ES2588731T3 - Calibrador para inmunoensayos - Google Patents

Abstract

Uso de un material calibrador que comprende fluido corporal de mamífero para calibrar un inmunoensayo para la detección de autoanticuerpos, donde dicho material del calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje.

Description

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DESCRIPCION

Calibrador para inmunoensayos Campo de la invencion

La invencion se refiere generalmente al campo de los inmunoensayos. En particular, la invencion se refiere al uso de un material calibrador para calibrar inmunoensayos para autoanticuerpos.

Antecedentes de la invencion

La variacion de un dfa al siguiente es inherente en cualquier inmunoensayo. Esta variacion puede ser debida a numerosos factores variables incluyendo las condiciones ambientales, el envejecimiento del instrumento de medida o de los reactivos, los cambios de lotes en los reactivos y la variacion biologica. En los estudios longitudinales, cuando se necesita comparar un resultado de ensayo en un dfa con otro medido en un dfa diferente, es necesario poder ajustar esta variacion. La calibracion del ensayo hace esto posible y puede tambien alertar al operario de problemas con la salida o la deriva diaria del instrumento.

En general, calibrar un inmunoensayo disenado para medir un antigeno en suero es relativamente sencillo, ya que las formas recombinantes o sinteticas del antigeno producirse y cuantificarse facilmente. Por tanto, se puede poner a disposicion un material calibrador muy caracterizado y claramente definido.

Para ensayos disenados para medir el nivel de autoanticuerpos humanos en una muestra de ensayo de un paciente, la identificacion de un material calibrador adecuando esta impedida por la especificidad diversa de los anticuerpos que se miden y la policlonalidad de la respuesta. Los presentes inventores han investigado el uso de anticuerpos monoclonales de raton como calibradores para ensayos de autoanticuerpos. Sin embargo, estos requieren un sistema indicador diferente del utilizado para detectar autoanticuerpos humanos de tal manera que nunca se puede garantizar que la variacion detectada sea una representacion verdadera de la variacion inherente en el ensayo del autoanticuerpo. Ademas, los anticuerpos monoclonales tienen una especificidad muy definida y carecen de la promiscuidad demostrada por las respuestas policlonales humanas. Esto significa que cambios sutiles en la estructura de captura del antfgeno que dan como resultado una variacion en el ensayo puede pasar desapercibidos. Si se deseara genomanipular un anticuerpo humanizado para su uso como un material calibrador se empleana el mismo sistema indicador que el ensayo del autoanticuerpo, pero presentana los mismos problemas de monoclonalidad que su homologo murino.

Los inventores, por tanto, han tenido que buscar una nueva fuente de material de calibracion que proporcionara una fuente de calibracion a largo plazo en terminos de tener suficiente volumen y tambien su capacidad para almacenarse durante un periodo prolongado de tiempo.

Sumario de la invencion

En un primer aspecto, la invencion se refiere al uso de un material calibrador que comprende un fluido corporal de mairnfero, y especialmente ser humano, para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, donde dicho material calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje.

En una realizacion, el material calibrador comprende fluido corporal humano.

El material calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje. Este material no contiene preferentemente ningun hemoproducto seleccionado entre el grupo que consiste en suero, sangre completa y plasma.

En una realizacion, el material calibrador comprende fluido corporal extrafdo de uno o mas sujetos con cancer.

En otra calibracion, el material de calibracion comprende fluido corporal extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con la que esta o estaba asociado un tumor.

En determinadas realizaciones no limitantes, el material de calibracion puede comprender fluido pleural o fluido de ascitis recogido de uno o mas pacientes humanos con cancer.

En una realizacion, el material de calibracion contiene autoanticuerpos humanos naturales inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral y el inmunoensayo que se va a calibrar es un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos humanos naturales inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona un metodo para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos que comprende:

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(a) poner en contacto cada una de una pluralidad de diferentes diluciones de un material de calibracion que comprende un fluido corporal de mairnfero con un antigeno espedfico del autoanticuerpo que se va a detectar en el inmunoensayo, donde dicho fluido corporal es conocido por contener autoanticuerpos inmunologicamente espedficos del antfgeno, y donde el material calibrador comprende, fluido, exudado o trasudados;

(b) detectar la cantidad de union espedfica entre dicho antfgeno y el autoanticuerpo presente en el material de calibracion; y

(c) representar graficamente o calcular una curva de la cantidad de dicha union espedfica frente a la dilucion del material de calibracion para cada dilucion del material de calibracion utilizado en la etapa (a), calibrando de esta forma un inmunoensayo utilizando dicho antfgeno para la deteccion de dicho autoanticuerpo.

En una realizacion, el material calibrador comprende fluido corporal humano.

El material calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje. Este material no contiene preferentemente ningun hemoproducto seleccionado entre el grupo que consiste en suero, sangre completa y plasma.

En una realizacion, el material calibrador comprende fluido corporal extrafdo de uno o mas sujetos con cancer.

En otra calibracion, el material de calibracion comprende fluido corporal extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con la que esta o estaba asociado un tumor.

En una realizacion, el material calibrador comprende fluido corporal de marnffero y, en particular, de ser humano, extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con el que esta o estaba asociado un tumor.

En determinadas realizaciones no limitantes, el material de calibracion puede comprender fluido pleural o fluido de ascitis recogido de uno o mas pacientes humanos con cancer.

En una realizacion, el material de calibracion contiene autoanticuerpos humanos naturales inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral y el inmunoensayo que se va a calibrar es un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos humanos naturales inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral.

Por tanto, en una realizacion espedfica no limitante, la invencion proporciona un metodo para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos marcadores antitumorales que comprende:

(a) poner en contacto cada una de una pluralidad de diferentes diluciones de un material de calibracion que comprende fluido pleural o fluido de ascitis aislado de uno o mas pacientes con cancer con un antigeno marcador tumoral espedfico del autoanticuerpo marcador antitumoral, donde dicho fluido pleural o fluido de ascitis es conocido por contener autoanticuerpos inmunologicamente espedficos de dicho antigeno, y donde el material calibrador comprende, fluido, exudado o trasudados de drenaje;

(b) detectar la cantidad de union espedfica entre dicho antfgeno y el autoanticuerpo presente en el material de calibracion; y

(c) representar graficamente o calcular una curva de la cantidad de dicha union espedfica frente a la dilucion del material de calibracion para cada dilucion del material de calibracion utilizado en la etapa (a), calibrando de esta forma un inmunoensayo utilizando dicho antfgeno para la deteccion de dicho autoanticuerpo.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona un kit de inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, comprendiendo dicho kit un conjunto de patrones de calibracion para su uso en la calibracion de un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, donde cada patron de calibracion de dicho conjunto comprende una dilucion diferente de un fluido corporal de mamffero, siendo dicho fluido corporal de mamffero conocido por contener autoanticuerpos humanos y donde el fluido corporal de mamffero es un fluido, exudado o trasudado de drenaje, y un reactivo de inmunoensayo que comprende un antfgeno inmunologicamente espedfico de dichos autoanticuerpos.

En una realizacion, el fluido corporal de mamffero es un fluido corporal humano.

En una realizacion, el fluido corporal de mamffero no comprende ningun hemoproducto seleccionado entre el grupo que consiste en suero, sangre completa y plasma.

El fluido corporal de mamnfero es un fluido, exudado o trasudado de drenaje.

En una realizacion, el fluido corporal de mamffero es un fluido corporal extrafdo de uno o mas sujetos con cancer.

En una realizacion, el fluido corporal de mamffero es un fluido extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con el que un tumor esta o estaba asociado.

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En una realizacion, el fluido corporal de mai^ero comprende fluido pleural ex^do de uno o mas sujetos con cancer, tales como pacientes humanos con cancer.

En una realizacion, el fluido corporal de mairnfero comprende fluido de ascitis extrafdo de uno o mas sujetos con cancer, tales como pacientes humanos con cancer.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Inhibicion espedfica de antigeno de autoanticuerpos humanos en fluidos pleurales procedentes de pacientes de cancer de mama avanzado.

Figura 2: Especificidad de fluidos pleurales para antigenos asociados a cancer recombinante demostrada mediante transferencia Western. (a) fluido B3280 espedfico de p53, (b) fluido B1564 espedfico de NY-ESO-1, (c) fluido PL-061 espedfico de BGU4-5 y Anexina 1, (d) fluido B3084 espedfico de p53, CAGE y NY-ESO-1. Banda 1 = marcadores de peso molecular, banda 2 = VOL, banda 3 = p53, banda 4 = c-myc, banda 5 = CAGE, banda 6 = NY-ESO-1, banda 7 = GBU4-5, banda 8 = lKBKE, banda 9 = Anexina 1, banda 10 = Anexina 2.

Figura 3: Union del suero a protemas bacterianas contaminantes en protemas recombinantes demostrada mediante transferencia Western. (a), (b). Banda 1 = marcadores de peso molecular, banda 2 = Anexina Xla, banda 3 = BRCA2, banda 4 = c-myc, banda 5 = ECD6, banda 6 = IKbKe, banda 7 = NY-ESO-1, banda 8 = p53, banda 9 = PSA, banda 10 = VOL.

Figura 4: Esta figura representa graficamente las diluciones del fluido del paciente frente a la valoracion de la concentracion nM de nYeSO revestido sobre la placa.

Figura 5: Reproducibilidad de las curvas de calibracion producidas utilizando fluidos de drenaje. La curva representa el promedio de diez analisis, representandose la variacion interensayo por la desviacion estandar que se muestra como barras de error. Se muestra la reactividad a p53 (a), c-myc (b), ECD6 (c), NYESO (d), BRCA2 (e) PSA (f) y Anexina Xla (g).

Figura 6: Reactividad de C3/C4 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de nYeSO en 5 analisis donde la dilucion log del fluido se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 7: Reactividad del combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de p53 en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la densidad optica registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 8: Reactividad del combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de BRCA2 en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 9: Reactividad del combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de c-myc en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 10: Reactividad del combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de PSA en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 11: Reactividad del combinado 83258/83255 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de ECD6 en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

Figura 12: Reactividad del combinado 83255/83258 de fluido pleural del paciente (a) y un combinado C3/C4 de fluido pleural del paciente (b) frente a 160 nM de Anexina Xla en 5 analisis donde la dilucion del fluido registrada se representa graficamente frente a la DO registrada. Los datos se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal obtenida procedente de la union al antfgeno del control negativo, VOL.

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Figura 13: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Los autoanticuerpos contra p53 se midieron en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 14: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Se midieron los autoanticuerpos contra c-myc en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 15: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Los autoanticuerpos contra ECD6 se midieron en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 16: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Los autoanticuerpos contra NYESO se midieron en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 17: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Los autoanticuerpos contra BRCA2 se midieron en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 18: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Se midieron los autoanticuerpos contra PSA en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 19: Efecto de la calibracion sobre la reproducibilidad de las muestras del control. Se midieron los autoanticuerpos contra Anexina Xla en 8 sueros del control en 5 ocasiones diferentes. Los valores brutos de DO se muestran en (a). Se analizo simultaneamente una curva del calibrador y esta se utilizo para extrapolar los valores de las muestras del control (b).

Figura 20: Comparacion del suero y fluidos de drenaje como materiales calibradores potenciales para los ensayos de autoanticuerpos. Se comparo el fluido pleural C3 (a) con la muestra de suero 18176 (b) procedente del mismo paciente.

Figura 21: Comparacion del suero y fluidos de drenaje como materiales calibradores potenciales para los ensayos de autoanticuerpos. Se comparo el fluido pleural C7 (a) con la muestra de suero 11828 (b) procedente del mismo paciente.

Figura 22: Curvas logfsticas de cuatro parametros del calibrador con suma minimizada de cuadrados residuales. Se trazo la grafica 4pl a partir de la densidad optica frente a la dilucion log del calibrador. Los promedios de los analisis 1 a 12 se muestran como lmeas grises solidas y los promedios de los analisis 13 y 14 se muestran como lmeas negras discontinuas. Las barras de error representan las desviaciones estandar de los promedios. Ensayos de autoanticuerpos espedficos de antfgenos para p53 (a), c-myc (b), CAGE (c), NY-ESO-1 (d), GBU4-5 (e), Anexina 1 (f) y Anexina 2(g).

Figura 23: Efecto de la calibracion sobre la variabilidad de las medidas de anticuerpos realizadas en diferentes ciclos de ensayos. Se corrigieron los resultados de las muestras de suero utilizando la curva del calibrador espedfica de antfgeno para este analisis. Triangulos abiertos = medidas sin calibrar, puntos solidos = medidas ajustadas mediante calibracion, lmeas discontinuas = promedio de los valores calibrados mas o menos 3 desviaciones estandar.

Figura 24: Comparacion de almuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido pleural C3 del calibrador con antfgeno NYESO. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 25: Comparacion de almuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido C7 pleural del calibrador con antfgeno c-myc. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

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Figura 26: Comparacion de alfcuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido 83258 pleural del calibrador con antigeno p53. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 27: Comparacion de alfcuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido 83258 pleural del calibrador con antigeno PSA. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 28: Comparacion de alfcuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido 83258 pleural del calibrador con antigeno Anexina. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 29: Comparacion de alfcuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido 83255 pleural del calibrador con antfgeno BRCA2. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 30: Comparacion de alfcuotas congeladas de series del calibrador con series del calibrador diluidas recientemente. Se dejo reaccionar fluido pleural C3 del calibrador con antfgeno ECD6. Cada pareja de series frescas y congeladas se analizo 10 veces (a). Se proporciona la grafica logantmica promedio en (b) con barras de errores que representan desviaciones estandar.

Figura 31: Reactividad de autoanticuerpos en fluidos de pacientes con diferentes tipos de cancer con antfgenos asociados a tumores.

Figura 32: Reaccion de una serie de diluciones de un fluido pleural procedente de un paciente con cancer de pancreas con protema del control negativo, VOL a 160 nM (a) y 50 nM (b). El experimento se repitio 5 veces en 5 dfas diferentes.

Figura 33: Resultados de 4 analisis de fluido 82993 de ascitis frente a 160 nM de C-myc con barras de errores de desviacion estandar en las Figuras a y b (la figura a representa graficamente el valor de DO del suero del control utilizado en este experimento).

Figura 34: Resultados de 4 analisis de fluido B3259 de ascitis frente a 160 nm de ECD6 con barras de errores de desviacion estandar en las Figuras a y b (la figura a representa graficamente el valor DO del suero del control utilizado en este experimento).

Figura 35: Resultados de 4 analisis de fluido B2993 de ascitis frente a 160 nm de ECD6 con barras de errores de desviacion estandar en las Figuras a y b (la figura a representa graficamente el valor DO del suero del control utilizado en este experimento).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de un material de calibracion que comprende un fluido corporal de mairnfero, y especialmente un ser humano, para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, y en particular, autoanticuerpos humano, donde dicho material calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje.

En una realizacion, el material de calibracion utilizado en el presente documento puede comprender fluido corporal humano como fuente de "autoanticuerpos humanos naturales", lo que significa que los autoanticuerpos se han producido en un hospedador humano como resultado de procesos inmunologicos naturales. Para evitar la duda, este material de calibracion no comprende anticuerpos no humanos ni ningun anticuerpo humano o humanizado producido de forma exogena mediante tecnicas de laboratorio, por ejemplo, anticuerpos monoclonales derivados de celulas inmunitarias cultivadas.

El material de calibracion puede comprender cualquier fluido corporal humano o de otro mai^ero que sea un fluido, exudado o trasudado de drenaje conocido por contener autoanticuerpos de la especificidad inmunologica adecuada; es decir, el calibrador debe comprender un fluido corporal de marnffero (por ejemplo, un ser humano) conocido por ser positivo para el autoanticuerpo que se va a detectar en el inmunoensayo. A este respecto, debe saberse por adelantado que el fluido calibrador contiene autoanticuerpos que presentan especificidad inmunologica comparable con los autoanticuerpos que se desea detectar utilizando el inmunoensayo. Una ventaja del material de calibracion es que contiene autoanticuerpos humanos naturales de especificidad inmunologica sustancialmente equivalente a autoanticuerpos humanos que se encuentran en suero humano, en terminos de union al antfgeno utilizado como

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reactivo en el inmunoensayo que se pretende calibrar.

Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se puede determinar por adelantado si una muestra dada de un fluido corporal humano contiene autoanticuerpos de la especificidad inmunologica adecuada llevando a cabo un ensayo de prueba con una antigeno de prueba. En una realizacion, este ensayo de prueba puede utilizar el mismo antigeno y metodologfa de deteccion que se pretende utilizar en el inmunoensayo adecuado. Los fluidos corporales que demuestran contener autoanticuerpos inmunologicamente espedficos del antigeno de prueba en dicho ensayo de prueba son adecuados para su uso como materiales del calibrador en inmunoensayos posteriores utilizando el mismo antigeno de ensayo para detectar los autoanticuerpos correspondientes en muestras de ensayo de pacientes con un estado de autoanticuerpos desconocido. En este contexto, las "muestras de ensayo" pueden definirse como muestras extrafdas de sujetos que se van a someter a ensayo para determinar la presencia de autoanticuerpos, donde el estado del autoanticuerpo del paciente es desconocido antes del ensayo de la muestra.

No suele ser necesario determinar un tftulo preciso de la cantidad de autoanticuerpo presente en el material de calibracion antes del uso, particularmente cuando se utiliza el metodo de calibracion de la invencion, que utiliza multiples diluciones del material de calibracion para proporcionar un conjunto de patrones de calibracion. La cantidad absoluta de autoanticuerpo presente en el conjunto de patrones de calibracion no tiene que determinarse con precision, con la condicion de que el conjunto de patrones de calibracion cubra el intervalo normal de tftulos de autoanticuerpo que se podna esperar encontrar cuando se someten a ensayo las muestras de ensayo del paciente con un estado de anticuerpo desconocido en el inmunoensayo adecuado. Esto se puede determinar empmcamente analizando un intervalo de muestras de calibracion diluidas en paralelo, en comparacion con muestras de ensayo de un paciente tipico.

El material de calibracion puede consistir simplemente en un fluido corporal humano en la forma en que este se afsla del cuerpo humano (por ejemplo, fluido pleural o de ascitis "puro") o el fluido corporal puede premezclarse o diluirse con otros componentes para formar un material de calibracion antes del uso. Normalmente, se prepara una serie de diluciones del fluido en un tampon adecuado para proporcionar un conjunto de patrones de calibracion. Los tampones de dilucion adecuados para la preparacion de los patrones de calibracion incluyen, por ejemplo, un tampon de elevada concentracion salina de PBS + NaCl 0,5 M + casema al 0,1 % + Tween 20 al 0,1 % (denominado en los ejemplos HSBT) o PBS que contiene BSA al 1 %. La invencion contempla por tanto el uso de materiales del calibrador que consisten en fluido corporal de un mairnfero (por ejemplo, un ser humano) de un tipo descrito en el presente documento premezclado con uno de estos tampones de dilucion. Los calibradores particularmente utiles consisten en fluido pleural humano o fluido de ascitis humano, que se puede obtener de uno o mas pacientes humanos de cancer, premezclados con HSBT. Alternativamente, podna utilizarse suero normal como diluyente del calibrador. Se contempla tambien concentrar el fluido corporal o (semi) purificar los anticuerpos y a continuacion diluir este material para proporcionar patrones de calibracion. Se pueden anadir componentes adicionales al material de calibracion, por ejemplo, para aumentar la estabilidad durante al almacenamiento a largo plazo.

Las muestras del material de calibracion diluidas en tampon de dilucion adecuado pueden dispensarse en alfcuotas y almacenarse antes del uso. De forma conveniente, las alfcuotas listas diluidas del material de calibracion se pueden almacenar congeladas a -20°C u -80°C y descongelarse antes del uso. Los inventores han mostrado que los fluidos pleurales y de ascitis son estables al almacenamiento a -20 °C y se pueden almacenar congelados durante extensos periodos sin perdida de la reactividad de autoanticuerpos. La predilucion y la distribucion en alfcuotas de los patrones de calibracion antes del almacenamiento en congelacion a largo plazo son convenientes y evita errores de reproducibilidad y numerosos ciclos de congelacion-descongelacion.

El uso de muestras positivas conocidas como calibradores para inmunoensayos es una practica bastante habitual en el campo de los inmunoensayos para la deteccion del antfgeno. Sin embargo, es diffcil proporcionar materiales de calibracion adecuados que sean muestras positivas conocidas que contengan anticuerpos de especificidad adecuada cuando la diana del ensayo es un anticuerpo, mas bien que un antfgeno. La invencion aborda este problema mediante el uso de un material de calibracion que comprende un fluido corporal del que se sabe por adelantado que contiene anticuerpos de la especificidad adecuada.

Generalmente, se prefiere no usar fluidos corporales que sean o comprendan "hemoproductos", tales como sangre completa, plasma o suero, como la base del material calibrador. En vez de esto, el material calibrador comprende fluidos corporales que son fluidos, exudados o trasudados de drenaje, e incluye dichos materiales producidos durante o como resultado de la enfermedad. En realizaciones no limitantes, se puede seleccionar el fluido corporal entre: efusion pleural, ascitis, hidrocele, fluido de drenaje de heridas, fluido sinovial inflamatorio o no inflamatorio, seroma, fluido aspirado del pezon, efusion pericardica, bilis, secreciones pancreaticas, etc. El fluido puede obtenerse de un sujeto humano o de un sujeto mai^ero no humano, incluyendo, por ejemplo, perros y primates no humanos.

En determinadas realizaciones, el material de calibracion puede comprender fluido corporal aislado de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con el que esta o se asocio un tumor. A este respecto, el termino "cavidad o espacio corporal" incluye cualquier cavidad o espacio corporal, ya sea una cavidad natural o un espacio o cavidad que surge como resultado de enfermedades o intervenciones medicas incluyendo cavidades colapsadas o antiguas. El fluido se deriva de dicha cavidad o espacio donde esta o estaba presente un tumor o con

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el que esta o estuvo asociado un tumor. Preferentemente el "fluido corporal derivado de una cavidad corporal " sera un fluido corporal inducido por tumor, que significa un fluido corporal que se ha producido durante el proceso patologico, por ejemplo, en respuesta a o como consecuencia de la presencia de celulas tumorales. A este respecto, fluidos de "cavidad corporal" ilustrativos son ascitis, efusion pleural, seroma, hidrocele y fluido de drenaje de heridas.

Para evitar dudas, los "fluidos corporales derivados de una cavidad o espacio corporal" no incluyen hemoproductos derivados de la circulacion sistemica, tales como sangre completa, suero o plasma.

El fluido pleural y el fluido de ascitis son fuentes particularmente utiles de material de calibracion para su uso de acuerdo con la invencion ya que se obtienen normalmente en un gran volumen y se extraen de los pacientes como parte de la estrategia terapeutica. Este fluido, que se descartana de otra forma, es una fuente valiosa de material de calibracion. Como se ha resenado anteriormente, los inventores han demostrado que los fluidos de la "cavidad humana" tales como el fluido pleural y de ascitis son materiales de calibracion adecuados en inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos en suero humano, ya que estos fluidos contienen autoanticuerpos que son comparables a los presentes en suero humano, tanto en terminos de especificidad inmunologica de union al antigeno con tambien para el isotipo del anticuerpo. El ultimo es importante ya que permite que se use el mismo sistema de deteccion para los autoanticuerpos en el material de calibracion y anticuerpos de especificidad de union a antigeno equivalente presentes en muestras de ensayo de suero de pacientes.

El material de calibracion puede comprender fluido corporal, y mas espedficamente fluido de "cavidad corporal" tal como fluido pleural o fluido de ascitis, extrafdo de uno o mas pacientes de cancer. En este contexto, el termino "paciente de cancer" incluye un individuo previamente diagnosticado de cancer, incluyendo, pero no de forma limitativa, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de hngado, cancer de pancreas, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer renal, cancer de vejiga, cancer de endometrio, linfoma y leucemia o cancer de mama. El fluido puede tomarse de un unico paciente o se pueden combinar entre sf los fluidos de dos o mas pacientes. Las muestras de fluido pueden combinarse de dos o mas pacientes que tiene el mismo o diferentes estadios del mismo o diferentes tipos de canceres. Se contempla tambien combinar diferentes tipos de fluidos corporales a partir de un unico o multiples pacientes de cancer.

Se puede usar un material de calibracion preparado a partir de fluido corporal tomado de paciente(s) de cancer con un tipo concreto de cancer para ayudar en el diagnostico de los mismos tipos de cancer o de diferentes tipos de cancer en otros individuos. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los autoanticuerpos humanos naturales espedficos de protemas marcadoras tumorales estan presentes en fluidos pleurales tomados de pacientes con cancer de colon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de tngado, cancer de pancreas y cancer de mama. Una vez que se ha establecido la presencia de autoanticuerpos de la especificidad inmunologica requerida usando un ensayo de prueba, dichos fluidos se pueden usar para calibrar inmunoensayos para analizar autoanticuerpos de especificidad inmunologica equivalente en las muestras de ensayo de pacientes con otros tipos de cancer, por ejemplo, los inmunoensayos para autoanticuerpos en suero de cancer de mama pueden calibrarse usando material de calibracion que comprende fluido pleural (y otros fluidos de cavidades corporales) de paciente(s) con cancer de colon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de hngado, o cancer de pancreas.

En una realizacion, se puede usar una solucion madre de material de calibracion preparada a partir de un paciente diagnosticado de cancer para calibrar un inmunoensayo llevado a cabo una fecha posterior para evaluar el estado inmunitario del mismo paciente o de un paciente diferente, por ejemplo, para vigilar la progresion de la enfermedad y/o evaluar la eficacia de un curso de tratamiento anticanceroso en este paciente.

Durante el uso, el material de calibracion de la invencion se puede usar para calibrar inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos realizada de acuerdo con metodos conocidos. Normalmente, el inmunoensayo puede tomar la forma de un ELISA directo, de tipo sandwich o competitivo, pero estan tambien comprendidas en el alcance de la invencion otras metodologfas de ensayo. Las caractensticas generales de los inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos humanos marcadores antitumorales se describen en los documentos WO 99/58978 y WO 2006/126008. El material calibrador proporcionado por la presente invencion se puede usar para calibrar los ensayos descritos en los documentos WO 99/58978 y wO 2006/126008.

El material de calibracion descrito en el presente documento, y los kits de inmunoensayos que comprenden conjuntos de patrones de calibracion que comprenden este material de calibracion, se pueden usar para calibrar un inmunoensayo para cualquier tipo de autoanticuerpo que sirva como un marcador de un estado de enfermedad o de susceptibilidad a la enfermedad, donde la enfermedad en cuestion tiene el potencial de producir/inducir la formacion de un fluido corporal del tipo descrito en el presente documento, que comprende autoanticuerpos de especificidad inmunologica comparable a la de los autoanticuerpos que sirven como marcador de la enfermedad.

Los ejemplos de enfermedades que se asocian normalmente con la produccion de fluidos corporales que contienen autoanticuerpos incluyen canceres de los tipos citados en el presente documento. Como se ha explicado anteriormente, los fluidos corporales obtenidos de pacientes de cancer, y en particular "fluidos de cavidades corporales" tales como fluido pleural, fluido de ascitis, hidrocele, seroma, fluido de drenaje de heridas, etc., proporciona una fuente util de material de calibracion positivo que contiene autoanticuerpos espedficos de

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marcadores tumorales. Este material de calibracion puede por tanto utilizarse para calibrar inmunoensayos para la deteccion del cancer o enfermedades neoplasicas tempranas en muestras de ensayo de pacientes (por ejemplo, muestras de suero de pacientes de estado de autoanticuerpos desconocido). Dichos ensayos (para la deteccion de autoanticuerpos marcadores antitumorales en muestras de ensayo de pacientes) se pueden llevar a cabo utilizando los metodos descritos en los documentos WO 99/58978 y WO 2006/126008 o en las modificaciones de los mismos.

Debe entenderse, sin embargo, que la invencion no se limita al uso de fluidos derivados de cancer, ni tampoco a la deteccion de autoanticuerpos de marcadores tumorales, aunque esta es una realizacion importante. Otro grupo de enfermedades asociadas con la produccion de fluidos corporales (diferentes del suero, sangre completa o plasma) que contienen caractensticas de anticuerpos de la enfermedad son las enfermedades autoinmunes benignas. La invencion contempla por tanto el uso de fluidos corporales obtenidos de sujetos mairnferos (por ejemplo, seres humanos) sin enfermedad autoinmune benigna como materiales de calibracion de inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos que son marcadores de la enfermedad autoinmunitaria. Los ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias incluyen la artritis reumatoide (AR), el lupus sistemico eritematoso (LSE) cirrosis biliar primaria (CBP), tiroiditis autoinmunitaria (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto), gastritis autoinmunitaria (por ejemplo, anemia perniciosa), adrenalitis autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Addison), hipoparatiroidismo autoinmunitario, diabetes autoinmunitaria (por ejemplo, diabetes de Tipo 1) o miastenia grave.

En el caso de la artritis reumatoide, el material calibrador puede comprender o consistir en un exudado asociado con el proceso de la enfermedad, normalmente un fluido que se acumula en una articulacion, tal como un fluido sinovial inflamatorio aislado de la rodilla de un paciente con aR.

En el caso del lupus sistemico eritematoso (LSE), el material calibrador puede comprender o consistir en fluido de ascitis obtenido de pacientes con LSE (vease Lacconi et al. Internet Journal of Radiology, ISSN: 1528-8404). A este respecto, debe senalarse que no todos los fluidos de ascitis (o, por tanto, otros fluidos de cavidades corporales tales como efusiones pleurales) se asocian con la presencia de un tumor.

En el caso de cirrosis biliar, el material calibrador puede comprender o consistir en fluido de ascitis obtenido de pacientes con cirrosis biliar.

Las caractensticas generales de los inmunoensayos, por ejemplo, radioinmunoensayos ELISA y similares, son bien conocidas de los expertos en la materia (vease Immunoassay, E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Los inmunoensayos para la deteccion de anticuerpos que tienen una especificidad inmunologica concreta (por ejemplo, autoanticuerpos que tienen una reactividad inmunologica con un antfgeno dado, tales como una protema marcadora tumoral) requieren generalmente el uso de un reactivo que comprende un antfgeno que presenta reactividad inmunologica espedfica con el anticuerpo en ensayo. Dependiendo del formato del ensayo, este reactivo puede inmovilizarse sobre un soporte solido. Una muestra de ensayo que se va a analizar para determinar la presencia del anticuerpo se pone en contacto con el reactivo y, si los anticuerpos de la reactividad inmunologica requerida estan presentes en la muestra de ensayo, reaccionaran inmunologicamente con el reactivo para formar complejos autoanticuerpo-reactivo que se pueden a continuacion detectar o medirse cuantitativamente. Dichos inmunoensayos se calibran normalmente llevando a cabo ensayos paralelos utilizando los mismos reactivos utilizados para detectar (auto) anticuerpos en la muestra de ensayo, pero sustituyendo la muestra de ensayo con uno o mas patrones de calibracion, que son muestras de material de calibracion conocidas por contener (auto) anticuerpos de la especificidad inmunologica adecuada.

El metodo de calibracion preferido utilizando el material de calibracion de la invencion utiliza un conjunto de patrones de calibracion, normalmente diluciones en serie del material de calibracion de la invencion, que se someten a ensayo frente a una o mas concentraciones conocidas de antfgeno. En el ELISA de "tipo sandwich" normal, el antfgeno que tiene especificidad para los autoanticuerpos en ensayo se inmoviliza sobre una superficie solida (por ejemplo, los pocillos de una placa de ensayo de microvaloracion normalizada, o la superficie de una microperla) y una muestra del calibrador (o la muestra de ensayo que se va a analizar para determinar la presencia de autoanticuerpos) se pone en contacto con el antfgeno inmovilizado. Los autoanticuerpos de la especificidad deseada presentes en el material calibrador se uniran al agente inmovilizado. Los complejos autoanticuerpo/antfgeno unidos pueden detectarse a continuacion utilizando cualquier metodo adecuado.

La invencion proporciona por tanto un metodo para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos que comprende:

(a) poner en contacto cada una de una pluralidad de diluciones diferentes de un material de calibracion que comprende un fluido corporal humano o de otro mamffero con un antfgeno (inmunologicamente) espedfico de un autoanticuerpo, donde dicho fluido corporal humano es conocido por contener autoanticuerpos inmunologicamente espedficos para el antfgeno, donde el material del calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje;

(b) detectar la cantidad de union (inmunologicamente) espedfica entre dicho antfgeno y el autoanticuerpo presente en el material de calibracion; y

(c) representar graficamente o calcular una curva de la cantidad de dicha union espedfica frente a la dilucion

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del material de calibracion para cada dilucion del material de calibracion utilizado en la etapa (a), calibrando de esta forma un inmunoensayo utilizando dicho antigeno para la deteccion de dicho autoanticuerpo.

La metodolog^a precisa utilizada para detectar la union espedfica en la etapa (b) no es limitante de la invencion. En una realizacion, un anticuerpo secundario marcado dirigido contra una inmunoglobulina humana, que reconoce espedficamente un epftopo comun a una o mas clases de inmunoglobulinas humanas, se usa para detectar los complejos autoanticuerpo/antfgeno. Normalmente, el anticuerpo secundario se dirigira contra IgG o IgM. El anticuerpo secundario se marca usualmente con un marcador detectable, normalmente un marcador enzimatico tal como, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, permitiendo la deteccion cuantitativa mediante la adicion de un sustrato de la enzima que genera un producto detectable, por ejemplo, un producto coloreado, quimioluminiscente o fluorescente. Se pueden usar con efecto equivalente otros tipos de marcas detectables conocidas en la tecnica.

La concentracion del antigeno utilizado en la etapa (a) se selecciona para proporcionar un amplio intervalo dinamico en terminos de las medidas de union obtenidas en la etapa (b), a fin de proporcionar calibracion para un amplio intervalo de medidas de autoanticuerpos. Esta es una consideracion particularmente importante en relacion con los inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos marcadores antitumorales, que por definicion son policlonales y presentan una variacion de un paciente a otro en terminos de la fuerza de la union antigeno/autoanticuerpo, asf como la cantidad absoluta de autoanticuerpo presente. La concentracion del antigeno utilizado sera normalmente mayor que 20 nM, y mas concretamente esta en el intervalo de entre 20 nM a 180 nM, o en el intervalo de entre 50 nM a 160 nM.

Se pueden analizar tantas diluciones del material de calibracion como sean necesarias para construir en parte una amplia curva de calibracion en el apartado (c). Normalmente, se someten a ensayo al menos 6 diluciones diferentes del material de calibracion en cada concentracion de antfgeno utilizada, pero no se pretende que este numero sea limitante.

Un uso preferido del material de calibracion descrito en el presente documento es un calibrador de inmunoensayos para la deteccion de autoanticuerpos humanos naturales inmunologicamente espedficos de marcadores tumorales humanos, estando estos autoanticuerpos normalmente asociados a cancer.

El desarrollo y la progresion del cancer en un paciente se encuentra generalmente asociado a la presencia de marcadores en el fluido corporal del paciente, reflejando estos "marcadores tumorales" diferentes aspectos de la biologfa del cancer (vease Fateh-Maghadam, A. & Steilber, P. (1993) Sensible use of tumor markers. Publicado por Verlag GMBH, ISbN 3-926725-07-9; Harris et al., J Clin Oncol., 25: 5287-5312 2007; Voorzanger-Rousselot and Garnero, Cancer Treatment Reviews, 31: 230-283, 2007). Los marcadores tumorales a menudo se encuentran como formas alteradas de protemas naturales expresadas por celulas "normales", en cuyo caso, la alteracion puede ser un cambio en la secuencia de aminoacidos primaria, un cambio en la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria o un cambio en la modificacion posterior a la traduccion, por ejemplo, glicosilacion anomala. Ademas, las protemas naturales que estan reguladas en exceso o expresadas en exceso en celulas tumorales, posiblemente como resultado de la amplificacion genica o de una regulacion transcripcional anomala, pueden ser tambien marcadores tumorales.

Las diferencias entre una protema natural expresada por celulas "normales" y una protema marcadora tumoral correspondiente pueden conducir, en algunos casos, a que se reconozca la protema marcadora tumoral por el sistema inmunitario de un individuo como "no propia" y a estimular una respuesta inmunitaria en este individuo. Esta puede ser una respuesta inmunitaria humoral (es decir, mediada por linfocitos B) que conduce a la produccion de autoanticuerpos inmunologicamente espedficos de la protema marcadora tumoral. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antfgeno que el sistema inmunitario del individuo reconoce como extrano incluso aunque este antfgeno se haya originado realmente en el individuo. Pueden estar presentes en la circulacion como autoanticuerpos libres en circulacion o en la forma de complejos inmunitarios en circulacion que consisten en autoanticuerpos unidos a su protema marcadora tumoral diana.

La expresion autoanticuerpos marcadores antitumorales "asociados a cancer" se refiere a autoanticuerpos que son caractensticos de la patologfa del cancer, y que se dirigen contra epftopos presentes en formas de protemas marcadoras tumorales que se expresan preferentemente en la patologfa del cancer.

Normalmente, los antfgenos marcadores tumorales utilizados para detectar autoanticuerpos marcadores antitumorales comprenden protemas marcadoras tumorales recombinantes (expresadas en celulas bacterianas, de insectos, levaduras o de mairnferos) o antfgenos marcadores tumorales sintetizados qmmicamente, que pueden comprender protemas marcadoras tumorales sustancialmente completas, o fragmentos de las mismas, tales como antfgenos de peptidos cortos. Otras fuentes potenciales de protemas asociadas a tumor para su uso como base de los reactivos de inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos antitumorales incluyen celulas tumorales cultivadas (y el agotamiento de los medios utilizados para su crecimiento), tejido tumoral, y suero de individuos con neoplasia, u otros fluidos corporales de uno o mas pacientes de cancer (como se describe en el documento WO 2004/044590).

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El material de calibracion descrito en el presente documento se puede usar para calibrar inmunoensayos para la deteccion de una amplia gama de autoanticuerpos marcadores antitumorales contra diferentes marcadores tumorales, sin tener en cuenta la naturaleza del antigeno utilizado en dichos ensayos. Una caractenstica clave del material de calibracion utilizado en la presente invencion (y especialmente el material de calibracion que comprende fluido pleural o fluido de ascitis de uno o mas pacientes de cancer) es que contiene autoanticuerpos que se asemejan estrechamente a los presentes en muestras de ensayo de pacientes de cancer (por ejemplo, suero de paciente de cancer) en terminos de especificidad de union a antigeno. Este material de calibracion se puede usar con antigenos marcadores tumorales recombinantes, antfgenos de peptidos sinteticos marcadores tumorales, o antigenos naturales marcadores de tumores modificados.

No se pretende que la invencion este limitada con respecto a la diana del inmunoensayo, es decir, la especificidad del autoanticuerpo que se pretende detectar. El material de calibracion descrito en el presente documento se puede usar para calibrar un inmunoensayo para cualquier autoanticuerpo presente en el propio material de calibracion. Un material de calibracion unico puede contener numerosos autoanticuerpos diferentes de diferente especificidad inmunologica y, por tanto, el mismo material puede utilizarse para calibrar numerosos ensayos diferentes. A modo de ejemplo, que se ha mostrado en los ejemplos presentes que las muestras de efusion pleural humana contienen autoanticuerpos para una gama de marcadores tumorales, incluyendo p53, c-myc, ECD-6 (fragmento extracelular HER2/neu), NY-ESD1, BRCA2, PSA y Anexina X1-A.

Se describe un material de calibracion que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de protema etiquetada unida a una superficie solida, tal como los pocillos de una placa de microvaloracion, debido a la presencia en el material de calibracion de autoanticuerpos naturales inmunologicamente espedficos de un componente de la etiqueta peptfdica de la protema "etiquetada", tal como por ejemplo una etiqueta de histidina o una etiqueta de biotina. Se ha observado que determinadas muestras de fluido pleural aisladas de pacientes de cancer contienen anticuerpos inmunologicamente espedficos para etiquetas de histidina y/o biotina unidas a antigenos marcadores tumorales recombinantes. Estos fluidos pleurales pueden por tanto utilizarse para proporcionar un ELISA cuantitativo generico de protemas recombinantes que contienen etiquetas de histidina y/o biotina que utilizan un anticuerpo humano natural espedfico de la etiqueta, junto con un anticuerpo secundario dirigido contra inmunoglobulina humana marcado. Este metodo proporciona determinadas ventajas sobre el uso de anticuerpos monoclonales de murino para cuantificar el antfgeno etiquetado unido a un soporte solido en el contexto global de los inmunoensayos para autoanticuerpos marcadores antitumorales, ya que este usa el mismo sistema indicador que se usa para medir autoanticuerpos humanos naturales espedficos del propio antfgeno marcador tumoral. De esta manera, en una unica placa de ensayo, se puede llevar a cabo un ensayo para cuantificar la cantidad de antfgeno marcador tumoral recombinante etiquetado unido a la placa utilizando material de calibracion que contiene autoanticuerpos naturales contra la parte de etiqueta de histidina o etiqueta de biotina del antfgeno y, en paralelo, analizar un conjunto de patrones de calibracion para la union del mismo antfgeno recombinante etiquetado a autoanticuerpos marcadores antitumorales naturales, y usar el mismo sistema indicador para ambos ensayos.

Se describe un metodo para cuantificar la cantidad de protema unidad a una superficie solida, donde dicha protema comprende una etiqueta, comprendiendo el metodo: poner en contacto la superficie solida que se va a someter a ensayo para determinar para la presencia de dicha protema con un material reactivo que comprende un fluido corporal humano, donde dicho fluido corporal es conocido por contener un anticuerpo humano natural inmunologicamente espedfico para la etiqueta, y medir la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo humano natural y la etiqueta, cuantificando de esta forma la cantidad de dicha protema presente sobre la superficie.

En este contexto, el termino "etiqueta" se refiere a un resto qmmico unido a la protema que no esta presente en ninguna forma naturalmente expresada de la protema. La etiqueta puede ser un polipeptido, en cuyo caso, la etiqueta consiste en una secuencia de aminoacidos que no es contigua a la secuencia de aminoacidos de cualquier forma de la protema expresada naturalmente.

La protema que se va a cuantificar sobre la superficie solida es normalmente una protema expresada recombinantemente Los ejemplos de etiquetas normalmente unidas a protemas expresadas recombinantemente incluyen etiquetas de biotina y etiquetas de histidina. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, aproximadamente el 10 % de la poblacion humana contiene anticuerpos humanos que son inmunologicamente espedficos de la biotina. Los individuos humanos con anticuerpos naturales espedficos de etiquetas de histidina pueden identificarse tambien en la poblacion humana normal.

Se entendera que los analisis estadfsticos y matematicos de los datos de la curva de calibracion obtenidos de acuerdo con la presente invencion pueden incluir, pero no de forma limitativa, graficos logfsticos de cuatro parametros.

La invencion se entendera mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

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Materiales y metodos

Preparacion del material de calibracion

Se recogieron fluidos pleurales y de ascitis de pacientes de cancer bajo consentimiento informado utilizando protocolos normalizados. Normalmente, se recogieron los fluidos mediante insercion de un drenaje en la cavidad toracica o en la cavidad peritoneal con anestesia local. El drenaje puede insertarse con o sin control guiado por imagenes (por ejemplo, ultrasonidos) dependiendo de los protocolos locales y de la practica del especialista medico a cargo del tratamiento.

i) La efusion pleural debena recogerse en un recipiente de drenaje esteril toracico en la manera habitual para drenaje de una efusion pleural.

ii) Se recogio ascitis en una bolsa de drenaje esteril mediante un drenaje peritoneal en la manera habitual para el drenaje de ascitis.

No es necesario anadir productos qmmicos a la bolsa/recipiente mientras que el fluido drena en esta.

La bolsa/recipiente debe recogerse bien cuando esta llena o diariamente, lo que suceda primero.

En la cubierta de clase II, se transfirio 1 litro de fluido a tubos esteriles de 20 x 50 ml utilizando pipetas esteriles de 25 ml y se centrifugo a 400 g durante 5 minutos.

Los sobrenadantes se vertieron en 2 matraces de cultivo de tejido de 500 ml esteriles, y se anadio azida de sodio al 0,01 % (1 |jl de solucion madre al 10 % a 1 ml de sobrenadante). Se anadio aprotinina (inhibidor de la proteasa) a 1 |j/ml (1 j de 1 mg/ml de solucion madre de aprotinina en PBS a 10 ml de sobrenadante). A continuacion, se vertieron los sobrenadantes en tubos de 50 ml sin esterilizar y se almacenaron a -20 °C.

Lista de reactivos:

Solucion madre de azida de sodio almacenada a TA,

Aprotinina = Calbiochem 616370

Solucion madre de aprotinina almacenada en almuotas de 50 jl a -20 "C PBS = solucion salina tamponada con fosfato

Inmunoensayo normalizado de autoanticuerpos

La metodologfa de inmunoensayo general se ilustra en el presente documento utilizando antfgenos marcadores tumorales recombinantes, pero se apreciara que se puede adaptar el mismo protocolo de ensayo para su uso con otros (auto) antfgenos.

Se prepararon muestras de antfgenos marcadores tumorales mediante expresion recombinante, siguiendo metodos analogos a los descritos en el documento WO 99/58978.

En resumen, los ADNc que codificaban los antfgenos marcadores de interes se clonaron en el vector pET21 (Invitrogen) que se ha modificado para codificar una etiqueta de biotina y una etiqueta 6xhistidina para ayudar a la purificacion de la protema expresada. Los clones resultantes se hicieron crecer en una celula hospedadora bacteriana adecuada (en cuerpos de inclusion), las bacterias se lisaron y se desnaturalizaron y los antfgenos expresados se recuperaron mediante columnas de afinidad de mquel quelado (Hi-trap, comercialmente disponibles de Amersham, siguiendo el protocolo del fabricante). Los antfgenos expresados se renaturalizaron mediante dialisis en un tampon adecuado y se evaluo el rendimiento de la protema expresada mediante SDS-PAGE, transferencia western y ELISA y se cuantifico antes del almacenamiento.

El control negativo VOL es un vector vacm (es decir ADNc no clonado) que incluye ademas las secuencias de la etiqueta de His y la etiqueta de biotina.

Los numeros de registro de GenBank de numerosos ADNc marcadores son los siguientes:

P53: B003596 c-myc: V00568

EcD6 (HER2) dominio extracelular: M11730

NY-ESO: NM_001327

BRCA2: U43746

BRCA1 delta 9-10: NM_007302

Anexina X1-A: NM_145868

PSA: NM_001648

CAGE: NM 182699 XM 291343

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GBU4-5: NM_001110822 XM_001713629 XM_001713630 XM_001713631 Anexina 1: NM_000700 Anexina 2: NM_004039

1. Los antigenos y VOL (control negativo) se diluyeron a concentraciones adecuadas en tampon carbonato 0,1 M. Se dispensaron diluciones de antigeno a 50 pl/pocillo en las hileras de una placa de microvaloracion Falcon de acuerdo con la disposicion de la placa utilizando una pipeta electronica multicanal. Se cubrieron y almacenaron las placas a 4 °C durante 48 h.

2. Se lavaron las placas una vez en PBS + tween 20 al 0,1 % utilizando un lavador de placas automatizado y a continuacion se secaron golpeandolas sobre papel tisu.

3. Se bloquearon las placas con tampon de incubacion de una concentracion salina elevada (HSBT, PBS + NaCl 0,5 M + casema al 0,1 %+ Tween™ 20 al 0,1 %) a 200 pl/pocillo (almacen cubierto a 4 °C).

4. Las muestras de ensayo del fluido corporal del paciente y los materiales del calibrador se diluyeron segun necesidad en HSBT a temperatura ambiente.

5. Se vaciaron las placas y se secaron golpeandolas sobre papel tisu. Cada muestra de ensayo diluida (o material calibrador) se dispenso a 50 pl/pocillo en todos los pocillos de la placa de microvaloracion utilizando una pipeta multicanal electronica. Se cubrieron las placas y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente con agitacion.

6. Etapa de lavado: Se lavaron las placas tres veces en PBS + tween 20 al 0,1 % utilizando un lavador de placas automatizado y a continuacion se secaron golpeandolas sobre papel tisu.

7. IgG&M de conejo conjugada con peroxidasa de rabano picante dirigida contra IgG humana (Jackson, 1/10.000 en HSBT) o IgG de conejo dirigida contra IgG humana (Dako, 1/5000 en HSBT), se dispenso a 50 pl/pocillo en todos los pocillos de la placa de microvaloracion. La Ig de conejo conjugada con HRP dirigida contra Ig de raton (1/1000 en HSBT) se uso para los ensayos empleando anticuerpos monoclonales de raton. Las placas se incubaron a continuacion a temperatura ambiente durante una hora con agitacion.

8. Se lavaron las placas como en la etapa 6.

9. Se anadio sustrato TMB previamente preparado a 50 pl/pocillo y se incubo la placa sobre la poyata durante 1 min. Las placas se golpearon suavemente para mezclarse.

10. Se determino la densidad optica de los pocillos a 650 nM utilizando un protocolo normalizado de un lector de placas.

Ejemplo 1 (comparativo): Anticuerpos monoclonales como calibradores

Los anticuerpos monoclonales se investigaron como potenciales materiales calibradores en ensayos con autoanticuerpos (no se muestran los datos). Aunque se pudieran producir respuestas de dilucion reproducibles, estas no se podnan utilizar como curvas del calibrador. Se considero que esto era un sistema de calibracion ineficaz porque los anticuerpos monoclonales eran de origen murino y, por tanto, necesitaban un sistema indicador de anticuerpo secundario diferentes al utilizado para detectar autoanticuerpos humanos en el suero. Asf, con este enfoque, se estan utilizando realmente dos sistemas de medicion diferentes y las variaciones interdfa debido al sistema del anticuerpo secundario no se pueden detectar ni calibrar por el sistema monoclonal de raton. Ademas, la respuesta monoclonal es tan espedfica que no puede imitar eficazmente la respuesta policlonal mostrada por los autoanticuerpos humanos. Esto puede explicar por que no se usan anticuerpos monoclonales para como materiales del calibrador en enfermedades autoinmunes benignas tales como el lupus eritematoso sistemico y la artritis reumatoide.

Como los anticuerpos monoclonales se han descartado como posibles materiales del calibrador, los inventores han preferido investigar los fluidos pleurales y de ascitis humanos como posibles fuentes de materiales del calibrador por los motivos detallados anteriormente.

Ejemplo 2: Demostracion de la especificidad de antigeno de los autoanticuerpos en fluidos humanos

Los fluidos de los pacientes se cribaron en un ensayo de autoanticuerpos convencional a una dilucion de 1 en 100 (en HSBT) para determinar los que conteman anticuerpos contra un antigeno dado (Tabla 1).

La Figura 1 a y b muestran ejemplos de la inhibicion de la union de los autoanticuerpos en dos fluidos pleurales diferentes frente a dos antfgenos diferentes mediante preincubacion de los mismos con dicho antigeno en solucion. Asf, los inventores han demostrado que los antfgenos seleccionados miden autoanticuerpos que son espedficos de

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ese antigeno concreto asociado al tumor.

Como demostracion adicional de la especificidad de los autoanticuerpos en fluidos pleurales para los antigenos asociados a tumores, se llevaron a cabo transferencias Western sobre los antigenos recombinantes utilizados como agentes de captura en el ensayo de autoanticuerpos. Estos se llevaron a cabo de acuerdo con las metodologfas habituales descritos en la bibliogratia y se sondearon con fluidos pleurales seleccionados como calibradores. Los resultados se muestran en la Figura 2, donde se demuestra la especificidad de cada fluido para un antigeno concreto por bandas intensas del tamano correcto que corresponden al anticuerpo unido al antigeno, con poca o ninguna evidencia de union a bandas de material contaminante. En la Figura 3, se utilizo suero para sondear transferencias Western similares y, en este caso, se pudo observar una fuerte union a los contaminantes bacterianos que estan presentes en todos los antigenos recombinantes. Los inventores han observado que 7/67 (90 %) de las muestras de suero analizadas contienen anticuerpos contra protemas bacterianas; sin embargo, de los 54 fluidos pleurales cribados mediante transferencias Western, solamente 4 (7 %) mostro alguna evidencia de dicha union.

A pesar del hecho de que pacientes con cancer metastasico y, por tanto, supuestamente el cancer ha estado presente durante algun tiempo, algunas muestras de fluido mostraron tener anticuerpos contra un numero limitado de antigenos (Tabla 1).

Tabla 1: Cribado de fluidos pleurales en busca de autoanticuerpos dirigidos contra siete antigenos asociados a tumor diferentes. Los niveles de autoanticuerpos medidos se designaron de forma arbitraria como bajos, intermedios

o altos.

Numero de fluidos en cada grupo del calibrador

P53

C-myc ECD6 NYESO BRCA2 PSA Anexina Xla

bajo

61 53 62 59 61 21 26

Intermedio

1 9 1 1 2 5 3

Alto

3 3 2 5 2 5 2

En enfermedades autoinmunitarias benignas, los autoantigenos suelen estar mucho mas limitados para cada trastorno en particular. A este respecto, los datos de los fluidos corporales en los pacientes de cancer notificados por los inventores son diferentes. La presencia de diferentes autoanticuerpos en diferentes pacientes de cancer convierte el desarrollo de un sistema de calibracion global para una prueba multiple de autoanticuerpos en un desatio mucho mas complejo. Tras el cribado de estos fluidos, lo que tuvieron un resultado positivo frente a un antigeno se analizaron adicionalmente para su mejor uso como calibrador para el ensayo.

Ejemplo 3: Antigeno y VOL titulado y fluidos titulados

La posibilidad de utilizar fluidos de pacientes como sistema de calibracion se investigo inicialmente usando un sistema de titulacion doble, donde las placas de ensayo se revistieron con titulaciones tanto de antigeno como de VOL (vease la Tabla 2a). Se dejo que los antigenos y VOL se adsorbieran en la placa durante un mmimo de 48 horas; transcurrido ese tiempo, la placa se lavo y se bloqueo durante 90 min con PBS que contema casema (0,1 % p/v), NaCl (0,5 M) y Tween 20 (0,1 % p/v). Durante la incubacion con bloqueo, se prepararon tubos con un conjunto de titulaciones de fluidos calibradores (en HSBT) de pacientes. Tras la eliminacion del tampon de bloqueo, se anadieron a una placa vacfa como se muestra en la Tabla 2b y se incubaron durante 90 min. El resto del ensayo se realizo como se describe en materiales y metodos.

2a

2 b

imagen1

O.SnM A

A trM A ISnM A SCrW A leOnM A Q.SrM A l.ErM A 6r.MA ierM A 5QnM A lEdnM A

0.5nM V

■ .fr-u v 5nM V 16nM V 5<VJM V Ifr'V V o.srM v t ,>VM V 5r>M V 16rM V r.c v v V

C.Sr'M A

'.1 A S-iM A a so'-y A 160frV A CUSt-M A ■w a 5r^M A ienM a SCrU A A

- V 7

‘.TV V 5fiM V 1«nWV 5CnMV 1 V 7 0.frV V 1 /V V Sr.M V 1frMV BOnM v 1*>nMV

A

a SflMA i6nM A StnM A IfiOfiM A 0.5r'd A l |6rW A 16nM A SCr-V A I60oM A

C 6rM V

•.fry v 5rM V IfinMV 5(i nW V 1(.>w V O.frMV -.•5nW V 6pMV 1«nM V 6C-MV 1«nMV

A

- ,er u A 6nM A 15nM A so-y A teo-ou a 0 6nA4 A 1 ,ErM A 5mWI A ienM A SCr'-\1 A ISOrtM A

Cj5nMV

fry V 5r.MV •tenMV 50nWV 160-lM V OJfj-VV t.frVV 5nVV 1'ViM V K -V V 1 ***** V

Fluido del calibrador dilucidn 1:32

Fluido del calibrador dilucion 1:2

Fluido del calibrador dilucion 1:64

Fluido del calibrador dilucion 1:4

Fluido del calibrador dilucion 1:28

Fluido del calibrador dilucion 1:8

Fluido del calibrador O

Fluido del calibrador dilucion 1:8

Tabla 2: Disposicion de placas y ensayo de la calibracion segun el Metodo 2, donde el fluido y el antigeno se titularon para la totalidad de la placa. Donde A: antigeno y V: VOL (protema del control negativo)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Al analizar los datos por este metodo, se encontraron gran cantidad de datos, no todos ellos aplicables para la funcion de un sistema de calibracion. La Figura 4 es un ejemplo de un resultado generado por este formato de ensayo usando fluido pleural como material de calibracion.

Mediante el uso de este metodo, se demostro que los fluidos de los pacientes podrian producir curvas de titulacion eficaces para diferentes fluidos y/o titulaciones de antigenos. Este metodo produce una gran cantidad de datos, pero no parece optimizar el uso de dichos fluidos como calibradores de ensayo. Como se demuestra claramente en la Figura 5, la union de los fluidos a concentraciones bajas de antigeno no es util en la calibracion debido a la baja senal y estrecho intervalo dinamico. Sin embargo, a una concentracion estatica elevada de antigeno tal como 160 y 50 nM aparece un intervalo dinamico amplio de valores de DO derivados de la union del fluido del paciente al antigeno; dando lugar a un alcance para la calibracion de una amplia gama de mediciones autoinmunitarias.

Este resultado condujo al calibrador Metodo 3, donde los inventores utilizaron esta observacion de tal forma que las placas se revistieron con una concentracion de antigeno estatica y el fluido del paciente se titulo como calibrador.

Ejemplo 4: Antigeno y VOL a concentraciones estaticas y fluidos titulados

Los inventores descubrieron que este metodo produda los conjuntos de datos mas utiles relativos a los ensayos con autoanticuerpos porque reduce la cantidad de datos a recoger hasta un nivel donde se pueden producir de forma reproducible, y analizarse eficazmente. Al reducir la cantidad de pocillos a analizar por analisis de calibracion, tambien fue posible analizar en paralelo muestras de control sobre las mismas placas que las curvas del calibrador. Tambien se ha demostrado que las mediciones de autoanticuerpos en suero a 160 y 50 nM proporciono la informacion mas util, y que las curvas de calibracion medidas frente a estas dos concentraciones de antigeno proporciono el intervalo dinamico mas grande para calibracion. Por tanto, se decidio investigar este metodo en diferentes escenarios.

Los experimentos iniciales estaban destinados a determinar la reproducibilidad de los fluidos del paciente frente a siete antigenos diferentes. Estos ensayos se llevaron a cabo en placas revestidas con el antigeno a 160 nM y 50 nM. Se dejo que los antigenos se adsorbieran en la placa durante un mmimo de 48 horas, despues de lo cual, la laca se lavo y se bloqueo durante 90 min con HSBT. Durante la incubacion con bloqueo, se prepararon tubos con un conjunto de titulaciones de fluidos calibradores de multiples pacientes. Tras la eliminacion del tampon de bloqueo, se anadieron a una placa vacfa y se incubaron durante 90 min. El resto del ensayo se realizo como se describe en materiales y metodos.

En cada placa, el fluido del calibrador se aplico por duplicado, en un intervalo de dilucion descendente a partir de 1:2. Este ensayo se realizo en 10 ocasiones para determinar la reproducibilidad de la senal. Los resultados de la Figura 5 muestran graficos representativos de la forma media de las curvas producidas a partir de los 10 analisis. La variacion interensayo se representa en forma de barras de error, que se muestran en forma de desviaciones estandar asociadas con el promedio de los 10 analisis. El coeficiente de variacion interensayo (CV) para la reaccion con cada antigeno se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: CV interensayo (%) para cada dilucion de fluido de drenaje que reacciona con una gama de antigenos asociados a tumores. Los datos se calcularon a partir de 10 analisis.

CV de datos de DO brutos

C-myc | P53 | PSA | Anexina | BRCA2 I ECD6 | NYESO

dilucion 1

11 9 8 6 13 13 7

dilucion 2

9 11 10 6 10 21 8

dilucion 3

11 14 12 8 9 20 14

dilucion 4

14 17 16 11 11 26 18

dilucion 5

15 13 17 17 13 26 21

dilucion 6

17 12 19 18 14 25 25

dilucion 7

16 10 17 21 17 20 20

dilucion 8

17 10 12 19 15 17 17

El desarrollo adicional de los experimentos anteriores condujo al siguiente protocolo de calibracion. Sin embargo, debe indicarse que este metodo se proporciona como ejemplo, pero no es el unico metodo por el cual los fluidos corporales como elusiones de ascitis y pleurales se podrian utilizar para producir un sistema de calibracion. El metodo descrito permite el uso del fluido de un paciente como calibrador que esta diluido en serie descendente en una placa que contiene una concentracion estatica de antigeno (por ejemplo, cualquiera de antigeno 50 nM o 160 nM y VOL). Tambien permite la incorporacion de suero de control en el formato de ensayo. Este metodo representa graficamente a continuacion graficas que representan el log de la dilucion del fluido frente a log DO para producir una curva logfstica de 4 parametros. Esta curva se uso a continuacion para extrapolar el valor de la dilucion equivalente del fluido del calibrador a partir de los valores del logaritmo de la densidad optica del suero del control.

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 5: optimizacion del metodo de calibracion:

Sigue un ejemplo de un plan de ensayo para calibrar los ensayos de autoanticuerpos marcadores antitumorales.

Placas de microvaloracion de 96 pocillos se recubrieron con antfgeno a los dos niveles de 160 nM y 50 nM (Anexina Xla, PSA, p53, ECD6, BRCA2, NYESO, y c-myc) y protema de control negativo VOL, como se muestra en la Tabla 4. Se dejo que los antfgenos se adsorbieran en la placa durante un mmimo de 48 horas a 4 °C. Transcurrido ese tiempo, la placa se lavo y se bloqueo durante 90 min con HSBT. Durante la incubacion con bloqueo, se prepararon diluciones del calibrador y el suero de control (diluido 1:100 en HSBT).

1-3 4-6 7-9 ___10-12 1-3______4^______7-9 10-12

A B C

Antigeno 160 nM

VOL 160 nM. D E F G H Antigeno 50 nM VOL 50 nM

Tabla 4: El metodo de recubrimiento para las placas de fluido del calibrador

Tras la eliminacion del tampon de bloqueo, se anadieron el fluido del calibrador y el suero de control a una placa vada como se muestra en la Tabla 5 y se incubaron durante 90 min. El resto del ensayo se realizo como se describe en materiales y metodos. Se trazaron las curvas de titulacion de antfgeno usando valores promedios de triplicados de cada calibrador. El logaritmo de la dilucion del fluido calibrador y el logaritmo del promedio de la densidad optica se representaron en un grafico que se utilizo para representar graficamente una curva logfstica de 4 parametros para ajustar los datos. Esta curva se uso a continuacion para extrapolar el valor de la dilucion equivalente del fluido del calibrador a partir de los valores del logaritmo de la densidad optica del suero del control.

Para cada dfa, en que se realizaron los ensayos con autoanticuerpos, tambien se analizo una placa del calibrador. Usando siete antfgenos a concentracion de 50 nM y 160 nM, se necesitaron un total de 14 placas de calibracion.

imagen2

B3255/ B3255/

B3258 C3/C4 Suero B3258 C3/C4 Suero

1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12

1:2

1:2

suero 1 1:2 1:2 suero 1

1:4

1:4

suero 2 1:4 1:4 suero 2

1:8

1:8

suero 3 1:8 1:8 suero 3

1:16

1:16

suero 4 1:16 1:16 suero 4

1:32

1:32

suero 5 1:32 1:32 suero 5

1:64

1:64

suero 6 1:64 1:64 suero 6

1:128

1:128

suero 7 1:128 1:128 suero 7

1:256

1:256

suero 8 1:256 1:256 suero 8

Tabla 5: Ejemplos de la configuracion del calibrador y del suero de control; el punto de inicio de la dilucion se determino empmcamente para proporcionar el valor mas adecuado para cada fluido del calibrador contra cada

antfgeno

Estos experimentos se llevaron a cabo inicialmente usando dos fluidos del calibrador diferentes, consistiendo cada uno de ellos en una combinacion de dos fluidos tomados del mismo paciente, pero en momentos diferentes y 8 sueros de control. Los datos de los cinco lotes de analisis se muestran en las Figuras 6-12.

El siguiente experimento se centro en la seleccion de un fluido del calibrador para cada antfgeno. La principal caractenstica que define un buen fluido de calibrador es un buen intervalo dinamico. Si se utiliza una representacion grafica logantmica, entonces el resto de caractensticas utiles son:

• Linealidad del grafico logantmico.

• Adecuabilidad de la pendiente del grafico logantmico.

• Reproducibilidad de la pendiente del grafico logantmico.

Ejemplo 6: Efecto de la calibracion sobre la variabilidad interdfa en las muestras del control

Las muestras del control se analizaron en la misma placa que las curvas del calibrador para investigar si el uso de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

curva de calibracion pleural para extrapolar respecto al logaritmo de un valor de dilucion podna corregir la variacion interdfa observada en las muestras del control. En las Figuras 13-19 se muestran los datos que muestran la variacion en los valores de DO brutos con los valores extrapolados desde las curvas del calibrador. En estas figuras se observa que, para la mayona de los antigenos, la extrapolacion desde el grafico logantmico de la lmea de calibracion mejora la reproducibilidad interdfa de la medicion de los niveles de autoanticuerpos en suero.

Ejemplo 7: Comparacion del suero con fluidos pleurales como materiales del calibrador

Los ensayos para medir autoanticuerpos en enfermedades autoinmunitarias tienen suero o plasma como materiales calibradores. Los fluidos de drenaje tienen varias ventajas sobre los hemoproductos. Estan disponibles en volumenes muy grandes, son estables en almacenamiento a bajas temperaturas durante periodos prolongados de tiempo y, por tanto, se pueden utilizar para proporcionar materiales del calibrador reproducibles para muchos ensayos. La recogida de un volumen importante en un unico punto temporal tiene importantes ventajas potenciales sobre la recogida secuencial multiple de volumenes mucho mas pequenos de suero. En primer lugar, la enfermedad metastasica es una dolencia incurable, y practicamente todos los pacientes fallecen debido a su enfermedad, por lo que la extraccion de sangre secuencial es muy diticil y practicamente imposible. En segundo lugar, el titulo de autoanticuerpos podna cambiar con el tiempo, de forma que las muestras de sangre secuenciales podnan no ser comparables. En tercer lugar, con la deriva antigenica, la respuesta inmunitaria humoral podna cambiar a otra de antigeno(s) inmunodominante(s). Incluso aunque las muestras de sangre se extraigan de pacientes de cancer de mama primario (es decir, en una etapa temprana), si una paciente se cura por su tratamiento, la respuesta de autoanticuerpos puede disminuir y no detectarse en las muestras secuenciales. Todo lo anterior significa que se cree que el uso de fluidos corporales como se describe en esta solicitud es novedosa e inventiva. Para valorar otras ventajas del uso de fluidos, se llevo a cabo una comparacion directa con muestras de suero emparejadas. Las series de dilucion de suero y fluidos de drenaje tomados del mismo paciente se analizaron para determinar su capacidad de union a una gama de antigenos asociados a tumores. Los resultados se muestran en las Figuras 20 y 21.

Puede observarse en la Figura 20 que el modelo de reactividad del fluido y el suero fue similar para una gama de antigenos. Sin embargo, la Figura 21 muestra que para los antigenos que muestran posible reactividad con los autoanticuerpos (es decir, ECD6, PSA y Anexina Xl-a), la senal del suero es generalmente inferior a la senal del fluido pleural. Ademas, el modelo de reactividad difiere para los autoanticuerpos del suero que tienen un nivel de reactividad mucho menor con PSA comparado con ECD6. Esto sugerina que, aunque las muestras C7 y 11828 proceden del mismo paciente, el fluido de drenaje pleural C7 proporcionana un calibrador mejor para los autoanticuerpos PSA debido a su mayor intervalo dinamico. Este hallazgo concreto fue muy inesperado.

Ejemplo 8: Uso de fluidos pleurales para calibrar ensayos en el escenario del laboratorio clinico

Para validad el uso de fluidos pleurales en las condiciones existentes en un laboratorio de alto rendimiento que realiza ensayos de autoanticuerpos, se realizaron los siguientes experimentos: Calibracion:

Tras la primera identificacion de fluidos del calibrador con especificidad para cada antigeno (vease el Ejemplo 2) y optimizar el intervalo de dilucion para ampliar el intervalo dinamico del ensayo (vease el Ejemplo 4), las placas del calibrador se revistieron con antigeno como en la Tabla 6:

Tabla 6: Formato de placas recubiertas de antigeno a usar en la calibracion.

A

B

C

D

E

F

G

H

1

2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 Ejemplo de serie dilucion del fluido:

1 en 8

1 en 16

Antigeno a

VOL a Antigeno a VOL a 1 en 32

160 nM

160 nM

50 nM 50 nM 1 en 64

1 en 128

1 en 256

1 en 512

1 en 1024

de

Los fluidos del calibrador espedficos de cada uno de los antigenos del panel mostrado en la Figura 3 se diluyeron en serie en el intervalo adecuado y se anadieron a la placa anterior como se muestra en el ejemplo. Estas placas se analizaron de acuerdo con el protocolo normalizado.

Muestras de suero:

Las placas se recubrieron con antigeno como en la Tabla 7 y se utilizaron para someter a ensayo varias muestras diferentes de suero que anteriormente habfan demostrado tener niveles de autoanticuerpos espedficos de antigenos. Los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo normalizado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 7: Formato de placas utilizado para someter a ensayo muestras para determinar el comportamiento del sistema de calibracion en las condiciones de un laboratorio clinico

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Los ensayos anteriormente descritos se realizaron dos veces al dfa (manana y tarde) durante 6 dfas en un intervalo de tiempo de 2 semanas (analisis 1 a 12).

Analisis de variabilidad:

0 nM

1,6 nM 5 nM 16 50 nM 160 0 nM 1,6 nM 5 16 50 160

nM nM nM nM nM nM

GBU4-5

p53 |

VOL |

c-myc

Anexina I

CAGE CAGE

Anexina II

NY-ESO-1

p53 |

GBU4-5

c-myc

VOL

CAGE

Anexina I

NY-ESO-1

Anexina II

Para someter a ensayo el sistema de calibracion, se tuvo que introducir variabilidad en el resultado del ensayo. Esto se consiguio reduciendo la concentracion de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rabano picante para producir una senal inferior en todas las placas. Esto se llevo a cabo dos veces en el septimo dfa de ensayo (analisis 13 y 14).

Calibracion de las muestras de suero:

Se trazaron representaciones graficas logfsticas de cuatro parametros (4pl) para cada conjunto de datos del

calibrador. Para cada representacion grafica, la asmtota inferior se ajusto a cero y la pendiente se ajusto a 1. La asmtota superior se limito a un maximo de 2. Los datos de cada curva individual se resolvieron para minimizar la suma cuadratica de restos. Esto proporciono valores para los cuatro parametros (asmtota superior, asmtota inferior, pendiente y CE50), que se usaron a continuacion en una formula para leer las muestras de suero a partir de las curvas del calibrador. En la Figura 22 se muestra la representacion grafica 4pl de la densidad optica frente al logaritmo de la dilucion de fluido del calibrador para los analisis 1 a 12 (como lmea continua gris) junto con las barras de error que representan la desviacion estandar del conjunto de datos. La segunda curva de cada Figura (lmea discontinua) es el grafico 4pl promedio de los analisis de variabilidad (analisis 13 y 14) con las desviaciones estandar como barras de error.

Las ecuaciones que describen las representaciones graficas de la Figura 22 se utilizaron para corregir cada muestra de suero de acuerdo con su correspondiente calibrador. Esto dio como resultado un valor expresado en forma de una unidad arbitraria correspondiente al logaritmo de la dilucion del calibrador (valores UR). El efecto que esto tuvo sobre la variacion entre analisis se muestra en la Figura 23 para varias muestras de suero diferentes donde los valores sin calibrar se muestran como triangulos abiertos y los valores corregidos segun la curva de calibracion para dicho analisis se muestran como drculos solidos. Las lmeas discontinuas representan el promedio de los valores

calibrados, mas o menos 3 desviaciones estandar. Se resalta que la variabilidad introducida en los analisis 13 y 14 se redujo significativamente debido a la calibracion.

Ejemplo 9: Almacenamiento de series del calibrador congeladas

Como la dilucion de titulaciones en serie es laboriosa y propensa a errores de reproducibilidad, los inventores investigaron las diferencias entre un conjunto de calibradores 'congelados'; donde se prepararon diluciones madre de las diluciones del fluido pleural del calibrador, se distribuyeron en almuotas, y se congelaron a - 20°C; y las preparadas recientemente ese mismo dfa. Los resultados de este estudio se pueden observar en las Figuras 24-30. Se puede observar que hubo muy pocas diferencias entre las series del calibrador que se habfan preparado nuevas cada dfa y las que se habfan preparados en cantidades importantes y congeladas en almuotas. Esto sugerina que, cuando se utilizan como materiales del calibrador, los fluidos del paciente diluidos son estables en almacenamiento a baja temperatura (-20°C) y se pueden almacenar durante periodos prolongados de tiempo sin perdida de actividad. Este es, por tanto, un metodo valido para reducir la variacion entre analisis.

Ejemplo 10: Calibracion usando fluidos derivados de pacientes con canceres que no son cancer de mama

Algunos antfgenos asociados a tumores y los autoanticuerpos que suscitan no son espedficos del tipo de tumor. Por tanto, es posible que fluidos derivados de pacientes con cancer de pulmon, por ejemplo, se puedan tratar para calibrar ensayos de autoanticuerpos para el diagnostico temprano del cancer de mama, y viceversa. Para probar esta teona, los fluidos pleurales extrafdos de pacientes con cancer de colon, ovario, pulmon, hngado y pancreatico se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

cribaron contra un panel de antigenos asociados a tumores. Tras establecer el valor positivo, se prepararon curvas de calibracion por dilucion, y se sometieron a ensayo contra los antigenos. El experimento se repitio 5 veces en dfas diferentes para evaluar la reproducibilidad. En la Figura 31 se puede observar que el autoanticuerpo que se une a una gama de diferentes antigenos asociados a tumores se pueden detectar en fluidos procedentes de pacientes con cancer de colon (a y e), cancer de ovario (b), cancer de pulmon (c), cancer de Imgado (d y f) y cancer pancreatico (g). Estas respuestas parecen ser reproducibles y escalables, a medida que el fluido se diluye, indicando que tienen el potencial de utilizarse como materiales del calibrador en ensayos de autoanticuerpos para el diagnostico temprano de canceres de mama y otros canceres.

Ejemplo 11: Uso de fluidos humanos para la cuantificacion de la cantidad de protema en superficies solidas

La adsorcion de protemas en superficies de plastico tales como los pocillos de una placa de microtitulacion no esta claramente definida y controlada y puede depender de factores tales como la irregularidad de la superficie y las cargas de la proteina y el plastico. Por tanto, sena util poder cuantificar cuanta proteina se ha adsorbido y poder relacionar este valor con otras protemas y otras superficies. Los ensayos de protemas colorimetricos son demasiado insensibles para este tipo de mediciones. Se han descrito metodologfas de isotermas de adsorcion (Kelso et al) pero estas se basan en la disponibilidad de una molecula trazadora marcada. Los anticuerpos contra etiquetas de protemas (tales como la etiqueta His) tambien se pueden usar, pero normalmente tienen origen murino y por tanto se basan en un sistema indicador diferente al utilizado en la medicion de autoanticuerpos humanos.

Durante el cribado de fluidos humanos contra una gama de antfgenos asociados a tumores, se observo que dos de los fluidos se uman a todas las protemas, incluyendo el control negativo, VOL (Figura 32). VOL es un peptido recombinante clonado y expresado exactamente de la misma forma que los antfgenos, pero que simplemente consiste en una secuencia de una etiqueta de biotina y una etiqueta his. Por tanto, los anticuerpos humanos de dichos fluidos se deber unir a una o ambas de dichas etiquetas. Como las etiquetas tambien estan presentes en todos los antfgenos recombinantes asociados a tumores, el fluido podna utilizarse para cuantificar la cantidad de protema asociada a los pocillos de la placa. La Tabla 6 muestra la relacion de la senal a 50 nM a la senal a 160 nM para VOL para cada concentracion. Puede observarse que la relacion de la senal de union a VOL a 50 nM y 160 nM es relativamente constante para todas las diluciones de fluido pleural. Esto sugerina que la senal medida esta relacionada con la cantidad de protema en la placa y, por tanto, el sistema se puede utilizar para cuantificar niveles de protema.

Tabla 8: Medicion del autoanticuerpo que se une a VOL del fluido de drenaje 16. Relacion entre la senal a 50 nM y la

senal a 160 nM para cada VOL a cada dilucion de fluido.

Dilucion de fluido

Analisis 1 Analisis 2 Analisis 3 Analisis 4 Analisis 5

1 en 8

0,65 0,58 0,53 0,76 0,62

1 en 16

0,54 0,52 0,42 0,87 0,92

1 en 32

0,51 0,5 0,41 0,82 0,71

1 en 64

0,54 0,58 0,51 0,84 0,72

1 en 128

0,69 0,64 0,53 1,03 0,76

Ejemplo 12: Deteccion y calibracion de la union no espedfica

La union no espedfica es un problema inherente de cualquier inmunoensayo serologico debido a las elevadas concentraciones de inmunoglobulinas presentes en el suero, que tienen a unirse de forma no espedfica al plastico de la placa o al agente de recubrimiento. Las senales de union no espedfica vanan de una muestra de suero a otra, pero pueden ser tan intensas que enmascaren la reaccion espedfica del analito.

En la seccion anterior se identificaron fluidos que se uman a VOL. La reaccion de los anticuerpos sericos no es espedfica porque no se dirige contra ningun antfgeno concreto. Por tanto, estos fluidos pleurales pueden utilizarse para detectar y corregir la union no espedfica.

Ejemplo 13: Uso de fluidos de ascitis como material del calibrador

Ademas de los fluidos pleurales, los fluidos de ascitis son eficaces como sistema de calibracion analogo al utilizado en los ejemplos anteriores. Estos ensayos se llevaron a cabo en placas revestidas con el antfgeno a 160 nM y 50 nM. Se dejo que los antfgenos se adsorbieran en la placa durante un mmimo de 48 horas, despues de lo cual, la laca se lavo y se bloqueo durante 90 min con HSBT. Durante la incubacion con bloqueo, se prepararon tubos con un conjunto de titulaciones de fluidos calibradores de ascitis de multiples pacientes. Tras la eliminacion del tampon de bloqueo, se anadieron a una placa vada y se incubaron durante 90 min. El resto del ensayo se realizo como se describe en Materiales y metodos.

En cada placa, el fluido de ascitis se aplico por duplicado, en un intervalo de dilucion descendente a partir de 1:2. Este ensayo se realizo en 4 ocasiones para determinar la reproducibilidad de la senal. Los resultados de las Figuras

33-35 muestran graficos representativos de la forma media de las curvas corregidas para VOL producidas a partir de los 4 analisis. La variacion interensayo se representa en forma de barras de error, que se muestran en forma de desviaciones estandar asociadas con el promedio de los 4 analisis.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Uso de un material calibrador que comprende fluido corporal de mai^ero para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, donde dicho material del calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje.
2. 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 donde el material del calibrador

   a) comprende fluido corporal humano, o

   b) comprende fluido corporal extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con la que esta o estaba asociado un tumor.
3. 3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 2 donde el material de calibracion

   a) comprende fluido pleural recogido de uno o mas sujetos con cancer, o

   b) fluido de ascitis recogido de uno o mas sujetos con cancer.
4. 4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el inmunoensayo es para

   a) deteccion de autoanticuerpos del cancer, o

   b) para la deteccion de autoanticuerpos de un cambio neoplasico temprano.
5. 5. Un metodo para calibrar un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos que comprende:

   (a) poner en contacto cada una de una pluralidad de diluciones diferentes de un material de calibracion que comprende un fluido corporal humano con un antigeno espedfico de un autoanticuerpo, donde dicho fluido corporal de mamffero es conocido por contener autoanticuerpos inmunologicamente espedficos para el antfgeno y donde dicho material del calibrador comprende un fluido, exudado o trasudado de drenaje;

   (b) detectar la cantidad de union espedfica entre dicho antigeno y el autoanticuerpo presente en el material de calibracion; y

   (c) representar graficamente o calcular una curva de la cantidad de dicha union espedfica frente a la dilucion del material de calibracion para cada dilucion del material de calibracion utilizado en la etapa (a), calibrando de esta forma un inmunoensayo utilizando dicho antfgeno para la deteccion de dicho autoanticuerpo.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5 donde el material de calibracion

   a) comprende fluido corporal humano,

   b) comprende fluido corporal recogido de uno o mas sujetos con cancer, o

   c) comprende fluido corporal extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con la que esta o estaba asociado un tumor.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6 donde el material de calibracion comprende

   a) fluido pleural recogido de uno o mas sujetos con cancer, o

   b) fluido de ascitis recogido de uno o mas sujetos con cancer.
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el material de calibracion comprende fluido corporal humano que es conocido por contener autoanticuerpos naturales humanos que son inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral.
9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 donde el antfgeno de la parte (a) se utiliza a una concentracion

   a) mayor de 20 nM,

   b) en el intervalo de 20 nM a 180 nm, o

   c) en el intervalo de 50 nM a 160 nm.
10. 10. Un kit de inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, comprendiendo dicho kit un conjunto de patrones de calibracion para su uso en la calibracion de un inmunoensayo para la deteccion de autoanticuerpos, donde cada patron de calibracion de dicho conjunto comprende una dilucion diferente de un fluido corporal de mairnfero, siendo dicho fluido corporal de mamffero conocido por contener autoanticuerpos humanos y donde el fluido corporal de mamffero es un fluido, exudado o trasudado de drenaje, y un reactivo de inmunoensayo que comprende un antfgeno inmunologicamente espedfico de dichos autoanticuerpos.
11. 11. Un kit de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 10 donde dicho fluido corporal de mam^era

    a) es un fluido corporal humano,

    b) es un fluido recogido de uno o mas sujetos con cancer, o

    c) es fluido corporal extrafdo de una cavidad o espacio corporal donde esta o estaba presente un tumor o con la que esta o estaba asociado un tumor.

    5
12. 12. Un kit de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 11 donde el fluido corporal de mairnfero comprende

    a) fluido pleural recogido de uno o mas sujetos con cancer, o

    b) fluido de ascitis recogido de uno o mas sujetos con cancer.

    10
13. 13. Un kit de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 donde el fluido corporal de mai^ero es fluido corporal humano que es conocido por contener autoanticuerpos naturales humanos que son inmunologicamente espedficos de una protema marcadora tumoral.

    15 14. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 donde el inmunoensayo es para la deteccion de autoanticuerpos de

    una enfermedad autoinmunitaria benigna.