ES2579385B1 - Cultivos celulares de algodón y su uso en fotoprotección - Google Patents

Abstract

Cultivos celulares de algodón y su uso en fotoprotección.#La invención se refiere a un cultivo de células en suspensión de algodón (Gossypium) que es útil como agente fotoprotector de la piel y para la preparación de medicamentos. La invención también describe el procedimiento de obtención de este cultivo celular y composiciones cosméticas y farmacéuticas que lo comprenden.

Description

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DESCRIPCION

Cultivos celulares de algodon y su uso en fotoproteccion.

La invention se refiere a cultivos celulares de algodon (Gossypium). Tambien se refiere a metodos especialmente disenados para su obtencion y a usos medicos y cosmeticos de estos cultivos.

ESTADO DE LA TECNICA

Es altamente conocido que la piel supone la primera barrera de protection frente a agentes externos en la mayorla de animales. Tambien es sabido que la piel debe a su vez protegerse de agentes externos con la finalidad de no comprometer su integridad y as! no comprometer sus distintas funciones. Uno de estos agentes externos es precisamente la radiation solar (espectro ultravioleta, visible e infrarrojo), o cualquier tipo de radiacion electromagnetica que deba aplicarse por otras finalidades; por ejemplo, radiacion ultravioleta UV para conseguir un bronceado de manera controlada o radiacion infrarroja IR en caso de tratamientos por fisioterapia.

La fotoproteccion de la piel mediante filtros solares o productos topicos de uso diario se ha centrado basicamente en la prevention del dano agudo, como quemaduras, o cronico de la piel, como el cancer o el fotoenvejecimiento, causados por la exposition a la radiacion UV, basicamente UVA y UVB.

La radiacion UVB (280-315 nm) es responsable de la mayorla de quemaduras aunque la radiacion UVA (315-400 nm) tambien causa eritemas en menor extension. Ambos tipos de radiaciones alteran el sistema inmune. La radiacion UVB queda parcialmente filtrada por la capa de ozono, pero penetra en las capas superficiales de la piel hasta la capa basal de la epidermis. Es la causante de la generation de especies de oxlgeno reactivas (ROS), promoviendo la inflamacion y el envejecimiento. La radiacion UVB puede ademas ser absorbida por el ADN celular y causar lesiones mutagenicas. Por otro lado, la radiacion UVA, menos energetica que UVB pero en mayor proportion en el espectro de radiacion solar (esta ultima, la radiacion solar de 200 nm a 1 mm de longitud de onda) penetra mas que la radiacion UVB (UVA llega a niveles basales de la dermis); y es conocido que al generar ROS puede alterar tambien el ADN,

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protelnas, y ilpidos de la piel, lo que conlleva un envejecimiento de la misma y la formation de arrugas, e indirectamente incrementa el riesgo de sufrir cancer.

En los ultimos anos ha podido constatarse que otras longitudes de onda de la radiation solar, mas alla de las UV, en concreto el espectro de luz visible (alrededor del 40 % del espectro de radiacion solar) y la radiacion IR (mas del 50 % aproximadamente del espectro de radiacion solar) tambien causan dano en la piel y producen fotoenvejecimiento.

Segun se desprende de la referencia Dupont et al. "Review Article Beyond UV radiation: A skin under challenge”, International Journal of Cosmetic Science-2013, vol. No.: 35, pp.:224-232, la luz visible (de 400 a 700 nm) penetra profundamente en la dermis y un 20 % alcanza la hipodermis (Ver por ejemplo Figura 6 de esta referencia).

Tambien del documento anterior se desprende que de entre los distintos tipos de radiacion IR (IRA, IRB, IRC), la radiacion IRA (30 % del espectro IR), alcanza en un 65 % la dermis y en un 10 % la hipodermis. IRA puede inducir un desequilibrio en la expresion genica de la metaloproteinasa 1 de la matriz extracelular (MMP-1), alterando la expresion y funcionalidad del colageno. Con ello, IRA tambien esta involucrada en el fotoenvejecimiento y puede promover la carcinogenesis. Se postula que la radiacion IRA puede interaccionar con elementos de la cadena de transporte electronico en las mitocondrias y de este modo producir un desequilibrio favoreciendo la aparicion de ROS.

Si bien se conocen muchos compuestos y composiciones para el filtro de la radiacion UV, pocas son las composiciones que tambien incluyen activos que puedan prevenir el dano que pueda causar la radiacion IR o incluso la visible. Sin embargo, existen referencias que indican el efecto de ciertos antioxidantes topicos como agentes fotoprotectores de la radiacion IRA. Un ejemplo de ello lo encontramos descrito por Grether-Beck et al., "Review Article Photoprotection of human skin beyond ultraviolet radiation”, Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine -2014, doi:10.1111/phpp. 12111. Grether-Beck et al. indican que una combination de vitamina C, acido ferulico y tocoferol llegaron a inhibir la expresion del ARN mensajero de la MMP-1 (metaloproteinasa de la matriz extracelular 1) inducida por la IRA en fibroblastos y en piel humana. El documento tambien comenta la necesidad de

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localizar antioxidantes o compuestos que sean capaces de filtrar tanto la radiacion UV como la IR.

Con la finalidad de proporcionar filtros solares lo mas naturales posibles, efectivos y que comprendan solo mlnimas cantidades de activos sinteticos, se han desarrollado distintos extractos de plantas que han demostrado ser capaces de prevenir el dano de radiacion UV. Un ejemplo de ello se desprende del documento Mishra et al., "Review Article. Herbal Cosmeceuticals for Photoprotection from Ultraviolet B Radiation: A review”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research-2011, vol. No. 10(3), pp.: 351360. Este documento lista extractos de plantas y componentes aislados de las mismas con capacidad de eliminar o prevenir los efectos de los radicales libres causados por la radiacion UV en particular. De entre estas plantas se listan el tomate (Solanum lycopersicum), el ajo (Allium sativum), el Aloe vera, el azafran (Crocus sativus) o la verdolaga (Portulaca oleracea), entre otras.

Se desprende de todo ello que a fecha de hoy son todavla necesarias nuevas composiciones para prevenir y/o tratar los efectos de la radiacion solar, y en particular de sus distintos componentes, en especial la radiacion UV y algunos componentes del espectro IR e incluso la luz visible.

EXPLICACION DE LA INVENCION

Los inventores proponen un cultivo de celulas en suspension de algodon (genero Gossypium) que, sorprendentemente, actua como filtro de la radiacion solar, y en particular y muy eficazmente de la radiacion IR. Ademas, el cultivo tambien es altamente efectivo frente la radiacion UV. Segun se detallara en los ejemplos, el cultivo es un potente inhibidor de la expresion de la MMP-1, evitando asl la degradation del colageno y manteniendo la integridad de la piel. Su efecto es comparable al de la quercetina (un flavonol empleado en composiciones cosmeticas como filtro de radiacion) incluso a dosis mas bajas. El algodon es una planta que crece en distintas partes del planeta. Algunas de sus especies se caracterizan, entre otras capacidades, por crecer en zonas aridas. Los inventores han desarrollado un cultivo celular reproducible que, sorprendentemente, es capaz de prevenir los efectos nocivos de la radiacion solar con alta efectividad respecto de otros compuestos.

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Asl, en un primer aspecto la invention se refiere a un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, caracterizado porque comprende:

- polifenoles a una concentration de 250 a 500 miligramos por litro de cultivo;

- fitoesteroles a una concentracion de 30 a 60 miligramos por litro de cultivo;

- una mezcla de azucares que comprende a su vez glucosa, fructosa, sacarosa, furanosa, arabitol y mioinositol

- llpidos; y

- protelnas.

La composition del cultivo, comprendiendo las cantidades de polifenoles y fitoesteroles, asl como la presencia de llpidos, azucares y protelnas supone una combination sinergica, de tal modo que es la suma de sus componentes y sus proporciones la que da lugar al efecto ventajoso en cuanto a la prevention de los efectos daninos de la radiation. Ademas el cultivo supone la ventaja de evitarse la metodologla de obtencion de activos via extractos tradicionales de plantas y aporta muchos mas componentes activos que estos extractos.

En el sentido de la invencion debe entenderse por "cultivo de celulas en suspension de algodon o del genero Gossypium” a aquel grupo de celulas desdiferenciadas dispersadas o en suspension en un medio llquido. La suspension celular puede comprender celulas en varios estadios de agregacion. Los cultivos de celulas en suspension, tambien denominados cultivos o suspensiones celulares se inician generalmente a partir de callos friables (disgregables) en un medio de cultivo llquido y en agitation. Se introduce el callo en un recipiente (matraz) con medio de cultivo llquido y se coloca en agitacion varios dlas a 25 °C hasta obtener celulas libres. Seguidamente la suspension se filtra (250 pm) y se anade a otro recipiente con medio de cultivo nuevo y se continua la agitacion. Por callo debe entenderse aquella masa de celulas desdiferenciadas, amorfa que se multiplica de manera desorganizada. Los callos suelen inducirse in vitro a partir de organos vegetales (generalmente tambien establecidos in vitro) a medios de cultivo adecuados que comprenden distintos reguladores del crecimiento vegetales.

El empleo de cultivos de celulas en suspension de plantas conlleva la ventaja de disponer de factorlas de compuestos de interes de una manera controlada y reproducible una vez puesto a punto el sistema, que no es una tarea rutinaria. Asl,

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celulas aisladas de plantas se someten a desdiferenciacion para obtener celulas totipotentes. Estas celulas totipotentes (tambien conocidas como celulas madre vegetales) pueden diferenciarse luego en el tejido de interes bajo la correcta estimulacion, o bien llevarse a un estadio de production de compuestos de interes. Los cultivos en suspension se emplean generalmente para la produccion de metabolitos secundarios de la planta en cuestion y de especial interes en cosmetica o en farmacia.

En una realization particular del cultivo, los polifenoles estan en una concentration en peso de 200 a 400 mg/l de cultivo.

Entre los polifenoles presentes en el cultivo de celulas en suspension de la invention se encuentran aquellos presentes en el algodon, tal como fenoles y flavonoides seleccionados de acido galico, catequinas, acido gentlsico, acido cafeico, acido ferulico, acido cumarico, acido salicllico, acido cinamico, gosipetina, gosipetina glicosilada, glicosidos de kaempferol, glicosidos de herbacitina y mezclas de ellos. Sin quedar ligados a ninguna teorla, los inventores proponen que el cultivo comprende la cantidad total de polifenoles y dentro de este total una composicion particular de ellos que, junto con el resto de componentes, confieren las propiedades frente la radiation solar y en particular frente la radiacion IR.

Asimismo, entre los fitoesteroles presentes en el cultivo de celulas en suspension de algodon se encuentran, de manera particular, el lanosterol, el estigmaesterol y el p- sitoesterol.

En otra realizacion particular, el cultivo esta caracterizado porque la planta del genero Gossypium se selecciona del grupo constituido por Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium tomentosum, y mezclas de los mismos. En una realizacion todavla mas particular es de Gossypium herbaceum.

La invencion tambien tiene como segundo aspecto un procedimiento de obtencion de un cultivo de celulas de una planta del genero Gossypium en suspension, que comprende las siguientes etapas:

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(a) Cultivar celulas desdiferenciadas de la planta del genero Gossypium en un medio de cultivo de crecimiento que comprende reguladores del crecimiento de plantas, dichos reguladores seleccionados del grupo constituido por las auxinas acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), acido naftalenacetico (NAA) y las citoquininas quinetina, y 6-Benzilaminopurina (BAP) y mezclas de las mismas por un periodo de 5 a 10 dlas;

(b) anadir al cultivo de la etapa (a), de 2 a 4 veces, una composition o combination elicitora, donde esta composicion o combination se selecciona cada vez que se adiciona de:

- una composicion o combinacion que comprende ciclodextrinas, y al menos un compuesto de jasmonato, donde el compuesto de jasmonato se selecciona del grupo constituido por jasmonato de metilo, jasmonato de etilo y jasmonato de propilo; y donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composicion o combinacion elicitora, las ciclodextrinas estan a una concentration final en el cultivo de 18 a 72 g/l de cultivo y el compuesto de jasmonato esta en una concentracion final en el cultivo de 100 pM a 500 pM; y

- una composicion que comprende al menos un compuesto de jasmonato, seleccionado de jasmonato de metilo, jasmonato de etilo y jasmonato de propilo, donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composicion elicitora, el compuesto de jasmonato esta en una concentracion final en el cultivo de 100 pM a 500 pM.

En una realization particular, opcionalmente en combinacion con una o mas realizaciones descritas arriba o a mas abajo, el procedimiento se lleva a cabo a la oscuridad.

Por "medio de cultivo de crecimiento” debe entenderse un medio de cultivo adaptado para el cultivo de celulas en suspension de plantas , de tal forma que puedan realizar todo su ciclo celular y dividirse hasta alcanzar un estadio estacionario, momento cuando tantas celulas mueren como celulas se dividen. Estos medios comprenden los nutrientes y sales minerales para el correcto crecimiento de las celulas, tal como azucares y sales de sodio, potasio o calcio. Ademas, en funcion de lo que se pretenda con las celulas en suspension pueden anadirse reguladores del crecimiento de plantas y vitaminas.

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En otra realization particular, el medio de cultivo de crecimiento de la etapa (a) consiste en un medio de cultivo basal de celulas de plantas seleccionado del grupo formado por medio Murashige y Skoog (MS); LS Linsmaier y Skoog (LS) y Gamborg- B5, donde a dicho medio basal se anaden para complementary reguladores del crecimiento de plantas (tambien conocidos como fitohormonas) y seleccionados del grupo constituido por las auxinas acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), acido naftalenacetico (NAA) y las citoquininas quinetina, y 6-Benzilaminopurina (BAP) y mezclas de las mismas. El experto conoce estos medios basales y dispone de la tecnica para complementarlos con nutrientes y otros componentes de interes, segun cual sea el objetivo del cultivo.

En una realizacion particular, opcionalmente en combinacion con cualquier realizacion descrita mas arriba o abajo, el medio de cultivo es el medio Murashige y Skoog (MS) que ademas comprende los reguladores del crecimiento de plantas seleccionados del grupo constituido por las auxinas acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), acido naftalenacetico (NAA) y las citoquininas quinetina, y 6-Benzilaminopurina (BAP) y mezclas de las mismas.

En otra realizacion particular, tambien opcionalmente en combinacion con una o mas realizaciones descritas arriba o a mas abajo, el medio de cultivo comprende auxinas seleccionadas de aquellas indicadas anteriormente a una concentracion de 1 a 4 mg por litro de cultivo (mg/l) de la etapa (a); y citoquininas seleccionadas de aquellas indicadas anteriormente a una concentration de 0.1 a 3 mg/ litro de cultivo. En otra realization mas particular el medio de cultivo comprende la auxina acido 2,4- diclorofenoxiacetico (2,4-D), y la citoquinina quinetina a una concentration de 0.5 a 4 mg/ litro de cultivo y 0.1 a 3 mg/ litro de cultivo, respectivamente. Todavla en una realization mas particular la auxina acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) esta a una concentration inicial de 0.5 a 2 mg/l cultivo y la citoquinina quinetina a una concentration de 0.1 a 2 mg/l.

En una realization todavla mas particular, el medio de cultivo de la etapa (a) comprende 0.5 mg/ litro de acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) y 0.1 mg/l de quinetina.

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Se entiende ademas que las concentraciones de los integrantes de la composition o combination elicitora de la etapa (b) se refieren a la cantidad que se anade en el cultivo de tal modo que, una vez anadido en funcion del numero de veces, la concentration molar es la indicada o la concentration en peso/volumen es la indicada. Se tratara ademas de una composicion elicitora (estimuladora de slntesis de otros compuestos en la celula de la planta) si ambos componentes se anaden a la vez en una misma matriz (por ejemplo en medio basal), y por combination elicitora si se anaden simultaneamente pero por separado o secuencialmente.

En una realization particular del procedimiento, la concentration del compuesto de jasmonato es de 200 a 450 pM. Mas en particular de 300 a 450 pM. En otra realization todavla mas particular el compuesto de jasmonato esta en una concentration final en el cultivo de 450 pM.

Otra realization particular del procedimiento segun la invention, opcionalmente en combination con las otras realizaciones del procedimiento, comprende adicionar las ciclodextrinas a una concentration en el cultivo de 25 a 50 g/l (gramos por litro de cultivo), mas en particular de 30 a 40 g/l; y todavla mas en particular de 35 a 40 g/l.

En otra realization particular del procedimiento, este esta caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo con tres adiciones de la composicion o combination elicitora.

En otra realization todavla mas particular, el procedimiento esta caracterizado porque la adicion de la composicion o combination elicitora se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente patron de adicion:

(i) anadir una primera dosis de la composicion o combinacion elicitora cuando el cultivo de la etapa (a) ha crecido de 5 a 10 dlas;

(ii) anadir una segunda dosis de 3 a 4 dlas despues de la primera dosis; y

(iii) anadir una tercera dosis de 2 a 3 dlas despues de la segunda dosis.

En otra realization todavla mas particular, la adicion de la composicion o combination elicitora se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente patron de adicion:

(i) anadir una primera dosis de una composicion o combination elicitora que comprende ciclodextrinas y un compuesto de jasmonato, cuando el cultivo de la etapa (a) ha crecido de 5 a 10 dlas;

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(ii) anadir una segunda dosis de una composition que comprende un compuesto de jasmonato, de 3 a 4 dias despues de la primera dosis; y

(iii) anadir una tercera dosis una composition que comprende un compuesto de jasmonato, de 2 a 3 dias despues de la segunda dosis.

En una realization todavia mas particular, la adicion de la composition o combination elicitora se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente patron de adicion:

(i) anadir una primera dosis de una composition o combination elicitora que comprende ciclodextrinas y un compuesto de jasmonato, cuando el cultivo de la etapa (a) ha crecido de 5 a 10 dias, donde al final de la adicion las ciclodextrinas estan a una concentration final en el cultivo de 18 a 72 g/l de cultivo y la concentration de compuesto de jasmonato es de 50 pM;

(ii) anadir una segunda dosis de una composicion que comprende un compuesto de jasmonato, de 3 a 4 dias despues de la primera dosis, donde al final de la adicion la concentration de compuesto de jasmonato es de 50 pM; y

(iii) anadir una tercera dosis una composition que comprende un compuesto de jasmonato, de 2 a 3 dias despues de la segunda dosis, donde al final de la adicion la concentration de compuesto de jasmonato es de 50 pM.

Otra realization particular del procedimiento, opcionalmente en combination con el resto de realizaciones particulares aqu listadas, se caracteriza porque la composition elicitora comprende jasmonato de metilo, preferentemente a una dosis o concentration final de 300 a 450 pM una vez anadido de 2 a 4 veces.

En otra realizacion particular, tambien opcionalmente en combinacion con el resto de realizaciones particulares aqu listadas, la composition elicitora que comprende ciclodextrinas comprende una ciclodextrina seleccionada de a-ciclodextrina, p- ciclodextrina, Y-ciclodextrina o una mezcla de dos o mas de ellas. Las ciclodextrinas tal cual se describen en esta invention incluyen tambien ciclodextrinas modificadas o funcionalizadas con grupos hidroxilo, alquiladas (con C1-C4-alquilos lineales o ramificados, incluyendo -CH3, -CH2-CH3,) o hidroxialquiladas, tal cual se conocen en el estado de la tecnica.

El procedimiento segun la invention esta caracterizado tambien porque ademas comprende la etapa (c) de lisar el cultivo celular obtenido en la etapa (b).

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En una realization particular del procedimiento, la etapa (c) de lisado se lleva a cabo adicionando el cultivo obtenido en la etapa (b) a una solution liquida y homogeneizando la mezcla en un turrax a una velocidad de agitation de 15000 revoluciones por minuto (rpm) a 25000 rpm. En una realization todavia mas particular, la proportion en peso de cultivo en la solution liquida es del 10 al 40 % en peso, mas particularmente del 25 al 40 % en peso medido en gramos de cultivo por gramos de solution liquida. Mas particularmente del 30 al 35 % en peso de cultivo de la etapa (b) en la solution liquida.

En otra realization particular, la solution liquida de la etapa (c) comprende glicerina y, opcionalmente conservantes y aditivos, preferentemente gluconolactonas, benzoatos (como el benzoato sodico) y gluconatos.

En otra realization particular, la etapa (c) de lisado comprende las etapas de:

- congelar y liofilizar el cultivo de la etapa (b);

- adicionar una composition solida que comprende un compuesto seleccionado de maltodextrina, sorbitol, manitol y mezclas de dos o mas de ellos; y

- homogeneizar la mezcla solida.

La invention incluye por tanto tambien un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, caracterizado porque es obtenible por el procedimiento segun se ha descrito en una cualquiera de las variantes anteriores. Concretamente un cultivo en suspension de celulas de una planta del genero Gossypium, preferentemente de la especie Gossypium herbaceum, obtenible mediante las siguientes etapas;

(a) Cultivar celulas desdiferenciadas de la planta del genero Gossypium en un medio de cultivo de crecimiento que comprende reguladores del crecimiento de plantas, dichos reguladores seleccionados del grupo constituido por las auxinas acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), acido naftalenacetico (NAA) y las citoquininas quinetina, y 6-Benzilaminopurina (BAP) y mezclas de las mismas por un periodo de 5 a 10 dias;

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(b) anadir al cultivo de la etapa (a), de 2 a 4 veces, una composition o combination elicitora, donde esta composition o combination se selecciona cada vez que se adiciona de:

- una composition o combination que comprende ciclodextrinas, y al menos un compuesto de jasmonato, donde el compuesto de jasmonato se selecciona del grupo constituido por jasmonato de metilo, jasmonato de etilo y jasmonato de propilo; y donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composition o combination elicitora, las ciclodextrinas estan a una concentration final en el cultivo de 18 a 72 g/l de cultivo y el compuesto de jasmonato esta en una concentration final en el cultivo de 100 pM a 500 pM; y

- una composition que comprende al menos un compuesto de jasmonato, seleccionado de jasmonato de metilo, jasmonato de etilo y jasmonato de propilo, donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composition elicitora, el compuesto de jasmonato esta en una concentration final en el cultivo de 100 pM a 500 pM.

La invention tambien tiene como aspecto un lisado celular de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, caracterizado porque es obtenible por el procedimiento segun se ha descrito antes, comprendiendo la etapa (c) de lisis del cultivo.

El experto reconocera como proceder a la lisis de un cultivo celular, mediante la disgregacion o disruption de las celulas mecanicamente o mediante ultrasonidos. Con la lisis se consigue liberar el contenido del interior de las celulas en el medio, lo que da lugar a una mezcla particular que comprende componentes del citoplasma, de la membrana celular y de la pared celular.

Tanto el cultivo de celulas en suspension de la invention, como un lisado del mismo pueden emplearse en composiciones topicas, cosmeticas o farmaceuticas, como agentes activos para prevenir los efectos nocivos o antiesteticos ocasionados por la radiation solar, y en particular la radiation IR. Tambien se puede usar en forma de composition farmaceutica solida, tal como en capsulas o comprimidos que comprenden el cultivo o su forma lisada con los excipientes solidos farmaceuticamente aceptables.

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Asl, otro aspecto de la invention se refiere a composiciones farmaceuticas o cosmeticas topicas, caracterizadas porque comprenden una cantidad efectiva de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, segun se describe mas arriba, o una cantidad efectiva de un lisado segun se define tambien mas arriba, junto con uno o mas excipientes o vehlculos aceptables farmaceutica o cosmeticamente.

La expresion "cantidad efectiva del cultivo o lisado celular” se refiere a la cantidad de este que proporciona un efecto terapeutico o cosmetico despues de su aplicacion sin producir irritation y a la vez suficientemente baja como para evitar efectos secundarios (a una relation beneficio/riesgo razonable). La cantidad efectiva puede variar con la edad y las condiciones flsicas del usuario final, ya sea para un efecto terapeutico y en funcion de la enfermedad; o bien para un efecto cosmetico.

La expresion "excipientes o vehiculos aceptables farmaceuticamente” se refiere a materiales, composiciones o vehlculos farmaceuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmaceuticamente aceptable en el sentido que debe ser compatible con los otros ingredientes de la composition farmaceutica, a la vez que apto per uso en la piel (u otros tejidos) sin toxicidad excesiva o respuesta alergenica o inmunogenica. El termino "cosmeticamente aceptable” o "dermatologicamente aceptable” se refiere a excipientes o vehlculos adaptados para emplearse en contacto con la piel humana sin excesiva toxicidad, incompatibilidad o alergenicidad.

Es aceptado por la comunidad cientlfica que los mecanismos desencadenados por el efecto de la radiation UV son distintos que los ocasionados por la radiation IR, dada la distinta longitud de onda de las radiaciones. Ello implica que los compuestos que eficientemente permiten filtrar o neutralizar un tipo de radiacion, no tienen por que resultar efectivos con el otro tipo de radiacion electromagnetica. Pero ademas, a ello se suma que la fisiopatologla ocasionada por un tipo de radiacion no es identica a la causada por la otra. Todo ello hace que, de entrada, no sean extrapolables los efectos fotoprotectores de una composicion frente un tipo de radiacion a otro tipo con una longitud de onda distinta y dando lugar a consecuencias en la salud o apariencia estetica distintas.

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En una realization particular, la composition farmaceutica o la composition cosmetica esta caracterizada porque ademas comprende glicerina como vehlculo o excipiente aceptable, independientemente de poder comprender otros excipientes y/o vehlculos. En otra realization particular, la composition comprende conservantes tal como compuestos de gluconolactona y compuestos de benzoato (p.ej. benzoato sodico) y aditivos como el gluconato calcico u otros compuestos gluconatos.

En otra realization particular la concentration de polifenoles en estas composiciones farmaceuticas o cosmeticas es de al menos 50 mg/l de composition, preferentemente de 50 a 100 mg/l.

La invention tambien tiene como aspecto composiciones farmaceuticas o cosmeticas solidas caracterizadas porque comprenden una cantidad efectiva de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, segun se describe mas arriba, o una cantidad efectiva de un lisado segun se define tambien mas arriba, junto con uno o mas excipientes o vehlculos solidos aceptables farmaceutica o cosmeticamente. Ejemplos no limitativos de excipientes o vehlculos solidos se refieren a maltodextrinas, sorbitol y manitol.

La invention tambien se refiere a composiciones nutraceuticas caracterizadas porque comprenden una cantidad efectiva de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, segun se describe mas arriba, o una cantidad efectiva de un lisado segun se define tambien mas arriba, junto con uno o mas excipientes o vehlculos solidos aceptables.

Las composiciones nutraceuticas hacen referencia a todos aquellos
alimentos, por tanto mezclas de varios ingredientes comestibles, que se proclaman como poseedores de un efecto beneficioso sobre la
salud
humana. Del mismo modo, puede decirse que el cultivo o lisado de la invention es como producto per se un agente nutraceutico, puesto que administrado en una composition alimentaria es uno de los activos que ejerce este efecto beneficioso sobre la salud, en particular el efecto de evitar el dano que podrla ser ocasionado por la radiation solar o cualquiera de sus integrantes del espectro, en particular por la radiation IR, tal como se vera en los ejemplos.

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Dados los efectos protectores del cultivo o lisados objetos de la invention, es tambien un aspecto de la misma el uso de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium, o de un lisado celular del mismo segun se define arriba, o de una composition farmaceutica topica que los comprenda, para la preparation de un medicamento para la prevention y/o tratamiento de una enfermedad o condition causada por la exposition a radiation, seleccionada del grupo formado por radiation UV, radiacion IR y una combination de ambas, siendo una combination de ambas, por ejemplo, la radiacion solar.

En una realization particular el medicamento es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion infrarroja.

En otra realizacion particular, opcionalmente en combinacion con cualquier realizacion anterior o posteriores, el uso esta caracterizado porque la enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion se selecciona del grupo constituido por escozor y/o picor de la piel y/o del cuero cabelludo, envejecimiento precoz de la piel, quemaduras cutaneas por radiacion, inflamacion dermica ocasionada por radiacion, dermatitis atopica y cancer cutaneo.

En otra realizacion particular el medicamento es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion UV. En otra realizacion particular, el medicamento es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion IR.

La invencion tambien tiene por objeto el uso de un cultivo de celulas en suspension de una planta del genero Gossypium o de un lisado celular segun se define arriba, o de una composicion cosmetica topica segun se define arriba, como agente fotoprotector de la piel y/o del cuero cabelludo. La fotoproteccion de la piel comprende la mejora o prevencion de al menos uno de estos slntomas en la piel: arrugas, picor, sequedad, eritema, manchas y envejecimiento. Por agente fotoprotector se entiende que es una entidad que posee la capacidad de proteger la piel y/o cuero cabelludo de los afectos adversos (patologicos o esteticos) que van asociados a la radiacion, ya sea solar con todo su espectro o bien relativa a cada una de las radiaciones por separado (UV, IR, visible).

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El efecto cosmetico del cultivo, lisado o composiciones que los comprenden se refiere a la protection de la piel cuando esta no puede considerarse que esta enferma (o tenga alguna patologla), sino mas bien que se desea preservar o mejorar su apariencia externa sin que por ello haya habido ningun dano o patologla. Son efectos cosmeticos derivados de la fotoproteccion del cultivo celular, lisado o cualquier composition que los comprenda, el efecto reconfortante (tambien conocido como calmante), el efecto regenerador antiarrugas, la prevention de arrugas, la prevention o mejora de eritemas y/o eczemas, la fotoregeneracion dermica y epidermica, la fotoreparacion, y el efecto antioxidante en el sentido que se previene o se amortigua la aparicion de radicales libres (ROS) que empeoran el aspecto de la piel y/o cuero cabelludo. El efecto cosmetico sera una combination de los mencionados anteriormente en funcion de cual sea el estado de la piel y/o cuero cabelludo conde se aplique.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Ademas, la palabra “comprende” incluye el caso “consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion. Ademas, la presente invencion cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aqul indicadas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 se corresponde con la production de MMP-1 (pg/ml) en un cultivo de fibroblastos dermicos humanos (HDF) despues de la exposition a radiation IR a una intensidad de 150 J/cm2 (columna del medio) y de 300 J/cm2 (columna de la derecha en cada tipo de muestra ensayada), o bien sin exponerlos a radiacion (columna de la izquierda en cada tipo de muestra ensayada). La lampara utilizada fue el modelo IR Philips BR125 Infrared lamp hard glass Red (250 W, 230 V). Las muestras se correspondlan con cultivos de fibroblastos no tratados (NT), tratados con Quercetina (Qu) 25 pM, con acido ascorbico (Asc) a 10 pM, o bien con distintas concentraciones de un lisado de un cultivo de celulas en suspension de algodon de Arabia (Cott) a 23 pg/ml (masa de celulas lisadas en volumen de glicerina), 45.6 pg/ml y 91 pg/ml. La

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cantidad de MMP-1 en pg/ml se midio de acuerdo con un ensayo ELISA especlfico.

La FIG. 2 muestra el resultado del mismo ensayo que en la FIG. 1 pero se expresa la cantidad de MMP-1 detectada en cada tipo de muestra en porcentaje (%). El % se calcula considerando como el 100 % el de fibroblastos no tratados (NT) y no expuestos a radiacion (primera columna izquierda de NT). Las abreviaciones significan lo mismo que en la FIG. 1. La columna del medio de cada muestra se corresponde con la irradiacion IR a 150 J/cm2 (columna del medio), mientras que la columna de la derecha en cada tipo de muestra ensayada a una intensidad de 300 J/cm2 (columna de la derecha).

La FIG. 3 se corresponde con otro ensayo en un cultivo de fibroblastos dermicos humanos (HDF). Se compara el Indice MFI (intensidad de fluorescencia media) en los fibroblastos antes (columna izquierda en cada muestra) y despues de la irradiacion con IR a 200 J/cm2 (columna derecha en cada muestra). En el eje de las abscisas se muestran las distintas concentraciones y productos testados en los cultivos. NT, significa no tratados; Qu (con quercetina); Asc con Acido ascorbico (a 10 y 50 pM) y Cott con el cultivo de celulas en suspension de algodon (23 pg/ml de lisado en glicerina, 45.6 pg/ml, y 91 pg/ml)

La FIG. 4 muestra la production de especies reactivas de oxlgeno (ROS) (factor de incremento de produccion ROS intracelular) en los cultivos de fibroblastos de la FIG. 3 despues de irradiacion con IR (200 J/cm2 ).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Obtencion del cultivo celular

Para la obtencion del cultivo de celulas en suspension se partio de cultivos de Gossypium herbaceum crecidos 7 dlas en agitation constante (de 90 a 110 rpm) en la oscuridad y a temperatura ambiente. Antes de iniciar el tratamiento con la composition elicitora se confirmo que como mlnimo habla 500 ± 50 ml de celulas por cada litro volumen final de cultivo. El medio basal de cultivo fue el medio MS complementado con acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) (2 g/l), y quinetina (1 g/l).

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Seguidamente, se procedio a la elicitacion con una composition elicitora que comprendla ciclodextrinas (referencia 121877 de Wacker) a una concentration final en el cultivo 50 g/l; y jasmonato de metilo (referencia 392707 de Sigma) a una concentracion final en el cultivo de 50 pM. Los cultivos se dejaron en agitation (de 90 a 110 rpm) y a la oscuridad a una temperatura ambiente de 25 °C. Transcurridos 3 dlas desde la primera elicitacion se procedio a una segunda elicitacion con jasmonato de metilo a 50 pM. Las condiciones de agitacion, oscuridad y temperatura se mantuvieron tambien constantes. A los dos dlas de la segunda elicitacion se repitio el esquema elicitando de nuevo con jasmonato de metilo 50 pM, de tal modo que la concentracion final de jasmonato des de la primera elicitacion es de 150 pM. Se dejo dos dlas mas en agitacion y a la oscuridad.

Seguidamente se procedio al analisis de fenoles y flavonoides mediante espectrofotometrla (Espectrofotometro UV-visible marca Agilent Technologies/ modelo Agilent 8453/ n° serie0000338-02-01). Para ello se emplearon 10 ml de la muestra. Se comprobo que la muestra para analisis tenia una concentracion celular de 500 ±50 ml de celulas en 1 l de volumen final de cultivo. El mismo muestreo se utilizo para mandar una muestra para analisis microbiologico.

La cuantificacion de fenoles y flavonoides se realizo mediante extraction previa de los mismos del cultivo y seguido de su cuantificacion. Para ello se siguieron los protocolos descritos en la Monografla oficial de Farmacopea Europea (Ph Eur) de Herbal Drugs (European Pharmacopoeia 8.0) Markham, Andersen, paginas 1205-1206; y en la metodologia descrita en Marinova D et al., "TOTAL PHENOLICS AND TOTAL FLAVONOIDS IN BULGARIAN FRUITS AND VEGETABLES”, Journal of University of Chemical Technology and Metallurgy -2005, Vol. No. 40 (3), pp.: 255-260.

Los resultados del analisis de polifenoles aparecen en la Tabla 1.

El producto se formulo con glicerina (glicerinado) y se procedio al lisado de las celulas de algodon con un dispositivo Ultraturrax T-25 Basic. Herramienta de dispersion, modelo S 25 N - 25 G (Fabricante IKA), el control del lisado se realizo por observation con microscopio binocular BIOLUX-12 (marca KYOWA). Para ello, se adiciono glicerina (69%), cultivo celular (30%) y conservante Geogard™ ultra (1%), en un recipiente de acero inoxidable. Otros conservantes que el experto conocera son

tambien apropiados. Se coloco en bano de hielo con el objetivo de no superar los 30° durante el proceso y se disperso hasta la completa disolucion del conservante y hasta observar una rotura celular apropiada.

5 La composition cualitativa y cuantitativa del cultivo, en cuanto a polifenoles y otros componentes, aparece en la Tabla 1. En la Tabla 2 se detalla la composicion en el producto final glicerinado.

Tabla 1.

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Activo Metodo analltico Rango de Activos

concentracion identificados

Contenido en protelnas

Bradford 700-1200 mg/L Protelna total

Contenido en llpidos

Cromatografla capa fina Determination cualitativa (visual) Fitosteroles

Trigliceridos

ac. grassos libres

Cromatografla de Gases i Espectrometrla de Masas (GC-MS)1 Identification cualitativa Acido estearico

Monopalmitina

Monoestearina

Cuantificacion fitosteroles

GC-MS1 30-60 mg/L Stigmasterol

P -Sitosterol

Lanosterol

Contenido en azucares

GC-MS1 Identificacion cualitativa D-fructosa

Acido 2-keto-D- gluconico

6-deoxy- P-L- manofuranosa

a-D- glucopiranosa

Arabitol

Mioinositol

Polifenoles

Colorimetrla Espectrofotometro UV-visible (metodo segun indicado arriba) 250-500 mg/L Polifenoles totales

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Las condiciones cromatograficas GC-MS fueron las siguientes: Volumen de inyeccion: 1pL; Columna: Zebron ZB5MS 30m x 0.25 mm x 0.25pm; Programa de temperaturas: Temperatura inicial de 40°C mantenida 1 minuto, rampa de temperaturas de 10°C/min, temperatura final de 320°C mantenida 15 minutos; Gas 15 portador: He a velocidad lineal constante de 36cm/seg; Relation de split:

1:50;Temperatura de inyector: 320°C; Temperatura de interfase: 280°C Detection: SCAN de m/z 41 a m/z 600. Intervalo de SCAN 0,5 segundos.

5 Tabla 2. Composition y datos flsico-qulmicos del producto formulado en glicerina

Ensayo

Datos Metodo

Examen organoleptico

Apariencia

Suspension viscosa de lisado celular

Color

Marron-marron oscuro

Parametros flsico-qulmicos

pH

4-5.5

Densidad

1.10-1.30 g/ml Picnometro

polifenoles

> 50 mg/l

Parametros microbiologicos

Total aerobicos

< 100 cfu/g

HonGos y levaduras

< 10 cfu/g

Germenes patogenos

Farmacopea europea 8.0 2.6.12. Microbial enumeration tests, paginas 185 a 194.

Staphylococcus aureus

Ausencia en 1 g

Pseudomonas aeruginosa

Ausencia en 1 g

OTROS componentes

Fitosteroles (estigmasterol, P-sitosterol, lanosterol Llpidos (monogliceridos, trigliceridos, acidos grasos libres,) Azucares (glucosa, fructosa, sucrosa, furanosa, arabitol, mioinositol) Protelnas (ensayo Bradford) GC-MS (segun se detalla para Tabla 1)

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Ejemplo 2. Efecto inhibidor de la expresion de la enzima MMP-1 (encargada de la degradation de colagenos de la matriz extracelular) del lisado celular segun la invention.

En la FIG. 1 se detalla la production de la enzima MMP-1 (pg/ml) en un cultivo de fibroblastos dermicos humanos (obtenidos de muestras de piel humana-operaciones de fimosis 0-3 anos), cultivados y expandidos en medio de cultivo Dulbecco’s 1g/l glucosa (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium 1g/L glucose, Lonza BioWhitaker ) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (FCS, Labclinics), 2 mM L- glutamina (Lonza) y antibioticos (10pg/ml Penicilina 100 U/ml Estreptomicina, Lonza). Los fibroblastos fueron expuestos a radiation IR con una lampara IR Philips BR125 Infrared lamp hard glass Red (250 W, 230 V). Esta lampara acoge en su espectro de emision la region IR al completo, con un pico pronunciado a la longitud de onda de 1000 nm en la region IRA.

La cantidad de MMP-1 se midio mediante ensayo ELISA especlfico (ELISA plate reader, Multiskan Ascent (Labsystems- Perseptive Biosystems)) a partir de los sobrenadantes de los cultivos de los fibroblastos previamente expuestos a radiacion (de 24 a 48 h de exposition) y en presencia de distintas dosis de lisado de celulas de algodon o controles. La recoleccion de los sobrenadantes se hizo de 20 a 24 horas despues de la irradiation.

Los cultivos de fibroblastos se sembraron en 24 pocillos hasta confluencia. Se trataron con los distintos activos (distintas concentraciones del lisado celular en glicerina de la invencion, en concreto, 23 pg/ml, 45.6 pg/ml, 91 pg/ml; o con quercetina y acido ascorbico como controles positivo. El blanco fueron celulas no tratadas (NT))

Para la obtencion de las distintas concentraciones de lisado celular (tambien denominada aqul biomasa activa) en glicerina se realizaron las diluciones del lisado al 30 % en peso inicial de biomasa en glicerina, segun se detalla a continuation. Se resaltan en negrita las concentraciones ensayadas en los cultivos de fibroblastos. La dilucion se hizo con glicerina.

Relation de la muestra original lisado celular de Gossypium herbaceum en glicerina (%)

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Densidad muestra (g/ml)

1,21

Concentration real de la biomasa (lisado) en muestra (g/ml):

0,363

Dilution de la muestra Concentration biomasa Concentration biomasa

Dilucion

M06413 evaluada (veces): evaluada (%): evaluada (mg/ml)

1/500 Dilucion

500 0,06 0,73

1/1000 Dilucion

1000 0,03 0,36

1/2000 Dilucion

2000 0,015 0,18

1/4000 Dilucion

4000 0,0075 0,09

1/8000 Dilucion

8000 0,0038 0,045

1/16000

16000 0,0019 0,023

5 De la FIG. 1 se desprende que la presencia del lisado celular a las concentraciones indicadas y obtenido segun se describe en el Ejemplo 1 en los cultivos de fibroblastos, es capaz de reducir los niveles de expresion de esta enzima encargada de la degradation del colageno tipo 1. Aunque a mayor intensidad de radiation IR (300 J/cm2, columna de la derecha en cada tipo de muestra ensayada) la expresion era 10 mayor que a una intensidad menor de irradiation (intensidad de 150 J/cm2, columna del medio), los fibroblastos a los que se hablan anadido distintas concentraciones del lisado celular de la invention mostraron todos un nivel de expresion menor que en las celulas no tratadas (NT). Ademas, el nivel de expresion era similar al de la quercetina (25pM), un antioxidante generalmente empleado como control. Notese que incluso a 15 mucha menor concentration de activo (lisado celular), el efecto es mayor al de los activos de referencia quercetina y acido ascorbico.

Por otro lado, los mismos datos de la FIG. 1 se expresan en cantidad en porcentaje (%) de MMP-1 detectada en cada tipo de muestra en la FIG. 2. El % se calcula 20 considerando como el 100 % el de fibroblastos no tratados (NT) y no expuestos a

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radiacion (primera columna izquierda de NT). Se ve claramente que la expresion de MMP-1 es similar al del grupo con quercetina y claramente significativamente menor que en los fibroblastos no tratados.

En otro ensayo se valoro la actividad inhibitoria del lisado celular en glicerina en la production de sustancias reactivas de oxlgeno (ROS), ocasionada por el efecto de la radiacion IR a 200 J/cm2, aportada por la misma lampara que en el ensayo anterior. Los resultados se muestran en las FIGs. 3 y 4.

Para ello, los cultivos de fibroblastos se prepararon de la misma manera (placa de cultivo formato 96 pocillos) y se sometieron a radiacion pero sin ningun activo anadido (celulas NT de no tratadas) o en presencia de lisado celular en glicerina a las concentraciones antes indicadas. Tambien como control positivo se empleo quercetina (25 pM) y Acido ascorbico (concentraciones 10 y 50 pM). El lisado celular y los activos de los distintos controles se anadieron 24 horas antes de irradiar.

En este ensayo, la velocidad de produccion de especies reactivas de oxlgeno se determino mediante la sonda especlfica Carboxy-H2DCFDA (Molecular Probes). Esta sonda difunde al interior de las celulas (fibroblastos) y se mantiene en estado no fluorescente. Bajo estres (irradiation) los grupos acetato de esta sonda son eliminados por action de las esterasas intracelulares, dando lugar a su forma fluorescente, concediendole ademas cargas negativas que impiden su salida de las celulas. Tras la irradiacion se midieron por tanto los niveles de ROS de manera indirecta mediante fluorimetrla (Fluororoskan Ascent CF (Thermolabsystems)), puesto que son directamente proporcionales a la fluorescencia emitida por la sonda.

Como se indicaba antes, los datos de este ensayo aparecen ilustrados en las FIGs. 3 y 4. En la FIG. 3 se muestran los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) a una longitud de onda de excitation de 485 nm y a una longitud de onda de emision de 527 nm. Aunque en todas las muestras la radiacion con IR produjo una elevation del MFI respecto de las muestras no irradiadas, el valor absoluto de MFI era siempre menor que en la muestra de fibroblastos no tratados (NT). Ello da muestra del potencial del lisado de acuerdo con la invention como agente fotoprotector de la piel en relation a la radiacion IR. La FIG. 4, por otro lado, muestra el analisis de las ROS detectadas en cada muestra. Las muestras tratadas con el lisado de celulas de

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algodon mostraron un efecto protector con niveles de ROS significativamente menores que en los fibroblastos no tratados. Notese de nuevo que a menor concentration que los controles positivos (quercetina y acido ascorbico), el cultivo celular (lisado en glicerina) protegla igual o incluso mas que estos ultimos. Ello prueba que la composition del lisado es tal que sus componentes actuan de manera sinergica, pudiendose emplear dosis muy bajas para tener un efecto protector considerable.

Los datos obtenidos con los ensayos con radiation IR demuestran que con un ingrediente de obtencion asequible y reproducible, y a la vez siendo un producto natural, el efecto protector de la radiacion es comparable o incluso mejor que aquellos compuestos actualmente utilizados para ello.

Ejemplo 3. Efecto de la radiacion UV en fibroblastos humanos tratado con los cultivos de celulas en suspension de la invencion.

Con la finalidad de evaluar si el lisado celular o el cultivo de celulas de algodon en suspension era tambien activo frente a los mecanismos fisiologicos que provoca en la piel la radiacion UV, se realizaron tambien ensayos relativos a la capacidad protectora frente al estres oxidativo producido por radiacion UV en celulas de la piel; ensayos relativos a la capacidad protectora frente la degradation de las protelnas de la matriz extracelular inducida por UV (colagenos del tipo I y III y elastina); ensayos relativos a la capacidad regeneradora mediante la estimulacion de la slntesis de las protelnas de la matriz extracelular (colagenos del tipo I y III y elastina); y ensayos relativos a la modulacion del patron de citoquinas implicadas en los procesos de inflamacion de la piel inducida por UV.

Del mismo modo que para los ensayos con IR, se emplearon distintas concentraciones de un lisado celular de celulas de algodon, obtenidas por dilution acumulada de una composicion del lisado inicialmente al 30 % en peso en matriz de glicerina.

Estas muestras se anadieron en cultivos de fibroblastos dermicos humanos como en el Ejemplo 2 anterior.

En esta ocasion la irradiation se llevo a cabo con la lampara SOL500 (Dr. HONLE), Ref. 19671. Serial n° 0298 SOL 500 es un sistema de radiacion que simula la luz

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natural del sol. Esta compuesta por una lampara halogena de alta presion (Halogenide high-pressure SOL 500 S lamp) en una unidad de balasto (Ballast unit), y un disco filtrante (H-filter) el cual bloquea parcialmente la radiacion UVB. La radiacion emitida por el sistema esta dentro del rango de longitud de onda de 300-2500 nm (UVB-UVA- VS-IR). Esta configuration permite la emision de un espectro similar al de la luz del sol, que comprende luz UV (UVA principalmente, y un 17,3% de luz UVB), luz visible e infrarroja.

3.1. Capacidad de inhibir la aparicion de ROS

Para evaluar la capacidad de inhibir la aparicion de ROS, se utilizo el indicador general de estres oxidativo carboxi-H2DCFDA (Molecular Probes) como en el ejemplo 2.

Los fibroblastos dermicos humanos (HDF) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en crecimiento (37 ° C, 5% CO2) hasta su confluencia. Luego, las celulas fueron pre-tratadas con diferentes concentraciones de lisado celular de celulas de algodon en glicerina durante 24 h. Como un control de production basal de ROS, las celulas se mantuvieron en medio de cultivo durante el pretratamiento. Se utilizaron celulas tratadas con quercetina (25pM) como controles positivos. Cada condition experimental se evaluo por triplicado. Despues del pretratamiento, se retiraron las soluciones de ensayo, y los cultivos se lavaron 2 veces con solution de Hank tamponada de sal (HBSS) para su elimination completa. Se anadio nueva solucion HBSS a los pozos antes de su exposition al sol. Las celulas fueron irradiados con la lampara a intensidad de 12J/cm2. En paralelo, una placa de cultivo de control no fue expuesta a la radiacion solar. Entonces, el colorante carboxi-H2DCFDA se aplico sobre las celulas y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Cuando termino, se midio la fluorescencia y se registro en el fluorlmetro como en el ejemplo 2. Se calcularon las unidades de fluorescencia media relativa (MRFU) y desviacion estandar (SD) para cada condicion experimental. Los valores de MRFU son directamente proporcionales a la cantidad de ROS intracelular producida. La Tabla 3 muestra los resultados (disminucion en % de ROS respecto de las ROS en celulas no tratadas):

Tabla 3:

Analisis comparativo vs celulas no tratadas Analisis comparativo vs celulas irradiadas

Incremento S.D. Porcentaje medio (%) S.D.

Control colorante

0,377 0,003 1,616 0,013

Celulas no tratadas

23,315 1,439 100,000 6,173

Quercetina 25 pM

14,627 1,650 62,735 7,079

% lisado celular en ensayo

1,9 10-3 % (0.023 mg/ml) 16,332 1,400 70,049 6,006

3,7510-3 % (0.045 mg/ml)

15,894 1,186 68,170 5,085

7,510-3 % (0.091 mg/ml)

15,077 1,346 64,667 5,774

5 Como se muestra en la Tabla 3, despues de 12J/ cm2 de radiacion UV, los fibroblastos aumentaron la production de ROS intracelular (23,315 ± 1,44 aumentos) en comparacion con la produccion de la llnea de base (no UV). La quercetina, como control positivo en este ensayo, muestra una importante action antioxidante con un potente efecto inhibidor de la produccion de ROS intracelular inducida por UV en HDF 10 (inhibition de 37,3 ± 7,08% con respecto al control basal).La eficacia antioxidante de

los productos se definio como el porcentaje de reduction de la produccion de ROS en el pre-tratamiento de los fibroblastos con respecto a la produccion observada cuando los fibroblastos no se trataban.

15 Los fibroblastos (HDF) tratados con el lisado celular de acuerdo con la invention muestran un nivel de produccion de ROS de 30,21 ± 7,23%, 33,07 ± 8,18, y 35 052 ± 9,9 %, inferior a la observada en HDF sin tratar, a concentraciones de 0,023, 0,045, y 0,091 mg / ml, respectivamente. Estos resultados demuestran la potente accion protectora del lisado. Tomando de base estos resultados obtenidos con el lisado, 20 queda demostrada su potente accion antioxidante. El pretratamiento con 0,023, 0,045 y 0,091 mg / ml de lisado celular de celulas de algodon condujo a una reduccion de los niveles de ROS en HDF del 29.951 ± 6%, 31,830 ± 5,08, 35,33 ± 5,77%,

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respectivamente. Estos valores salen de restar al 100 % los valores de la Tabla 3 70.049, 68.170 y 64.667, respectivamente)

3.2. Capacidad protectora del lisado de la invention contra la degradation protelnas de la matriz extracelular (ECM)

La capacidad protectora del lisado de la invencion contra la degradacion de protelnas de matriz extracelular causada por la radiation solar fue evaluada sobre la base de la cuantificacion de colagenos tipo I y tipo III en los HDF pretratados y expuestos a la radiacion solar, por medio de analisis inmunocitoqulmico. Para ello los fibroblastos se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en el crecimiento (37 ° C, 5% CO2) hasta confluencia (72-96h despues de la siembra celular). Luego, las celulas fueron pre-tratamiento con diferentes concentraciones de algodon de Arabia (Gossypium herbaceum) durante 24 h. Las celulas no tratadas y celulas tratadas con quercetina 25 pM se utilizaron como un control basal y el control positivo, respectivamente. Despues del pretratamiento, se retiraron las soluciones de ensayo y las celulas se lavaron dos veces con solution salina tamponada de Hank (HBSS). Para el proceso de irradiation, se anadio nueva solucion de HBSS en la celula pocillos de cultivo y las celulas fueron expuestas a una dosis de radiacion de 40 J / cm2, con la lampara SOL 500. En paralelo placas de cultivo de HDF se evaluaron en las mismas condiciones experimentales y tratamientos y controles sin estar expuestos a la radiacion solar.

Inmediatamente despues de la irradiacion, la solucion de HBSS se elimino de los cultivos y se anadio nuevo medio de cultivo con baja concentration de FCS (1%). Los cultivos se mantuvieron en incubacion durante 24 h adicionales. Despues de este perlodo, las celulas se lavaron y se fijaron con para-formaldehldo para la cuantificacion de colageno de tipo I y tipo III presente en la matriz extracelular de tratados y se irradiaron HDF por analisis inmunocitoqulmico. La detection de estas protelnas de la matriz se realizo por la tecnica de inmunocitoqulmica mediante ELISA. Para este analisis, se utilizaron los anticuerpos humanos primarios especlficos contra ambas protelnas (anticuerpo monoclonal anti- colageno de tipo I humano de Sigma, anticuerpo monoclonal anti- colageno de tipo III humano de MP Biomedicals y anticuerpo monoclonal anti-elastina humana de Sigma), seguido por el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) y la incubation con su

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sustrato, o-fenilendiamina, en tampon de urea H2O2. Al final de la reaccion de HRP, se midio la absorbancia en un espectrofotometro (492 nm). Los cultivos que se incubaron con el anticuerpo secundario solamente se utilizaron como controles para la union de anticuerpo no especlfica. Los valores obtenidos en estos pocillos de control se restaron de los pocillos de ensayo. Los valores de absorbancia son proporcionales a la cantidad de protelna presente en la matriz extracelular de los cultivos de HDF evaluados.

Aunque no se muestran los datos se detecto una reduction significativa en la cantidad de protelnas de la matriz extracelular (ECM) en los fibroblastos inducidos por UV en comparacion con los no irradiados. La reduccion de colageno de tipo I, colageno de tipo III y elastina fue de 58,97 ± 8,14%, 47,91 ± 8,11% y 62,47 ± 4,42%, respectivamente, en HDF expuestos a 40 J/cm2 de UV con respecto a los no irradiados. Esta reduccion en los niveles de protelnas ECM fue ligeramente inferior en los fibroblastos tratados con quercetina despues de UV-exposicion (reduccion de 46,78 ± 6,91%, 25,03 ± 8,08% y 49,15 ± 10,17% en colageno de tipo I, colageno de tipo III y elastina, respectivamente). Estos resultados apoyan el efecto protector de la quercetina contra la degradation foto-inducida de protelnas ECM.

El efecto protector del lisado de la invention fue mayor que la mostrada por la quercetina. Los valores de reduccion de colageno tipo I en HDF pre-tratados con lisado en comparacion con los no irradiados fue de 36,59 ± 7,72 %, 37,81 ± 4,62 % y 32,95 ± 7,25 % para el 0.091, 0.182 y 0.363 mg / ml de concentration de lisado, respectivamente. En consecuencia, HDF tratados con 0,091, 0,182 y 0,363 mg / ml de lisado tenlan un 54,55 ± 4,18%, 51,58 ± 11,26% y 63,41 ± 17,67% mas de colageno de tipo I en su matriz extracelular, que los fibroblastos no tratados.

El lisado tambien mostro un efecto protector del colageno de tipo III y la elastina. Los fibroblastos tratados con 0.091, 0,182 y 0,363 mg / ml de lisado tenlan un 44,46 ± 23,43%, 53,13 ± 22,2% y 61,02 ± 17,8% mas de colageno de tipo III y 59,18 ± 11,045%, 58,58 ± 1,12% y 43,46 ± 29,01% mas de elastina en matriz extracelular respecto de los fibroblastos no tratados.

3.3. Production de protelnas de la matriz extracelular (ECM)

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La production de protelnas de ECM se evaluo con el fin de medir la firmeza de la piel, la elasticidad y los efectos anti-envejecimiento del lisado. Se analizaron los colagenos fibrilares (colagenos tipo I y tipo III) y la production de elastina mediante el metodo immunocitoqulmico anterior. Para ello, se sembraron celulas HDF en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en condiciones de crecimiento (medio de crecimiento, 37 ° C, 5% de CO2) hasta 75-80% de confluencia. Luego, las celulas fueron tratadas con diferentes concentraciones de lisado durante 72 h (tiempo necesario para la slntesis, procesamiento y la insertion de las protelnas seleccionadas en la matriz extracelular). Las celulas no tratadas se utilizaron como control negativo. Como control positivo, las celulas fueron incubadas con 10 ng/ml de factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-pi), un agente inductor conocido de la slntesis de protelnas ECM en HDF. Cada condition experimental se evaluo por triplicado. Al final del tratamiento de celulas, los cultivos se lavaron con HBSS y se fijaron con paraformaldehldo para el analisis de colageno tipo I y tipo III y el contenido de elastina en la matriz extracelular de las celulas tratadas. La absorbancia de los cultivos de ensayo se midio en un espectrofotometro a 492 nm. Valores de absorbancia obtenidos son directamente proporcionales a la cantidad de la protelna detectada en el ECM de la cultura HDF. Los cultivos que se incubaron con el anticuerpo secundario solo se utilizaron como controles para la union de anticuerpos inespeclficos y sus valores de absorbancia se restaron de los pocillos de ensayo. Los resultados obtenidos en las celulas tratadas con el lisado se compararon con los del control no tratado, para determinar el efecto inductor de la slntesis de protelnas ECM.

El factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-pi) indujo la production de colageno tipo I, colageno de tipo III y elastina en un 98,71 ± 9,31 %, 109,97 ± 6,73 % y 46,74 ± 18,59 %, respectivamente, despues del tratamiento HDF durante 72 h en comparacion con los fibroblastos no tratados. Las muestras tratadas con los lisados mostraron (datos no mostrados) un efecto ligeramente estimulante sobre la production de colageno de tipo I de una manera dependiente de la dosis a las concentraciones evaluadas. En particular, un aumento de la production de colageno de tipo I del 31,63 ± 8,53 %, 37,24 ± 7,98%, 58,22 ± 8,6 y 51 ± 16,63% en los HDF tratados con 0,091, 0,182, 0,363 y 0,726 mg/ml de lisado respecto de los fibroblastos no tratados. Los fibroblastos tratados con 0,363 y 0,726 mg/ml de lisado en glicerina segun Ejemplo 1 durante 72 h mostraron un aumento en la slntesis de colageno tipo III del 50,29 ± 10,23% y 78,97 ± 26,16%, respectivamente, en comparacion con HDF no tratados.

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Ademas, los HDF tratados con lisado celular de celulas de algodon tambien indujeron la production de elastina por 68,86 ± 14,44% a la concentration mas alta evaluada (0.726 mg / ml).

Estos datos de produccion de protelnas de la ECM demuestran que el lisado de la invention posee un efecto regenerador (actividad regeneradora) debida a su capacidad de promover la slntesis de estas protelnas.

3.4. Modulation de la respuesta inflamatoria

Aunque no se muestran los datos, se determinaron tambien en los cultivos de fibroblastos las concentraciones de distintas citoquinas pro-inflamatorias. El lisado celular de celulas de algodon redujo la produccion de las citoquinas responsables del inicio de la inflamacion cutanea IL-1a, IL-1p y TNF-a. Tambien redujo la produccion de las mayorla de citoquinas implicadas en la fase de amplification de inflamacion de la piel inmunomediada, tal como las interleuquinas IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, interferon Y (INF-y) y la protelna quimiotactica de monocirtos-1 (MCP-1).

3.5. Eficacia del lisado frente radiation UV en ensayo in vivo en humanos

Se realizaron ensayos in vivo con el lisado celular (al 30 % en glicerina) segun la invencion en 16 voluntarios. El lisado se aplico junto con una crema basal comercial para la piel a una concentracion de lisado glicerinado en la crema del 1 % en peso. Los voluntarios inclulan varios fototipos (I-III) segun escala Fitzpatrick

Un ensayo consistio en evaluar el potencial del lisado celular segun la invencion, como agente fotoprotector.

El efecto de protection solar se evaluo mediante la determination de la dosis minima de eritema (MED) antes y despues de 4 dlas de tratamiento. La MED se calculo induciendo un eritema en la piel con un simulador solar. El efecto del lisado se comparo con placebo (crema comercial sin el lisado celular). Para la induction del eritema se utilizo una fuente de luz artificial con el sistema de filtrado Multiport® (Luz solar luz Co): de arco de xenon (300 W) y Schott WG 320 y UG 11 (1 mm) filtros. El espectro de emision del simulador oscila entre 290 y 400 nm.

Las areas de irradiacion fueron elegidas por el tecnico responsable, teniendo en cuenta el aspecto de la piel (sin marcas y que tuviera color uniforme), y que el area no hubiera sido expuesta a la irradiacion del sol 1 mes antes del comienzo del estudio, 5 evitando las areas de friccion (ropa), los salientes oseos y las zonas extremas de curvatura. Las areas se limitaron con una pluma quirurgica especial (Superficie: 35 cm2).Las exposiciones se realizaron antes de la aplicacion del producto y despues de 4 aplicaciones.

10 Los valores de MED se leyeron cuando la respuesta de eritema era optima (es decir, 20 ± 4, entre 16 a 24 horas) despues de la exposition a los rayos UV. La determination de la MED se realizo visualmente. La MED se definio como la energla radiante de calidad (la dosis mas baja UV) necesaria para producir el primer enrojecimiento perceptible y sin ambiguedades, con bordes definidos en la mayorla de 15 la zona de la exposicion a UV y lelda de 16 a 24 horas despues de la exposicion.

La MED se calculo luego segun:

MED = (Dosis (en MED/min) x tiempo de exposicion (en segundos)) / 60 Las siguientes tablas 4 a 6 muestran los resultados obtenidos:

20

Tabla 4. Resultados con la crema con lisado al 1 %

MED Dosis minima de eritema

Antes del tratamiento (Dia 1)

Despues del tratamiento (dia 8) % de variacion (antes-despues)

Media

1.43 1.54 11.50%

S.D.

0.32 0.39 28.40%

Tabla 5. Resultados con crema placebo

MED Dosis minima de eritema

Antes del tratamiento (Dia 1)

Despues del tratamiento (dia 8) % de variacion (antes-despues)

Media

1.43 1.42 0.80%

S.D.

0.32 0.33 18.10%

5

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15

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25

Tabla 6. Resultados control (area sin tratar)

MED Dosis minima de eritema

Antes del tratamiento (Dia 1)

Despues del tratamiento (dia 8) % of variation (antes-despues)

Media

1.43 1.36 -2.90%

S.D.

0.32 0.34 20.00%

Los resultados muestran una mejora del MED (11,5%) en el area tratada con el lisado de celulas de algodon. Por otro lado, no se observo ninguna variation importante en la MED para la zona de control y la zona tratada con el placebo.

Puede concluirse entonces que, las condiciones experimentales adoptadas y teniendo en cuenta la evolution del parametro decisivo considerado, el producto (lisado) de la invention tiene un efecto protector de sol despues de 4 aplicaciones.

Por otro lado, tambien se evaluoo en otro ensayo el efecto reparador (soothing effect; after-sun action) proporcionado por el lisado al 1 % en la misma crema basal comercial.

Para ello, zonas de la piel con los mismos criterios de seleccion que para el ensayo de fotoproteccion, se irradiaron con la misma lampara en los mismos 16 voluntarios. La radiation UV se aplico por 6 fibras opticas (8 mm de diametro) que definen sobre la piel 6 subsitios de 0,5 cm2.

El efecto calmante del producto se evaluo, objetiva y cuantitativamente, mediante mediciones colorimetricas, con el Mexameter® MX18 (Courage & Khazaka), que tiene una sonda de medicion con un diametro de superficie de medicion de 5 mm. La medicion se realizo en el area de la piel tratada con el producto de prueba y el producto placebo y el area no tratada, despues de la exposition a la radiacion.

La superficie de las sub-sitios de exposicion (irradiation) fue de 0,5 cm2 y la distancia minima entre los bordes de dos sub-sitios de exposicion adyacente era de 0,8 cm por lo menos.

5

10

15

20

25

La energla producida por cada fibra del simulador estaba regulada por las pantallas de observation de los valores crecientes segun una progresion geometrica 1,25.

Las dosis de UV se midieron mediante un doslmetro de luz solar previamente calibrado y se expresaron en MED / min. (escala hasta aproximadamente las 3.00 MED / min). Todas las mediciones de irradiancia se hicieron usando el mismo doslmetro.

El tiempo de exposition de la zona (establecido mediante el MED estimada, por colorimetrla) fue de 15 a 60 segundos y variaba de acuerdo a los sujetos (fototipos). Los resultados se expresaron en valores medios del parametro E o el nivel de eritema.

Se calculo la diferencia entre el valor del parametro E obtenido en el area irradiada y la obtenida en la zona adyacente (AE).

Las mediciones de nivel de eritema se realizaron en D2 / T0H (6h despues de la irradiation de la piel y antes de la aplicacion del producto de ensayo y el producto placebo) y en D2 / T1h y D2 / T2H (1h y 2h despues de la aplicacion del producto de prueba y el placebo producto).

El porcentaje de reduction de eritema observado en cada voluntario para la crema con el lisado celular de celulas de algodon (1% en peso), para el placebo y para el control se detalla en las Tabla 7 siguiente:

Tabla 7. Porcentaje de reduccion del eritema tras irradiacion y aplicacion del lisado celular, el placebo o en areas no tratadas

Tratamiento con lisado celular de celulas de algodon

Sujeto

Porcentaje de reduccion D2/T 1h-D2/T0h (%) Porcentaje de reduccion D2/T2h-D2/T0h (%)

1

-10% -25%

2

-15% -27%

3

-26% -4%

4

-16% -31%

5

-44% -34%

6

-11% -13%

7

-9% -6%

8

-28% -52%

9

-31% -33%

10

-1% -1%

11

-12% -26%

12

-9% -10%

13

-20% -8%

14

-13% -8%

15

-2% -1%

16

-8% -18%

Media

-15.9% -18.5%

Desviacion estandar (SD)

11.3% 14.6%

Placebo

Sujeto

Porcentaje de reduccion Porcentaje de reduccion

D2/T 1h-D2/T0h (%)

D2/T2h-D2/T0h (%)

1

2% -2%

2

1% 12%

3

-7% -55%

4

-3% 1%

5

-12% 6%

6

6% 8%

7

1% 11%

8

-10% -1%

9

9% -9%

10

-44% 5%

11

17% 20%

12

4% 3%

13

-14% 4%

14

-4% -17%

15

2% -8%

16

3% -1%

Media

-3.1% -1.4%

Desviacion estandar (SD)

13.4% 16.8%

Control

Sujeto

Porcentaje de reduccion D2/T 1h-D2/T0h (%) Porcentaje de reduccion D2/T2h-D2/T0h (%)

1

3% 25%

2

-8% -23%

3

-10% -12%

4

-19% -11%

5

-38% 14%

6

11% 16%

7

0% 10%

8

151% 195%

9

-28% 5%

10

20% 33%

11

46% 52%

12

-4% -7%

13

-5% 4%

14

-5% -16%

15

7% 7%

16

-12% -17%

Media

6.8% 17.3%

Desviacion estandar (SD)

42.9% 51.5%

Estos resultados muestran que el lisado celular de celulas de algodon segun se describe en el Ejemplo 1 (aplicado al 1 % en peso en una crema basal), muestran que el producto reduce el nivel de eritema en un 16%, 1 hora despues de su aplicacion y 5 en un 19%, 2 horas despues de su aplicacion. De la misma manera, el porcentaje de reduccion del nivel de eritema detectado en los "sujetos reactivos" es 16,5% y 23,3%, 1h y 2h despues de la aplicacion del producto, respectivamente.

En las condiciones experimentales adoptadas y teniendo en cuenta la evolucion de los parametros fundamentales de analisis, el lisado celular de la invencion demuestra un 10 efecto calmante estadlsticamente significativo. Este efecto se detecto en el 81 % de los voluntarios ensayados.

5

10

15

Ejemplo 4. Composition topica con lisado celular de un cultivo de celulas de algodon en suspension.

Componente

Porcentaje (%)

Glicerina

69

Lisado de cultivo celular de Gossypium herbaceum (algodon)

30

Conservantes

Gluconolactona

0.74

Benzoato sodico

0.25

Aditivos

Gluconato calcico

0.01

Esta composicion puede ser un ingrediente adicionado a otras composiciones o galenicas de uso topico, tal como cremas, geles, unguentos, vaporizadores (sprays), bases de maquillaje, o champus para el cuero cabelludo.

REFERENCIAS CITADAS

- Grether-Beck et al., "Review Article Photoprotection of human skin beyond ultraviolet radiation”, Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine - 2014, doi: 10.1111/phpp. 12111.

- European Pharmacopoeia 8.0 Markham, Andersen, paginas 1205-1206.

- Marinova D et al., "TOTAL PHENOLICS AND TOTAL FLAVONOIDS IN BULGARIAN FRUITS AND VEGETABLES”, Journal of University of Chemical Technology and Metallurgy -2005, Vol. No. 40 (3), pp.: 255-260.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. - Cultivo de celulas de planta del genero Gossypium en suspension, caracterizado porque comprende:

   - polifenoles a una concentration de 250 a 500 miligramos por litro de cultivo;

   - fitoesteroles a una concentracion de 30 a 60 miligramos por litro de cultivo;

   - una mezcla de azucares, que comprende a su vez glucosa, fructosa, sacarosa, furanosa, arabitol y mioinositol;

   - llpidos; y

   - protelnas.
2. 2. - Cultivo segun la revindication 1, caracterizado porque los polifenoles estan en una concentracion de 200 a 400 mg/l de cultivo.
3. 3. - Cultivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 anteriores, caracterizado porque la planta del genero Gossypium se selecciona del grupo constituido por Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium tomentosum, y mezcla de los mismos.
4. 4. - Procedimiento de obtencion de un cultivo de celulas de una planta del genero Gossypium en suspension que comprende las siguientes etapas:

   (a) Cultivar celulas desdiferenciadas de la planta del genero Gossypium en un medio de cultivo de crecimiento que comprende reguladores del crecimiento de plantas, dichos reguladores seleccionados del grupo constituido por las auxinas acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), acido naftalenacetico (NAA) y las citoquininas quinetina, y 6-Benzilaminopurina (BAP) y mezclas de las mismas por un periodo de 5 a 10 dlas;

   (b) anadir al cultivo de la etapa (a), de 2 a 4 veces, una composition o combination elicitora, donde esta composicion o combination se selecciona cada vez que se adiciona de:

   - una composicion o combinacion que comprende ciclodextrinas, y al menos un compuesto de jasmonato, donde el compuesto de jasmonato se selecciona del grupo constituido por jasmonato de metilo, jasmonato de

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   etilo y jasmonato de propilo; y donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composition o combination elicitora, las ciclodextrinas estan a una concentration final en el cultivo de 18 a 72 g/l de cultivo y el compuesto de jasmonato esta en una concentracion final en el cultivo de 100 pM a 500 pM; y

   - una composicion que comprende al menos un compuesto de jasmonato, seleccionado de jasmonato de metilo, jasmonato de etilo y jasmonato de propilo, donde al final de las 2 a 4 veces de adicion de la composicion elicitora, el compuesto de jasmonato esta en una concentracion final en el cultivo de 100 pM a 500 pM.
5. 5. - Procedimiento segun la reivindicacion 4, caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo con tres adiciones de la composicion o combinacion elicitora.
6. 6. - Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado porque la adicion de la composicion o combinacion elicitora se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente patron de adicion:

   (i) anadir una primera dosis de la composicion o combinacion elicitora cuando el cultivo de la etapa (a) ha crecido de 5 a 10 dlas;

   (ii) anadir una segunda dosis de 3 a 4 dlas despues de la primera dosis; y

   (iii) anadir una tercera dosis de 2 a 3 dlas despues de la segunda dosis.
7. 7. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, caracterizado porque la adicion de la composicion o combinacion elicitora se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente patron de adicion:

   (i) anadir una primera dosis de una composicion o combinacion elicitora que comprende ciclodextrinas y un compuesto de jasmonato, cuando el cultivo de la etapa (a) ha crecido de 5 a 10 dlas;

   (ii) anadir una segunda dosis de una composicion que comprende un compuesto de jasmonato, de 3 a 4 dlas despues de la primera dosis; y

   (iii) anadir una tercera dosis de una composicion que comprende un compuesto de jasmonato, de 2 a 3 dlas despues de la segunda dosis.
8. 8. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque la composicion o combinacion elicitora comprende jasmonato de metilo.

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   20

   25

   30

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9. 9. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque ademas comprende la etapa (c) de lisar el cultivo celular obtenido en la etapa (b).
10. 10. - Lisado celular de un cultivo en suspension de celulas de una planta del genero Gossypium, caracterizado porque es obtenible por el procedimiento segun la reivindicacion 9.
11. 11. - Composition farmaceutica o cosmetica topica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de un cultivo en suspension de celulas de una planta del genero Gossypium segun se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un lisado segun se define en la reivindicacion 10, junto con uno o mas excipientes o vehlculos aceptables farmaceutica o cosmeticamente.
12. 12. - Composicion segun la reivindicacion 11, caracterizada porque ademas comprende glicerina como excipiente.

    13- Uso de un cultivo en suspension de celulas de una planta del genero Gossypium segun se define en las reivindicaciones 1 a 3, o de un lisado celular segun se define en la reivindicacion 10, o de una composicion farmaceutica topica segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, para la preparacion de un medicamento para la prevention y/o tratamiento de una enfermedad o condition causada por la exposition a radiation seleccionada del grupo formado por radiation ultravioleta (UV), radiation infrarroja (IR) y una combination de ambas.
13. 14. - Uso segun la reivindicacion 13, caracterizado porque el medicamento es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion infrarroja.
14. 15. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizado porque la enfermedad o condicion causada por la exposicion a radiacion se selecciona del grupo constituido por escozor y/o picor de la piel y/o del cuero cabelludo, envejecimiento precoz de la piel, quemaduras cutaneas por radiacion, inflamacion dermica ocasionada por radiacion, dermatitis atopica y cancer cutaneo.
15. 16.- Uso de un cultivo en suspension de celulas de una planta del genero Gossypium segun se define en las reivindicaciones 1 a 3, o de un lisado celular segun se define en la reivindicacion 10, o de una composition cosmetica topica segun se define en una 5 cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, como agente fotoprotector de la piel y del cuero cabelludo.