JP2004089673A - 花粉アレルゲンの不活性化方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】アレルゲン、特に花粉由来のアレルゲン、を特異的に排除する方法を提供する。
【解決手段】熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法。さらに花粉アレルゲンを不活性化した後これを補足、具備する空調機。
【選択図】 なし
【解決手段】熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法。さらに花粉アレルゲンを不活性化した後これを補足、具備する空調機。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、花粉症を引き起こす原因物質であるアレルゲンを不活性化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境や生活様式などの変化により、アレルギーを引き起こす原因物質であるアレルゲンが四季を問わずに存在するようになった。特に、花粉症患者は、国民の１０％にも及び、そのうちの８０％はスギ花粉に対してアレルギー反応を示すものである。花粉症患者の数は、年々増加の一途を辿り、現在では社会問題となっている。
【０００３】
花粉症に対する対策は、花粉との接触を避けることを基本としており、マスクや眼鏡等を使用することにより防除する方法が主流である。しかしながら、アレルギーを引き起こす原因物質（即ち、アレルゲン）を特定して排除するような技術は確立されてはおらず、ハウスダストとして纏めて処理する掃除用具、例えば、例えば掃除機やモップなどが市販されている程度に留まっている。
【０００４】
以上にように、従来の花粉症対策は、外出時に着用するマスクのガーゼに微細繊維フィルターを設けることにより、人体への花粉の吸引を回避することや、居住空間において、集塵機に代表されるような装置で空気中浮遊物質の一部として花粉を捕獲することが行われているに過ぎない。従来では、積極的なアレルゲン除去が行われているとは言い難い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、本発明の目的は、アレルゲン、特に花粉由来のアレルゲン、を特異的に排除する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための鋭意研究の結果、本発明者らは、以下のような手段を見出した。即ち、
熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉由来アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
花粉症は、空気中のアレルゲンである花粉を吸い込むことにより引き起こされる。そのため、空気中のアレルゲンを遮断および／または排除することでアレルギー症状を緩和できると考えられる。一方、花粉などの生物由来のアレルゲンは、タンパク質が主成分である。従って、花粉に含まれるタンパク質を分解または変性することで、その活性を失わせることができると本発明者らは考えた。
【０００８】
１．アレルゲン不活化方法
アレルギーを引き起こす原因物質であるアレルゲンは、生物由来のタンパク質を主成分とする。本発明は、本発明者らがタンパク質を変性することによってアレルゲンを特異的且つ効果的に不活性化できることを明らかにしたことに基づく。本明細書は、タンパク質の変性により花粉アレルゲンを不活性化できることを初めて報告するものである。ここで使用される「アレルゲン」または「アレルゲン物質」の語は、アレルゲンとして活性を有する物質を示す。特に、花粉に由来するアレルゲンを「花粉アレルゲン」と記す。
【０００９】
本発明に従うと、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより花粉アレルゲンを不活性化する方法が提供される。
【００１０】
従来では、一般的にタンパク質が、酸やアルカリによる化学的変性、高温での物理的変性、およびタンパク質分解酵素による生化学的変性によって分解されることは知られている。しかしながら、このようなタンパク質の変性によって、タンパク質が有するであろうエピトープとなり得る性質、即ち、アレルゲンとしての活性を特異的に不活化できることは報告されてはいない。また、生化学の知識で理解できるような効果的なアレルゲン不活性化方法はこれまでには報告されていない。今回本発明者らが、タンパク質の変性によりアレルゲン、特に、花粉アレルゲンを不活性化できることを明らかにしたことは画期的なことである。
【００１１】
以下、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼを用いてアレルゲンを不活性化する方法に関して説明する。
【００１２】
（１）熱
本発明に従って、熱の存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、例えば、約６５℃以上の場合であれば約１２０分間、アレルゲンを熱に対して曝露すればよい。また、６５℃以下の温度であっても、例えば加熱時間を長くすればアレルゲンの不活性化は可能である。
【００１３】
本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化に熱を使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、温度や加熱時間などの条件ではなく、熱を利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、熱によってアレルゲンを不活性化するために必要な温度や加熱温度の組み合わせなどの条件は、可能な組み合わせが本発明に含まれるものである。
【００１４】
またここで使用される「熱の存在する条件」とは、それ自身公知の熱源を用いてアレルゲンまたはこれを含む対象を加熱しても、或いは加熱した媒体を介して間接的にアレルゲンまたはこれを含む対象を加熱しても得ることが可能である。
【００１５】
（２）アルカリ
本発明に従って、アルカリの存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、例えば、約２．５ＭのＮａＯＨが存在する条件、またはこれに類似する条件を達成し得る塩基性物質が存在する条件下でアレルゲンを存在させればよい。本発明においてアルカリの存在する条件を得るために使用できる塩基性物質は、水に溶解した場合に水酸化物イオンを生成する物質であればよい。例えば、これらに限られるものではないが、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの種々の塩、並びに強塩基性陰イオン交換樹脂などの物質でよい。また、アルカリ条件に加えて、熱を存在させれば、効率的に不活性化を行うことが可能である。アルカリと熱を組み合わせて処理する場合には、加熱温度と加熱時間を調節することにより、上述の条件よりも低濃度の塩基性物質または上述の強塩基に比較してアルカリ性の弱い弱塩基性物質を使用することによっても良好なアレルゲンの不活性化が達成され得る。
【００１６】
本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化にアルカリを使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、アルカリの存在に関する詳細な条件にあるのではなく、アルカリを利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、アルカリによるアレルゲンの不活性化に関わるｐＨおよび塩基性物質の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００１７】
（３）酸
本発明に従って、酸の存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、これに限定されるものではないが、例えば、約２．５Ｍの濃度でＨＣｌが存在する条件、またはこれに類似する条件を達成し得る酸性物質が存在する条件下でアレルゲンを存在させればよい。本発明において酸の存在する条件を得るために使用できる物質は、水に溶解した場合に水素イオンを生成する物質であればよい。例えば、これらに限られるものではないが、塩酸および硫酸などの酸、並びに強酸性陽イオン交換樹脂が含まれる。また、酸条件に加えて、熱を存在させれば、効率的に不活性を行うことが可能である。酸と熱を組み合わせて処理する場合には、加熱温度と加熱時間を調節することにより、上述の条件よりも低濃度の酸性物質または上述の強酸に比較して酸性の弱い弱酸性物質を使用することによっても良好なアレルゲンの不活性化が達成され得る。
【００１８】
上述の本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化に酸を使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、酸の存在に関する詳細な条件にあるのではなく、酸を利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、酸によるアレルゲンの不活性化に関わるｐＨおよび酸性物質の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００１９】
（４）プロテアーゼ
ここで使用される「プロテアーゼ」の語は、タンパク質およびペプチドを分解する性質を有する酵素を総括的に示す。本発明において使用できる酵素は、それ自身公知の酸性、中性および塩基性の何れのプロテアーゼであってよい。例えば、トリプシンなどのセリンプロテアーゼ、パパイン、カルパイン、カテプシンＢおよびカテプシンＬなどのシステインプロテアーゼ、ペプシン、レニンおよびカテプシンＤなどのアスパラギン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼであってよい。また、プロテアーゼによりアレルゲンを不活性化する場合、使用されるプロテアーゼの至適条件を考慮して、温度および補酵素などの条件を実施者が任意に選択してよい。
【００２０】
また、本発明に従ってプロテーゼによってアレルゲンを不活性化する場合には、使用されるプロテアーゼに加えて尿素などの変性剤を存在させれば、より効率的に不活性を行うことが可能である。
【００２１】
例えば、本発明に使用されるプロテアーゼの濃度は、例えば、ｐｆｕの場合、アレルゲンタンパク質０．４５μｇ当たり約１ユニットである。また、プロテアーゼを使用する場合、処理温度や処理時間および尿素の有無によって、得られる効果は変動する。従って、使用されるプロテアーゼの濃度は上記に限定されるものではなく、種々の条件で有効に使用することが可能である。
【００２２】
上述の本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化にプロテアーゼを使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、それらの濃度および処理時間並びに加熱温度および加熱時間などの詳細な条件ではなく、プロテアーゼを利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、プロテーゼによるアレルゲンの不活性化に関わる酵素の種類および濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。また、プロテアーゼと尿素を併用処理してもよく、この場合もプロテアーゼの種類および濃度および尿素の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００２３】
２．空調機への利用
本発明の更なる側面に従うと、上述した方法を空調機に利用することが可能である。即ち、本発明は、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下にアレルゲンを維持することによりアレルゲンを不活性化する方法を行うためのアレルゲン不活性部を具備する空調機も提供するものである。
【００２４】
本発明に従って使用されるアレルゲン不活性部は、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下でアレルゲンを維持することが可能な手段であればよい。熱の存在下でアレルゲンを維持する場合には、それ自身公知の任意の加熱体を用いればよい。アルカリ、酸またはプロテアーゼの存在下でアレルゲンを維持する場合には、例えば、一般的なクロマトグラフィー技術を利用することが可能である。その場合、アルカリおよび酸を提供し得る化合物または酵素を、フィルターまたは粒子などの担体に固定化し、移動相に含まれるアレルゲンを処理すればよい。
【００２５】
本発明に従って使用され得るフィルターの例を以下に示す。
【００２６】
（１）熱によるアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第１の例は、図１に示す通り、アレルゲンをトラップする不織布フィルター１１と、この不織布フィルター１１の片面に配置されたステンレス製面発熱体１２と、このステンレス製面発熱体１２を加熱するヒータ１３とを具備する（図１）。
【００２７】
ステンレス製面発熱体１２としては、これに限るものではないが、例えば、ステンレス線維をメッシュ状に編んだものが含まれる。ヒータ１３の電源は、通常アレルゲン不活性フィルター１４は空調機に組み込まれて使用されるので、空調機の電源を利用することが好ましい。ヒータ１３は、通常空調機がＯＦＦの時、所定の温度、時間加熱するが、短時間であれば空調機などの部品に損傷を与えない程度の高温で行い、長時間であれば低温で加熱する。しかし、温度および時間は部品の材質等に応じて適宜設定することができる。ヒータ１３による面発熱体１２の加熱によりアレルゲンタンパク質の変性が起こり、アレルゲンとしての活性が失われる。
【００２８】
（２）酸またはアルカリを保持させたアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第２の例は、図２に示す通り、不織布フィルター２１に、強酸性陽イオン交換樹脂または強塩基性陰イオン交換樹脂を保持させたことを特徴とする（図２）。このようなフィルターは、以下に示すようなイオン交換樹脂（例えば、線維または粒状樹脂であってよい）を一般的なフィルターに織り込むことにより製造可能である。
【００２９】
ｉ）強酸性陽イオン交換樹脂
本発明では、例えば、一般式Ｒ−ＳＯ３・Ｈ（但し、Ｒは高分子基体を）で表される強酸性陽イオン交換樹脂を使用することが可能である。この樹脂は酸を用いて再生することが可能である。使用前には酸を用いて活性化しておく必要がある。
【００３０】
ｉｉ）強塩基性陰イオン交換樹脂
また、本発明では、例えば、以下の一般式で表される強塩基性陰イオン交換樹脂を使用することが可能である。この樹脂は塩基を用いて再生することが可能である。使用前には塩基を用いて活性化しておく必要がある。
【００３１】
【化１】
酸またはアルカリの存在する条件下で維持されたアレルゲンタンパク質はそのｐＨ条件の作用によって変性され、アレルゲンとしての活性を失う。
【００３２】
（３）酵素を保持させたアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第３の例は、図３に示す通り、吸水性ポリマーの径より小さいメッシュを有した第１の支持体３１と、この第１の支持体３１の片側に配置された、吸水性ポリマーの径より小さいメッシュを有した第２の支持体３２と、前記第１の支持体と第２の支持体間に配置された吸水性ポリマー層３４とを具備する（図３）。
【００３３】
酵素の担体としては、アクリル酸−ビニルアルコール共重合体、アクリル酸−ナトリウム重合体などの吸水性ポリマーを使用し得る。また、前記担体の吸水能は少なくとも乾燥重量１ｇの吸水性ポリマー当たり６００ｇ程度であることが好ましい。
【００３４】
前記第１および第２の支持体としては、例えば、樹脂製のものが挙げられるが、これに限るものではない。また、前記吸水性ポリマー３４は、所定数のプロテアーゼを含むことが好ましい。酵素を保持させたアレルゲン不活性フィルター３５は、例えば、担体を織り込んだフィルターを作製した後に酵素溶液をフィルターに塗布してもよく、担体に酵素溶液を塗布した後にこれをフィルターに織り込んでもよい。また、相対湿度（即ち、水分活性）を７０％以下に保つことによってカビ汚染も減少できる。更に、界面活性剤（例えば、０．１％程度）を共存させることによって更なる効果も期待できる。
【００３５】
アレルギーはアレルゲンが直接皮膚に接触することによっても生じるが、その多くは、空気中の浮遊アレルゲンを吸引することによって生じる。従って、空気中のアレルゲンを排除できれば、アレルギー症状を緩和できると考えられる。上述のような本発明に従う装置によって空気中に浮遊するアレルゲンを不活性化することが可能であり、それにより住環境の大幅な改善が期待できる。
【００３６】
【実施例】
以下、例を用いて本発明を更に詳しく説明する。
【００３７】
１．材料
本発明の実施例では、本発明の効果を説明するために、花粉症の中でも最も患者数が多いとされるスギ花粉をアレルゲンとして用いて実験を行った。具体的には、スギのアレルゲンとしてスギ抽出物とスギ抗原を使用した。
【００３８】
（１）スギ抽出物
スギ花粉の抽出物として市販のスギ抽出物を使用した。市販のスギ抽出物は、コスモバイオ社より入手したスギ抽出物−Ｃｊである。このスギ抽出物は、具体的には、スギ花粉を炭酸水素ナトリウム（ｐＨ．８）で攪拌後、ホモジナイズし、硼酸緩衝溶液で透析したものである。使用時には、これを精製水を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に懸濁したものをスギ原液として使用した。
【００３９】
（２）スギ抗原
スギ抗原Ｃｒｙｊ−１（以下、Ｃｊ−１と記す）と、Ｃｒｙｊ−２（以下、Ｃｊ−２と記す）は共に林原研究所から入手し、使用時には各々１００μｇ／ｍＬで使用した。
【００４０】
２．実施例
２−１．電気泳動による解析
実施例１ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのフェニルメチルスルホニルフルオリド液（以下、ＰＭＳＦ液と記す。これはプロテアーゼ阻害剤である）を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１とした。
【００４１】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理１）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２とした。
【００４２】
（３）サンプル３（スギ抽出物熱処理２）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、６５℃で１２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル３を作成した。
【００４３】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１〜３を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキット（ＮｕＰａｇｅＴＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）を用いて、各レーンに対して、上記で作成したサンプル１からサンプル３を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標、ｓｉｍｐｌｙ ＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００４４】
その結果を図４に示す。図４から明かであるように、加熱によりサンプル１では見られた複数のバンドが、サンプル２および３では観察されなかった。即ち、８０℃で２０分の加熱処理および６５℃で１２０分の加熱処理によって、スギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図４）。
【００４５】
実施例２ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００４６】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕ プロテアーゼＳ（ｐｆｕ ＰｒｏｔｅａｓｅＳ、宝酒造社製、以下、ｐｆｕと記す）を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００４７】
（３）サンプル５（スギ抽出物パパイン処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２７．０μＬのスギ原液と３μＬ（０．２ｇ／ｍＬ）の食品用精製パパイン（ナガセケムテックス社製、以下、パパインと記す）を加え、４０℃で１５分間加熱した。その後、そこに、３μＬのインヒビターカクテル液（プロテーゼ阻害剤、ｒｏｃｈｅ社製、１錠／ｍＬ）を加えた。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル５を作成した。
【００４８】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１、サンプル４及びサンプル５を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１、サンプル４及びサンプル５を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００４９】
その結果を図５に示す。図５から明かであるように、２種類のプロテアーゼ処理により、サンプル１のレーンで見られた複数のバンドは、サンプル４および５では観察されなかった。また、サンプル４および５ではそれぞれ、サンプル１ではバンドのなかった位置にプロテアーゼに由来するバンド（図５中破線の楕円で囲んだバンド）のみが観察された。従って、２種類のプロテアーゼ処理により、スギタンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図５）。
【００５０】
実施例３ スギ抗原Ｃｒｙｊ−１のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル６（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル６を作成した。
【００５１】
（２）サンプル７（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル７を作成した。
【００５２】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル６およびサンプル７を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル６およびサンプル７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００５３】
その結果を図６に示す。図６から明かであるように、プロテアーゼ処理により、サンプル６で２本観察されていたバンドがサンプル７では消失し、プロテアーゼに由来するバンド（図６中破線楕円により囲まれるバンド）のみが観察された。従って、プロテアーゼ処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図６）
実施例４ スギ抗原Ｃｒｙｊ−２のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル８（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル８を作成した。
【００５４】
（２）サンプル９（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル９を作成した。
【００５５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル８およびサンプル９を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル８およびサンプル９を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００５６】
その結果を図７に示す。図７から明かであるように、サンプル８で見られたバンドはプロテアーゼ処理によって消失し、それに変わってサンプル９ではプロテアーゼに由来するバンド（図７中破線楕円で囲んだバンド）のみが観察された（図７）従って、プロテアーゼ処理によりスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図７）。
【００５７】
２−２．電気泳動とウエスタンブロットによる解析
以下に、上述の実施例１から４で処理したのと同様にアレルゲンを処理した後で、電気泳動どウエスタンブロットとを組み合わせた方法によりアレルゲンの不活化を測定した結果を示す。
【００５８】
上述したようにアレルゲンはタンパク質である。従って、タンパク質を分解および／または変性させることによりアレルゲンとしての能力を失わせることが可能である。これを生化学の知識で理解できる効果的なアレルゲン不活性方法を本出願人は特願２００１−３８４７６２で報告してる。
【００５９】
上記の報告では、アレルゲンの測定を簡易測定法（即ち、ドットブロットやダニスキャン（登録商標）を利用した方法）により行っていた。そのため、アレルゲンの不活性化状況が詳細には分からなかった。１つの原因物質、例えば、ダニや花粉などに含まれるアレルゲンは、詳しくは何種類ものグループに分類されるアレルゲンが存在するものである。従って、それらの個別のアレルゲンに関して不活性化が可能であることを確認することは大切である。
【００６０】
特願２００２−１０６８３４において、本発明者らは、そのような個別のアレルゲンについてその活性を測定できる方法を開示している。これはタンパク質電気泳動とウエスタンブロットとを組み合わせた方法である。この方法は、タンパク質電気泳動により、エピトープとなるアレルゲンを分離する。その結果から、タンパク質の存在有無や検出されるバンド濃淡を指標に、アレルゲンに含まれるタンパク質の分解および／または変性が生じたか否かを判定できる。さらに詳細な分析として、抗原抗体反応を利用したウエスタンブロットを行うことにより、、そこに存在する物質がアレルゲン性を有するか否かを判定する。以下、そのような方法により、本発明の方法に従って処理したアレルゲンが不活性化されていることを説明する。
【００６１】
実施例５ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００６２】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理１）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２を作成した。
【００６３】
（３）サンプル３（スギ抽出物熱処理２）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、６５℃で１２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル３を作成した。
【００６４】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１〜３を先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１からサンプル３を夫々１５μＬずつ添加し、電気泳動を行った。
【００６５】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュール（ＸｃｅｌｌＩＩＴＭ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ）を製造者の処方箋に従って使用した。
【００６６】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体（コスモバイオ社製、ウサギ全血清）を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ、登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標、アマシャムファルマシア社製）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００６７】
その結果を図８に示す。図８から明かであるように、サンプル１で観察されていたバンドは、サンプル２および３では消失し、その変わりに前記バンドの上方に広範囲に亘るバンドが観察された。このバンドはスギタンパク質が変性した結果生じたものであると考えられる。従って、その結果から加熱によりＣｊ−１アレルゲンの不活性化が生じると示唆された（図８）。
【００６８】
実施例６ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００６９】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００７０】
（３）サンプル５（スギ抽出物パパイン処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２７．０μＬのスギ原液と３μＬ（０．２ｇ／ｍＬ）の食品用精製パパイン（ナガセケムテックス社製、以下、パパインと記す）を加え、４０℃で１５分間加熱した。その後、そこに、３μＬのインヒビターカクテル液を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル５を作成した。
【００７１】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１、サンプル４及びサンプル５を先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１、サンプル４及びサンプル５を夫々１５μＬずつ添加した。
【００７２】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００７３】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００７４】
その結果を図９に示す。図９から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドは、サンプル４および５では消失していた。従って、プロテアーゼによりＣｊ−１アレルゲンは不活性化されることが示唆された（図９）。
【００７５】
実施例７ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００７６】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２を作成した。
【００７７】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１および２を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１およびサンプル２を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００７８】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００７９】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００８０】
その結果を図１０に示す。図１０から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドはサンプル２では消失していた。従って、加熱処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１０）。
【００８１】
実施例８ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００８２】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００８３】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１およびサンプル４を先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１およびサンプル４を夫々１５μＬずつ添加した。
【００８４】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００８５】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００８６】
その結果を図１１に示す。図１１から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドはサンプル４では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１１）。
【００８７】
実施例９ スギ抗原Ｃｒｙｊ−１のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル６（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル６を作成した。
【００８８】
（２）サンプル７（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル７を作成した。
【００８９】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル６およびサンプル７を、先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル６およびサンプル７を夫々１５μＬずつ添加した。
【００９０】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００９１】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００９２】
その結果を図１２に示す。図１２から明かであるように、サンプル６で観察されたバンドはサンプル７では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１２）。
【００９３】
実施例１０ スギ抗原Ｃｒｙｊ−２のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル８（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル８を作成した。
【００９４】
（２）サンプル９（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル９を作成した。
【００９５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル８およびサンプル９を、先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル８およびサンプル９を夫々１５μＬずつ添加した。
【００９６】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００９７】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００９８】
その結果を図１３に示す。図１３から明かであるように、サンプル８で観察されたバンドはサンプル９では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１３）。
【００９９】
２−３．花粉アレルゲン不活性部を具備する空調機の例
実施例１１
図１を参照しながら実施例１１を説明する。図中の符番１１は、アレルゲンをトラップする不織布フィルターを示す。この不織布フィルター１１の下面には、花粉粒子（２０〜３０μｍ）やダニ（特にダニの糞、１０〜４０μｍ）の径より小さいメッシュを有したステンレス製の繊維状面発熱体１２が配置されている。このステンレス製の線維状面発熱体（商品名：ソフテレック、帝人社製）１２の下部には、前記面発熱体１２を加熱する電熱ヒータ１３が配置されている。
【０１００】
このように実施例９に係るアレルゲン不活性フィルター１４は、アレルゲンをトラップする不織布フィルター１１と、この不織布フィルター１１の下面に配置された、花粉粒子やダニの径より小さいメッシュを有したステンレス製面発熱体１２と、この繊維状面発熱体１２の下部に配置された、該面発熱体１２を加熱する電熱ヒータ１３とを具備した構成となっている。
【０１０１】
こうしたアレルゲン不活性フィルター１４は、後述する空調機（図１４参照）の所定の位置にエアコン搭載可能な大きさ（例えば、５ｃｍ×１０ｃｍ）で取り付けられて使用される。空調機の空気取り込み口にアレルゲン不活性フィルター１４を取り付ける際は、不織布フィルター１１をアレルゲン含有空気（矢印Ａ）の入口側に配置する。そして、空調機がＯＦＦの時、フィルター１４の電熱ヒータ１３をＯＮにして面発熱体１２の加熱温度を例えば約７０℃で発熱される。
【０１０２】
これにより、アレルゲン含有空気は不織布フィルター１１を通過するが、高温状態に保持された面発熱体１２で花粉粒子やダニが捕獲され、ここでアレルゲンタンパク質の変性が行われ、アレルゲンとしての活性は失われ、ステンレス面発熱体１２からはアレルゲン軽減空気（矢印Ｂ）が通過する。
【０１０３】
従って、実施例１１のアレルゲン不活性フィルター１４によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので、薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、前記発熱体を所定の温度で加熱するだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０４】
実施例１２
図２を参照する。実施例１２に係るアレルゲン不活性フィルター２１は、不織布フィルター２２に、強酸性陽イオン交換樹脂（図示せず）を保持させた構成となっている。ここで、強酸性陽イオン交換樹脂は、Ｒ−ＳＯ３・Ｈ（但し、Ｒは高分子基体を示す）であり、酸を使って再生が可能である。この強酸性陽イオン交換樹脂は、使用前に活性化しておく。
【０１０５】
実施例１２によれば、アレルゲン含有空気Ａが不織布フィルター２２を通過するだけで該不織布フィルター２２に保持された強酸性陽イオン交換樹脂によりアレルゲンタンパク質はそのｐＨの影響で変性し、アレルゲンとしての活性を失う。従って、不織布フィルター２２からはアレルゲン軽減空気Ｂが排気される。従って、実施例１２のアレルゲン不活性フィルター２１によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、強酸性陽イオン交換樹脂を保持させた不織布フィルター２２にアレルゲン含有空気Ａを通すだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０６】
なお、実施例１２では、強酸性陽イオン交換樹脂を使用する場合について述べたが、これに限らず、上記化合物１に示す強塩基性陰イオン交換樹脂を使用してもよい。但し、この場合も、強塩基性陰イオン交換樹脂は使用前に活性化しておくことが好ましい。
【０１０７】
実施例１３
図３を参照して実施例１３を説明する。図中の符番３１は吸水性ポリマー３２が移動しない大きさで且つ花粉粒子やダニを通すメッシュ（＞５０μｍ）を有した樹脂製の第１の支持体を示す。この第１の支持体３１の下側には吸水性ポリマー３４が移動しない大きさで且つ花粉粒子やダニを通さないメッシュ（＞５０μｍ）を有した樹脂製の第２の支持体３３が配置されている。前記第１の支持体３１と第２の支持体３３の間には、吸水性ポリマー３２からなる吸水性ポリマー層３４が挟まれて配置されている。ここで、吸水性ポリマー３２は、例えば、５０万ユニット／フィルターのプロテアーゼを含んでいる。前記吸水ポリマー層３４は、例えば、プロテアーゼを含む酸素溶液にポリマーを含浸させることにより形成することができる。
【０１０８】
実施例１３に係るアレルゲン不活性フィルター３５は、樹脂製の第１の支持体３１と第２の支持体３３の間に吸水性ポリマー層３４を挟んだ構造を有する。それにより、アレルゲン含有空気Ａが吸水性ポリマー層３４を通過するだけで、タンパク質を分解する酵素によってアレルゲンが分解される。従って、実施例１３のアレルゲン不活性フィルター３５によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、吸水性ポリマー層３４にアレルゲン含有空気Ａを通すだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０９】
実施例１４
図１４は、実施例１１から１３に係るアレルゲン不活性フィルターをエアコンの空気取り込み口に取り付けた例を示す。図１４において、符番４２はエアコン用冷却ユニットを示し、符番４３は筐体を示す。この筐体４３の内側には、ファン４４などが配置されている。ここで、前記アレルゲン不活性フィルター１４は、該フィルター１４の主要な構成である不織布フィルター２１が空気アレルゲン含有空気の入口に位置するよう配置される。
【０１１０】
このように実施例１４に係る空調機は、エアコンの空気取り込み口にアレルゲン不活性フィルター１４を配置した構成になっている。そのため、空調機がＯＦＦの時、フィルター１４の電熱ヒータ１３をＯＮにして面発熱体１２を発熱させることにより、高温状態に保持された面発熱体１２で花粉粒子やダニが捕獲され、ここでアレルゲンタンパク質の変性が起こり、アレルゲンとしての活性が失われる。ステンレス面発熱体１２からはアレルゲン軽減空気が通過する。なお、前記電熱ヒータ１３には空調機の電源を利用する。
【０１１１】
エアコン、空気清浄機などの空調機に、本発明のアレルゲン分解機能を付加することで住環境の著しい改善が図れる。
【０１１２】
２−４．酸およびアルカリの効果
実施例１５ スギ抽出物の酸による不活化
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１１３】
（２）サンプル１１（スギ抽出物ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１１４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１１を作成した。
【０１１５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０および１１を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０およびサンプル１１を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１１６】
その結果を図１５に示す。図１５から明かであるように、サンプル１０で観察されたスギ花粉アレルゲンに由来するバンドはサンプル１１では消失していた。従って、酸処理によってスギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１５）。
【０１１７】
実施例１６ スギ抗原Ｃｒｊ−１の酸による不活化
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１１８】
（２）サンプル１３（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１１９】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１３を作成した。
【０１２０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２および１３を電気泳動で解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２およびサンプル１３を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１２１】
その結果を図１６に示す。図１６から明かであるように、サンプル１２で観察されたスギ抗原Ｃｊ−１に由来するバンドはサンプル１３では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１６）。
【０１２２】
実施例１７ スギ抗原Ｃｒｊ−２の酸による不活化
（１）サンプル１４（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１４を作成した。
【０１２３】
（２）サンプル１５（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１２４】
更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１５を作成した。
【０１２５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１４および１５を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１４およびサンプル１５を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１２６】
その結果を図１７に示す。図１７から明かであるように、サンプル１４で観察されたスギ抗原Ｃｊ−２に由来するバンドはサンプル１５では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１７）。
【０１２７】
実施例１８ スギ抽出物のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１２８】
（２）サンプル１６（スギ抽出物ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１２９】
更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１６とした。
【０１３０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０および１６を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０およびサンプル１６を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１３１】
その結果を図１８に示す。図１８から明かであるように、サンプル１０で観察されたスギ花粉アレルゲンに由来するバンドはサンプル１６では消失していた。従って、アルカリ処理によってスギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１８）。
【０１３２】
実施例１９ スギ抗原Ｃｒｊ−１のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１３３】
（２）サンプル１７（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１３４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１７を作成した。
【０１３５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２および１７を電気泳動で解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２およびサンプル１７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１３６】
その結果を図１９に示す。図１９から明かであるように、サンプル１２で観察されたスギ抗原Ｃｊ−１に由来するバンドはサンプル１７では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１９）。
【０１３７】
実施例２０ スギ抗原Ｃｒｊ−２のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１４（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１４を作成した。
【０１３８】
（２）サンプル１８（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１３９】
更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１８を作成した。
【０１４０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１４および１８を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１４およびサンプル１８を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１４１】
その結果を図２０に示す。図２０から明かであるように、サンプル１４で観察されたスギ抗原Ｃｊ−２に由来するバンドはサンプル１８では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図２０）。
【０１４２】
実施例２１ 酸およびアルカリのアレルゲン不活性化についての電気泳動とウエスタンブロットによる解析（１）
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１４３】
（２）サンプル１１（スギ抽出物ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１４４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１１を作成した。
【０１４５】
（３）サンプル１６（スギ抽出物ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１４６】
更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１６とした。
【０１４７】
（４）電気泳動
上記の（１）、（２）および（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０、１１および１６を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０、１１およびサンプル１６を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１４８】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【０１４９】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【０１５０】
その結果を図２１に示す。図２１から明かであるように、サンプル１０で観察されたバンドはサンプル１１および１６では消失していた。従って、酸およびアルカリ処理の何れの処理によってもＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図２１）。
【０１５１】
実施例２２ 酸およびアルカリのアレルゲン不活性化についての電気泳動とウエスタンブロットによる解析（２）
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１５２】
（２）サンプル１３（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１５３】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１３を作成した。
【０１５４】
（３）サンプル１７（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１５５】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１７を作成した。
【０１５６】
（４）電気泳動
上記の（１）、（２）および（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２、１３および１７を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２、１３およびサンプル１７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１５７】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【０１５８】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【０１５９】
その結果を図２２に示す。図２２から明かであるように、サンプル１２で観察されたバンドはサンプル１３および１７では消失していた。従って、酸およびアルカリ処理の何れの処理によってもＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図２１）。
【０１６０】
【発明の効果】
本発明に従うと、アレルゲンを特異的に排除する方法が提供される。
【０１６１】
また、既に先の報告で、本発明者らは、ダニアレルゲンの不活性化方法（特願２００１−３８４７６２を参照されたい）および同アレルゲンの測定方法（特願２００２−１０６８３４を参照されたい）を報告している。本報告は、アレルギーの原因物質である生物由来のアレルゲンが、その種を問わずに不活性化できること、並びに活性を測定できることを報告するものでもある。また特に、特願２００１−２２４９２８号で開示する技術と合わせることにより、住環境の大幅な改善が期待できる装置が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図２】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図３】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図４】電気泳動の結果を示す模式図。
【図５】電気泳動の結果を示す模式図。
【図６】電気泳動の結果を示す模式図。
【図７】電気泳動の結果を示す模式図。
【図８】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図９】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１０】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１１】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１２】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１３】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１４】図１のアレルゲン不活性フィルターを空気の入口側に取り付けた本発明に係る空調機を示す図。
【図１５】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１６】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１７】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１８】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１９】電気泳動の結果を示す模式図。
【図２０】電気泳動の結果を示す模式図。
【図２１】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図２２】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【符号の説明】
１．ちり採取器 ２．サンプル添加部 ３．バンド １１．不織布フィルター １２．繊維状面発熱体 １３．電熱ヒータ １４．アレルゲン不活性フィルター ２１、２２．不織布フィルター ３１．第１の支持体 ３２．吸水性ポリマー ３３．第２の支持体 ３４．吸水性ポリマー層 ３５．アレルゲン不活性フィルター ４２．エアコン用冷却ユニット ４３．筐体 ４４．ファン
【発明の属する技術分野】
本発明は、花粉症を引き起こす原因物質であるアレルゲンを不活性化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境や生活様式などの変化により、アレルギーを引き起こす原因物質であるアレルゲンが四季を問わずに存在するようになった。特に、花粉症患者は、国民の１０％にも及び、そのうちの８０％はスギ花粉に対してアレルギー反応を示すものである。花粉症患者の数は、年々増加の一途を辿り、現在では社会問題となっている。
【０００３】
花粉症に対する対策は、花粉との接触を避けることを基本としており、マスクや眼鏡等を使用することにより防除する方法が主流である。しかしながら、アレルギーを引き起こす原因物質（即ち、アレルゲン）を特定して排除するような技術は確立されてはおらず、ハウスダストとして纏めて処理する掃除用具、例えば、例えば掃除機やモップなどが市販されている程度に留まっている。
【０００４】
以上にように、従来の花粉症対策は、外出時に着用するマスクのガーゼに微細繊維フィルターを設けることにより、人体への花粉の吸引を回避することや、居住空間において、集塵機に代表されるような装置で空気中浮遊物質の一部として花粉を捕獲することが行われているに過ぎない。従来では、積極的なアレルゲン除去が行われているとは言い難い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、本発明の目的は、アレルゲン、特に花粉由来のアレルゲン、を特異的に排除する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための鋭意研究の結果、本発明者らは、以下のような手段を見出した。即ち、
熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉由来アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
花粉症は、空気中のアレルゲンである花粉を吸い込むことにより引き起こされる。そのため、空気中のアレルゲンを遮断および／または排除することでアレルギー症状を緩和できると考えられる。一方、花粉などの生物由来のアレルゲンは、タンパク質が主成分である。従って、花粉に含まれるタンパク質を分解または変性することで、その活性を失わせることができると本発明者らは考えた。
【０００８】
１．アレルゲン不活化方法
アレルギーを引き起こす原因物質であるアレルゲンは、生物由来のタンパク質を主成分とする。本発明は、本発明者らがタンパク質を変性することによってアレルゲンを特異的且つ効果的に不活性化できることを明らかにしたことに基づく。本明細書は、タンパク質の変性により花粉アレルゲンを不活性化できることを初めて報告するものである。ここで使用される「アレルゲン」または「アレルゲン物質」の語は、アレルゲンとして活性を有する物質を示す。特に、花粉に由来するアレルゲンを「花粉アレルゲン」と記す。
【０００９】
本発明に従うと、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより花粉アレルゲンを不活性化する方法が提供される。
【００１０】
従来では、一般的にタンパク質が、酸やアルカリによる化学的変性、高温での物理的変性、およびタンパク質分解酵素による生化学的変性によって分解されることは知られている。しかしながら、このようなタンパク質の変性によって、タンパク質が有するであろうエピトープとなり得る性質、即ち、アレルゲンとしての活性を特異的に不活化できることは報告されてはいない。また、生化学の知識で理解できるような効果的なアレルゲン不活性化方法はこれまでには報告されていない。今回本発明者らが、タンパク質の変性によりアレルゲン、特に、花粉アレルゲンを不活性化できることを明らかにしたことは画期的なことである。
【００１１】
以下、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼを用いてアレルゲンを不活性化する方法に関して説明する。
【００１２】
（１）熱
本発明に従って、熱の存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、例えば、約６５℃以上の場合であれば約１２０分間、アレルゲンを熱に対して曝露すればよい。また、６５℃以下の温度であっても、例えば加熱時間を長くすればアレルゲンの不活性化は可能である。
【００１３】
本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化に熱を使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、温度や加熱時間などの条件ではなく、熱を利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、熱によってアレルゲンを不活性化するために必要な温度や加熱温度の組み合わせなどの条件は、可能な組み合わせが本発明に含まれるものである。
【００１４】
またここで使用される「熱の存在する条件」とは、それ自身公知の熱源を用いてアレルゲンまたはこれを含む対象を加熱しても、或いは加熱した媒体を介して間接的にアレルゲンまたはこれを含む対象を加熱しても得ることが可能である。
【００１５】
（２）アルカリ
本発明に従って、アルカリの存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、例えば、約２．５ＭのＮａＯＨが存在する条件、またはこれに類似する条件を達成し得る塩基性物質が存在する条件下でアレルゲンを存在させればよい。本発明においてアルカリの存在する条件を得るために使用できる塩基性物質は、水に溶解した場合に水酸化物イオンを生成する物質であればよい。例えば、これらに限られるものではないが、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの種々の塩、並びに強塩基性陰イオン交換樹脂などの物質でよい。また、アルカリ条件に加えて、熱を存在させれば、効率的に不活性化を行うことが可能である。アルカリと熱を組み合わせて処理する場合には、加熱温度と加熱時間を調節することにより、上述の条件よりも低濃度の塩基性物質または上述の強塩基に比較してアルカリ性の弱い弱塩基性物質を使用することによっても良好なアレルゲンの不活性化が達成され得る。
【００１６】
本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化にアルカリを使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、アルカリの存在に関する詳細な条件にあるのではなく、アルカリを利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、アルカリによるアレルゲンの不活性化に関わるｐＨおよび塩基性物質の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００１７】
（３）酸
本発明に従って、酸の存在する条件下でアレルゲンを不活性化する場合、これに限定されるものではないが、例えば、約２．５Ｍの濃度でＨＣｌが存在する条件、またはこれに類似する条件を達成し得る酸性物質が存在する条件下でアレルゲンを存在させればよい。本発明において酸の存在する条件を得るために使用できる物質は、水に溶解した場合に水素イオンを生成する物質であればよい。例えば、これらに限られるものではないが、塩酸および硫酸などの酸、並びに強酸性陽イオン交換樹脂が含まれる。また、酸条件に加えて、熱を存在させれば、効率的に不活性を行うことが可能である。酸と熱を組み合わせて処理する場合には、加熱温度と加熱時間を調節することにより、上述の条件よりも低濃度の酸性物質または上述の強酸に比較して酸性の弱い弱酸性物質を使用することによっても良好なアレルゲンの不活性化が達成され得る。
【００１８】
上述の本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化に酸を使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、酸の存在に関する詳細な条件にあるのではなく、酸を利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、酸によるアレルゲンの不活性化に関わるｐＨおよび酸性物質の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００１９】
（４）プロテアーゼ
ここで使用される「プロテアーゼ」の語は、タンパク質およびペプチドを分解する性質を有する酵素を総括的に示す。本発明において使用できる酵素は、それ自身公知の酸性、中性および塩基性の何れのプロテアーゼであってよい。例えば、トリプシンなどのセリンプロテアーゼ、パパイン、カルパイン、カテプシンＢおよびカテプシンＬなどのシステインプロテアーゼ、ペプシン、レニンおよびカテプシンＤなどのアスパラギン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼであってよい。また、プロテアーゼによりアレルゲンを不活性化する場合、使用されるプロテアーゼの至適条件を考慮して、温度および補酵素などの条件を実施者が任意に選択してよい。
【００２０】
また、本発明に従ってプロテーゼによってアレルゲンを不活性化する場合には、使用されるプロテアーゼに加えて尿素などの変性剤を存在させれば、より効率的に不活性を行うことが可能である。
【００２１】
例えば、本発明に使用されるプロテアーゼの濃度は、例えば、ｐｆｕの場合、アレルゲンタンパク質０．４５μｇ当たり約１ユニットである。また、プロテアーゼを使用する場合、処理温度や処理時間および尿素の有無によって、得られる効果は変動する。従って、使用されるプロテアーゼの濃度は上記に限定されるものではなく、種々の条件で有効に使用することが可能である。
【００２２】
上述の本発明の１側面において、本発明は、アレルゲンの不活性化にプロテアーゼを使用するというユニークで且つ新しい発想を基に達成された。従って、本発明において重要な点の１つは、それらの濃度および処理時間並びに加熱温度および加熱時間などの詳細な条件ではなく、プロテアーゼを利用してアレルゲンを不活性化すること自体にある。言い換えれば、プロテーゼによるアレルゲンの不活性化に関わる酵素の種類および濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。また、プロテアーゼと尿素を併用処理してもよく、この場合もプロテアーゼの種類および濃度および尿素の濃度、並びに加熱の有無や加熱温度および時間などの条件は、可能な全ての組み合わせが本発明に全て含まれるものである。
【００２３】
２．空調機への利用
本発明の更なる側面に従うと、上述した方法を空調機に利用することが可能である。即ち、本発明は、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下にアレルゲンを維持することによりアレルゲンを不活性化する方法を行うためのアレルゲン不活性部を具備する空調機も提供するものである。
【００２４】
本発明に従って使用されるアレルゲン不活性部は、熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下でアレルゲンを維持することが可能な手段であればよい。熱の存在下でアレルゲンを維持する場合には、それ自身公知の任意の加熱体を用いればよい。アルカリ、酸またはプロテアーゼの存在下でアレルゲンを維持する場合には、例えば、一般的なクロマトグラフィー技術を利用することが可能である。その場合、アルカリおよび酸を提供し得る化合物または酵素を、フィルターまたは粒子などの担体に固定化し、移動相に含まれるアレルゲンを処理すればよい。
【００２５】
本発明に従って使用され得るフィルターの例を以下に示す。
【００２６】
（１）熱によるアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第１の例は、図１に示す通り、アレルゲンをトラップする不織布フィルター１１と、この不織布フィルター１１の片面に配置されたステンレス製面発熱体１２と、このステンレス製面発熱体１２を加熱するヒータ１３とを具備する（図１）。
【００２７】
ステンレス製面発熱体１２としては、これに限るものではないが、例えば、ステンレス線維をメッシュ状に編んだものが含まれる。ヒータ１３の電源は、通常アレルゲン不活性フィルター１４は空調機に組み込まれて使用されるので、空調機の電源を利用することが好ましい。ヒータ１３は、通常空調機がＯＦＦの時、所定の温度、時間加熱するが、短時間であれば空調機などの部品に損傷を与えない程度の高温で行い、長時間であれば低温で加熱する。しかし、温度および時間は部品の材質等に応じて適宜設定することができる。ヒータ１３による面発熱体１２の加熱によりアレルゲンタンパク質の変性が起こり、アレルゲンとしての活性が失われる。
【００２８】
（２）酸またはアルカリを保持させたアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第２の例は、図２に示す通り、不織布フィルター２１に、強酸性陽イオン交換樹脂または強塩基性陰イオン交換樹脂を保持させたことを特徴とする（図２）。このようなフィルターは、以下に示すようなイオン交換樹脂（例えば、線維または粒状樹脂であってよい）を一般的なフィルターに織り込むことにより製造可能である。
【００２９】
ｉ）強酸性陽イオン交換樹脂
本発明では、例えば、一般式Ｒ−ＳＯ３・Ｈ（但し、Ｒは高分子基体を）で表される強酸性陽イオン交換樹脂を使用することが可能である。この樹脂は酸を用いて再生することが可能である。使用前には酸を用いて活性化しておく必要がある。
【００３０】
ｉｉ）強塩基性陰イオン交換樹脂
また、本発明では、例えば、以下の一般式で表される強塩基性陰イオン交換樹脂を使用することが可能である。この樹脂は塩基を用いて再生することが可能である。使用前には塩基を用いて活性化しておく必要がある。
【００３１】
【化１】
【００３２】
（３）酵素を保持させたアレルゲン不活性フィルター
本発明に従うフィルターの第３の例は、図３に示す通り、吸水性ポリマーの径より小さいメッシュを有した第１の支持体３１と、この第１の支持体３１の片側に配置された、吸水性ポリマーの径より小さいメッシュを有した第２の支持体３２と、前記第１の支持体と第２の支持体間に配置された吸水性ポリマー層３４とを具備する（図３）。
【００３３】
酵素の担体としては、アクリル酸−ビニルアルコール共重合体、アクリル酸−ナトリウム重合体などの吸水性ポリマーを使用し得る。また、前記担体の吸水能は少なくとも乾燥重量１ｇの吸水性ポリマー当たり６００ｇ程度であることが好ましい。
【００３４】
前記第１および第２の支持体としては、例えば、樹脂製のものが挙げられるが、これに限るものではない。また、前記吸水性ポリマー３４は、所定数のプロテアーゼを含むことが好ましい。酵素を保持させたアレルゲン不活性フィルター３５は、例えば、担体を織り込んだフィルターを作製した後に酵素溶液をフィルターに塗布してもよく、担体に酵素溶液を塗布した後にこれをフィルターに織り込んでもよい。また、相対湿度（即ち、水分活性）を７０％以下に保つことによってカビ汚染も減少できる。更に、界面活性剤（例えば、０．１％程度）を共存させることによって更なる効果も期待できる。
【００３５】
アレルギーはアレルゲンが直接皮膚に接触することによっても生じるが、その多くは、空気中の浮遊アレルゲンを吸引することによって生じる。従って、空気中のアレルゲンを排除できれば、アレルギー症状を緩和できると考えられる。上述のような本発明に従う装置によって空気中に浮遊するアレルゲンを不活性化することが可能であり、それにより住環境の大幅な改善が期待できる。
【００３６】
【実施例】
以下、例を用いて本発明を更に詳しく説明する。
【００３７】
１．材料
本発明の実施例では、本発明の効果を説明するために、花粉症の中でも最も患者数が多いとされるスギ花粉をアレルゲンとして用いて実験を行った。具体的には、スギのアレルゲンとしてスギ抽出物とスギ抗原を使用した。
【００３８】
（１）スギ抽出物
スギ花粉の抽出物として市販のスギ抽出物を使用した。市販のスギ抽出物は、コスモバイオ社より入手したスギ抽出物−Ｃｊである。このスギ抽出物は、具体的には、スギ花粉を炭酸水素ナトリウム（ｐＨ．８）で攪拌後、ホモジナイズし、硼酸緩衝溶液で透析したものである。使用時には、これを精製水を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に懸濁したものをスギ原液として使用した。
【００３９】
（２）スギ抗原
スギ抗原Ｃｒｙｊ−１（以下、Ｃｊ−１と記す）と、Ｃｒｙｊ−２（以下、Ｃｊ−２と記す）は共に林原研究所から入手し、使用時には各々１００μｇ／ｍＬで使用した。
【００４０】
２．実施例
２−１．電気泳動による解析
実施例１ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのフェニルメチルスルホニルフルオリド液（以下、ＰＭＳＦ液と記す。これはプロテアーゼ阻害剤である）を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１とした。
【００４１】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理１）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２とした。
【００４２】
（３）サンプル３（スギ抽出物熱処理２）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、６５℃で１２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル３を作成した。
【００４３】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１〜３を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキット（ＮｕＰａｇｅＴＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）を用いて、各レーンに対して、上記で作成したサンプル１からサンプル３を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標、ｓｉｍｐｌｙ ＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００４４】
その結果を図４に示す。図４から明かであるように、加熱によりサンプル１では見られた複数のバンドが、サンプル２および３では観察されなかった。即ち、８０℃で２０分の加熱処理および６５℃で１２０分の加熱処理によって、スギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図４）。
【００４５】
実施例２ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００４６】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕ プロテアーゼＳ（ｐｆｕ ＰｒｏｔｅａｓｅＳ、宝酒造社製、以下、ｐｆｕと記す）を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００４７】
（３）サンプル５（スギ抽出物パパイン処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２７．０μＬのスギ原液と３μＬ（０．２ｇ／ｍＬ）の食品用精製パパイン（ナガセケムテックス社製、以下、パパインと記す）を加え、４０℃で１５分間加熱した。その後、そこに、３μＬのインヒビターカクテル液（プロテーゼ阻害剤、ｒｏｃｈｅ社製、１錠／ｍＬ）を加えた。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル５を作成した。
【００４８】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１、サンプル４及びサンプル５を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１、サンプル４及びサンプル５を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００４９】
その結果を図５に示す。図５から明かであるように、２種類のプロテアーゼ処理により、サンプル１のレーンで見られた複数のバンドは、サンプル４および５では観察されなかった。また、サンプル４および５ではそれぞれ、サンプル１ではバンドのなかった位置にプロテアーゼに由来するバンド（図５中破線の楕円で囲んだバンド）のみが観察された。従って、２種類のプロテアーゼ処理により、スギタンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図５）。
【００５０】
実施例３ スギ抗原Ｃｒｙｊ−１のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル６（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル６を作成した。
【００５１】
（２）サンプル７（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル７を作成した。
【００５２】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル６およびサンプル７を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル６およびサンプル７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００５３】
その結果を図６に示す。図６から明かであるように、プロテアーゼ処理により、サンプル６で２本観察されていたバンドがサンプル７では消失し、プロテアーゼに由来するバンド（図６中破線楕円により囲まれるバンド）のみが観察された。従って、プロテアーゼ処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図６）
実施例４ スギ抗原Ｃｒｙｊ−２のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル８（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル８を作成した。
【００５４】
（２）サンプル９（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル９を作成した。
【００５５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル８およびサンプル９を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル８およびサンプル９を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００５６】
その結果を図７に示す。図７から明かであるように、サンプル８で見られたバンドはプロテアーゼ処理によって消失し、それに変わってサンプル９ではプロテアーゼに由来するバンド（図７中破線楕円で囲んだバンド）のみが観察された（図７）従って、プロテアーゼ処理によりスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が分解されたことが分かった（図７）。
【００５７】
２−２．電気泳動とウエスタンブロットによる解析
以下に、上述の実施例１から４で処理したのと同様にアレルゲンを処理した後で、電気泳動どウエスタンブロットとを組み合わせた方法によりアレルゲンの不活化を測定した結果を示す。
【００５８】
上述したようにアレルゲンはタンパク質である。従って、タンパク質を分解および／または変性させることによりアレルゲンとしての能力を失わせることが可能である。これを生化学の知識で理解できる効果的なアレルゲン不活性方法を本出願人は特願２００１−３８４７６２で報告してる。
【００５９】
上記の報告では、アレルゲンの測定を簡易測定法（即ち、ドットブロットやダニスキャン（登録商標）を利用した方法）により行っていた。そのため、アレルゲンの不活性化状況が詳細には分からなかった。１つの原因物質、例えば、ダニや花粉などに含まれるアレルゲンは、詳しくは何種類ものグループに分類されるアレルゲンが存在するものである。従って、それらの個別のアレルゲンに関して不活性化が可能であることを確認することは大切である。
【００６０】
特願２００２−１０６８３４において、本発明者らは、そのような個別のアレルゲンについてその活性を測定できる方法を開示している。これはタンパク質電気泳動とウエスタンブロットとを組み合わせた方法である。この方法は、タンパク質電気泳動により、エピトープとなるアレルゲンを分離する。その結果から、タンパク質の存在有無や検出されるバンド濃淡を指標に、アレルゲンに含まれるタンパク質の分解および／または変性が生じたか否かを判定できる。さらに詳細な分析として、抗原抗体反応を利用したウエスタンブロットを行うことにより、、そこに存在する物質がアレルゲン性を有するか否かを判定する。以下、そのような方法により、本発明の方法に従って処理したアレルゲンが不活性化されていることを説明する。
【００６１】
実施例５ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００６２】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理１）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２を作成した。
【００６３】
（３）サンプル３（スギ抽出物熱処理２）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、６５℃で１２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル３を作成した。
【００６４】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１〜３を先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１からサンプル３を夫々１５μＬずつ添加し、電気泳動を行った。
【００６５】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュール（ＸｃｅｌｌＩＩＴＭ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ）を製造者の処方箋に従って使用した。
【００６６】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体（コスモバイオ社製、ウサギ全血清）を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ、登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標、アマシャムファルマシア社製）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００６７】
その結果を図８に示す。図８から明かであるように、サンプル１で観察されていたバンドは、サンプル２および３では消失し、その変わりに前記バンドの上方に広範囲に亘るバンドが観察された。このバンドはスギタンパク質が変性した結果生じたものであると考えられる。従って、その結果から加熱によりＣｊ−１アレルゲンの不活性化が生じると示唆された（図８）。
【００６８】
実施例６ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００６９】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００７０】
（３）サンプル５（スギ抽出物パパイン処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２７．０μＬのスギ原液と３μＬ（０．２ｇ／ｍＬ）の食品用精製パパイン（ナガセケムテックス社製、以下、パパインと記す）を加え、４０℃で１５分間加熱した。その後、そこに、３μＬのインヒビターカクテル液を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル５を作成した。
【００７１】
（４）電気泳動
上記の（１）から（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１、サンプル４及びサンプル５を先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１、サンプル４及びサンプル５を夫々１５μＬずつ添加した。
【００７２】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００７３】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００７４】
その結果を図９に示す。図９から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドは、サンプル４および５では消失していた。従って、プロテアーゼによりＣｊ−１アレルゲンは不活性化されることが示唆された（図９）。
【００７５】
実施例７ スギ抽出物の熱による不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００７６】
（２）サンプル２（スギ抽出物熱処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル２を作成した。
【００７７】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１および２を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１およびサンプル２を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【００７８】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００７９】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００８０】
その結果を図１０に示す。図１０から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドはサンプル２では消失していた。従って、加熱処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１０）。
【００８１】
実施例８ スギ抽出物のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル１（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対してインビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１を作成した。
【００８２】
（２）サンプル４（スギ抽出物ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのスギ原液と２μＬ（０．２ユニット）のｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕｐａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル４を作成した。
【００８３】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１およびサンプル４を先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１およびサンプル４を夫々１５μＬずつ添加した。
【００８４】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００８５】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００８６】
その結果を図１１に示す。図１１から明かであるように、サンプル１で観察されたバンドはサンプル４では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１１）。
【００８７】
実施例９ スギ抗原Ｃｒｙｊ−１のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル６（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル６を作成した。
【００８８】
（２）サンプル７（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−１液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。更にそれに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル７を作成した。
【００８９】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル６およびサンプル７を、先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル６およびサンプル７を夫々１５μＬずつ添加した。
【００９０】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００９１】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００９２】
その結果を図１２に示す。図１２から明かであるように、サンプル６で観察されたバンドはサンプル７では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１２）。
【００９３】
実施例１０ スギ抗原Ｃｒｙｊ−２のプロテアーゼによる不活化
（１）サンプル８（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬの水を加え、更に、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル８を作成した。
【００９４】
（２）サンプル９（スギ抗原ｐｆｕ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、２２．５μＬのＣｊ−２液と２μＬのｐｆｕを加え、８０℃で２０分間加熱した。その後、そこに、０．５μＬのＰＭＳＦ液を加えた（ＰＭＳＦの終濃度は４ｍＭである）。インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル９を作成した。
【００９５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル８およびサンプル９を、先ず、電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル８およびサンプル９を夫々１５μＬずつ添加した。
【００９６】
（４）ウエスタンブロット
上記（３）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【００９７】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−２抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【００９８】
その結果を図１３に示す。図１３から明かであるように、サンプル８で観察されたバンドはサンプル９では消失していた。従って、プロテアーゼ処理によってＣｊ−２アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図１３）。
【００９９】
２−３．花粉アレルゲン不活性部を具備する空調機の例
実施例１１
図１を参照しながら実施例１１を説明する。図中の符番１１は、アレルゲンをトラップする不織布フィルターを示す。この不織布フィルター１１の下面には、花粉粒子（２０〜３０μｍ）やダニ（特にダニの糞、１０〜４０μｍ）の径より小さいメッシュを有したステンレス製の繊維状面発熱体１２が配置されている。このステンレス製の線維状面発熱体（商品名：ソフテレック、帝人社製）１２の下部には、前記面発熱体１２を加熱する電熱ヒータ１３が配置されている。
【０１００】
このように実施例９に係るアレルゲン不活性フィルター１４は、アレルゲンをトラップする不織布フィルター１１と、この不織布フィルター１１の下面に配置された、花粉粒子やダニの径より小さいメッシュを有したステンレス製面発熱体１２と、この繊維状面発熱体１２の下部に配置された、該面発熱体１２を加熱する電熱ヒータ１３とを具備した構成となっている。
【０１０１】
こうしたアレルゲン不活性フィルター１４は、後述する空調機（図１４参照）の所定の位置にエアコン搭載可能な大きさ（例えば、５ｃｍ×１０ｃｍ）で取り付けられて使用される。空調機の空気取り込み口にアレルゲン不活性フィルター１４を取り付ける際は、不織布フィルター１１をアレルゲン含有空気（矢印Ａ）の入口側に配置する。そして、空調機がＯＦＦの時、フィルター１４の電熱ヒータ１３をＯＮにして面発熱体１２の加熱温度を例えば約７０℃で発熱される。
【０１０２】
これにより、アレルゲン含有空気は不織布フィルター１１を通過するが、高温状態に保持された面発熱体１２で花粉粒子やダニが捕獲され、ここでアレルゲンタンパク質の変性が行われ、アレルゲンとしての活性は失われ、ステンレス面発熱体１２からはアレルゲン軽減空気（矢印Ｂ）が通過する。
【０１０３】
従って、実施例１１のアレルゲン不活性フィルター１４によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので、薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、前記発熱体を所定の温度で加熱するだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０４】
実施例１２
図２を参照する。実施例１２に係るアレルゲン不活性フィルター２１は、不織布フィルター２２に、強酸性陽イオン交換樹脂（図示せず）を保持させた構成となっている。ここで、強酸性陽イオン交換樹脂は、Ｒ−ＳＯ３・Ｈ（但し、Ｒは高分子基体を示す）であり、酸を使って再生が可能である。この強酸性陽イオン交換樹脂は、使用前に活性化しておく。
【０１０５】
実施例１２によれば、アレルゲン含有空気Ａが不織布フィルター２２を通過するだけで該不織布フィルター２２に保持された強酸性陽イオン交換樹脂によりアレルゲンタンパク質はそのｐＨの影響で変性し、アレルゲンとしての活性を失う。従って、不織布フィルター２２からはアレルゲン軽減空気Ｂが排気される。従って、実施例１２のアレルゲン不活性フィルター２１によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、強酸性陽イオン交換樹脂を保持させた不織布フィルター２２にアレルゲン含有空気Ａを通すだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０６】
なお、実施例１２では、強酸性陽イオン交換樹脂を使用する場合について述べたが、これに限らず、上記化合物１に示す強塩基性陰イオン交換樹脂を使用してもよい。但し、この場合も、強塩基性陰イオン交換樹脂は使用前に活性化しておくことが好ましい。
【０１０７】
実施例１３
図３を参照して実施例１３を説明する。図中の符番３１は吸水性ポリマー３２が移動しない大きさで且つ花粉粒子やダニを通すメッシュ（＞５０μｍ）を有した樹脂製の第１の支持体を示す。この第１の支持体３１の下側には吸水性ポリマー３４が移動しない大きさで且つ花粉粒子やダニを通さないメッシュ（＞５０μｍ）を有した樹脂製の第２の支持体３３が配置されている。前記第１の支持体３１と第２の支持体３３の間には、吸水性ポリマー３２からなる吸水性ポリマー層３４が挟まれて配置されている。ここで、吸水性ポリマー３２は、例えば、５０万ユニット／フィルターのプロテアーゼを含んでいる。前記吸水ポリマー層３４は、例えば、プロテアーゼを含む酸素溶液にポリマーを含浸させることにより形成することができる。
【０１０８】
実施例１３に係るアレルゲン不活性フィルター３５は、樹脂製の第１の支持体３１と第２の支持体３３の間に吸水性ポリマー層３４を挟んだ構造を有する。それにより、アレルゲン含有空気Ａが吸水性ポリマー層３４を通過するだけで、タンパク質を分解する酵素によってアレルゲンが分解される。従って、実施例１３のアレルゲン不活性フィルター３５によれば、従来のように害虫駆除用の薬品を用いることがないので薬品自体の人体への影響を回避できるとともに、吸水性ポリマー層３４にアレルゲン含有空気Ａを通すだけで自動的にアレルゲン量を軽減することができる。
【０１０９】
実施例１４
図１４は、実施例１１から１３に係るアレルゲン不活性フィルターをエアコンの空気取り込み口に取り付けた例を示す。図１４において、符番４２はエアコン用冷却ユニットを示し、符番４３は筐体を示す。この筐体４３の内側には、ファン４４などが配置されている。ここで、前記アレルゲン不活性フィルター１４は、該フィルター１４の主要な構成である不織布フィルター２１が空気アレルゲン含有空気の入口に位置するよう配置される。
【０１１０】
このように実施例１４に係る空調機は、エアコンの空気取り込み口にアレルゲン不活性フィルター１４を配置した構成になっている。そのため、空調機がＯＦＦの時、フィルター１４の電熱ヒータ１３をＯＮにして面発熱体１２を発熱させることにより、高温状態に保持された面発熱体１２で花粉粒子やダニが捕獲され、ここでアレルゲンタンパク質の変性が起こり、アレルゲンとしての活性が失われる。ステンレス面発熱体１２からはアレルゲン軽減空気が通過する。なお、前記電熱ヒータ１３には空調機の電源を利用する。
【０１１１】
エアコン、空気清浄機などの空調機に、本発明のアレルゲン分解機能を付加することで住環境の著しい改善が図れる。
【０１１２】
２−４．酸およびアルカリの効果
実施例１５ スギ抽出物の酸による不活化
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１１３】
（２）サンプル１１（スギ抽出物ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１１４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１１を作成した。
【０１１５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０および１１を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０およびサンプル１１を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１１６】
その結果を図１５に示す。図１５から明かであるように、サンプル１０で観察されたスギ花粉アレルゲンに由来するバンドはサンプル１１では消失していた。従って、酸処理によってスギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１５）。
【０１１７】
実施例１６ スギ抗原Ｃｒｊ−１の酸による不活化
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１１８】
（２）サンプル１３（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１１９】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１３を作成した。
【０１２０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２および１３を電気泳動で解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２およびサンプル１３を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１２１】
その結果を図１６に示す。図１６から明かであるように、サンプル１２で観察されたスギ抗原Ｃｊ−１に由来するバンドはサンプル１３では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１６）。
【０１２２】
実施例１７ スギ抗原Ｃｒｊ−２の酸による不活化
（１）サンプル１４（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１４を作成した。
【０１２３】
（２）サンプル１５（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１２４】
更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１５を作成した。
【０１２５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１４および１５を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１４およびサンプル１５を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１２６】
その結果を図１７に示す。図１７から明かであるように、サンプル１４で観察されたスギ抗原Ｃｊ−２に由来するバンドはサンプル１５では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１７）。
【０１２７】
実施例１８ スギ抽出物のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１２８】
（２）サンプル１６（スギ抽出物ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１２９】
更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１６とした。
【０１３０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０および１６を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０およびサンプル１６を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１３１】
その結果を図１８に示す。図１８から明かであるように、サンプル１０で観察されたスギ花粉アレルゲンに由来するバンドはサンプル１６では消失していた。従って、アルカリ処理によってスギ由来のタンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１８）。
【０１３２】
実施例１９ スギ抗原Ｃｒｊ−１のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１３３】
（２）サンプル１７（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１３４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１７を作成した。
【０１３５】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２および１７を電気泳動で解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２およびサンプル１７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１３６】
その結果を図１９に示す。図１９から明かであるように、サンプル１２で観察されたスギ抗原Ｃｊ−１に由来するバンドはサンプル１７では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−１タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図１９）。
【０１３７】
実施例２０ スギ抗原Ｃｒｊ−２のアルカリによる不活性化
（１）サンプル１４（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１４を作成した。
【０１３８】
（２）サンプル１８（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−２液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１３９】
更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１８を作成した。
【０１４０】
（３）電気泳動
上記の（１）および（２）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１４および１８を電気泳動により解析した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１４およびサンプル１８を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１４１】
その結果を図２０に示す。図２０から明かであるように、サンプル１４で観察されたスギ抗原Ｃｊ−２に由来するバンドはサンプル１８では消失していた。従って、酸処理によってスギ抗原Ｃｊ−２タンパク質の大部分が変性されたことが明かとなった（図２０）。
【０１４２】
実施例２１ 酸およびアルカリのアレルゲン不活性化についての電気泳動とウエスタンブロットによる解析（１）
（１）サンプル１０（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と２０μＬの水を加えた。更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１０とした。
【０１４３】
（２）サンプル１１（スギ抽出物ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１４４】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１１を作成した。
【０１４５】
（３）サンプル１６（スギ抽出物ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのスギ原液と１０μＬの５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１４６】
更にそれに対して、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファー（ＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤（ＮｕＰａｇｅＴＭｓａｍｐｌｅ ａｎｔｉ ｏｘｉｄａｎｔ）を、製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１６とした。
【０１４７】
（４）電気泳動
上記の（１）、（２）および（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１０、１１および１６を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１０、１１およびサンプル１６を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１４８】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【０１４９】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【０１５０】
その結果を図２１に示す。図２１から明かであるように、サンプル１０で観察されたバンドはサンプル１１および１６では消失していた。従って、酸およびアルカリ処理の何れの処理によってもＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図２１）。
【０１５１】
実施例２２ 酸およびアルカリのアレルゲン不活性化についての電気泳動とウエスタンブロットによる解析（２）
（１）サンプル１２（コントロール）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と２０μＬの水を加えた。更に、そこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１２を作成した。
【０１５２】
（２）サンプル１３（スギ抗原ＨＣｌ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ塩酸を加え、６０℃で６０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１５３】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１３を作成した。
【０１５４】
（３）サンプル１７（スギ抗原ＮａＯＨ処理）
１．５ｍＬのディスポーザブルチューブに、１０μＬのＣｊ−１液と１０μＬの５Ｎ水酸化ナトリウムを加え、４０℃で１０分間のインキュベーションを行った。このインキュベーションは、１０μＬの５Ｎ塩酸を加えて反応溶液を中和することにより終了した。
【０１５５】
更にそこに対して、インビトロジェン社のＮｕＰａｇｅＴＭＬＤＳサンプルバッファーと、同社のＮｕＰａｇｅＴＭサンプル還元剤、更に同社ＮｕＰａｇｅＴＭサンプル抗酸化剤を製造者の処方箋に従って適宜添加して、電気泳動用のサンプル１７を作成した。
【０１５６】
（４）電気泳動
上記の（１）、（２）および（３）の方法により作成した電気泳動用のサンプル１２、１３および１７を、先ず電気泳動に供した。電気泳動用緩衝液として、ビス−トリスゲル用のＮｕＰａｇｅＴＭＭＯＰＳバッファーキットを用いて、各レーンに対して上記で作成したサンプル１２、１３およびサンプル１７を夫々１５μＬずつ添加した。電気泳動の後に、インビトロジェン社製のシンプリィ ブルー セイフステイン（登録商標）を用いてタンパク質の染色を行った。その後、製造者の処方箋に従って脱色を行った。
【０１５７】
（５）ウエスタンブロット
上記（４）の電気泳動を行った後、予め前処理を行ったＰＶＤＦ膜に、タンパク質を電気的に転写した。なお、ＰＶＤＦ膜の前処理および転写は、インビトロジェン社製のＸｃｅｌｌＩＩＴＭ ブロット モジュールを製造者の処方箋に従って使用した。
【０１５８】
本実施例におけるウエスタンブロットでのアレルゲン検出には、１次抗体としてＣｊ−１抗体を５０００倍に希釈して使用した。また、２次抗体、ブロッキングおよび検出試薬として、インビトロジェン社製のウェスタンブリーズ ケミルミネッセント ディテクション システム、抗ウサギ（登録商標）を製造者の処方箋に従って使用した。上記の処理を行ったＰＶＤＦ膜に発光試薬を加え、どこでもカメラ ＥＣＬミニカメラ（登録商標）を用いて、ポラロイドフィルムで撮影し、タンパク質を検出した。
【０１５９】
その結果を図２２に示す。図２２から明かであるように、サンプル１２で観察されたバンドはサンプル１３および１７では消失していた。従って、酸およびアルカリ処理の何れの処理によってもＣｊ−１アレルゲンが不活性化されることが示唆された（図２１）。
【０１６０】
【発明の効果】
本発明に従うと、アレルゲンを特異的に排除する方法が提供される。
【０１６１】
また、既に先の報告で、本発明者らは、ダニアレルゲンの不活性化方法（特願２００１−３８４７６２を参照されたい）および同アレルゲンの測定方法（特願２００２−１０６８３４を参照されたい）を報告している。本報告は、アレルギーの原因物質である生物由来のアレルゲンが、その種を問わずに不活性化できること、並びに活性を測定できることを報告するものでもある。また特に、特願２００１−２２４９２８号で開示する技術と合わせることにより、住環境の大幅な改善が期待できる装置が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図２】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図３】本発明に従うアレルゲン不活性フィルターの例を示す図。
【図４】電気泳動の結果を示す模式図。
【図５】電気泳動の結果を示す模式図。
【図６】電気泳動の結果を示す模式図。
【図７】電気泳動の結果を示す模式図。
【図８】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図９】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１０】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１１】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１２】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１３】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図１４】図１のアレルゲン不活性フィルターを空気の入口側に取り付けた本発明に係る空調機を示す図。
【図１５】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１６】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１７】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１８】電気泳動の結果を示す模式図。
【図１９】電気泳動の結果を示す模式図。
【図２０】電気泳動の結果を示す模式図。
【図２１】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【図２２】ウエスタンブロットの結果を示す模式図。
【符号の説明】
１．ちり採取器 ２．サンプル添加部 ３．バンド １１．不織布フィルター １２．繊維状面発熱体 １３．電熱ヒータ １４．アレルゲン不活性フィルター ２１、２２．不織布フィルター ３１．第１の支持体 ３２．吸水性ポリマー ３３．第２の支持体 ３４．吸水性ポリマー層 ３５．アレルゲン不活性フィルター ４２．エアコン用冷却ユニット ４３．筐体 ４４．ファン
Claims (3)
- 熱、アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法。
- アルカリ、酸およびプロテアーゼからなる群より選択される１と熱の存在する条件下に花粉アレルゲンを維持することにより、前記花粉アレルゲンを不活性化する方法。
- 請求項１または２の何れか１項に記載の花粉アレルゲンを不活化する方法を行うための花粉アレルゲン不活性部を具備する空調機。
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| JP2002314424A JP2004089673A (ja) | 2002-07-08 | 2002-10-29 | 花粉アレルゲンの不活性化方法 |
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Cited By (4)
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-
2002
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| WO2021235176A1 (ja) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 学校法人麻布獣医学園 | アレルゲン不活化剤の評価方法及びアレルゲン不活化剤の評価キット |
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