ES2576853T3 - Compuestos dirigidos al receptor del manosa 6-fosfato independiente de cationes - Google Patents

Abstract

Un conjugado, en el que dicho conjugado es - un producto de interés Y seleccionado entre el grupo que consiste en glucoproteínas, nanopartículas y marcadores para la formación de imágenes médicas, conjugado a través de un enlazador L con - un compuesto que tiene la fórmula (1)**Fórmula** en la que - la línea punteada representa un enlace que está presente o no, - X representa un análogo de un grupo fosfato, - R se selecciona del grupo que consiste en H y OH, - A se selecciona del grupo que consiste en O, S y CH2, y en el que - dicho compuesto que tiene la fórmula (1) está unido al enlazador a través del resto A, - dicho enlazador L separa A e Y por una cadena de 4 a 15 átomos consecutivos cuando dicho enlace representado por la línea punteada está ausente, X se selecciona del grupo que consiste en: o un grupo fosfonato saturado que tiene la fórmula**Fórmula** o un grupo bis fluoro fosfonato que tiene la fórmula**Fórmula** o un grupo fluoro fosfonato que tiene la fórmula**Fórmula** o un grupo carboxilato saturado que tiene la fórmula**Fórmula** y o un grupo malonato que tiene la fórmula**Fórmula** - cuando dicho enlace representado por la línea punteada está presente, X se selecciona del grupo que consiste en: o un grupo fosfonato insaturado que tiene la fórmula**Fórmula** y o un grupo carboxilato insaturado que tiene la fórmula**Fórmula**

Description

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fórmula (1) de acuerdo con invención, estando unidos dichos compuestos a la misma cadena de oligosacáridos o a dos cadenas de oligosacáridos diferentes de dicha glucoproteína, y en el que cuatro análogos de M6P de dichos al menos dos compuestos son reconocibles por los cuatro sitios de unión de la M6P de un dímero de CI-M6PR.

De acuerdo con la invención, cuando dicha glucoproteína se conjuga con más de un compuesto de fórmula (1), cada compuesto se une a dicha glucoproteína a través de enlazador L que puede ser idéntico o diferente.

Típicamente, el conjugado de acuerdo con la invención, en el que Y es una glucoproteína, tiene una afinidad de unión para el CI-M6PR (CI50) de como máximo 100 nM, según se midió por un método descrito en Jeanjean et al., Bioorg Med Chem (2006) 14:3575-82. En particular, dichos conjugados de acuerdo con la invención tienen una afinidad de unión para el CI-M6PR (CI50) de como máximo 50 nM. Más particularmente, dichos conjugados de acuerdo con la invención tienen una afinidad de unión para el CI-M6PR (CI50) de como máximo 25 nM. Del modo más particular, dichos conjugados de acuerdo con la invención tienen una afinidad de unión para el CI-M6PR (CI50) de como máximo 2 nM.

En una realización, dichas glucoproteínas son enzimas lisosomales.

En una realización particular, dichas enzimas lisosomales se seleccionan del grupo que consiste en 1-betagalactosidasa ácida, esfingomielinasa ácida, alfa-D-manosidasa, alfa-fucosidasa, alfa-galactosidasa A, alfaglucosaminida acetiltransferasa, alfa-glucosidasa, alfa-L-iduronidasa, alfa-N-acetilgalactosaminidasa, alfa-Nacetilglucosaminidasa, alfa-neuraminidasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, beta manosidasa, catepsina D, catepsina K, ceramidasa, cistinosina, galactocerebrosidasa, glucocerebrosidasa, activador del gangliósido GM2, heparán sulfatasa, hexosaminidasa A y hexosaminidasa B, hialuronidasa, iduronato sulfatasa, LAMP2, Linclin, lipasa ácida lisosomal, N-acelilglucosamina-1-fosfotransferasa, N-acetilgalactosamina 6sulfatasa, N-acetil glucosamina-1-fosfotransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, N-aspartil-betaglucosaminidasa, palmitoil-proteína tioesterasa-1, proteína protectora / catepsina A (PPCA), sialina, enzima TPP1.

Típicamente, las glucoproteínas que van a unirse a los compuestos de acuerdo con la invención se producen por ingeniería genética con sistemas de expresión recombinantes. Típicamente, dichas glucoproteínas se producen con sistemas de expresión que permiten la producción de altos niveles (hasta 1.000 mg/l) de proteínas recombinantes funcionales y biológicamente activas adecuadamente modificadas post-traduccionalmente (plegamiento, formación de enlaces disulfuro, oligomerización, glicosilación, acilación, escisión proteolítica). Un sistema de expresión típico de acuerdo con la invención es el sistema de expresión por el vector Baculovirus. El sistema de expresión por el vector Baculovirus está basado en la introducción de un gen extranjero en una región del genoma no esencial para la replicación viral a través de una recombinación homóloga con un vector de transferencia que contiene el gen diana. El Baculovirus recombinante resultante carece de un gen no esencial (por ejemplo polh, v-cath, chiA, etc.) reemplazado por un gen extranjero que codifica la proteína heteróloga. Dicha proteína, típicamente una glucoproteína, puede expresarse en células de insecto cultivadas y larvas de insectos. Típicamente, la expresión de la glucoproteína se realiza en células de insecto, que conducen a una glicosilación satisfactoria de las proteínas. Más particularmente, la expresión se realiza en las células de la línea celular Sf9 (Spodoptera frugiperda), que permite una glicosilación satisfactoria de las proteínas, estando dicha glicosilación libre de residuos α-1,3-fucosa que son inmunogénicos para los seres humanos.

Otro objeto de la invención se refiere al conjugado de acuerdo con la invención, para su uso en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. De hecho, debido a que los conjugados de acuerdo con la invención tienen una alta afinidad para el CI-M6PR, pueden ser útiles en el diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas con el aumento o la disminución de la expresión de CI-M6PR.

Otro objeto de la invención se refiere a conjugados de acuerdo con la invención, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal. De hecho, los conjugados de acuerdo con la invención tienen muchas aplicaciones en el campo de la medicina.

Por ejemplo, se ha demostrado que en algunos cánceres de próstata, los CI-M6PR están sobreexpresados y se liberan autoanticuerpos anti-CI-M6PR en la circulación sanguínea (Huang YY, et al., Clinical Immunology 2004; 111 (2):202-9): al utilizar un conjugado de acuerdo con la invención que comprende, por ejemplo, un marcador de fluorescencia o un radiomarcador, es posible identificar las áreas del cuerpo donde están sobreexpresados los CI-M6PR y, por lo tanto, es posible irradiar al paciente con mucha precisión, sólo en las zonas que deben tratarse.

Otros ejemplos de enfermedades que pueden tratarse con los conjugados de acuerdo con la invención son las enfermedades causadas por una deficiencia en un producto Y en el lisosoma. Esta deficiencia puede compensarse por la administración de un conjugado de la invención, que es capaz de entregar específicamente el producto Y deficiente hacia el lisosoma.

La invención también se refiere en particular al conjugado de acuerdo con la invención para ser utilizado en un método para el tratamiento de un trastorno por almacenamiento lisosomal en el cuerpo humano o animal. De hecho, cuando Y es una enzima lisosomal, los conjugados de acuerdo con la invención se pueden utilizar en métodos de

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considerarse como ilustrativos.

Descripción de las figuras

Figura 1: Estructura molecular de los análogos de M6P. Figura 2: Enlaces de hidrógeno potenciales de la M6P insertada en el bolsillo de unión del ligando del CI-M6PR. Figura 3: Cinética de la degradación de la M6P y del fosfonato 1 en suero humano. Figura 4: Unión específica de la M6P y el fosfonato 1 en una línea de células humanas normales. Figura 5: Ninguno efecto citotóxico de la M6P y el fosfonato 1 en la línea celular de fibroblastos humanos normales IMR-90 (A) y dos líneas celulares de cáncer de mama (B). Figura 6: Modelado molecular del malonato 3 con o sin un espaciador, insertado en el bolsillo de unión del CI-M6PR. Figura 7: Mejora de la afinidad de unión del carboxilato 4 después del injerto de brazos espaciadores. Figura 8: Ejemplos de brazos espaciadores injertados en el fosfonato 1 (AMFA-1, AMFA-2) Figura 9: Síntesis de AMFA-1. Figura 10: Síntesis de AMFA-2. Figura 11: Síntesis de AMFA-3. Figura 12: Síntesis de AMFA-5. Figura 13: Síntesis de M6P-hexanohidrazida. Figura 14: Análisis de las propiedades farmacológicas de AMFA-1. (A) CI50; (B) afinidad de unión al CI-M6PR y estabilidad en suero humano, (C) toxicidad en los fibroblastos humanos. Figura 15: Análisis de las propiedades farmacológicas de los AMFA-1, AMFA-2, AMFA-3 AMFA-5 en comparación con M6P y M6P-hexanohidrazida: afinidad de unión al CI-M6PR a 20 ºC (A) y en suero humano (B). Figura 16: Efecto del injerto de AMFA-1 sobre las cadenas oligomanósidicas de una enzima recombinante humana. (A) afinidad de unión; (B) actividad catalítica. Figura 17: Purificación de iduronidasa (IDUA) (A), detección inmunohistoquímica de la absorción del neo-IDUA (B-E) y la detección en gel de poliacrilamida-SDS de neo-IDUA intracelular (F) en los fibroblastos de Scheie y Hurler. Figura 18: Viabilidad de fibroblastos de Hurler tratados con diferentes dosis de Neo-IDUA.

Ejemplos

1.1. Síntesis y caracterización de análogos muy potentes de la M6P.

La síntesis y caracterización de análogos muy potentes de la M6P (M6Pa) se realizaron mediante la sustitución del grupo fosfato con un grupo fosfonato, malonato o carboxilato [Vidal et al., Bioorg Med Chem. 10, 4051, 2002; Jeanjean A et al., Bioorg Med Chem. 14, 2575, 2006; Jeanjean A et al., Bioorg Med Chem Lett. 18, 6240, 2008].

1.2. Ensayo de unión de análogos de M6P en el CI-M6PR.

Los ensayos de unión de los análogos de M6Pa se realizaron utilizando el CI-M6PR biotinilado. En resumen, el CI-M6PR, purificado en una columna de afinidad de Sefarosa-fosfomanosa, fue biotinilado con la biotina N– hidroxisuccinimida. La unión del CI-M6PR biotinilado (CI-M6PRb) a la pentamanosa 6-fosfato (PMP) previamente adsorbida sobre una placa de microtitulación fue desplazada por concentraciones crecientes de M6Pa. El CI-M6PRb unido fue entonces determinado usando el par de estreptavidina/peroxidasa y el sustrato OPD con las medidas de la densidad óptica. En experimentos de control, el método se estandarizó mediante la determinación de la concentración máxima de la PMP adsorbida en la placa de microtitulación y la concentración de CI-M6PRb necesaria para saturar la PMP adsorbida [Jeanjean A y al, Bioorg Med Chem. 14: 3.575-82, 2006].

La Figura 1 muestra que el fosfonato 1 y el malonato 3, dos análogos isostéricos de la M6P tienen una mayor afinidad de unión para el CI-M6PR que la de la M6P natural. Sin embargo, los análogos no isostéricos como fosfonato 2, no son reconocidos por CI-M6PR. Por otro lado, el carboxilato 4 muestra una afinidad de unión para el CI-M6PR inferior a la del malonato 3. Estos resultados demuestran que el fosfonato 1 y el malonato 3 presentan un potencial fuerte para apuntar las células que expresan el CI-M6PR.

1.3. Modelado de la inserción de los análogos de M6P en el bolsillo de unión del CI-M6PR.

La estructura cristalina de CI-M6PR en un complejo con el ligando natural correspondiente se ha obtenido a partir de los archivos de datos cristalográficos (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/, el código de identificación 1SZ0). Los inventores han construido los análogos de M6P sobre la base de la estructura de M6P pesada (heteroátomo M6P500) con el software del módulo de diseño de ligandos. La inserción del ligando se llevó a cabo primero por la superposición de la estructura del análogo de M6P sobre la estructura del agonista de M6P. Con el fin de equilibrar el complejo, el complejo ligando-receptor se sometió a continuación a la minimización de la energía usando gradientes conjugados para 2000 pasos a 300 ºK y un potencial armónico se utilizó para las energías de unión hasta que la derivada máxima fue inferior a 0,07 kcal/Ǻ. A continuación, la simulación dinámica molecular se realizó

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utilizando el módulo Discover. Se aplicó el campo de fuerza constante y el algoritmo de gradiente conjugado juntocon una distancia de corte de 25 Å. Una restricción de fijación se aplicó al esqueleto del receptor [Jeanjean A. et al. Curr Med Chem. 14: 2945- 53,2007].

La Figura 2 muestra que la M6P natural exhibe 11 posibles enlaces de hidrógeno y sólo seis diferentes puntos de anclaje, mientras que el análogo de fosfonato 1 muestra 12 posibles enlaces de hidrógeno con los residuos esenciales en el dominio de unión de ligando, y está anclado por 8 posiciones diferentes al CI-M6PR. Además, el malonato 3, que se caracteriza por dos restos carboxilato en lugar de un resto fosfato forma 13 enlaces de hidrógeno potenciales y dispone de 8 puntos de anclaje (datos no mostrados).

Sin embargo, para el carboxilato 4 que exhibe una afinidad de unión inferior a la referencia M6P, la interacción directa entre el residuo Y324 y la manosa faltaba. Estudios anteriores [Hancock, MK. y al, J Biol Chem, 277, 1125564, 2002] también han demostrado que sencillas sustituciones de aminoácidos están implicados en la estabilidad del ligando.

1.4. Caracterización biológica de análogos muy potentes de M6P

Las propiedades farmacológicas de un análogo muy potente, el fosfonato 1, han sido comparadas con la M6P.

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En primer lugar, se analizó la estabilidad del fosfonato 1 en el 75 % (v/v) de suero humano. Los resultados muestran que el fosfonato 1 es 10 veces más estable en el suero que la M6P natural (Fig. 3).

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En segundo lugar, el efecto del fosfonato 1 sobre la endocitosis a través del CI-M6PR ha sido comparado con el de la M6P natural. Los resultados anteriores demostraron que un complejo de catepsina D/anticuerpo anticatepsina D fue internalizado específicamente por el CI M6PR en fibroblastos humanos normales [Laurent-Matha V et al., J. Cell Sci. 111: 2539-49, 1998] El complejo fue aquí detectado por coloración por inmunofluorescencia.

La figura 4A muestra que el 80 % de las células de control han internalizado el complejo catepsina D/anticuerpo anticatepsina D, mientras que las células pre-incubadas con 10 mM de M6P o fosfonato 1 han internalizado sólo el 30 % y 10 %, respectivamente. Este resultado demuestra que el fosfonato 1 tiene una mayor afinidad de unión que la de la M6P. La figura 4B muestra que la intensidad de la coloración de células es menor en la presencia de fosfonato 1 que en presencia de M6P. Todos estos resultados demuestran el alto potencial de fosfonato 1 para dirigirse al CI-M6PR. -En tercer lugar, se estudió la citotoxicidad del fosfonato 1 in vitro. Líneas de células normales o cancerosas fueron tratadas durante 4 días con dosis crecientes de fosfonato 1. Los gráficos de barras indican que este compuesto no indujo ninguna citotoxicidad, incluso a alta concentración (0,1 mM) ni en los fibroblastos humanos normales (Figura 5A) ni en las líneas celulares de cáncer de mama, como MCF7 o MDA-MB-231 (Figura 5B).

1.5. Modelado molecular de un análogo de M6P, el malonato 3 en el bolsillo de unión del CI-M6PR, antes (Figura 6A) y después (6B) de acoplamiento con un enlazador (hexano hidrazida)

Con el fin de eliminar o reducir el impedimento estérico cerca del bolsillo de unión del CI-M6PR debido al injerto de análogos de M6P en una macromolécula, se ha propuesto la adición de un enlazador espaciador. La Figura 6 muestra que un enlazador hexanoil hidrazida permite una separación suficiente entre los sitios de unión por la M6P del CI-M6PR y el producto que se debe unir al grupo hidrazida. Estudios de Modelado molecular muestran que se requiere un espaciador de 6 a 7 Å en el bolsillo de unión del CI-M6PR entre los análogos de M6P y la macromolécula que debe ser injertada. El brazo espaciador podría estar sustituido en diferentes posiciones por un átomo de nitrógeno u oxígeno, que podrían realizar enlaces de hidrógeno con ciertos residuos del bolsillo de unión del ligando tal como Y324, E323, K350, Q356. Este enlazador podría ser o bien una cadena alifática o ciclos como un fenilo sustituido o un triazol. Por lo tanto, de esta manera, la afinidad de unión para análogos de M6P para el CI-M6PR no será alterada por el injerto de una macromolécula tal como una enzima lisosomal.

1.6 Síntesis y caracterizaciones de los enlazadores

La Figura 7 muestra la mejora en la afinidad de unión de lo carboxilato 4 (A) para el CI-M6PR por un factor de 1,7 después del injerto a la posición aglicona de OPhNH2 (B) y por un factor de 2 después de un injerto adicional de un clorambucil (C).

La Figura 8 describe la estructura del fosfonato 1 unido con diferentes enlazadores (hexanohidrazida AMFA-1), triazol (AMFA-2) y aminoxi (AMFA-3). Estos compuestos (AMFA, análogo de la M6P funcionalizado en el aglicona) son ejemplos de compuestos que tienen la fórmula (I) de acuerdo con la invención. La estructura del malonato 3 (AMFA-5) y M6P vinculado a un brazo hexanohidrazida también se da en la Figura 8.

1.7. Síntesis de AMFA-1, AMFA-2, AMFA-3, AMFA-5 y M6P-hexanohidrazida - figuras 9-13

1.7.1. Síntesis de AMFA-1 (Fig. 9)

2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-D- manopiranósido de 5-etoxicarbonilpentilo 1:

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Se agitó 7 (0,048 g, 0,124 mmol) en 3 ml de metanol/H2O (2:1) durante 18 h en una atmósfera de hidrógeno en presencia de Pd/C (10 %, 8 mg). La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de Celite y se evaporó al vacío para dar lugar a 8 (0,046 g, 100 %). Fr = 0,51 [AcOEt/MeOH, (9:1)] EM, IEN + m/z:387 [M + H]+, 409 [M + Na]+, 425 [M + K]+

Sal disódica de 5-hidrazinocarbonilpentil-6-desoxi-6-diidroxifosfinilmetil-α-D-manopiranósido 9 o AMFA-1

A 8 (0,045 g, 0,12 mmol) en 2 ml de MeOH, se añadió hidrazina monohidrata (28 10-3 ml, 0,58 mmol). Después de 18 h, los disolventes se evaporaron y la hidrazina residual se co-evaporó 4 veces con etanol. El producto en bruto se purificó por cromatografía de gel de sílice 100 C18-fase inversa (Fluka) (eluyente:H2O) y después se trató por la resina de intercambio catiónico (Dowex® 50WX2, forma Na+, 0,200 g). La resina se filtró y 9 se obtuvo después de la liofilización (0,035 g, 68 %). Fr = 0,44 [MeOH] [α]D20 = + 69,12° (c 1/D2O) EM, IEN-m/z:385 [M – 2Na+ + H]+

1.7.2. Síntesis de AMFA-2 (Fig. 10)

2,3,4,6-tetra-O-trimetilsilil-α-D-manopiranósido de propargilo 10

Se preparó 10 de acuerdo con el mismo procedimiento que para 3. Fr = 0,95 [EP/Et2O (7:3)] Rendimiento = 95 % EM, IEN+ m/z:529 [M+Na]+

2,3,4-tri-O-trimetilsilil-α-D-manopiranósido de propargilo 11:

El compuesto 11 se preparó de acuerdo con el mismo procedimiento que para 4. Fr = 0,37 [EP/Et2O (9:1)] Rendimiento = 57 % EM, IEN+ m/z:457 [M+Na] +

(E)-2,3,4-tri-O-trimetilsilil-6,7-didesoxi-7-dibenziloxifosfinil-α-D-mano-hept-6-enopiranósido de propargilo 13

El fosfonato 13 se preparó de acuerdo con el mismo procedimiento que para 7 a través de la preparación del aldehído 12 preparado siguiendo el mismo procedimiento que para 6. Para obtener el fosfonato de dibencilo 13, el tetrabencilmetilendifosfonato se utilizó en lugar del tetraetilmetilendifosfonato. Fr = 0,83 [Et2O/EP (8:2)] Rendimiento = 63 % EM, IEN+ m/z:691 [M+H] +, 713 [M+Na] +

(E) 2,3,4-Tri-O-trimetilsilil-6,7-didesoxi-7-dibenciloxifosfinil-α-D-mano-hept-6-enopiranósido de (metoxicarboniletil)-1H-1,2,3-triazol-4-il-metilo 14:

Al fosfonato 13 (250 mg, 0,362 mmol) y 3-azidopropionato de metilo (37 µl, 0,435 mmol) en CH2Cl2 (2 ml), se añadieron sucesivamente Cu(CH3CN)4PF6 (135 mg, 0,362 mmol) y 2,6-lutidina (5 µl 0,0362 mmol). La mezcla se agitó durante 20 h a temperatura ambiente. Después de la evaporación del disolvente, el producto en bruto se purificó directamente por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:CH2Cl2 después CH2Cl2/MeOH, 99:1 y 98:2) para dar 14 (236 mg, 80 %). Fr = 0,65 [CH2Cl2/MeOH, (98:2)] EM, IEN+ m/z:820 [M+H] +

6-Desoxi-6-diidroxifosfinilmetilen-α-D-manopiranósido de (metoxicarboniletilo)-1H-1,2,3-triazol-4-il-metilo 15

Una mezcla de fosfonato 14 (130 mg, 0,159 mmol) y 20 mg de Pd/C (10 %) en 6 ml de EtOH/H2O (5:1) se agitó en una atmósfera de hidrógeno (20 bares). Después de 16 h, se eliminó el catalizador por filtración a través de una almohadilla de Celite y el filtrado se concentró a presión reducida para dar 15. Fr = 0,17 [AcOEt/MeOH, (7:3)]

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EM, IEN-m/z:424 [M-H]

Sal disódica de 6-Desoxi-6-diidroxifosfinilmetilen-α-D-manopiranósido (hidrazinocarboniletil)-1H-1,2,3-triazol4-il-metil 16 o AMFA-2

AMFA-2 se preparó siguiendo el procedimiento aplicado a AMFA-1.

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Se añadió gota a gota anhídrido trifluorometansulfónico (106 10-3 ml, 0,697 mmol) a -40 ºC a 4 (300 mg, 0,57 mmol) y 2,6-di-terc-butil-4-metilpiridina (153 mg, 0,744 mmol) disuelta en CH2Cl2 (3 ml). La mezcla se agitó durante 30 min y después se diluyó con CH2Cl2 y el estrato orgánico se lavó con agua, se secó con MgSO4 y se concentró al vacío. El exceso de 2,6-di-terc-butil-4-metilpiridina se eliminó por precipitación en hexano. El triflato bruto 35 se utilizó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.

A una solución del triflato 35 (328 mg, 0,50 mmol) en THF (3 ml) se añadió a TA la sal sódica del malonato dibencilico (0,720 mmol) diluida en THF (15 ml). Después de la terminación de la reacción, la mezcla que contenía 36 se trató con HCl 1 N para desililar el malonato 36. Después de 10 min, la mezcla se neutralizó con NaHCO3 ac. La fase acuosa se extrajo dos veces con CH2Cl2. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (CH2Cl2, y después CH2Cl2/MeOH, 9:1) dando lugar a 37 (0,075 g, 23 %). Fr = 0,52 [CH2Cl2/MeOH, (9:1)] EM, IEN+ m/z :597 [M+Na] +

Acido [5-metoxicarbonilpentil-6,7-didesoxi-7-(carboxi)-α-D-mano-octopiranósido]urónico 38

La desbencilación de 37 se realizó de acuerdo con el mismo procedimiento que para la preparación del fosfonato 15. Fr = 0,34 [AcOEt/MeOH, (8:2)] Rendimiento = 93 % EM, IEN+ m/z :395 [M+H] +

-

EM, IEN+ m/z :393 [M-H]

Sal disódica de [5-metoxicarbonilpentil-6,7-didesoxi-7-(carboxi)-α-D-mano-octopiranósido]uronato 39 o AMFA-5

Partiendo de 38, el malonato 39 se preparó siguiendo el procedimiento aplicado a AMFA-1. Fr = 0,55 [MeOH] Rendimiento = 56 % EM, IEN-m/z:393 [M- 2Na + H]-

1.7.5. Síntesis de M6P-hexanohidrazida (i.e. compuesto 34) (Fig. 13)

2,3,4-tri-O-trimetilsilil-6-difenoxifosfinil-α-D-manopiranósido de 5-metoxicarbonilpentilo 32

Se añadieron difenilclorofosfato (143 10-3 ml, 0,69 mmol), Et3N (112 10-3 ml, 0,8 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP a 4 (300 mg, 0,57 mmol) disuelto en CH2Cl2 (5 ml). La mezcla se agitó durante 5 h, después se evaporaron los disolventes, el producto en bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (PE/Et2O, 6:4 a continuación, 5:5) dando lugar a 6 (0,42 g, 95 %). Fr = 0,63 [Hexano/AcOEt, (5:5)] EM, IEN+ m/z : 779 [M+Na] +

6-Fosfato-α-D-manopiranósido de 5-metoxicarbonilpentilo 33

Se añadió PtO2 (70 mg) a 32 (0,410 g, 0,54 mmol) disuelto en etanol (15 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 6 h a TA en una atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de Celite y se evaporó al vacío para dar lugar a 33 (0,207 g, 97 %). Fr = 0,12 [AcOEt/MeOH (8:2)] EM, IEN-m/z : 387 [M-H]-, 775 [2M-H]-

Sal disódica de 5-hidrazinocarbonilpentil-6-fosfato-α-D-manopiranósido 34

Partiendo de 33, el fosfato 34 se preparó siguiendo el procedimiento aplicado a AMFA-1. Fr = 0,28 [Isopropanol/NH4OH, (5:5)] Rendimiento = 25 % EM, IEN-m/z:387 [M- 2Na + H]-

1.8. Análisis de las propiedades farmacológicas de AMFA-1.

Como se muestra en la Figura 14, la afinidad de unión, la estabilidad en 75 % (v/v) de suero humano y la ausencia de toxicidad en los fibroblastos humanos de AMFA-1 fueron idénticos a las del fosfonato 1 solo. Del mismo modo, AMFA-1 no mostró ninguna toxicidad en líneas celulares de cáncer de mama humano MCF7 y MDA (datos no mostrados). Esto indica que la adición del enlazador hexanohidrazida en la posición anomérica no altera las propiedades farmacológicas del análogo de la M6P.

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1.13. La eficacia terapéutica de IDUA-AMFA-1 (MPSI) en el modelo de ratón de la mucopolisacaridosis I.

Ratones IDUA homocigotos -/- (6-8 semanas de edad) fueron tratados por vía intravenosa con vehículo solo (control)

5 o con neoIDUA 0,16 mg/kg de peso corporal / semana durante 6 semanas. Los GAG secretados en la orina se analizaron después de 6 inyecciones y se normalizaron con respeto a la concentración de creatinina de la orina utilizando los métodos descritos anteriormente [Barbosa et al., Glycobiology Adv. Access 13: 647-53, 2003].

Las concentraciones de GAG secretados se redujeron significativamente en la orina en 59,8 % por este tratamiento

10 (véase la Tabla 2). Esto indica la eficacia de IDUA-AMFA-1 para el tratamiento de la MPS-I. Estos datos indican la eficacia terapéutica de la enzima IDUA-AMFA-1 obtenida por producción en el sistema de expresión de baculovirus y el subsiguiente injerto AMFA para dirigirse al CI-M6PR.

Tabla 2: Relaciones entre las concentraciones de GAG secretados / concentraciones de creatinina en orina de 15 ratones homocigotos MPS-I (% de control).

Tiempo de tratamiento

Ratones MPS-I Control (5 ratones) Ratones MPS-I + IDUA-AMFA-1 (0,16 mg/kg peso corporal) (6 ratones)

6 semanas

100 ± 18,5 59,8 ± 9,0*

Media ±DT; *p< 0,0005 (prueba de Student)

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Claims (1)

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