ES2584184T3 - Equipo para el tratamiento extracorporal de la sangre - Google Patents

Abstract

Un equipo para el tratamiento extracorporal de la sangre, que comprende: un circuito extracorporal de sangre; una bomba configurada para desplazar el líquido por dentro del circuito extracorporal de sangre; y una cámara de reacción conectada al circuito extracorporal de sangre y configurada para recibir la sangre o una fracción de sangre que contiene el C5a de humano desde el circuito y tratar la sangre o la fracción de sangre que contiene el C5a de humano, caracterizado por que la cámara de reacción comprende una enzima proteásica inmovilizada de forma irreversible a un soporte, en donde la enzima proteásica es específica del C5a de humano presente en la sangre o fracción de sangre, y es capaz de escindirlo de forma irreversible, de tal manera que se reduce la capacidad quimiotáctica del C5a de humano escindido, en donde la abundancia del C5a funcional de humano en la sangre o la fracción de sangre tratada es menor que en la sangre o la fracción de sangre sin tratar.

Description

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Figura 2. Actividad de ScpA frente al mediador proinflamatorio C5a

El panel a muestra el análisis por SDS-PAGE de C5a sin tratar (–) y tratado (+) con ScpA

El panel b muestra el enlace escindible de la secuencia de C5a confirmado mediante análisis por espectrometría de masas de C5a escindido con ScpA.

Figura 3A: construcción del prototipo

El diagrama muestra el prototipo y la ruta del flujo de circulación simple. 1 es la cámara de reacción que contiene ScpA-agarosa empaquetada en un casete, 2 bomba peristáltica, 3 cámara que contiene el suero humano enriquecido con C5a. Las flechas indican la dirección del flujo, * indica el punto donde se tomó la muestra del primer paso (FP).

Figura 3B: pruebas de actividad para el prototipo.

Las muestras del régimen de pruebas del prototipo se analizaron por SDS-PAGE. Los puntos temporales se tomaron del agotamiento del reservorio y de la albúmina antes del análisis. FP indica que la muestra se tomó inmediatamente después de la exposición a la cámara de reacción, a saber, antes de la recirculación. La flecha a la derecha del gel indica la posición del C5a sin escindir.

Descripción detallada de la invención

Con respecto a la figura 1, se da a conocer un equipo para el tratamiento extracorporal de la sangre de acuerdo con la invención y se indica por lo general mediante el número 1 de referencia. El equipo 1 comprende un circuito extracorporal de sangre 2, que tiene una línea de alimentación 3 para extraer la sangre del brazo de un paciente 4 para el tratamiento y una línea de retorno 5 para devolver la sangre tratada al paciente, y una bomba ajustable 6 que se proporciona en la línea de alimentación para que la sangre se desplace por dentro del circuito de sangre 2.

El equipo también incluye un separador de sangre 7 y una cámara de reacción 8 en el circuito 2, en donde el separador 7 se proporciona antes de la cámara de reacción 8. El separador comprende un cartucho 9 que tiene dos cámaras 10a y 10b separadas por una membrana semipermeable 11 adaptada para que las proteínas de la sangre se separen de las células de la sangre. La sangre completa pasa desde el paciente a la primera cámara 10a, donde las proteínas del plasma sanguíneo pasan a la segunda cámara 10b, lo que forma una fracción de plasma rica en proteínas en la segunda cámara y deja las células sanguíneas en la primera cámara 10a. Se proporciona un tubo 12 para transferir el plasma de la fracción rica en proteínas así formada desde la primera cámara 10b a la cámara de reacción 8, donde se trata. Se proporciona además un tubo 13 para transferir la fracción rica en células desde la primera cámara 10a para reagruparse con el plasma tratado distalmente de la cámara de reacción 8 en una cámara de mezclado 15, donde las dos fracciones se mezclan antes de devolverlas al paciente a través de la línea de retorno 5 de la sangre completa.

La cámara de reacción comprende un vaso cilíndrico 16 rellenado con un material de soporte funcionalizado 17 que contiene la enzima inmovilizada, con lo que se proporciona una gran superficie para el tratamiento del plasma entrante. Con el tubo 12 se alimenta el vaso cilíndrico 16 por la parte superior, y el plasma se filtra a través del cilindro antes de salir del vaso a través de un tubo 14.

Los materiales de sílice mesoporoso (MPS) (entre ellos, pero sin limitarse a ellos, los materiales de tipo MCM, SBA, MCF y PMO) se preparan con un método de síntesis con modelo. Idealmente, estas partículas tienen una naturaleza monodispersa. Las partículas tendrán un tamaño de partícula específico en el margen de 0,1 a 50 µm, que contienen nanoporos con un diámetro interno final en el margen de 8 a 12 nm y tienen una superficie grande, de 300 a 800

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Las características de la superficie de los nanovehículos de sílice se modificarán directamente con una serie de grupos funcionales (p. ej., -NH2, -COOH, -SH) durante la síntesis del material, o mediante el injerto posterior a la síntesis para facilitar el acoplamiento covalente (a través de los restos de polilisina o de poliglutamato o de cisteína, respectivamente) de la enzima a la superficie después de la adsorción específica de la orientación.

El MPS modificado con Ni2+ se preparará mediante la adhesión de 3-yodotrimetoxipropilsilano a la superficie del silicato seguido de la reacción con ciclam y la incorporación del ion de metal. Con esto se inmoviliza la proteasa en una orientación controlada.

Al ser usado, el circuito extracorporal de sangre se conecta a un paciente, por lo general a un brazo de un paciente, y se hace funcionar la bomba para extraer la sangre del paciente y bombearla a través del circuito. La sangre completa del paciente entra al separador 7 y se separa con presión en las dos fracciones. La fracción de plasma se bombea desde la primera cámara (10a) a la cámara de reacción 8, donde la sangre se percola a través del lecho del casete funcionalizado 21. En la cámara de reacción, el mediador en el plasma se fija a la enzima proteásica que está

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inmovilizada en el material de soporte y se escinde en una forma inactiva que se devuelve al plasma y deja la enzima inmovilizada libre para otra reacción. Como resultado de pasar el plasma a través de la cámara de reacción, se reduce significativamente la concentración del mediador funcional en el plasma. El plasma así tratado se bombea a continuación a la cámara de mezclado 17, donde se reúne con la fracción rica en células para formar la sangre completa que está significativamente desprovista de la proteína mediadora activa. La sangre completa se devuelve al paciente a través de la línea de retorno 4.

Se apreciará que es opcional el uso de un separador para filtrar la sangre antes del tratamiento, y que el tratamiento de la sangre completa en la cámara de reacción forma parte de la invención.

Experimental

Materiales y métodos

Ensayos de actividad de la peptidasa de C5a

Se produjo el C5a recombinante como una fusión con etiqueta de His en el extremo amino (HT-C5a) de acuerdo con el método de Toth et al1, y la actividad quimiotáctica se comprobó en un ensayo de migración en agarosa (datos sin mostrar). La actividad C5a-asa de ScpA se mostró en las reacciones que consistían en ScpA a 42 nM con HT-C5a a 37 µM, en Tris/HCl a 50 mM (pH 7,5), NaCl a 100 mM y CaCl2 a 5 mM durante 30 min a 20 º C. La actividad C5a-asa observada era independiente de la presencia del cóctel inhibidor Complete Mini EDTAfree (Roche). Se realizó el análisis de escisión de HT-C5a mediante espectrometría de masas (EM) de tiempo de vuelo acoplada a la ionización/desorción por láser asistida por matriz.

Construcción del prototipo

La ScpA se inmovilizó de forma irreversible a una partícula de agarosa. El acoplamiento implicó la unión covalente de la enzima, a través de una cisteína del extremo carboxilo que se introdujo en la proteína por mutagénesis, a la partícula de silicato a través de un conector de yodoacetilo sobre la superficie de la partícula de agarosa.

El material de agarosa con la enzima se empaquetó en un reactor de flujo y, mediante una bomba peristáltica, se le aplicó el suero humano enriquecido con C5a (figura 3a). La escisión de C5a se monitorizó mediante la toma de muestras del suero en circulación después del primer contacto y a continuación monitorizando la desaparición del C5a activo desde un reservorio de suero. La pérdida de masa de 830 Da del C5a se confirmó mediante el análisis de MALDI-TOF acoplado a EM.

Resultados

Ensayo de la actividad

El ensayo de la actividad mostró que el ScpA escindió el C5a en un solo sitio (figura 2a). El análisis de EM indicó una pérdida de 830 Da, que concordaba con la retirada de siete restos del extremo carboxilo (figura 2b) que eliminan la capacidad quimiotáctica.

Funcionalidad del prototipo

Las muestras del pase inicial del suero humano enriquecido a través del prototipo indican que el C5a se escinde a un nivel que se aproxima a una eficacia del 100% (figura 3b). La monitorización del C5a en circulación desde el vaso de reacción indica que 1 hora de circulación da lugar a una escisión completa y a la desaparición de una cantidad de C5a coherente con el C5a total esperado en un humano en el pico de una respuesta a la septicemia (figura 3b). La pérdida de 830 Da del C5a confirmó que se habían retirado del C5a las secuencias estimuladoras.

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Claims (1)

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