로, 단백질 오염물의 상당한 부분의 제거에 기여한다.

이 회전자/고정자 분산기는 종래에는 에멀젼 또는 피그먼트 현탁액를 제조하기 위하여, 또는 용액 중에 세제를 내포시키기 위하여, 또는 콜로이드 용액을 제조하기 위하여, 또는 분말 및 이와 유사한 제품을 균질화하기 위하여 사용됨은 알려져 있지만, 이 회전자/고정자 분산기가 혈장 단백질의 정제 방법에 사용됨의 기재는 없다.

분산기를 사용하면 용액 또는 현탁액이 가열되므로, 항온조에는 이 분산기를 사용할 수 없음이 알려졌었다. 그러므로, 본 발명의 이전까지는, 분산기를 혈장 제품의 제조 방법에 사용하면, 온도가 상승하여, 결과적으로 혈장 단백질이 분해하는 것으로 생각했던 것 같다.

그러나, 본 출원인은 분산기를 사용하면 분산에 필요한 시간이 단축되어 분산액의 가열이 감소함을 의외로 알아냈다. 현재 예상한 기술적 의견과 반대로, 혈장 단백질의 분해를 일으키지 않는 범위 내에서, 분산기를 혈장 단백질의 정제 방법에 사용함이 특히 적합함이 입증되었다.

또한, 본 출원인은 분산기를 사용하면, 오염 단백질의 양이 현격히 감소함을 알아냈다. 하나의 바람직한 형태로, 본 발명의 단계 c)에서 분산에 의한 세척 단계는 인라인 분산기를 사용하여 행한다. 이 경우, 바람직한 회전자/고정자 타입의 분산기는, 상기 정제법을 수행하기 위하여 요구되는 다른 공업적 장치와 동일한 생산 라인 상에 탑재된다. 단계 b)의 침전물은 바람직하게는 세척 버퍼와 함께 인라인 분산기의 축 주입구로 공급되고, 세척물(세척 버퍼 중에 에탄올 침전물이 실질적 균질하게 분산되어 있는 분산액)은 상기 인라인 분산기의 레디얼 배출구로 배출된다.

상기 인라인 분산기는 간단하게 떼어내서 손쉽게 세정할 수 있도록 디자인되어 있고 또 CIP 시스템(Clean-In-Place) 내에 통합할 수 있기 때문에, 이 분산기를 사용하면 무균 상태를 보증할 수 있게 된다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 단계 c)에서 분산기를 사용하여 에탄올 침전물을 세척하면, 사용한 세척 버퍼 내에 에탄올 침전물의 균질 또는 실질적인 균질 현탁액을 얻을 수 있다. 이 균질한 또는 실질적으로 균질한 현탁액은 그 현탁액 내에 응집이 없음을 육안으로 관찰하여 입증할 수 있다.

또 하나의 구체예로, 본 발명의 단계 c)는 응집 방지 블레이드 타입의 교반기가 장착된 탱크를 사용하여 행한다. 이 교반기는 1차 분산을 행하며, 이 1차 분산에 의하면 균질 하지는 않지만 응집이 없는 페이스트가 얻어진다. 이 교반기는 2차 분산을 행하는 인라인 분산기 시스템과 짝을 이루며, 이 2차 분산에 의하여 미세하고 균질한 현탁액이 얻어진다.

또 하나의 바람직한 구체예로, 단계 b)에서 행한 침전물의 회수 및/또는 단계 d)에서의 혈장 페이스트의 회수는 원심분리에 의해 행한다. 단계 d)에서의 혈장 페이스트의 회수는 주입(injection) 원심분리기를 이용하여 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, 단계 c)에서 분산에 의해 세척된 침전물을 현탁액 내의 입자 크기와 연관하여 직경을 조정한 인젝터에 의해 공업적 원심분리기에 안착시킨다. 하나의 바람직한 구체예로, 상기 주입 원심분리기는, 사용되는 분리기와 연관하여 직경을 조정(2~4mm)한 특정의 인젝터를 갖는 <<Sharpless AS 16>> 타입 또는 <<Westfalia Separator>> 타입의 것이다.

단계 c)에서 분산에 의해 세척을 행하면, 세척 버퍼 내에 매우 미세한 에탄올 침전물 입자가 분산되어 있는 현탁액을 얻을 수 있다. 형성된 실질적으로 균질한 현탁액에 대해, 그 현탁액이 원심분리기 인젝터의 막힘을 방지할 수 있는 범위 내에서, 주입 원심분리기를 사용할 수 있음이 입증되었다.

또 하나의 바람직한 구체예로, 혈장 페이스트의 용해는 0.06~0.18 M 염화나트륨, 0.005~0.02 M 구연산 3나트륨 및 0.02~0.08 M 아르기닌을 함유하는 버퍼로, pH 7.3~7.5에서 행한다.

또 하나의 바람직한 구체예로, 에탄올 침전에 의해 형성된 침전물은 0.5~1.5 M 글리신, 0.01~0.1 M 구연산 3나트륨 및 5.8~8.0 %(v/v) 에탄올의 혼합물로 구성된 버퍼로 pH 6.7~6.9에서, 분산에 의해 세척된다.

또 하나의 구체예로, 본 발명은

f) 상기 용해된 혈장 페이스트를 수산화알루미늄으로 처리, 및/또는 그 용해된 혈장 페이스트를 저온에서 처리하는 단계;

g) 단계 f)로부터 생성된 상징액을 청징화(clarifying) 여과, 및/또는 멸균 여과함으로써 가용 혈장 분획을 얻는 단계;

를 더 포함한다.

단계 f)에서 수산화알루미늄을 첨가하면 원치않는 단백질(예: 인자 II (FII), 인자 VII (FVII), 인자 IX (FIX), 인자 X (FX))을 제거할 수 있다. 용해된 혈장 페이스트를 처리하여 생성된 상징액(출원 명세서에서는 <<가용 혈장 분획>>으로도 표기됨은 적어도 하나의 청징화 여과 및/또는 멸균 여과에 의해 정제된다. 이 가용 혈장 분획은 수산화알루미늄의 유지를 허용할 목적으로 뎁스(depth) 여과를 행할 수도 있다.

청징화 여과를 행하면 불용의 오염 입자를 제거할 수 있다. 이 청징화 및 멸균 여과는 예를 들어 0.8 내지 0.1㎛ 필터를 사용하여 통상적으로 행하여진다. 적어도 하나의 청징화 여과는 셀룰로오스 섬유 0.65㎛ 필터를 사용하여 행하는 것이 바람직하다. 하나의 바람직한 구체예로, 적어도 하나의 멸균 여과는 0.2㎛ 필터를 사용하여 행한다.

단계 g) 후에 얻어진 가용 혈장 분획은 바로 사용할 수 있고, 필요하다면 추가의 정제 단계를 수행할 때까지 동결시킬 수 있다.

분산에 의하여 세척하는 단계를 포함하는 혈장 처리 방법을 수행하면, 상기 가용 혈장 분획 내에 피브리노겐 순도가 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%로 된다.

세척 단계 동안 인라인 분산 시스템을 사용하면, 가용 혈장 분획 단계에서 피브리노겐이 풍부하게 된다. 이 기술을 행하면, 인라인 분산시에 현탁액의 균질도가 향상되고 또 세척 단계에서 피브리노겐이 풍부해지는 결과를 재현할 수 있고, 후 단계에서 원하는 단백질의 분해를 막을 수 있게 된다.

바람직한 하나의 구체예로, 본 발명에 의한 혈장 처리 방법은

h) 소정의 염기 pH 이온 강도의 버퍼로 미리 평형화된 약 염기 타입의 음이온 교환 수지상에서, 단계 g)의 가용 혈장 분획을, 상기 버퍼의 이온 강도를 증가시킴으로써 용출되는 생물학적 글루(glue)의 유지를 허용하는 조건 하에서 크로마토그래피 정제를 행하는 단계;

i) FXIII를 침전시키는 적어도 하나의 화학 약품을 첨가함으로써, 단계 h)에서 얻어진 생물학적 글루 용출액의 전부 또는 일부로부터 FXIII의 침전을 행하는 단계;

j) 단계 i)의 상징액에 대응하는 정제된 피브리노겐 용액을 회수하는 단계; 및

k) 피브리노겐 용액 및/또는 생물학적 글루 용액 및/또는 용액에 재투입된 FXIII 용액을 투석여과(diafiltration)하고, 이어서 상기 용액을 동결건조하는 단계;

를 더 포함한다.

가용 혈장 분획의 크로마토그래피 정제(단계 h)는 DEAE와 같은 약 염기 타입의 음이온 교환기가 그래프트 되어 있는 천연 또는 합성 중합체 마트릭스, 수지 또는 겔 상에서 행한다. 종래 이러한 타입의 크로마토그래피 지지체는 DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE-Trisacryl LS, Fractogel TSK-DEAE 650 M or S, DEAE-Macroprep (Bio-Rad, France) 등의 이름으로 시판되고 있다.

상기 음이온 교환기의 평형 버퍼는 소정의 이온 강도를 갖고, 또 염기성 pH를 가져야 한다. 이 이온 강도는 전형적으로 0.2 미만의 값이며, 바람직하게는 0.06~0.2, 더욱 바람직하게는 0.08~0.15이다.

이 이온 강도는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 무기 염, 또는 이들의 혼합물, 가장 바람직하게는 알칼리 금속의 무기 염, 구체적으로는 염화나트륨을 첨가함으로써 조정할 수 있다.

상기 평형 버퍼의 최대 pH 값은 제품의 변성을 회피할 수 있는 범위 내에서 선택할 수 있지만, 약 10이다.

그 pH는 7 초과 9 이하이고, 바람직하게는 7.5~8.2이다.

하나의 예로서, 이 버퍼는 pH 7.9~8.1이고, 0.06 M 농도의 염화나트륨으로 구성되며, 바람직하게는 구연산 3나트륨 0.011 M 농도를 포함하는 것이 가장 바람직할 수 있다. 또한, 염화나트륨계, 또는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 무기염계 버퍼에, 원하는 제품의 변성을 일으키지 않는 생물학적으로 적합한 다른 화합물을 더 포함하는 임의 다른 버퍼를 사용할 수 있다.

상기 가용 혈장 분획을 음이온 교환기에 적용할 때, 운전 조건은 생물학적 글루가 지지체 상에 유지되도록 하는 것이다.

하나의 바람직한 구체예로, 생물학적 글루의 용출 단계에 앞서, 본 발명의 방법은, 단백질과 비유지 오염물이 제거될 때까지 상기 평형 버퍼를 사용하여 음이온 교환기를 세척하는 단계를 포함해도 좋다. 이 세척 단계에서, 지지체 상에 세척 버퍼의 투수를 통해, 피브리노겐 함유 용액에 존재하는 단백질(예: 이뮤노글로빈 G (IgG), A (IgA) 및 M (IgM) 과 알부민), 및 음이온 교환기에 의하여 유지되지 않거나 또는 약하게 유지되는 오염물(예: 화학적 바이러스 불활성제)의 여과액 속으로 통과하게 된다. 세척 시간은 여과액의 광학 밀도(OD)를 파장 280nm에서 측정함으로써 구할 수 있다. 기준선의 OD값에 대응하는 OD 값은 상기 인용한 화합물이 효과적으로 제거되었는지에 대한 좋은 지표이다.

하나의 바람직한 구체예에서, 상기 상용된 세척 버퍼는 컬럼의 평형 버퍼와 대응하며, 염화나트륨 0.02~0.1 M과 구연산 3나트륨 0.005~0.02 M로 형성되며 pH 7.8~8.2인 것이 바람직하다.

기준선으로 회귀한 후, pH가 7.4~7.6으로 설정된 평형 또는 세척 버퍼의 이온 강도를 증가시킴으로써 생물학적 글루의 용출이 행하여진다. 이온 강도의 값은 생물학적 글루의 효율적인 용출을 얻을 수 있는 범위이면서, 제품의 특성을 손상하지 않는 것을 고려하여 선택된다.

상기 용출 버퍼의 이온 강도의 값은 0.5~1.3, 특히 0.9~1.1이다. 이온강도는 상기한 염 또는 염의 혼합물, 특히 염화나트륨을 첨가함으로써 증가시킬 수 있다. 상기 용출 버퍼는 구연산 3나트륨(10~12 g/l), 리신(1~5 g/l), 글리신(1~5 g/l), 트리스 염(Tris salt)(2~5 g/l), 아르기닌(25~50 g/l) 및 이소류신(5~15 g/l)을 포함하는 혼합물 A로 불리는 성분 혼합물과 같은 다른 부형제를 포함해도 좋다.

상기 용출액 내에서 단백질의 농도는 통상 4 g/l의 오더이다.

그 후 생물학적 글루 용출액의 일부 양을 채취하여 피브리노겐을 수반하는 FXIII을 분리하기 위하여 기획된 처리에 제공할 수 있다.

이 분리는 단계 h)의 용출액에 화학적 침전제(가능한 한 인자 XIII의 침전을 얻을 수 있는 적당한 농도의 수용액의 형태임)를 첨가하여 FXIII의 침전을 일으킴으로써 행하여진다.

상기 화학적 침전제는 구연산 나트륨, 특히 구연산 3나트륨과 같은 구연산염 1M을 함유하는 수용액이 바람직하다.

그 후, 형성된 FXIII 침전물을 피브리노겐이 풍부한 상징액으로부터 분리한다.

하나의 바람직한 구체예로, FXIII 침전물을 5㎛ 필터를 통한 여과에 의하여 회수할 수 있다.

이렇게 회수한 FXIII 침전물을 용액, 바람직하게는 물 또는 버퍼에 다시 넣는다. 하나의 바람직한 구체예로, FXIII의 침전물을 pH가 6.9~7.1로 조정된, 10~12g/l 구연산 3나트륨, 1~5 g/l 리신, 1~5 g/l 글리신, 2~5 g/l 트리스, 25~50 g/l 아르기닌 및 5~15 g/l 이소류신의 혼합물을 포함하는 버퍼에 용해시켜서, 인자 XIII의 농도가 통상의 혈장의 농도보다 약 100배 큰 활성도에 대응시킬 수 있다.

이러한 관점에서, FXIII 침전물을 용해시켜서 약 1~5g 단백질/l의 농도를 갖도록 할 수 있다.

본 발명에 의하면, 생물적 글루 용액(즉 단계 h)에서 생성되는 생물학적 글루의 용출액)과 피브리노겐 용액(피브리노겐이 풍부한 상징액)을 한외 여과에 의해 15~25g 단백질/l 함량(종래 당업자에게 널리 알려진 측정 방법에 의해 구해짐)까지 농축할 수 있다.

필요에 따라 농축하여 얻어진, 피브리노겐, 인자 XIII 및 생물학적 글루의 3가지 용액을 그 후 투석여과 단계에 제공한다.

이 투석여과 단계에 의하여, 0.2M 이하의 이온 강도를 갖는 용액을 얻기 위하여 사용된 과잉의 무기 염과, 용액 내에 재투입된 침전물 내에 존재하는 침전제가 제거된다. 생물학적 글루의 용출에 필요했던 무기 염이 너무 많이 존재하면, 동결건조 공정 및 건조 가열에 의한 바이러스 불활성 공정의 효율뿐만 아니라 적합한 나노필터의 바이러스 유지 용량에 나쁜 영향을 끼침을 유의해야 한다.

이 투석여과 단계는 피브리노겐, FXIII 및 생물학적 글루를 변성시키지 않고 건조 가열을 행하기 위한, 또 동결건조 제품을 3~8분 내에 신속하게 용해시키기 위한 부형제(예: 안정제 및/또는 보호제)를 내포시키기 위하여 이용될 수 있다.

하나의 바람직한 구체예로, 상기 투석여과 버퍼는 혼합물 A(구연산 3나트륨 10~12g/l, 리신 1~5 g/l, 글리신 1~5 g/l, 트리스 2~5 g/l, 아르기닌 25~50 g/l 및 이소류신 5~15 g/l를 포함함)를 함유하며, pH는 6.9~7.1 이다.

혼합물 A를 함유하는 투석여과 버퍼는 음이온 교환수지로부터 생물학적 글루를 용출시키기 위하여 사용한 것과 같은 것이 좋다. 상기의 바람직한 구체예에 의해, 본 발명의 방법과 투석여과를 간단하고 최적으로 실행한다.

필요에 따라 다른 조성의 투석여과 버퍼도 상기한 목적 범위를 충족시킨다면 사용될 수 있다. 상기한 한외여과 단계도 상기 방법의 단계와 동일한 조건으로 수행할 수도 있다.

필요에 따라 한외여과에 의해 농축된 투석여과 용액은 이어서 종래 방법과 통상의 조건, 즉 -40℃~-30℃에서 약 48시간 동결건조한다.

하나의 바람직한 구체예로, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 바이러스 불활성 처리 단계 및/또는 프리온과 같은 바이러스 및 오염물 제거 처리 단계를 포함한다. 이 처리는 화학적 바이러스 불활성 처리, 나노여과 및 건조 가열 바이러스 불활성 처리로 구성된 군으로부터 선택된다.

상기 바이러스 불활성 처리가 화학적 처리일 경우, 용매-세제로 처리하고, 이어서 특허 EP 0 131 740에 기재된 방법에 따르는 것이 좋다. 사용되는 바이러스 불활성 화학 약품은 Tween-TnBP의 혼합물이 바람직하며, Triton(옥토시놀)-TnBP의 혼합물(각각의 농도는 0.3%(v/v)와 1%(w/v)임)이 더욱 바람직하다. 이 화학적 처리에 의한 바이러스 불활성은 본 방법의 임의 단계에서 행할 수 있지만, 단계 h)의 크로마토그래피 정제 전에 행하는 것이 중요하다. 이와 같이, 크로마토그래피 정제는 불활성 화학 약품을 효율적으로 제거하는 데 기여한다.

본 방법의 하나의 바람직한 구체예로, 바이러스, 특히 외피 없는 바이러스, 및 외인 오염물을 제거하기 위한 나노여과 단계를, 상기한 화학적 바이러스 불활성 처리에 부가하여, 필요에 따라 행할 수도 있다. 나노여과는 공극 35nm 및/또는 15nm을 갖는 필터로 수행하는 것이 좋고, 다른 나노필터도 여과 시간과 바이러스 유지 효율이 최적화되는 범위 내에서 사용할 수 있다.

나노여과는 단계 h)에서 생성된 용출액에 대하여, 또는 피브리노겐 용액, 생물학적 글루 용액 및/또는 용액 내에 재투입된 FXIII 용액에 대하여, 그것의 동결건조 전에 행하는 것이 좋다.

상기 나노여과를 효율 좋게 수행하기 위해서는, 필터의 막힘과 바이러스 및 오염물의 통과를 방지하면서, 여과된 회수 화합물의 수율에 영향을 주는 물리화학적 파라미터에 대하여 컨트롤이 필요함을 유의해야 한다. 이들 파라미터(예: 용액의 이온 강도, pH, 여과 운전 조건 등)는 여과된 용액 내에 존재하는 화합물의 종류에 따라 수행 조건이 특이적으로 변경된다.

크로마토그래피 정제와 투석여과를 행할 때 화학적 파라미터를 잘 선정하면, 품질의 수준을 떨어뜨림 없이 나노여과를 수행할 수 있게 된다.

마지막으로, 동결건조 단계 후에 얻어진 피브리노겐, 생물학적 글루 및 FXIII의 동결건조 제품에 대해, 상기한 바이러스 불활성 및/또는 바이러스 제거의 적어도 2개의 단계에 의해서도 불활성 및/또는 제거되지 않았던 외피 없는 바이러스를 불활성 하기 위하여, 종래의 조건 즉 80℃, 72시간 동안 건조 가열 바이러스 불활성 처리를 행하는 것이 좋다.

그 후 상기 건조 가열된 동결건조 제품을 임상적 용도로 적합한 수용성 매체, 바람직하게는 주사용 정제수(WFI) 내에 재구성하여, 정맥을 통해 바로 주사할 수 있다.

그러므로, 이 방법을 수행하면, 단백질 전체 함량에 대한 피브리노겐의 함량이 약 85% 내지 90%인, 생물학적 글루 및 피브리노겐의 고순도 농축 동결건조 제품을 얻을 수 있다.

상기 인라인 분산기를 사용하지 않으면, 전체 단백질 함량에 대한 피브리노겐 함량은 70 내지 77%이다(표 1 참조).

또한, 생물학적 글루 및 피브리노겐의 농축액에서 인자 XIII의 활성도는 각각 약 5U/ml 및 약 1.5 U/ml이다.

FXIII 침전물을 용액에 재투입하고 농축하여 얻어진 인자 XIII의 농축액 및/또는 한외여과 후에 농축하여 얻어진 인자 XIII의 농축액은 오염 단백질이 없으며, 필요에 따라, 30 U/ml 내지 700 U/ml, 바람직하게는 100 U/ml 내지 400 U/ml 범위의 활성도를 갖는다.

또한, 본 발명의 방법에서는 적어도 하나의 바이러스 불활성 처리 단계 및/또는 바이러스 및 오염물의 제거 단계를 가지므로, 이 방법에 의하여 얻어진 생물학적 글루, 피브리노겐 및 인자 XIII의 농축액은 치료 용도로 적합하다.

본 발명의 구체예를 다음의 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

실시예

저온침전물이 없는 인간 혈장 1200 l를 사용하였다. 이 혈장을 당업자에게 널리 알려진 조건 하에서, 에탄올 침전 후 Cohn's법을 적용하여, 혈장 내 에탄올 농도를 8%(v/v)로 하였다. 이렇게 얻어진 혼합물의 온도는 -3℃~-5℃이다.

그 후, 얻어진 상징액과 침전물을 원심분리하였다. 에탄올 침전물 8 내지 12kg을 얻었는데, 이 침전물은 Cohn 불순 분획 I을 형성한다.

이 Cohn 불순 분획 I을 1 M 글리신, 0.055 M 구연산 3나트륨 및 6.5 % 에탄올 (v/v)의 혼합물로 형성된 <<Blombach　>> 버퍼 (Blomback B, Blomback M: Purification of human and bovine fibrinogen. Ark Kem 10:415-443, 1956) 300 l에 pH 6.8에서 재현탁하고 세척하였다.

상기 세척은 인라인 분산 시스템 타입 Z66(Ystral)을 사용하여 행하였다.

3mm로 조정된 주입기를 갖는 Sharpless AS 16 원심분리기로 원심분리 후에, 0.12 M 염화나트륨, 0.010 M 구연산 3나트륨 및 0.05 M 아르기닌의 혼합물로 형성된 pH 7.4의 버퍼 60 l로, 온도 37℃에서 용해된 약 8 kg의 세척 혈장 페이스트를 회수하였다(Cohn 정제 분획 I).

이렇게 하여 얻어진 용해된 혈장 페이스트를 온도 25℃, pH 6.9~7.1에서 혈장 페이스트 1kg 당 108g의 비율로, 알루미나 겔로 처리하였다. 알루미나 겔로 처리한 후, 그 용액을 0.65㎛의 셀룰로오스 섬유 필터(Seitz, K700 타입)를 사용하여 뎁스 렌즈형 여과(depth lenticular filtration) 및 0.2㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과를 하였다.

그 후, 그 용액을 EP 0 131 740에 기재된 방법에 따라, Tween-TnBP(각각의 농도는 0.3%(v/v) 및 1%(w/v) 임)의 존재하에서 용매-세제에 의한 제1 바이러스 불활성 처리를 행하였다.

표 1에서, 인라인 분산(상술함)에 의한 세척 단계를 포함하는 방법을 수행하여 얻어진 피브리노겐과 단백질의 농도 및 피브리노겐의 순도와 분산 단계를 인라인 분산 시스템 없이 수행한 유사 방법을 수행하여 얻어진 피브리노겐과 단백질의 농도 및 피브리노겐의 순도를 비교하였다.

표 1에 나타낸 결과는 분산에 의한 세척 단계를 포함하지 않는 방법에 대한 혈장의 2 배치로부터 얻어진 평균값과 분산에 의한 세척 단계를 포함하는 방법에 대한 혈장의 3 배치로부터 얻어진 평균값이다. 표 1에 기술한 방법에서, 에탄올 침전물을 세척할 때 회전자/고정자 타입의 인라인 분산기를 사용한 것과 그것을 사용하지 않은 것은 엄격히 비교할 만하다(사용한 버퍼와 온도 모두를 포함함).

		분산에 의한 세척 단계를 포함하지 않는 방법	인라인 분산에 의한 세척 단계를 포함하는 방법
		2배치 평균	3배치 평균
에탄올 침전 이전의 원료의 혈장 재료	체적(L)	796	778
	단백질(g/L)	56	54.83
	응고성 피브리노겐(g/L)	1.55	1.46
	피브리노겐 순도(%)	2.76	2.66
용해된 혈장 페이스트	체적(L)	53	54.33
	단백질(g/L)	21.25	17.83
	응고성 피브리노겐(g/L)	15.15	15.9
	피브리노겐 순도(%)	71.29	89.17
용해된 혈장 페이스트를 수산화알루미늄으로 처리한 후에 얻어진 상징액	체적(L)	55	54
	단백질(g/L)	16.5	15.16
	응고성 피브리노겐(g/L)	11.85	12.96
	피브리노겐 순도(%)	71.81	85.13
청정화 및 멸균 여과 후의 가용성 혈장 분획	체적(L)	53.45	53.3
	단백질(g/L)	16	14.33
	응고성 피브리노겐(g/L)	12.35	12.53
	피브리노겐 순도(%)	77.18	87.43

표 1: 제조하는 동안 대조구들의 결과치

인라인 분산기에 의한 세척 방법을 통해서 얻은 피브리노겐의 순도가 종래의 세척 시스템을 사용하여 얻은 순도보다 유의 차가 있게 높음을 명확히 알 수 있다. 그러므로, 인라인 분산기가 세척 단계의 효율 향상에 기여하였고, 그 결과 피브리노겐의 순도가 증가한 것 같다. 그러므로 인라인 분산기는 세척 버퍼 내에 에탄올 침전물을 매우 미세하게 분산시켜서, 한층 더 균질한 용액으로 하고, 그렇기 때문에 오염물의 상당 부분의 제거에 기여하게 된다. 또한 세척 단계 후의 단계에서, 원심분리기 주입구를 막을 수 있는 응집체가 용액 내에 육안으로 관찰되지 않음도 중요하다.

또한, 상기 방법의 첫 번째 부분에서 생성된 상기 가용 혈장 분획 중에 있는 다른 오염 단백질의 농도를 측정하였다. 이들 결과를 아래 표 2에 정리하였다.

		분산에 의한 세척 단계를 포함하지 않는 방법	인라인 분산에 의한 세척 단계를 포함하는 방법
		2배치 평균	3배치 평균
전체 단백질	g/L	16.00	14.33
함께 정제된 단백질
피브로넥틴	mg/L	746.75	607.8
IgG	mg/L	837.25	325.5
IgA	mg/L	92.35	83.81
IgM	mg/L	257.75	114.9
C3c	g/L	0.13	0.06
C4	g/L	0.155	0.036
플라스미노겐	㎍/L	69.68	53.25
FII	μU/L	743.8	578.1
함께 정제된 단백질	g/L	2.362	1.289
함께 정제된 단백질	%	14.76	8.99

표 2에 나타낸 결과로부터, 인라인 분산에 의한 세척 단계를 수행하면, 피브리노겐에 수반되는 함께 정제된 단백질(co-purified proteins)(오염 단백질)의 상당 수가 제거되었음을 명확히 알 수 있다. 그 후, 희석된 가용 혈장 분획을 Macropep DEAE 음이온 교환 겔(Bio-Rad, 프랑스)로 채워진 크로마토그래피 컬럼에 주입하였는데, 이 컬럼은 미리 0.06 M 염화나트륨 및 0.011 M 구연산 3나트륨으로 형성된 버퍼로 평형화하였고, pH는 8, 삼투압은 130~150 mosmolkg^-1로 조정하였다. 이 조건 하에서, 생물학적 글루를 형성하는 피브리노겐 및 인자 XIII가 지지체 상에 유지되었다. Tween-TnBP 뿐만 아니라, 지지체 상에 약하게 유지되거나 또는 유지되지 않은 단백질은 동일한 버퍼로 여러 번 연속적 세척에 의해 여과액 내로 제거되었다.

280nm에서 측정한 OD는 기준선 값으로 떨어졌을 때, 1M 염화나트륨과 혼합물 A'(구연산 3나트륨(11.2 g/l), 리신(2.0 g/l), 글리신(2.0g/l), 트리스 염(2.40 g/l), 아르기닌(40 g/l) 및 이소류신(10 g/l)로 구성되고, pH 7.5, 삼투압 >2000 mosmolkg^-1로 조정됨)을 함유하는 용출 버퍼로 생물학적 글루를 형성하는 피브리노겐 및 인자 XIII의 용출을 행하였다.

이렇게 회수된 정제 생물학적 글루의 용출액을 표면적 1㎡, 35nm PLANOVA 필터(Asahi, 일본) 상에서 나노여과하여, 용매-세제 처리에 의하여 불활성화되지 않았던 바이러스를 제거하였다.

본 방법의 이 단계에서는 전체 단백질의 함량이 약 4.0g/l(용액) 이었다. 이 생물학적 글루 용출액의 체적 50%를 단리하고, 그 용출액의 나머지 체적에 1M 구연산 3나트륨 용액을 첨가하여 인자 XIII를 침전시켰다. 인자 XIII가 모두 침전되었음을 확인한 후에, 침전물을 단리하고 5㎛ Sartopure 필터(Sartorius, 프랑스) 상에서 여과하여 회수하였다.

이렇게 회수된 FXIII 침전물을 약 1 g/l의 비율로, 주사용 순수 용액에 재투입하였다.

생물학적 글루(용출액)와 피브리노겐을 표면적 5㎡의 Biomax Millipore 100 kDa 필터 상에서 한외여과에 의해 농축하여, 용액 중의 각각의 단백질 함량이 15 g/l에 이르도록 하였다.

상기 농축된 용액과 FXIII 용액을 한외여과에 사용한 것과 동일한 필터 상에서 투석여과 하여 pH 6.9-7.1, 삼투압 590-610 mosmolkg^-1로 획정된 혼합물 A'와 염화나트륨을 제거하였다.

각각 투석여과 된 용액을 0.45-0.2 ㎛의 필터 상에서 멸균 여과한 후에, 각각 100ml를 채취하여 유리병에 넣고, -40℃~-30℃에서 약 48시간 동결건조를 하였다.

얻어진 피브리노겐, 생물학적 글루 및 인자 XIII의 동결건조 제품을 80℃에서 72시간 건조 가열함으로써 최종 바이러스 불활성 단계를 수행하고, 치료적 용도로 사용하기까지 저장하였다.

Claims (11)

1. a) 혈장 또는 혈장 분획을 에탄올 침전시키는 단계;
   b) 단계 a)에서 형성된 침전물을 회수하는 단계;
   c) 상기 침전물을 분산에 의해 세척하는 단계;
   d) 상기 세척된 혈장 페이스트를 회수하는 단계; 및
   e) 상기 세척된 혈장 페이스트를 용해시키는 단계;
   를 포함하는 혈장 처리 방법.
2. 제1항에 있어서,
   단계 c)의 분산에 의한 세척은 회전자/고정자 타입의 분산기를 사용하여 행하는 혈장 처리 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   단계 c)의 분산에 의한 세척은 인라인 분산기를 사용하여 행하고, 단계 b)의 침전물은 분산기의 축 주입구로 공급되고, 세척물은 분산기의 레디얼 배출구로 배출되는 혈장 처리 방법.
4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   단계 b)에서의 침전물의 회수 및/또는 단계 d)에서의 혈장 페이스트의 회수는 원심분리에 의해 행하는 혈장 처리 방법.
5. 제4항에 있어서,
   단계 d)에서의 혈장 페이스트의 회수는 주입(injection) 원심분리기를 사용하여 행하는 혈장 처리 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   단계 c)에서의 세척물은 실질적으로 균질인 혈장 처리 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   f) 상기 용해된 혈장 페이스트를 수산화알루미늄으로 처리, 및/또는 그 용해된 혈장 페이스트를 저온에서 처리하는 단계;
   g) 단계 f)로부터 생성된 상징액을 청징화(clarifying) 여과, 및/또는 멸균 여과함으로써 가용 혈장 분획을 얻는 단계;
   를 더 포함하는 혈장 처리 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   단계 c)의 분산에 의한 세척은 0.5~1.5 M 글리신, 0.01~0.1 M 구연산 3나트륨 및 5.8~8.0 %(v/v) 에탄올의 혼합물로 구성된 버퍼로 pH 6.7~6.9에서 행하는 혈장 처리 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   h) 소정의 염기 pH 이온 강도의 버퍼로 미리 평형화된 약 염기 타입의 음이온 교환 수지상에서, 단계 g)의 가용 혈장 분획을, 상기 버퍼의 이온 강도를 증가시킴으로써 용출되는 생물학적 글루(glue)의 유지를 허용하는 조건 하에서 크로마토그래피 정제를 행하는 단계;
   i) FXIII를 침전시키는 적어도 하나의 화학 약품을 첨가함으로써, 단계 h)에서 얻어진 생물학적 글루 용출액의 전부 또는 일부로부터 FXIII의 침전을 행하는 단계;
   j) 단계 i)의 상징액에 대응하는 정제된 피브리노겐 용액을 회수하는 단계; 및
   k) 피브리노겐 용액 및/또는 생물학적 글루 용액 및/또는 용액에 재투입된 FXIII 용액을 투석여과(diafiltration)하고, 이어서 상기 용액을 동결건조하는 단계;
   를 더 포함하는 혈장 처리 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 바이러스 불활성 처리 단계 및/또는 바이러스 및 오염물의 제거 단계를 더 포함하고, 상기 처리는 화학적 바이러스 불활성 처리, 나노여과 및 건조가열에 의한 바이러스 불활성 처리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈장 처리 방법.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투석여과 단계 k)에 앞서 또는 상기 단계 후, 동결건조 전에 농축 한외여과 단계를 더 포함하는 혈장 처리 방법.

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