CN108218932B

CN108218932B - 凝集素受体介导的癌症预靶向治疗药物

Info

Publication number: CN108218932B
Application number: CN201711450688.3A
Authority: CN
Inventors: 贾兵; 王凡; 姚美男
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108218932A

Abstract

一种基于凝集素受体预靶向策略的癌症治疗前药，所述前药是蒽环类抗肿瘤抗生素的前药，具有如下式I所述的结构，本发明还提供所述化合物的药物组合物和用途。

Description

凝集素受体介导的癌症预靶向治疗药物

技术领域

本发明涉及一种基于凝集素受体预靶向策略的癌症治疗前药，尤其涉及一种用于治疗凝集素受体介导的结直肠癌的前药。

背景技术

凝集素(Lectin)是一类能与生命体中糖化合物中糖基发生特异性结合的蛋白质，其被研究的历史已超过一百余年。上个世纪90年代，科学家们发现许多胃肠道肿瘤中凝集素表达量远远高于癌周组织。例如Ohannesian等人曾经将21种结直肠癌细胞系进行分子生物学分析，发现有20种均表达凝集素。因此，对于结直肠癌而言凝集素无疑是一个很好的药物作用靶点，可以用于肿瘤的诊断和治疗。

亲和素(Avidin)提取自蛋清中，分子量66–69kDa，是一种高度糖基化、带正电荷的蛋白质(pI＝10.5)，含有末端N-乙酰化的葡萄糖及甘露糖残基。这些糖残基能被凝集素特异性识别，并发生高亲和力的结合形成Avidin–Lectin复合物。在生物体内，Avidin可以特异性的结合肿瘤细胞高表达的Lectin，未与Lectin结合的Avidin会重新进入血液循环，被肝吸收并通过肝胆代谢出体外。因此，Avidin可以作为Lectin的特异性配体，用于在体检测Lectin表达水平的靶向分子或特异性载体。

癌症的临床治疗中，化疗是目前最常用的治疗手段之一。但由于一般化疗药物对肿瘤细胞和组织不具有选择性，对正常的体细胞造成极大的损害，导致广泛的毒副作用，限制了化疗药物的临床应用。

蒽环类非细胞周期特异性抗肿瘤抗生素自20世纪70年代问世以来，因疗效确切，抗肿瘤谱广，已成为临床上最有效的抗肿瘤药物之一。目前，临床上常用的蒽环类药物有阿霉素(DOX，多柔比星)、柔红霉素、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星以及米托蒽醌等。这些药物对多种恶性肿瘤都具有很强的细胞毒性，但是其作为一种小分子药物，在体内代谢迅速、不具有对肿瘤部位的靶向性，因此可以引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应，其中心脏毒性是蒽环类药物最严重的毒副作用，使其治疗效果受到限制。

发明内容

为了改善现有技术存在的上述问题，本发明提供如下式I所述的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、或其药学上可接受的盐：

其中：

R1、R2、R5、R6、R7彼此独立的选自：H、OH、卤素、NH₂、C_1-6烷基；

R3为H、OH、C_1-6烷氧基；

R8为H、OH、任选被OH取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、CH₂OC(O)(CH₂)_mRa；

R9为H、OH、卤素；

R10为OH、NH₂、N₃、NHCOCF₃、C_1-6烷氧基、任选被C_1-6烷氧基取代的3-6元饱和杂环；

R11为-OH、-OSO₂C_1-6烷基、-N₃、-C_1-6烷氧基、其中OH任选被H、-CH₃、-NH₂、-OCH₃取代的六元糖苷基；

R12为H、卤素、任选被卤素取代的-C_1-6烷基；

Ra为-COOH、-NH₂、-C_1-6烷基；

m为1-6的整数，如1、2、3、4、5、6；

-L-选自如下所示的连接臂：

R各自独立的选自H、任选被羟基取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、-NH₂；

n为3-8的整数，例如3、4、5、6、7、8；

s为0-6的整数，例如0、1、2、3、4、5、6。

根据本发明，所述化合物可具有式II所示的结构：

其中：

R1、R2、R7彼此独立的选自：H、OH、F、NH₂、CH₃；

R3为H、OCH₃；

R8为H、OH、CH₃、CH₂OH、CH₂OC(O)(CH₂)₅COOH、CH₂OC(O)(CH₂)₂NH₂、CH₂OC(O)(CH₂)₃CH₃；

R9为H、OH、F；

R10为-OH、-NH₂、NHCOCF₃、-OCH₃、-N₃、

R11为-OH、-OSO₂CH₃、-N₃、-OCH₃、

R12为H、CH₃、CF₃；

n为3-8的整数，如3、4、5、6、7、8。

优选地，所述化合物可具有如下式III所示的结构(立体异构体)：

其中所述基团定义同上述式I结构。

作为实例，本发明化合物可为式III中为n＝4的以下化合物：

R3为OCH₃，R8为CH₂OH，R11为OH，R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为OCH₃，R8为CH₃，R11为OH，R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为H，R8为CH₃，R11为OH，R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为OCH₃，R8为CH₂OH，R11为R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为OCH₃，R8为CH₂OC(O)(CH₂)₃CH₃，R11为OH，R10为NHCOCF₃，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为H，R8为CH₂OC(O)(CH₂)₅COOH，R11为OH，R10为OH，R9为F，R12为CH₃；或者

R3为H，R8为CH₂OC(O)(CH₂)₂NH₂，R11为OH，R10为OH，R9为F，R12为CH₃；或者

R3为H，R8为CH₃，R11为OH，R10为OH，R9为H，R12为H；或者

R3为H，R8为CH₃，R11为OSO₂CH₃，R10为R9为H，R12为CH₃。

本发明还提供所述式I化合物的制备方法，包括将蒽环类化合物式I-1与式I-2反应得到式I化合物：

其中，所述基团符号具有如上式I所述的定义；

根据本发明的制备方法，所述反应可以在溶剂中进行,如二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、甲苯、甲醇等；或者该反应在碱催化下，以二甘醇等作为溶剂。

根据本发明的制备方法，所述反应的温度可以为15-50℃，优选接近室温，例如25℃；

根据本发明的制备方法，所述反应的时间可以为12-24小时，优选放置过夜；并优选地，在放置过程中避光。

优选地，所述制备方法还包括使用高效液相色谱对产物式I进行分析纯化；

当使用高效液相色谱时，可以在0-5min内使用流动相为体积比为95:5的流动相A:流动相B；之后至32min左右时使用流动相为体积比为20:80的流动相A:流动相B；

流动相A是中性水相流动相即可，例如含2g/L NH₄OAc去离子水；流动相B可以为任意不参与反应的有机相，例如乙腈、甲醇；按照以下方式梯度淋洗；0-5-13-18-28-32-36min，0％B-5％B-30％B-33％B-40％B-80％B-0％B；

根据本发明的制备方法，所述式I-2化合物可通过购买或制备获得。例如从ThermoScientific公司购买到所述化合物，或者由可购买的式I-2化合物的前体羧酸制备得到。

优选地，所述制备方法还包括式I-2化合物的制备：所述方法包括将式I-3的化合物与水合肼反应

根据本发明的制备方法，在式I-3的化合物与水合肼反应前，先加入EDC和NHS活化；

根据本发明的制备方法，所述制备式I-2化合物的反应可以在溶液中进行,如二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)；

根据本发明的制备方法，所述制备式I-2化合物的反应温度可以为25-50℃，优选30-40℃，例如33℃；

根据本发明的制备方法，所述制备式I-2化合物的反应时间可以为2-8小时，优选4小时；

优选地，所述式I-2化合物的制备方法还包括使用高效液相色谱对产物式I-2进行分析纯化；

当使用高效液相色谱时，可以在0-5min内使用流动相为体积比为95:5的流动相A:流动相B；之后在18min左右时使用流动相体积比为67:33的流动相A:流动相B；

可以使用流动相A：含2g/L NH₄OAc去离子水，流动相B：乙腈，按照以下方式梯度淋洗：0-5-13-18-23min，0％B-5％B-30％B-33％B-0％B；

本发明的制备方法，反应路线短，步骤简单，所用试剂环境友好，无污染。

本发明还提供一种药物组合物，包含治疗有效量的式I化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、或其药学上可接受的盐。

根据本发明，所述药物组合物可包含上述化合物的一种、两种或更多种。还可任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。

所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述pH调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

本发明的药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。药物可以手术前、手术中、手术后施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。式I化合物的单次剂量可以在每个患者每天约0.0001至约10000mg的宽范围内变化。该范围可以更特别地为成人(约60kg)每天约0.001mg/kg至100mg/kg体重/天。

本发明还提供一种药物系统，所述系统包含治疗有效量的式I化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、或其药学上可接受的盐和Avidin。

优选地，所述药物系统是一种试剂盒，本发明的式I化合物和Avidin分装在所述试剂盒内。实施治疗时，患者首先单一日剂量注射Avidin，剂量可以在每个患者每天约0.0001至约10000mg的宽范围内变化，该范围可以更特别地为成人(约60kg)每天约0.001mg/kg至100mg/kg体重/天。Avidin注射2-10小时后，优选4-5小时后，再实施本发明药物的给药。

本发明还提供所述式I化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。

根据本发明，所述药物用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，例如在血液、肝、肠、肾、胃、脾、肺、肌肉、骨头等部位的恶性肿瘤。优选那些凝集素lectin受体高表达的癌症，例如胃肠道肿瘤，优选结直肠癌。

本发明还提供一种治疗血液系统和实体恶性肿瘤，特别是治疗或缓解结直肠癌的方法，将治疗有效量的式I化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐和Avidin组成药物系统，基于肿瘤预靶向策略，施用于有此需求的个体。

根据本发明，所述个体可以为哺乳动物，如人类。

有益效果

蒽环类抗肿瘤抗生素因其不具有对肿瘤部位的靶向性，产生多种毒副作用，限制了使用效果。我们发现，将所述蒽环类抗肿瘤药物制备成前药，所述前药可与配体亲和素Avidin发生高效的非共价特异性结合，其结合力非常强，约为抗原和抗体结合亲和力的万倍左右，而Avidin可以和肿瘤癌症中高表达的凝集素Lectin特异性结合。因此我们建立了Avidin和本发明前药的预靶向系统，利用Avidin将本发明的前药富集在肿瘤部位，前药在受体介导的内吞作用下进入溶酶体，并在酸性条件下释放所述药物，杀伤肿瘤细胞。经实验证明，本发明式I化合物，即所述蒽环类抗肿瘤抗生素的前药具有以下优异效果：1)本发明设计的前药结构极性增强从而提高了原型蒽环类抗肿瘤药物的水溶性，便于制成各种剂型，尤其是注射剂；2)本发明的前药具有小分子结构，其与抗肿瘤大分子药物性质差异很大，分属两种不同的药物形式，因此本发明的前药具有小分子药物的特定优势，例如可进入细胞内、生物相容性好、肝脏滞留少、正常组织处药物代谢迅速、生产成本低、便于储存运输等；3)本发明设计的前药具有pH敏感特性，在生理pH值(～7.4)的水溶液状态下较稳定，显示出非常低的细胞毒性。但特异性结合Avidin并通过Lectin受体介导被内吞至肿瘤细胞进入溶酶体后(pH～5.0)，前药便快速水解并大量释放原型蒽环类抗肿瘤药物。4)本发明设计的前药结构及预靶向药物系统，具有肿瘤细胞/非肿瘤细胞的高摄取比，即增加了对肿瘤的靶向性，降低了非靶器官的毒性，同时具有低剂量高肿瘤细胞增殖抑制效果，比单独施用蒽环类抗肿瘤药具有更好的治疗活性以及更低的毒副作用。

术语定义和说明

除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。

本文所记载的“蒽环类抗肿瘤抗生素”是一类现有技术已知的抗肿瘤药物，其结构通常由一个芳香稠环结构和一个脱氧糖结构组成。本发明优选的蒽环类抗肿瘤抗生素由以下结构式表示：其中R4为糖苷基。更优选地，所述结构式中的基团定义如本发明式I化合物中所述，R4如式I结构式中相应的糖苷基所定义。例如多柔比星(阿霉素、DOX)、柔红霉素、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星、米托蒽醌、氨柔比星等等。

本文所记载的数值范围，当该数值范围被定义为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“0～10的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数。当该数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“0～10的数”应当理解为不仅记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。

术语“任选/任意”或“任选地/任意地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

术语“C1-6烷基”应理解为优选表示具有1～6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，表示具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。

术语“C1-6烷氧基”中的烷基具有与上述“C1-6烷基”相同的含义。

术语“3-6元饱和杂环”应理解为包含1-3个独立选自N、O和S的杂原子的一价单环。所述杂环基可以通过所述碳原子中的任一个或氮原子(如果存在的话)与分子的其余部分连接。3元环，如氮杂环丙烷基；4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基。

术语“六元糖苷基”应理解为氧杂环己烷的吡喃糖苷基，所述吡喃糖例如是葡萄糖、甘露糖、半乳糖等或它们的立体异构体。例如葡萄糖还可以是D-葡萄糖、L-葡萄糖，α-D-葡萄糖，β-D-葡萄糖等。

术语“卤素”是指F、Cl、Br、I。

本文所用术语“药学上可接受的盐”是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。药学上可接受的盐是指把母体化合物中的碱基基团转换成盐的形式。药学上可接受的盐包括，但不仅限于，碱基基团例如胺(氨)基的无机或有机酸盐类。例如硝酸盐、盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。

本文使用的“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。式I化合物含有不对称或手性中心，因此，存在不同的立体异构形式。式I的所有立体结构和混合物一样，包括外消旋混合物，作为目前申请的一部分。非对映体混合物能够分离成单独的非对映体，基于它们不同的物理化学性质，采用众所周知的手段，例如，对映异构体的拆分可通过与适当的光学活性物质(例如手性醇或Mosher`s莫氏酰氯)反应转换为非对映异构体，将其分离并转化(如水解)为相对应的单一的异构体。式I中的化合物可能存在着不同的互变异构形式，这些形式都包含在本申请范围内。例如，酮-烯醇和亚胺-烯胺形式的化合物。

本文所用的术语“治疗”和其它类似的同义词包括缓解、减轻或改善疾病或病症症状，预防其它症状，改善或预防导致症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，使疾病或病症好转，缓解由疾病或病症导致的症状，或者中止疾病或病症的症状，此外，该术语包含预防的目的。该术语还包括获得治疗效果和/或预防效果。所述治疗效果是指治愈或改善所治疗的潜在疾病。此外，对与潜在疾病相关的一种或多种生理症状的治愈或改善也是治疗效果，例如尽管患者可能仍然受到潜在疾病的影响，但观察到患者情况改善。就预防效果而言，可向具有患特定疾病风险的患者施用所述组合物，或者即便尚未做出疾病诊断，但向出现该疾病的一个或多个生理症状的患者施用所述组合物。

本文所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开化合物的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。

本文所使用的术语“预靶向”是指将Avidin和本发明的前药按照先后顺序、按照一定时间间隔分别施药。例如首先将一定剂量的Avidin注射至患者体内，经过2-10小时的代谢，再给于患者施药一定剂量的本发明设计的前药。Avidin可以特异性的结合肿瘤细胞高表达的Lectin受体，未与Lectin结合的Avidin会重新进入血液循环，被肝吸收并通过肝胆代谢出体外。结合在肿瘤部位的Avidin将本发明的前药富集在肿瘤细胞表面，前药在受体介导的内吞作用下进入溶酶体，并在酸性条件下释放所述药物，完成肿瘤预靶向治疗策略。

附图说明

图1：实施例1中间体产物的质谱分析图；

图2：实施例1式I化合物bDOX(终产物)的质谱分析图；

图3：实施例2式I化合物bDOX在不同pH条件下阿霉素的释放曲线，其中a-c分别为pH 5.0、6.0、7.4的阿霉素释放HPLC监测图谱；d为释放率归一后拟合曲线；

图4实施例3人胚肾细胞HEK293、肿瘤细胞HT-29和LS180对三种药物pretargetedbDOX、DOX及bDOX摄取的共聚焦显微图。

图5a：实施例3肿瘤细胞HT-29和LS180分别进行pre-bDOX、DOX及bDOX处理6、24及48h后的细胞存活情况；

图5b：实施例3人胚肾细胞HEK293分别进行pre-bDOX、DOX及bDOX处理6、24及48h后的细胞存活情况；

图6：实施例4预靶向的bDOX和单纯的DOX在肿瘤和正常器官的生物分布，其中上图是肿瘤和主要脏器离体观，下图是荧光成像结果图，标尺颜色越浅荧光强度越高；

图7：实施例5中的动物活体光学成像图；

图8a：实施例5中的五组小鼠肿瘤个数图片；

图8b：小鼠肿瘤个数统计图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1式I化合物bDOX的制备

称取原料B-PEG₄-COOH(参见如下反应式)14.74mg溶于200μL DMF(1液)，EDC 32mg溶于30μL去离子水(2液)，NHS 20mg溶于30μL DMF(3液)，将2液与3液加入1液中混匀，活化30min。活化后加入150μL水合肼，33℃振荡4h，用高效液相在210nm波长分析并收样。流动相A：含2g/L NH₄OAc去离子水，流动相B：乙腈。梯度：0-5-13-18-23min，0％B-5％B-30％B-33％B-0％B。产物冻干称重(中间体产物的质谱分析图见附图1，m/z[M+H]⁺为506.26)。

称取上一步产物和盐酸阿霉素各4mg，溶于2.5mL DMF中，加4μL TFA，25℃避光放置过夜，用高效液相在210nm、485nm波长分析并收样。流动相A：含2g/L NH₄OAc去离子水，流动相B：乙腈。梯度：0-5-13-18-28-32-36min，0％B-5％B-30％B-33％B-40％B-80％B-0％B。产物冻干称重(产物命名为：bDOX，质谱分析图见附图2，m/z[M+H]⁺为1031.51，m/z[M+Na]⁺为1053.51，m/z[M+K]⁺为1069.48)。

实施例2式I化合物bDOX作为前药的酸性控释实验

前药的阿霉素释放实验分别在pH 7.4、pH 6.0、pH 5.0的磷酸盐缓冲液(0.2M)中进行，模拟体内正常环境、肿瘤微环境及溶酶体内环境。

实施步骤如下：bDOX溶解于缓冲液中使其终浓度为1mg/mL，于37℃空气浴中120rpm恒速振荡。在不同时间点(0，1，2，5，8，18和30h)取100μL溶液用HPLC分析。

结果如附图3，在pH 5.0的条件下，药物释放迅速，30h时释放率已达到97％；在pH6.0时药物也有释放，释放率为64％；而前药在pH 7.4的环境中较为稳定，30h后药物释放率低至15％。这些结果说明前药bDOX中的腙键在酸性环境中具有高敏感性。

另外，已知阿霉素水溶性很差，所以注射用药物都是阿霉素盐酸盐。而本发明制备得到的阿霉素前药bDOX，和原型阿霉素比，具有提高的水溶性。

实施例3式I化合物bDOX的体外细胞摄取实验

实施步骤如下：将三种细胞孵育在共聚焦小皿里，每皿1.45×10⁵个细胞，于37℃孵育过夜。每种细胞各加入等阿霉素浓度(9.0625μM DOX)的三种药物pretargeted bDOX、free DOX及bDOX，其中预靶向组先孵育avidin 5小时后再孵育bDOX。细胞孵育药物4小时后移除药物并用PBS漂洗3遍，用488nm激光激发，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞对药物的摄取情况。

结果如附图4，对于人正常组织细胞HEK293，细胞对阿霉素的摄取远高于对预靶向前药的摄取，这说明预靶向给药bDOX对正常组织的毒副作用小；对于结直肠癌细胞HT-29及LS180，细胞对预靶向前药的摄取远高于对阿霉素的摄取，具有统计学差异，这说明预靶向给药可使更多的化疗药物被肿瘤细胞摄取，具有更好的肿瘤抑制效果。

实施例4式I化合物bDOX的体外细胞治疗实验

分别在肿瘤细胞HT-29(Lectin⁺⁺)、LS180(Lectin⁺)和人正常体细胞HEK293(Lectin^-)的治疗实验中进行验证。

实施步骤如下：将三种细胞接种于96孔板中，每孔3.65×10⁴个。每种细胞分别按照预靶向bDOX(pre-bDOX)策略及单纯只进行阿霉素(DOX)及bDOX孵育处理。其中预靶向组提前将Avidin与细胞孵育5h后，再将前药bDOX加入。各种药物孵育6h、24h、48h后用CCK8试剂盒检测细胞存活率。

结果如附图5a，5b，孵育药物48小时，对于肿瘤细胞HT-29，预靶向给药bDOX的半数细胞致死药物浓度(IC₅₀)为0.67μM，而DOX的IC₅₀为1.46μM；对于肿瘤细胞LS180，预靶向给药bDOX的IC50为10.69μM，而阿霉素的IC50为40.96μM，这说明预靶向给药bDOX对肿瘤细胞的杀伤力更强。相反，对于对照组HEK293细胞来说，孵育药物48小时后，药物浓度达到10μM及以上时预靶向药物组的细胞存活率显著高于阿霉素组，具有统计学意义。这足以说明预靶向给药bDOX比单独给药阿霉素具有更好的治疗效果及更低的副作用。

实施例5式I化合物bDOX的离体生物分布实验

所述体内生物分布评价，主要包括以下步骤：

(1)裸鼠结直肠癌腹腔弥散肿瘤模型的建立：将LS180细胞腹腔注射至5周龄BALB/c裸鼠，每只裸鼠接种5×10⁶个细胞，于SPF级环境中饲养；

(2)接种细胞10天后，将荷瘤鼠随机分为两组(预靶向组和阿霉素组)，每组3只。对于预靶向组，经腹腔注射每只100μL 300μg的avidin，5小时后再经尾静脉注射10mg/kg的bDOX；对于阿霉素组，经腹腔注射每只100μL的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH＝7.2-7.4)，5小时后经尾静脉注射每只10mg/kg的盐酸阿霉素。注射4小时后处死荷瘤鼠，取心、肝、脾、肺、肾、瘤，于小动物活体光学成像系统中进行荧光显像，所用激发波长为465nm，发射波长为600nm。

成像结果如附图6所示，由于bDOX的荧光性质与阿霉素基本相同，所以bDOX与阿霉素荧光的相对强弱可以代表两者浓度的相对大小。预靶向组在肿瘤部位的荧光强度明显高于阿霉素组，而在心、肝、肺、肾的荧光强度明显低于阿霉素组，说明预靶向组药物在肿瘤部位的浓度高于阿霉素组，而在正常器官的浓度低于阿霉素组，由此可知，肿瘤细胞对本发明预靶向的阿霉素前药摄取率非常高，而正常细胞对本发明阿霉素前药的摄取率却非常低，可见本发明的预靶向阿霉素前药增加了对肿瘤的靶向性，同时降低了非靶器官的毒性。

实施例6式I化合物bDOX的动物治疗实验

所述动物治疗效果评价，主要包括以下步骤：

(1)裸鼠结直肠癌腹腔弥散肿瘤模型的建立：将转染Luciferase的LS180细胞腹腔注射至5周龄BALB/c裸鼠，每只裸鼠接种5×10⁶个细胞，于SPF级环境中饲养；

(2)接种细胞4天后，将荷瘤鼠随机分为5组，每组5只。各组处理方式如下：(I)高剂量预靶向组，经腹腔注射每只100μL 300μg的avidin，5小时后经尾静脉注射7.5mg/kg的bDOX；(II)低剂量预靶向组，经腹腔注射每只100μL 300μg的avidin，5小时后经尾静脉注射5mg/kg的bDOX；(III)阿霉素组，经腹腔注射每只100μL的avidin，5小时后经尾静脉注射5mg/kg的DOX；(IV)单纯bDOX组，经腹腔注射每只100μL的PBS，5小时后经尾静脉注射5mg/kg的bDOX；(V)载体对照组，经腹腔注射每只100μL的avidin，5小时后经尾静脉注射100μL的Biotin。两天给药一次，共5次。

(3)利用小动物活体光学成像系统，每隔一天对荷瘤鼠进行Luciferase荧光成像。由于LS180细胞转染了luciferase，因此通过荧光强度可以监测肿瘤生长情况。

(4)在最后一次给药两天后将小鼠安乐死，解剖并统计每只小鼠的肿瘤个数。

治疗效果如附图7所示，PBS对照组的肿瘤生长迅速，单纯bDOX组的肿瘤生长情况与PBS对照组基本一致，说明单纯注射bDOX不会引起肿瘤生长的抑制。但是，当采用预靶向的bDOX时，低剂量预靶向组的肿瘤生长受到明显的抑制，且抑制效果明显优于阿霉素组。并且，高剂量的预靶向组进一步提高了肿瘤生长抑制效果。肿瘤个数统计结果如图8所示，预靶向给药组的肿瘤个数显著少于阿霉素组的(p<0.05)，且远少于对照组的(p<0.001)，而阿霉素组与对照组没有统计学差异。由此可知，在动物实验中，本发明预靶向的阿霉素前药具有低剂量高肿瘤生长抑制作用的优异效果，且因毒性较小，可提高临床用药时的给药剂量窗。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.下式II所述的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐：

其中：

R1、R2、R7彼此独立的选自：H、OH、F、NH₂、CH₃；

R3为H、OCH₃；

R9为H、OH、F；

R10为-OH、-NH₂、NHCOCF₃、-OCH₃、-N₃、

R11为-OH、-OSO₂CH₃、-N₃、-OCH₃、

R12为H、CH₃、CF₃；

n为3-5的整数。

2.根据权利要求1所述的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物可具有如下式III所示的结构(立体异构体)：

3.根据权利要求2所述的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐，其特征在于，化合物为式III中n为4的以下化合物：

R3为H，R8为CH₃，R11为OH，R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为OCH₃，R8为CH₂OH，R11为R10为NH₂，R9为H，R12为CH₃；或者

R3为H，R8为CH₃，R11为OH，R10为OH，R9为H，R12为H；或者

R3为H，R8为CH₃，R11为OSO₂CH₃，R10为R9为H，R12为CH₃。

4.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1-3任一项所述的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可包含所述化合物的一种、两种或更多种，还可任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于所述药物组合物是注射给药组合物。

7.一种预靶向药物系统，其特征在于，所述系统包含权利要求1-3任一项所述的治疗有效量的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐和Avidin。

8.根据权利要求7所述的药物系统，其特征在于，所述药物系统是一种试剂盒，所述化合物和Avidin分装在所述试剂盒内。

9.权利要求1-3任一项所述的化合物、其消旋体、立体异构体、或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于：用于制备治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的药物。

10.根据权利要求9所述的用途，所述肿瘤是在血液、肝、肠、肾、胃、脾、肺、肌肉、骨头部位的恶性肿瘤。

11.根据权利要求10所述的用途，所述肿瘤是凝集素Lectin受体高表达的癌症。

12.根据权利要求11所述的用途，所述肿瘤是胃肠道肿瘤。

13.根据权利要求12所述的用途，所述肿瘤是结直肠癌。

14.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：将所述化合物和Avidin作为预靶向药物系统联用，分装在试剂盒内。