ES2575252T3 - Proceso para la producción de ácido hialurónico en Escherichia coli o Bacillus megaterium - Google Patents

Proceso para la producción de ácido hialurónico en Escherichia coli o Bacillus megaterium Download PDF

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Abstract

Proceso para la preparación de ácido hialurónico en Bacillus megaterium, que comprende las siguientes etapas: (a) cultivo de células huésped bacterianas de Bacillus megaterium transformadas de manera estable con el sistema de la ARN polimerasa T7, bajo condiciones apropiadas para la producción de ácido hialurónico en presencia de xilosa como inductor, en donde dichas células huésped bacterianas se caracterizan por ser transformadas adicionalmente con: (i) al menos un vector plásmido episomal que comprende una secuencia que codifica la hialuronano sintasa de la enzima y una secuencia que codifica para la enzima UDP-glucosa deshidrogenasa en tándem, bajo el control del promotor T7 fuerte inducible, preferiblemente bajo el control del promotor T7 fuerte inducible del bacteriófago T7; o (ii) al menos un vector plásmido episomal que comprende una secuencia que codifica para la enzima hialuronato sintasa, una secuencia que codifica para la enzima UDP-glucosa deshidrogenasa, una secuencia que codifica para la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa y una secuencia que codifica para la enzima glucosa 6 fosfato isomerasa, bajo el control del promotor T7 fuerte inducible, preferiblemente bajo el control del promotor T7 fuerte inducible del bacteriófago T7; (b) recuperación del ácido hialurónico del medio de cultivo, en donde dichas células huésped bacterianas de Bacillus megaterium transformadas de manera estable con el sistema de la ARN polimerasa T7 y con el vector plásmido (i) o (ii) capaz de producir ácido hialurónico de la etapa a) se preseleccionan en la placa en un gradiente de xilosa.

Description

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pueden ser utilizados para verificar la clonación. Dos oligonucleótidos para uso con PCR se diseñaron y sintetizaron para recuperar la secuencia de codificación:
5’atgagaacattaaaaaacctcataac 3’ (SEQ ID NO:9) y 5’taataattttttacgtgttccccag 3’ (SEQ ID NO:10)
El ADN genómico de la bacteria Streptococcus zooepidemicus se recuperó con el kit de extracción de Qiagen. La secuencia codificante de 1254 pb se recuperó con PCR. El amplificado esperado de las dimensiones correctas fue controlado con la enzima de restricción HindIII, y dio lugar a dos bandas de aprox. 100 pb y 1150 pb que se corresponden con el corte esperado.
Ejemplo 3: Construcción del plásmido pGEM4hasA
Otros dos oligonucleótidos con la siguiente secuencia se crearon para clonar la secuencia de hasA en el plásmido pGEM4Z:
5’ ggaggatccatgagaacattaaaaaacctcat 3’ (SEQ ID NO:11) y
5’ cagtctagattataataatttttacgtgtcc 3’ (SEQ ID NO:12)
El sitio de restricción BamHI fue creado en el primer oligonucleótido cerca de 5', y el sitio de restricción XbaI fue creado en el segundo oligonucleótido, de nuevo en 5'. El amplificado obtenido a través de estos dos oligonucleótidos se clonó entre los sitios de restricción BamHI y XbaI en el plásmido pGEM4Z (PROMEGA) entre los mismos sitios para dar el plásmido pGEM4hasA.
La secuencia de ADN entre dichos dos sitios de restricción se analizaron con un secuenciador ABI 7000, resultó ser correcta, y es idéntica a la publicada.
HindIII-BamHI ----------------hasA---------------XbaI-SalI
Se comprobó el plásmido para la expresión de la proteína recombinante en E. coli y presentó un peso molecular de aprox. 42 kDa, lo que concuerda con el peso reportado para la proteína en la bibliografía, aunque tiene un peso molecular teórico de 47.778 kDa (Figura 3).
La clonación de hasA a partir de streptococcus, por lo tanto, también se manifestó en términos de expresión de la proteína. El plásmido es incapaz de producir cantidades significativas de ácido hialurónico debido a que carece del gen tuaD.
Ejemplo 4: Construcción de un plásmido con el gen tuaD después de hasA
Con esta construcción, el gen hasA se coloca en tándem con el gen tuaD. Para este fin, el plásmido pGEM4hasA, que ya contiene el gen hasA, se utiliza como vector. El plásmido se cortó con XbaI y SalI, y la secuencia del gen tuaD del plásmido pRSEtuaD se cortó con XbaI y -XhoI y se clonó en los mismos sitios (XhoI y SalI son compatibles) pGEM4hasA
HindIII-BamHI ---------------hasA---------------XbaI-SalI pRSE triaD
XbaI--NdeI----------------tuaD-----------------NheI -BamHI--BglI -XhoI
se obtiene la siguiente secuencia final:
HindIII-BamHI ---------hasA----------XbaI--NdeI---------tuaD-NheI -BamHI--BglI -XhoI
Ejemplo 5 Clonación del gen hasA-tuaD en el plásmido pPT7 para B. megaterium.
Este plásmido pPT7 (MoBiTec) contiene dos orígenes de replicación, uno para E. coli y uno para B. megaterium, y por lo tanto se pueden propagar en ambas bacterias. También contiene la resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina, que se puede utilizar para E. coli y B. megaterium respectivamente, y la secuencia de reconocimiento para ARN polimerasa T7, es decir, el promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 del bacteriófago T7 seguido por su terminador.
El plásmido contiene el sitio de restricción BsrGI con la secuencia tgtaca unas pocas bases después de la secuencia Shine-Dalgarno, y un sitio BamHI (ggatcc) después de la metionina inicial. Se sintetizaron dos oligonucleótidos para la clonación con el fin de crear los siguientes dos sitios de restricción en el extremo:
5’GCTTGTACATGAGAACATTAAAAAACCTCA 3’ (SEQ ID NO:13) 5’AGGGATCCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG 3’ (SEQ ID NO:14)
esto es BsrGI y BamHI en dirección 5’ y en dirección 3’ de los genes hasA y tuaD respectivamente. El amplificado de 2698 pb obtenido se cortó con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y se clonó en los mismos sitios de restricción como plásmido pPT7 para obtener el plásmido pPT7hasAtuaD (Figura 4).
La secuencia completa de este plásmido, denominado pPT7hasAtuaD, se analizó y se expone a continuación:
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El plásmido tiene un peso molecular de 7880 pb y contiene los diversos genes responsables de la síntesis de ácido hialurónico bajo el control del promotor fuerte T7 del bacteriófago T7. La secuencia de la sintasa de hasA a partir de Streptococcus equi cae entre las bases 196 y 1383, y la del gen tuaD entre las bases 1430 y 2873.
5 Ejemplo 6: Clonación del gen gtaB (UDP-Glc pirofosforilasa)
El gen gtaB a partir de Bacillus Subtilis se recuperó del genoma bacteriano como el anterior, y a través de dos oligonucleótidos que tienen las siguientes secuencias:
5’ATGTCTAGAATAATAAGGAAGGTGCCTTTTAAATGAA 3’ (SEQ ID NO:15)
5’CTCTCGAGCTAGCTTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAAG 3’ (SEQ ID NO:16)
10 El producto amplificado de 925 pb se cortó con XbaI y XhoI y se clonó en el plásmido pGEM4hasA en los mismos sitios de restricción; el plásmido pGEMhasA-gtaB se obtiene de esta manera.
Ejemplo 7 Clonación del gen pgi a partir de Bacillus subtilis en el plásmido pRSET B
El gen pgi (glucosa 6 fosfato isomerasa, también llamado pgi fosfoglucoisomerasa, correspondiente a hasE de S. zooepidemicus) se recuperó a partir del genoma de bacterias como se describe anteriormente con estos dos
15 oligonucleótidos
5’TACATATGACGCATGTACGCTTGACTACTCCAAAAG 3’ (SEQ ID NO:17)
5’ATGCTAGCTCATTTATAATCTTCCAGACGTTTTTCAAG 3’ (SEQ ID NO:18)
y PCR, y se clonó después del corte con enzimas de restricción NdeI y NheI en plásmido pRSETB entre los mismos sitios de restricción. El plásmido pRSEpgi se obtiene de esta manera. Se coloca el gen pgi bajo el control de un 20 promotor T7, y cuando se transfiere a las células de E. coli BL21 DE3 que produce la proteína del peso molecular esperado. Este plásmido se cortó con XbaI y PstI, y el fragmento de 1340 pb se clonó en el plásmido pGEMhasA-gtaB entre los sitios NheI y PstI. El sitio de restricción XbaI, como NheI, se pierde después de la clonación. De esta manera el gen pgi se coloca detrás del gen gtaB. El plásmido, denominado pGEM hasA-gtaB-pgi, se cortó con XbaI y XhoI, y el fragmento que contiene las secuencias que codifican para gtaB y pgi se clonó en el plásmido pRSEtuaD entre los
25 mismos sitios. El plásmido obtenido se denomina pRSEtuaD-gtaB-pgi.
Este último se cortó con XbaI y BamHI y el fragmento que contiene la secuencia que codifica para tuaD, gtaB y pgi se clonó en el plásmido pPT7hasAtuaD entre los mismos sitios para obtener el plásmido pPT7hasAtuaDgtaBpgi, que se llama pT7hyal.
La secuencia del plásmido pT7hya1 se muestra a continuación
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