ES2566228B1 - Uso de ésteres derivados de pirazol protón-ionizables y sus correspondientes sales para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis - Google Patents

Abstract

Uso de ésteres derivados de pirazol protón-ionizables y sus correspondientes sales para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis.#Uso de ésteres derivados de pirazol, preferiblemente derivados protón-ionizables en forma neutra o en forma de sales (pirazolatos), como medicamentos y más particularmente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de origen parasitario tales como la enfermedad de Chagas o la leishmaniasis.

Description

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DESCRIPCION

Uso de esteres derivados de pirazol proton-ionizables y sus correspondientes sales para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis.

La presente invention se refiere al uso de esteres derivados de pirazol proton- ionizables en forma neutra o en forma de sales (pirazolatos), como medicamentos y mas particularmente para la prevention y/o el tratamiento de enfermedades de origen parasitario tales como la enfermedad de Chagas o la leishmaniasis.

ESTADO DE LA TECNICA

La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) es una enfermedad tropical infecciosa catalogada en el grupo de las denominadas “enfermedades olvidadas” ("neglected deseases”), que afecta en America Latina a millares de personas en areas de poblacion con bajos recursos economicos, y representa por tanto un grave problema de salud.

Se trata de una enfermedad parasitaria, generalmente cronica, causada por el parasito protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). El reservorio natural lo constituyen armadillos, marsupiales, roedores, murcielagos y primates silvestres, ademas de ciertos animales domesticos (perros y gatos). Se transmite al hombre por triatominos hematofagos tales como Triatoma infestans, Rhodius prolixus o Triatoma dimidiata, que defecan sobre las picaduras que ellos mismos han realizado para alimentarse. La enfermedad puede ser tambien transmitida por mecanismos no vectoriales tales como transfusion de sangre contaminada o donation de organos, por ingestion de alimentos contaminados o verticalmente de una madre infectada al feto.

Inicialmente, la fase de infection aguda es normalmente asintomatica, y la mayor parte de los pacientes no se da cuenta de que han sido infectados; pero esta fase aguda evoluciona posteriormente a un estado cronico, al cual llegan entre el 30% y el 40% de todos los enfermos chagasicos, en el que se manifiestan severas complicaciones a los 10-30 anos posteriores a la infeccion. Suele producirse cardiomiopatla difusa grave, alteraciones del sistema nervioso periferico, dilatation patologica del esofago y colon, megaesofago, y megacolon, respectivamente. Muchos de ellos sufren fallo cardiaco y muerte subita. Debido al gran incremento de viajes

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internacionales y a la inmigracion, la enfermedad de Chagas se ha extendido, no solo a traves de toda America Latina, sino tambien a Estados Unidos, Canada, Espana, Italia y otros palses.

Actualmente no hay una terapia adecuada ni una vacuna efectiva. Los dos medicamentos principalmente utilizados para tratar la enfermedad de Chagas son dos heterociclos nitroaromaticos descubiertos hace mas de tres decadas: el nifurtimox (Nfx, 3-metil-4-(5-nitrofurfurilidenamino)tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dioxido, Lampit®, que recientemente se ha dejado de fabricar por Bayer), y el benznidazol (Bzn, N- bencil-2-(2-nitroimidazol-1-il)acetamida, Rochagan® de Roche, ahora fabricado por LAFEPE en Brasil). El uso de dichos medicamentos en la fase aguda es ampliamente aceptado, pero su eficacia en la fase cronica es bastante controvertida, y se calcula que la cura parasitologica en esta fase solo se obtiene en un 10-20% de los pacientes [Maya, J.D. et al., Comp. Biochem. Physiol. Part A 2007, 146, 601-620]. Ademas, causan efectos secundarios severos como pancreatitis y toxicidad cardiaca. El mas utilizado en cllnica es el benznidazol, a pesar de que en adultos genera un considerable numero de efectos secundarios adversos, tales como trastornos digestivos, hematologicos, dermatologicos y neurologicos [Castro, J.A. et al., Hum. Exp. Toxicol. 2006, 25, 471-479].

Otro aspecto preocupante de la enfermedad de Chagas es la alta capacidad de reactivation de la parasitemia en individuos inmunodeprimidos. Se ha comprobado que pacientes curados que han sido sometidos posteriormente a trasplante de rinon o hlgado, diagnosticados de sida, o tratados con quimioterapia anticancerosa, sufrieron reactivacion de la enfermedad de Chagas con un curso cllnico muy agresivo conduciendo a meningoencefalitis y/o miocarditis aguda. De hecho, cuando enfermos con cardiopatla chagasica cronica sufren trasplante cardiaco, se produce reactivacion de la parasitemia y el tratamiento con benznidazol solo conduce a remision temporal, pero la infection por T. cruzi persiste [Campos, S.V. et al., J. Heart Lung Transp. 2008, 27, 597-602].

Considerando estos hechos, puede concluirse que urge la necesidad de encontrar nuevos medicamentos menos toxicos para los pacientes y mas efectivos en la fase cronica de la enfermedad de Chagas que el benznidazol, utilizado actualmente, y que tengan ademas la capacidad de reducir la reactivacion de la parasitemia en casos de inmunodeficiencia.

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Otra importante enfermedad producida por parasitos protozoarios kinetoplastidos es la leishmaniasis, causada por la infeccion con diferentes especies de protozoos del genero Leishmania, que se transmite a traves de la picadura de dlpteros de los generos Phlebotomus y Lutzomyia. Actualmente, la leishmaniasis es endemica en 98 palses, principalmente en America, pero tambien en Europa y Asia, con mas de 350 millones de personas en riesgo, mas de 2 millones de nuevos casos cada ano, y una mortalidad anual que supera los 60.000 pacientes. La Organization Mundial de la Salud la ha clasificado en noveno lugar entre las enfermedades infecciosas mas severas.

La leishmaniasis se puede presentar con diferentes manifestaciones cllnicas: (I) visceral, que es la mas severa de todas; (II) la cutanea, que origina nodulos y ulceras que pueden persistir durante anos; y (III), la mucocutanea, que causa lesiones permanentes en la boca, nariz o en la mucosa genital. La leishmaniasis visceral es la forma cllnica que se cobra mas vidas mundialmente. Puede ser fatal si no se trata a tiempo y se caracteriza por la inflamacion del hlgado y del bazo, acompanada por distension abdominal severa, perdida de condition corporal, desnutricion y anemia.

La Leishmania infantum (L. infantum) se considera que es el principal agente etiologico de la leishmaniasis visceral en el sureste de Europa. Utiliza perros como reservorio y afecta principalmente a ninos, aunque la coinfection con HIV y el uso creciente de quimioterapia para inmunosupresion en trasplantes han conducido a un aumento considerablemente del porcentaje de casos en adultos. Otra especie significativa es la Leishmania braziliensis (L. braziliensis) que afecta principalmente a los palses andinos, y cuenca de la Amazonia, y causa leishmaniasis cutanea y mucocutanea.

El tratamiento de la leishmaniasis es complicado. No hay vacunas efectivas y las pruebas diagnosticas no son especlficas debido a las deficientes medidas de control del vector [Barrett, M.P. et al., Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2, 471-482]. La quimioterapia es el arma principal para combatir las manifestaciones cllnicas de la mayorla de las formas de leishmaniasis. Los medicamentos que se han utilizado comunmente hasta ahora son el estibogluconato sodico (Pentostan®) y el antimoniato de meglumina (Glucantime®). Pero son muy inefectivos y causan multitud de efectos secundarios toxicos tales como nauseas, vomitos, diarrea, erupciones cutaneas,

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vertigos, arritmia cardiaca, hipotension, hepatitis y pancreatitis. El tratamiento actual con Glucantime, se basa en la aplicacion intramuscular durante un plazo de 20 a 30 dlas. Sin embargo, este farmaco muestra una toxicidad elevada y ademas no es efectivo [Palumbo, E., Am. J. Ther. 2009, 16, 178-182].

Otros medicamentos utilizados son: anfotericina B (AmBiosome®) que se administra durante un maximo de 10 dlas y no presenta toxicidad, pero es sumamente caro (1.500 a 2.400 $ por tratamiento); la miltefosina que es de administration oral pero el tratamiento dura 4 semanas y tiene restricciones de uso para gestantes y ninos; la pentamidina y el ketoconazol. Por otra parte, las infecciones repetidas o los tratamientos inefectivos han ocasionado resistencia de los parasitos a estas terapias [Singh, N. et al., Indian J. Med. Res. 2006, 123, 411- 422]. Por lo tanto, resulta necesario obtener nuevos agentes antileishmaniasicos de menor coste, mayor efectividad y con menores efectos secundarios adversos.

La busqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y de la leishmaniasis se ha centrado principalmente en su action potencial sobre componentes esenciales y exclusivos de tripanosomatidos. Entre las enzimas especlficas de tripanosomatidos se encuentra la hierro superoxido dismutasa (FeSOD), que juega un papel fundamental en la supervivencia de parasitos tales como T. cruzi y Leishmania spp., por su capacidad para evadir el dano originado por los radicales toxicos del hospedador. Como la FeSOD no esta presente en humanos puede considerarse una atractiva diana para la busqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y de la leishmaniasis. Dado que los grupos prosteticos son esenciales en todos los procesos enzimaticos, las modificaciones en el centro activo de la enzima, ya sea por disociacion del metal o por cambios en la geometrla de coordination, podrlan ser una via eficaz para desactivar su accion antioxidante, y posiblemente afectar tanto al crecimiento como a la supervivencia de las celulas del parasito.

Se ha descrito anteriormente que alquilamino derivados de benzo[g]ftalazina o ftalazina con actividad antiparasitaria in vitro y/o in vivo frente a T. cruzi y Leishmania spp., mostraron una potente capacidad de inhibition de la FeSOD de los respectivos parasitos [Sanchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 9900-9913]. De forma similar, poliaminas macroclclicas y macrobiclclicas conteniendo anillos de pirazol, que inhiben la FeSOD de T. cruzi, mostraron actividad tripanosomicida en las fases aguda

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y cronica de la enfermedad de Chagas [Sanchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 4231-4243]. Sin embargo, no se ha descrito hasta el momento la utilization de esteres aclclicos sencillos derivados de pirazol proton-ionizables y de sus correspondientes sales (pirazolatos), a los que hace referencia esta invention, ni como inhibidores de FeSOD ni como agentes antiparasitarios para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona el uso de unos compuestos de baja toxicidad y bajo coste, que poseen una potente actividad antiparasitaria frente a la clase Kinetoplastea y en concreto frente a la familia Trypanosomatidae, en particular actividad tripanosomicida en la enfermedad de Chagas, mas particularmente, en casos de inmunodeficiencia en los que se produce frecuentemente reactivation de la parasitemia, ademas de actividad frente a la leishmaniasis. En general, dichos compuestos se caracterizan por una potente eficacia para inhibir la enzima hierro superoxido dismutasa (FeSOD). Dado que la supervivencia del parasito esta estrechamente vinculada a la capacidad de sus enzimas (FeSOD) de evitar el dano originado por los radicales toxicos de su hospedador y que, por lo tanto, la FeSOD desempena un papel relevante como parte de la defensa antioxidante en los parasitos que causan dichas enfermedades, en la presente invencion se han utilizado compuestos de formula (I) y (II) capaces de inhibir la FeSOD de Trypanosoma y Leishmania, limitando su defensa antioxidante frente a los radicales toxicos del hospedador.

Como se evidencia en los ejemplos, los compuestos de la invencion son estructuralmente diferentes a los farmacos conocidos y presentan una toxicidad mucho menor. Son particularmente significativos los resultados de actividad antiparasitaria y baja toxicidad obtenidos in vivo frente a T. cruzi, en la fase aguda y en la cronica de la enfermedad de Chagas, asl como en condiciones de inmunodeficiencia en las que se producen procesos de reactivacion de la parasitemia.

Un primer aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de formula general (I) o (II) (a partir de ahora compuestos de la invencion):

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donde:

R1 y R2, pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo alquilo (C1-C10);

R3 se selecciona de entre hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C10); y

X+ es un cation monovalente farmaceuticamente aceptable;

para la elaboration de un medicamento, preferiblemente el medicamento es un

agente antiparasitario.

Por tanto, otro aspecto de la presente invention se refiere a los compuestos de formula general (I) o (II), descritos en la presente invencion, para su uso como medicamento.

El termino "alquilo”, se refiere en la presente invencion, a cadenas alifaticas lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo o terc-butilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a 4 atomos de carbono.

En una realization preferida los compuestos de la invencion R3 es hidrogeno.

En otra realizacion preferida, R1 y/o R2 es un grupo alquilo (C1-C4), mas preferiblemente R1 y R2 son iguales.

En una realizacion preferida, X+ es un cation alcalino, mas preferiblemente se selecciona de entre Li+, Na+ o K+, aun mas preferiblemente es Na+.

En una realizacion preferida el compuesto de la invencion se selecciona de entre: 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo;

3.5- bis(metoxicarbonil)pirazolato sodico;

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo;

3.5- bis(etoxi carbonil)pirazolato sodico;

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1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo;

3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sodico;

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de diisopropilo; y

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.

En una realization mas preferida, los compuestos de la invention son 1H-pirazol-3,5- dicarboxilato de dietilo o 3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sodico, aun mas preferiblemente el compuesto es el 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de formula general (I) o (II) segun se han descrito previamente, para la elaboration de un medicamento para la prevention y/o el tratamiento de una enfermedad parasitaria, que preferiblemente esta basada en la inhibition de la enzima FeSOD parasitaria, mas preferiblemente para la prevencion y/o el tratamiento enfermedades causadas por un parasito de la clase Kinetoplastea, mas preferiblemente de la familia Trypanosomatidae, mas preferiblemente los parasitos son del genero Trypanosoma o Leishmania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.

Las enfermedades parasitarias a tratar podrlan ser leishmaniasis o tripanosomiasis. La “leishmaniasis” es una
enfermedad causada por un
protozoo del
genero
Leishmania y transmitido, principalmente por dipteros conocidos como “sand fly”, moscas de la arena o jejenes. Esta enfermedad se produce en humanos y animales vertebrados, como pueden ser
marsupiales,
canidos,
roedores y
primates. Las “tripanosomiasis” son enfermedades producidas en humanos o animales vertebrados que son causadas por parasitos protozoarios del genero
Trypanosoma, entre ellas se puede encontrar la tripanosomiasis humana africana, tambien conocida como enfermedad del sueno, la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas o la tripanosomiasis en animales o
Nagana. Preferiblemente la tripanosomiasis es la enfermedad de Chagas, preferiblemente en su fase aguda o en su fase cronica, en particular en individuos inmunodeprimidos en los que se produce reactivation de la parasitemia.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que comprende al menos un compuesto de formula general (I) o (II) segun se ha descrito

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previamente, junto con un vehlculo farmaceuticamente aceptable, opcionalmente dicha composition puede comprender otro principio activo, preferibiemente el principio activo es un antiparasitario. Ademas el uso de dicha composicion sera en una cantidad terapeuticamente efectiva.

Los adyuvantes y vehlculos farmaceuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehlculos conocidos por los tecnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboration de composiciones terapeuticas.

Los esteres de pirazol de la presente invention y sus sales farmaceuticamente aceptables, asl como las composiciones farmaceuticas que los contienen, pueden ser utilizados junto con otros farmacos, o principios activos adicionales, preferiblemente antiparasitarios, para proporcionar una terapia de combination. Dichos farmacos adicionales pueden formar parte de la misma composicion farmaceutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composicion separada para su administration simultanea o no a la de un compuesto de formula general (I) o (II) o a la composicion farmaceutica que los comprende.

Ejemplos de un principio activo adicional incluyen, pero no se limitan a: antimoniato de meglumina, estibogluconato sodico, anfotericina B, ketoconazol, miltefosina, paromomicina, pentamidina, alopurinol, itraconazol, interferon gamma, bleomicina, levamisol, mebendazol, metronidazol, clorpromazina, miconazol, minomicina, metiluracilo, nifurtimox, diminazeno, palmoato de cicloguanilo, emetina, furazolidona, rifampicina, isoniazida, interleucina 2, trimetoprima-sulfametoxazol, suramina, melarsoprol, eflornitina, cloroquina, quinina, fluconazol, tinidazol, asl como cualquiera de sus sales, solvatos, esteroisomeros o prodrogas farmaceuticamente aceptables administrados de forma simultanea o secuencial a al menos uno de los compuestos de formula (I) o (II) descritos en la presente invencion.

Por tanto, otro aspecto de la presente invencion se refiere a una preparation combinada para su uso por separado, simultaneo o secuencial que comprende al menos un compuesto de formula general (I) o (II) como se ha descrito anteriormente y otro principio activo, preferiblemente un antiparasitario. Mas preferiblemente el uso de esa preparacion combinada para la fabrication de un medicamento para el tratamiento y/o prevention de una enfermedad causada por un parasito, preferiblemente de la

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clase Kinetoplastea, mas preferiblemente de la familia Trypanosomatidae, mas preferiblemente los parasitos son del genero Trypanosoma o Leishmania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.

En el sentido utilizado en esta description, la expresion "cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la action terapeutica determinada por sus propiedades farmacologicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendra determinada, entre otras causas, por las caracterlsticas propias de los compuestos, as! como la edad, estado del paciente, la severidad de la alteration o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administration.

Dicha composition terapeutica se puede preparar en forma solida o en suspension, en un diluyente farmaceuticamente aceptable. La composicion terapeutica proporcionada por esta invention puede ser administrada por cualquier via de administracion apropiada, para lo cual dicha composicion se formulara en la forma farmaceutica adecuada a la via de administracion elegida.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere a un compuesto seleccionado de entre: 3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sodico; 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de

dipropilo; 3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sodico; y 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1 Evaluation de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infection y division de las formas intracelulares de T. cruzi en cultivo de celulas Vero infectadas. (A) % de infeccion. (B) numero de amastigotes por celula infectada. (C) numero de

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tripomastigotes en el medio de cultivo. Los valores son resultados de cuatro experimentos independientes; en la leyenda se indica el valor de la reduction del correspondiente parametro en relation con el control para cada uno de los compuestos testados.

FIG. 2.- (A) Inhibition in vitro (%) de CuZnSOD de eritrocitos humanos con los compuestos 3 y 4. (B) Inhibicion in vitro (%) de FeSOD de formas epimastigote de T. cruzi con los compuestos 3 y 4. Concentraciones ensayadas: 1-100 pM; en la leyenda se indican los valores de IC50 de la correspondiente SOD obtenidos para cada uno de los compuestos testados. Los valores de IC50 para los eritrocitos se obtuvieron por extrapolation matematica.

FIG. 3.- Evaluation de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infection y division de las formas intracelulares de L. infantum en cultivo de macrofagos J774.2 infectados con L. infantum. (A) % de infeccion. (B) numero de amastigotes por celula infectada. Medido a una concentration IC25; en la leyenda se indica el valor de la reduccion del correspondiente parametro en relacion con el control para cada uno de los compuestos testados.

FIG. 4.- Evaluacion de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infeccion y division de las formas intracelulares de L. braziliensis en cultivo de macrofagos J774.2 infectados con L. braziliensis. (A) % de infeccion. (B) numero de amastigotes por celula infectada. Medido a una concentracion de IC25; en la leyenda se indica el valor de la reduccion del correspondiente parametro en relacion con el control para cada uno de los compuestos testados.

FIG. 5.- (A) Inhibicion in vitro (%) de CuZnSOD de eritrocitos humanos por los compuestos 3 y 4. (B) Inhibicion in vitro (%) de FeSOD de formas promastigote de L. infantum por los compuestos 3 y 4. (C) Inhibicion in vitro (%) de FeSOD de formas promastigote de L. braziliensis por los compuestos 3 y 4. Concentraciones ensayadas: 1-100 pM; en la leyenda se indican los valores de IC50 de la correspondiente SOD obtenidos para cada uno de los compuestos testados. Los valores de IC50 para los eritrocitos se obtuvieron por extrapolacion matematica.

FIG. 6.- Parasitemia en modelo murino durante la fase aguda de la enfermedad de Chagas. Dosis administrada: 25 mg/kg; en la leyenda se indica el valor de la reduccion

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del numero de tripomastigotes/mL en relacion con el control (animales sin tratar) para cada uno de los compuestos testados.

FIG. 7- Porcentaje de reactivation de la parasitemia tras la administration de un ciclo de tratamiento inmunosupresor tanto para el grupo de ratones control (animales sin tratar) como el de tratados.

FIG. 8.- Niveles totales de Ig-G anti-7. cruzi expresados en unidades de absorbancia (DO, densidad optica) para los grupos de ratones control (animales sin tratar) y tratados a diferentes dlas posinfeccion (p.i.). Para el dla 120 p.i. los grupos fueron divididos en dos subgrupos: inmunosuprimidos (IS) y no inmunosuprimidos.

FIG. 9.- Resultado de la amplification de PCR para los organos de raton post mortem (dla 120 p.i.), mediante el uso de unos primers especlficos para el gen de la superoxido dismutasa del parasito (sod-b). Calles: (M) Marcador de pares de bases, (1) Control positivo de PCR, (2) Control negativo de PCR, (3) Corazon del grupo control de la infection, (4) Corazon del grupo infectado y tratado con el compuesto 4, (5) Corazon del grupo infectado y tratado con el compuesto 3, (6) Corazon del grupo control de la infeccion inmunosuprimido, (7) Corazon del grupo infectado, tratado con el compuesto 4 e inmunosuprimido, (8) Corazon del grupo infectado, tratado con el compuesto 3 e inmunosuprimido.

EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invention mediante unos estudios realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la invencion

Ejemplo 1

Preparacion de los compuestos de formula general (I) y (II)

Los compuestos de formula general (I) se prepararon por esterification del acido 1H- pirazol-3,5-dicarboxllico con el alcohol correspondiente y los compuestos de formula general (II) se prepararon por tratamiento de los esteres (I) con hidroxido sodico.

Procedimiento general de sintesis de compuestos de formula (I):

cuando R1 y R2 son iguales y se representan como R y R3 es H

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o o

HO'JJ ^

N-NH

ROH HCI (g)

imagen2

Metodologia: A una solucion de acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato (5,00 g; 28,7 mmol) en 100 mL del alcohol adecuado (ROH) se hizo pasar una corriente de cloruro de hidrogeno gaseoso hasta saturacion, manteniendo la agitacion durante 24 h. Transcurrido ese tiempo, se elimino el disolvente a sequedad y se anadio una solucion acuosa al 10% de NaCO3H hasta alcanzar un pH basico. La mezcla de reaccion se extrajo con cloroformo y se seco la fase organica con MgSO4. La elimination del disolvente conduce al producto deseado en forma de aceite cromatograficamente puro que solidifica al poco tiempo.

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo (1)

o o

MeO-^^^Y^OMe

N-NH

(1)

Reactivos: acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato, metanol. Rendimiento: 4,86 g (92%) (lit. 86%; Schenck, T.G. et al., Inorg. Chem. 1985, 24, 2334-2337). P. f. 154155 oC. Analisis elemental (C7H8N2O4): Teorico %C 45,66, %H 4,38, %N 15,21; Hallado %C 45,77, %H 4,30, %N 15,07. vmax (KBr)/cm-1 3369 (NH), 1729, 1709 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) 5: 14,71 (1 H, s), 7,21 (1 H, s), 3,84 (3H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 160,7, 143,3, 135,9, 111,3, 52,5. EM-FAB (m/z): 185 (MH+).

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo (3)

o o

imagen3

N-NH

(3)

Reactivos: acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato, etanol. Rendimiento: 5,48 g (90%). P. f. 54-55 oC (hexano) (lit., p.f. 53-54 oC; Iturrino, L. et al., Eur. J. Med. Chem. 1987, 22, 445-451). Analisis elemental (C9H12N2O4): Teorico %C 50,94, %H 5,70, %N 13,20; Hallado %C 50,80, %H 5,51, %N 13,34. vmax (KBr)/cm‘1 3260 (NH), 1730 (CO). 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6) 5: 14,62 (1 H, s), 7,18 (1 H, s), 4,31 (4H, c), 1,31 (6H, t).

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13C RMN (75 MHz; DMSO-d6) 5: 160,9, 159,0, 143,6, 134,7, 110,8, 60,9, 14,1. EM- FAB (m/z): 213 (MH+).

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo (5)

o o

N-NH

(5)

Reactivos: acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato, propanol. Rendimiento: 6,35 g (92%). P. f. 53-55 oC. Analisis elemental (C11H16N2O4): Teorico %C 54,99, %H 6,71, %N 11,66; Hallado %C 54,91, %H 6,65, %N 11,71. vmax (KBr)/cm-1 3443 (NH), 1732 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) 5: 14,64 (1 H, s), 7,17 (1 H, s), 4,19 (4H, t), 1,67 (4H, m), 0,92 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 161,2, 158,6, 143,8, 134,7, 110,8, 66,3, 21,54, 10,2. EM-FAB (m/z): 241 (MH+).

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de diisopropilo (7)

imagen4

N-NH

(7)

Reactivos: acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato, isopropanol. Rendimiento: 6,21 g (90%). P. f. 50-52 oC. Analisis elemental (C11H16N2O4): Teorico %C 54,99, %H 6,71, %N 11,66; Hallado %C 55,07, %H 7,08, %N 11,62. vmax (KBr)/cm-1 3432 (NH), 1724 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-da) 5: 14,58 (1 H, s), 7,11 (1 H, s), 5,09 (4H, m), 1,28 (6H, s), 1,26 (6H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 161,0, 158,5, 144,4, 135,4, 111,1, 69,0, 22,0. EM-FAB (m/z): 241 (MH+).

1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo (8)

o o

imagen5

N-NH

(8)

Reactivos: acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico monohidrato, butanol. Rendimiento: 6,78 g (88%). P. f. 46-47 oC. Analisis elemental (C13H20N2O4): Teorico %C 58,19, %H 7,51, %N 10,44; Hallado %C 58,17, %H 7,42, %N 10,40. vmax (KBr)/cm'1 3437 (NH), 1727 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) 5: 14,66 (1 H, s), 7,16 (1 H, s), 4,25 (4H, t), 1,65

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(4H, m), 1,37 (4H, m), 0,89 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-da) 5: 160,3, 143,8, 135,4, 111,2, 64,9, 30,6, 19,1, 14,0. EM-ES+ (m/z): 269 (MH+).

Procedimiento general de sintesis de sales sodicas de formula (II):

cuando R1 y R2 son iguales y se representan como R

RoJSTV^OR ------^oH * RO^^^^OR

N-NH N-N

Na+

(I) (H)

Metodologia: A una solucion del ester del acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico (1,00 g) en 30 mL del alcohol correspondiente (ROH), se anadio lentamente una cantidad equimolecular de hidroxido sodico disuelto en 10 mL del mismo alcohol. La mezcla de reaccion se mantuvo con agitacion y a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado en cada caso, se concentro el disolvente y se filtro el solido obtenido.

3.5- bis(metoxicarbonil)pirazolato sodico (2)

o o

MeO OMe

N-N Na+

(2)

Reactivos: ester metllico del acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico, metanol. Condiciones de reaccion: agitacion a temperatura ambiente 48 h. Rendimiento: 1,06 g (95%). P. f.: >215 oC (descomp.). Analisis elemental (C7H7N2O4Na): %C 40,79, %H 3,42, %N 13,59; Hallado %C 40,52, %H 3,55, %N 13,42. vmax (KBr)/cm-1 1704 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) 5: 6,97 (1H, s), 3,68 (6H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 163,3, 142,5, 111,0, 50,3. EM-FAB (m/z): 207 (MH+).

3.5- bis(etoxicarbonil)pirazolato sodico (4)

o o

^°JS©rJ'0^

N-N

Na+

(4)

Reactivos: ester etllico del acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico, etanol. Condiciones de reaccion: agitacion a temperatura ambiente 1 h. Rendimiento: 1,07 g (97%). P. f.: 213-

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214 oC (lit.3, p.f. 212-214 oC) (Reviriego, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16458-16459. Analisis elemental (C9H11N2O4Na): %C 46,15, %H 4,70, %N 11,96; Hallado %C 46,03, %H 4,68, %N 12,10. Vmax (KBr)/cm-1 1670 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-da) 5: 6,69 (1H, s), 4,16 (4H, c), 1,25 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 163,6, 142,4, 111,1, 58,5, 14,4. EM-FAB (m/z): 235 (MH+).

3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sodico (6)

o o

N-N

Na+

(6)

Reactivos: ester propllico del acido 1H-pirazol-3,5-dicarboxllico, propanol. Condiciones de reaccion: agitacion a temperatura ambiente 48 h. Rendimiento: 1,06 g (97%). P. f.: >300 oC. Analisis elemental (C11H15N2O4Na): %C 50,38, %H 5,77, %N 10,68; Hallado %C 50,72, %H 5,70, %N 10,43. Vmax (KBr)/cm-1 1724, 1696 (CO). 1H RMN (500 MHz; DMSO-da) 5: 6,93 (1H, s), 4,05 (4H, t), 1,64 (4H, m), 0,92 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-d6) 5: 163,9, 142,5, 110,9, 63,9, 21,7, 10,3. EM-FAB (m/z): 263 (MH+).

Ensayos de actividad in vitro frente a T. cruzi y Leishmania spp.

Tal y como se demuestra en los Ejemplos 2 (Tabla 1) y 3 (Tablas 2 y 3), los compuestos que comparten la formula general (I) (compuestos 1, 3, 5, 7 y 8) y la formula general (II) (compuestos 2, 4, y 6) son eficaces in vitro en el tratamiento de enfermedades causadas por los parasitos T. cruzi y Leishmania spp., a la vez que mantienen un nivel de toxicidad bajo (sustancialmente menor que los compuestos de referencia). En general, todos ellos inhiben selectivamente la FeSOD de los parasitos T. cruzi y Leishmania spp. en relacion a la CuZnSOD.

Ejemplo 2

Procedimiento de evaluacion de la actividad in vitro y toxicidad de los compuestos 1-8 frente a formas epimastigote (extracelulares) y amastigote (intracelulares) de T. cruzi, toxicidad frente a celulas Vero e indices de selectividad (IS)

Metodologfa: Para estos estudios se utilizo T. cruzi tipo I (cepa SN3, aislada en Guajira al norte de Colombia en humanos, 2006) [Tellez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34]. El cultivo de las formas epimastigote de T. cruzi se realizo in vitro

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en esterilidad en medio de cultivo monofasico MTL (Medium Trypanosomes Liquid) enriquecido con el 10% (v/v) de suero bovino fetal (SBF-I) inactivado a 56 °C durante 30 minutos. El inoculo de parasitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 celulas/mL en 5 mL de medio en frascos de plastico Falcon® de 25 cm2 y se mantuvieron en una estufa a 28 °C. Los cultivos se realizaron de manera rutinaria consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios. Para la realization de los ensayos se usaron tanto formas epimastigote como tripomastigote y amastigote.

Las formas epimastigote de T. cruzi cultivadas de la forma anteriormente descrita fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugation a 1500 rpm durante 10 min. El numero de parasitos fue contado en una camara hemocitometrica de Neubauer y sembrado en una placa de 24 pocillos a una concentracion de 5 x104 parasitos/pocillo.

Los compuestos a ensayar se disolvieron en dimetilsulfoxido (DMSO), disolvente que a una concentration final en el medio de ensayo de 0,01% (v/v) no muestra toxicidad ni tiene ningun efecto sobre el crecimiento de los parasitos. Los compuestos fueron anadidos al medio de cultivo a concentraciones finales de 100, 50, 25, 10 y 1 pM. El efecto de cada compuesto sobre el crecimiento de las formas epimastigote, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluo a las 72 h, usando una camara hemocitometrica de Neubauer y el efecto tripanocida se expreso como la IC50 (concentracion requerida para producir una inhibition del 50%, calculado por el analisis de la regresion lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) [Sanchez- Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 970-979].

Para el estudio del efecto in vitro sobre formas intracelulares de T. cruzi se uso el modelo experimental disenados por los autores de la presente invention [Ramlrez- Maclas, I. et al., Parasitol. Int. 2012, 61, 405-413]. Las celulas Vero se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridas mediante tripsinizacion. Para ello, se elimino el medio de cultivo, seguidamente se cubrio la superficie celular con EDTA- tripsina y se incubo en frlo durante 5 minutos. Tras ello, se paso la mezcla a un frasco de fondo conico de 25 mL de capacidad (esterilln), se centrifugo a 800 rpm durante 5 minutos, se retiro el sobrenadante y las celulas se contaron en camara de Neubauer. Las celulas Vero se resuspendieron a una concentracion de 1 x 104 celulas/pocillo en medio de cultivo RPMI, cultivandose en placas de 24 pocillos, en cada uno de los

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cuales se habla introducido previamente un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm. Para su adherencia, las celulas se dejaron 24 h a 37 °C en 5% CO2.

Una vez adheridas las celulas, se infectaron in vitro con 1 x 105 celulas/pocillo de formas tripomastigote de T. cruzi [Ramlrez-Maclas, I. et al., Parasitol. Int. 2012, 61, 405-413]. La infeccion se mantuvo durante 24 horas para que el parasito entrase en la celula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para obtener la IC50 (100 a 1 pM). A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la retirada de los cristales.

Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les anadio DPX (Panreac®), medio de montaje para microscopla y se tineron con Giemsa; para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyo solucion Azur-Eosina-Azul de Metileno segun Giemsa DC (Codigo 251338) con tampon Sorensen (dilucion 1:10), se mezclo bien y se cubrio la preparation dejando colorear durante 20 minutos. Se lavo con agua destilada. Se dejo escurrir y secar en position vertical. Por ultimo se examino con el objetivo de inmersion y se conto el numero de formas amastigote intracelulares en un total de 200 celulas.

Para el estudio de la toxicidad inespeclfica frente a celulas Vero se uso el modelo experimental disenados por los autores de la presente invention [Marin, C. et al., J. Nat. Prod. 2011, 74, 744-750]. Las celulas Vero fueron establecidas a partir del rinon de un mono verde africano adulto, manteniendo los cultivos a una densidad 1 x 104 celulas/mL a 37 °C y 5% de CO2. Las celulas, se depositaron en un esterilln y se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se descarto y las celulas se resuspendieron en medio RPMI. Se depositaron 1 x 104 celulas/pocillo en placas de titulacion de 24 pocillos, se incubaron durante 24 h a 37 °C en atmosfera humeda enriquecida con 5% CO2. Esto se realizo para que se fijasen las celulas. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25, 10 y 1 pM. A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la preparacion de las muestras para su lectura en el citometro de flujo siguiendo un procedimiento descrito previamente. Se partio de las celulas y el medio presente en los pocillos, a los cuales se adiciono 100 pl de solucion de ioduro de propidio (PI, 100 pg/mL) (Sigma Chemical Co), incubandose a 28 °C en

oscuridad unos 10 minutos; posteriormente, se anadio 100 pL de diacetato de fluorescelna (FDA) (Sigma Chemical Co) en solucion (100 ng/mL) volviendose a incubar a 28 °C en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedio a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se 5 analizaron los resultados teniendo en cuenta que las celulas con la membrana plasmatica intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las celulas danadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculo el porcentaje de viabilidad. El numero de celulas muertas se determino por comparacion con los cultivos control.

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Tabla 1.- Actividad, toxicidad e Indices de selectividad encontrados para los compuestos 1-8 frente a formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentration necesaria para obtener el 50% de inhibition, calculada por analisis de regresion linear del valor Kc a las

15 concentraciones empleadas (1, 10, 25, 50 y 100 pM). bConcentracion necesaria para obtener el 50% de inhibicion frente a celulas Vero despues de 72 h de cultivo. clndice de Selectividad = IC50 de las celulas Vero/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi. Entre parentesis: numero de veces que el IS de los compuestos es superior al IS del farmaco de referencia.

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Compuestos

IC50 pMa Toxicidad IC50 cel. Vero (pM)b ISc

Formas epimastigote

Formas amastigote intracelulares Formas epimastigote Formas amastigote intracelulares

Benznidazol

15,8±1,1 23,3±4,6 13,6±0,9 0,9 0,6

1

40,5±6,3 16,9±2,8 186,5±9,3 4,6 (5) 11,0 (18)

2

27,5±3,2 27,1 ±1,1 139,1±9,3 5,0 (6) 5,1 (9)

3

17,2±2,4 10,8±0,7 385,4±11,5 22,4 (25) 35,7 (59)

4

16,5±1,6 9,3±5,8 404,1±13,3 24,5 (27) 43,4 (72)

5

38,7±7,7 23,6±1,4 154,5±12,5 4,0 (4) 6,5 (11)

6

34,5±2,2 34,5±1,7 170,2±13,8 4,9 (6) 4,9 (8)

7

31,2±3,8 30,9±4,7 179,4±13,1 5,7 (6) 5,8 (10)

8

35,8±4,1 23,7±3,3 242,1±10,6 6,8 (7) 10,2 (17)

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Los compuestos particularmente preferidos de la presente invencion para su uso como antiparasitarios frente a T. cruzi son los compuestos de formula 3 y 4, los cuales presentan un nivel de toxicidad inespeclfica frente a celulas Vero mucho menor que la del benznidazol (Bzn) e incluso menor que el resto de los esteres y pirazolatos estudiados en la presente invencion.

Ejemplo 3

Procedimiento de evaluacion de la actividad in vitro de los compuestos 1-8 frente a formas promastigote (extracelulares) y amastigote (intracelulares) de L. infantum y L. braziliensis, toxicidad frente a macrofagos e indices de selectividad

Metodologia: Para este estudio, se emplearon formas promastigote y amastigote de dos especies del genero Leishmania:

- L braziliensis (MHOM/BR/1975/M2904).

- L infantum (MCAN/ES/2001/UCM-10).

Las especies de Leishmania se mantienen en nuestro laboratorio desde hace varios anos mediante cultivos a 28 °C en medio MTL enriquecido con un 10% de suero bovino fetal inactivo (FCSI) y para que no pierda su virulencia se realizan pases periodicos in vivo en ratones cepa Balb/c [Tellez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34].

Alcanzada la fase exponencial de desarrollo (106 promastigotes/mL), el cultivo fue centrifugado a 1000 g durante 10 minutos a fin de concentrar en un boton las formas flageladas. Las formas amastigote se obtuvieron in vitro previa infestacion de macrofagos de la llnea J774.2 (ECACC 85011428) de acuerdo con el metodo desarrollado por los autores de la presente invencion [Gonzalez, P. et al., J. Antimicrob. Agents 2005, 25, 136-141].

Para los ensayos in vitro de las formas promastigote, se partio de formas promastigote en fase exponencial de crecimiento, cultivadas a 28 °C en medio MTL suplementado con un 10% FCSI de las dos cepas de Leishmania. El ensayo sobre formas promastigote se realiza de forma similar al descrito para el caso de formas epimastigote de T. cruzi.

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Para los estudios sobre formas amastigote se procede de forma similar a la descrita para T. cruzi, solo que en este caso se utilizan macrofagos J774.2 con formas promastigote en fase estacionaria de crecimiento de las dos cepas de Leishmania, segun la metodologla descrita anteriormente.

A lo largo de todos los experimentos se realizaron estudios encaminados a conocer las diferencias en la sensibilidad de los parasitos frente a farmacos de actividad conocida como el benznidazol en el caso de T. cruzi y Glucantime para las dos cepas de Leishmania, lo que nos permitio comparar su comportamiento con los resultados obtenidos con nuestros productos.

Tabla 2.- Actividad, toxicidad e Indices de selectividad encontrados para los compuestos 1-8 frente a formas extracelulares e intracelulares de Leishmania infantum. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentracion necesaria para obtener el 50% de inhibicion, calculada por analisis de regresion linear del valor Kc a las concentraciones empleadas (1, 10, 25, 50 y 100 pM). bConcentracion necesaria para obtener el 50% de inhibicion frente a macrofagos J 774.2 despues de 72 h de cultivo. clndice de Selectividad = IC50 de los macrofagos/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de L. infantum. Entre parentesis: numero de veces que el IS de los compuestos es superior al IS del farmaco de referencia

Compuestos

IC50 pMa Toxicidad IC50 macrofagos (pM)b ISc

Formas promastigote

Formas amastigote intracelulares Formas promastigote Formas amastigote intracelulares

Glucantime

18,0±3,1 30,0±2,7 15,2±1,3 0,8 0,5

1

23,5±4,2 18,4±2,0 166,2±11,4 7,1 (9) 9,0 (18)

2

17,5±3,2 22,4±1,5 222,4±21,2 12,7 (16) 9,9 (20)

3

24,4±1,5 16,3±0,9 233,5±15,6 9,6 (12) 14,3 (29)

4

5,9±0,2 6,7±1,0 288,6±23,1 48,9 (61) 43,1 (86)

5

15,6±0,8 7,6±0,6 170,2±13,5 10,9 (14) 22,4 (45)

6

17,7±2,5 21,3±1,0 264,3±16,9 14,9 (19) 12,4 (25)

7

19,7±0,8 2,8±0,7 158,1±7,4 8,0 (10) 56,1 (113)

8

24,8±2,6 19,1±1,1 271,1±16,1 10,9 (14) 14,2 (28)

Tabla 3.- Actividad, toxicidad e Indices de selectividad encontrados para los compuestos 1-8 frente a formas extracelulares e intracelulares de Leishmania braziliensis. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentracion necesaria para obtener el 50% de inhibicion, calculada por analisis de regresion linear

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del valor Kc a las concentraciones empleadas (1, 10, 25, 50 y 100 pM). bConcentracion necesaria para obtener el 50 % de inhibicion frente a macrofagos J 774.2 despues de 72 h de cultivo. clndice de Selectividad = IC50 de los macrofagos/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de L. braziliensis. Entre parentesis: numero de veces

que el IS de los compuestos es superior al IS del farmaco de referencia.

Compuestos

IC50 pMa Toxicidad IC50 macrofagos (pM)b ISc

Formas promastigote

Formas amastigote intracelulares Formas promastigote Formas amastigote intracelulares

Glucantime

25,6±1,6 31,1±3,0 15,2±1,3 0,6 0,5

1

21,4±1,7 18,2±0,9 166,2±11,4 7,8 (13) 9,1 (18)

2

15,9±0,8 23,2±3,5 222,4±21,2 14,0 (23) 9,6 (19)

3

18,8±1,8 9,3±0,8 233,5±15,6 12,4 (21) 25,1 (50)

4

23,8±3,2 6,8±0,7 288,6±23,1 12,1 (20) 42,4 (85)

5

16,0±1,4 17,9±2,2 170,2±13,5 10,6 (18) 9,5 (19)

6

16,6±1,4 14,7±0,5 264,3±16,9 15,9 (26) 18,0 (36)

7

32,1±2,9 21,5±1,5 158,1±7,4 4,9 (8) 7,35 (15)

8

36,2±3,6 20,8±1,4 271,1±16,1 7,5 (13) 13,0 (26)

Los compuestos particularmente preferidos para su uso como antiparasitarios frente a Leishmania spp. son los de formula 3, 4 y 7. Concretamente, los compuestos 3 y 4 son mucho mas activos frente a formas extracelulares (promastigotes) e intracelulares (amastigotes) de L. infantum y L. braziliensis que el medicamento de referencia, el Glucantime, y mucho menos toxicos sobre macrofagos.

Ejemplo 4

Procedimiento de evaluacion de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infeccion y el crecimiento de parasitos en medios de cultivo de celulas Vero infectadas con T. cruzi

Metodologfa: Las celulas Vero se cultivaron en las mismas condiciones resenadas anteriormente durante 2 dlas. Despues las celulas fueron infectadas in vitro con formas metaclclicas de T. cruzi, en proporcion 10:1. Los compuestos 3 y 4 (a la concentration IC25) fueron adicionados inmediatamente despues de la infestation e incubados por 12 h a 37 °C en 5% CO2. Los parasitos no fagocitados y los productos fueron eliminados mediante lavado y los cultivos infectados fueron cultivados durante 10 dlas en medio fresco, adicionando medio fresco cada 48 horas. La actividad de los compuestos fue determinada por el % de celulas infectadas, numero de amastigotes por celula infectada y numero de tripomastigotes en el medio. Cultivos tratados y sin tratar fueron fijados y tenidos con metanol y Giemsa. El % de celulas infectadas y la media del numero de amastigotes por celula infectada se determino por analisis de

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200 celulas Vero en un microscopio cada 48 horas. El numero de tripomastigotes en el medio fue determinado usando una camara de Neubauer.

En ensayos de crecimiento de parasitos en medios de cultivo de celulas Vero infectadas con T. cruzi, los compuestos 3 y 4 reducen eficazmente la velocidad de infeccion, el numero de amastigotes por celula infectada, y el numero de tripomastigotes en el medio de cultivo en relacion al control (ver FIG. 1). Los valores tlpicos del benznidazol en estos ensayos fueron 23% (FIG. 1A), 13% (FIG. 1B) y 46% (FIG. 1C) [Sanchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 4231-4243].

Ejemplo 5

Procedimiento de evaluacion de la capacidad de los compuestos 3 y 4 para inhibir la FeSOD de epimastigotes de T. cruzi en relacion a la CuZnSOD de eritrocitos humanos

Metodologfa: Los compuestos seleccionados previamente fueron evaluados como inhibidores de la enzima FeSOD exclusiva de protozoos parasitos de la clase Kinetoplastea, y por lo tanto ausente en el hospedador mamlfero, a fin de validar esta nueva y atractiva diana para el diseno de nuevos farmacos con actividad antiparasitaria debido a su capacidad para inactivar la accion de la FeSOD del parasito capturando su ion metalico mediante mecanismos competitivos de complejacion. Paralelamente se realizaron ensayos de selectividad FeSOD (parasito)/CuZnSOD (humana). La inhibicion de los nuevos compuestos sobre la actividad FeSOD/CuZnSOD se cuantifico en un espectrofotometro a 560 nm segun una tecnica descrita anteriormente [Beyer, W.F. & Fridovich, I., Anal Biochem. 1987, 161, 559-66], basada en la reduccion de nitroazul de tetrazolio (NBT) por los iones superoxido y que los autores de la presente invencion han puesto a punto para el ensayo en tripanosomatidos de modo rutinario [Sanchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 970-979; Ramlrez-Maclas, I. et al., J. Antimicrob. Chemother. 2011, 66, 913-919].

En estos ensayos se ha demostrado como inhiben eficaz y selectivamente la FeSOD de formas epimastigote de T. cruzi en relacion a la CuZnSOD de eritrocitos humanos (ver FIG. 2).

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Ejemplo 6

Procedimiento de evaluacion del efecto de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infeccion y el crecimiento de parasitos en medios de cultivo de macrofagos infectados con L. infantum y L. braziliensis

Metodologfa: Macrofagos de la ilnea J774.2, conservados en laboratorio por criopreservacion en nitrogeno llquido y sucesivos pases en cultivo con medio esencial mlnimo (MEM) + glutamina + 20% FCSI, fueron depositados en un esterilln y centrifugados a 100 g durante 5 min, el sobrenadante fue descartado y las celulas resuspendidas en el mismo medio a una concentracion final de 1 x 106 celulas/mL.

Luego, 10 pl de la suspension celular se deposito en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos (cada uno con un cristal cubreobjetos redondo de 10 mm de diametro) en un volumen total de 500 pl, e incubadas por 24 h a 37 °C en atmosfera humeda enriquecida con 5% CO2.

Las celulas fueron infectadas in vitro con formas promastigote de las dos especies de Leishmania, en proporcion 10:1. Los compuestos 3 y 4 (a una concentracion IC25) fueron adicionados inmediatamente despues de la infestacion e incubados por 12 h a 37 °C en 5% CO2. Los parasitos no fagocitados y los productos fueron eliminados mediante lavado y las celulas infectadas fueron cultivadas durante 10 dlas en medio fresco, que se fue adicionando cada 48 horas. La actividad de los compuestos fue determinada por el % de celulas infectadas y el numero de amastigotes por celula infectada [Sanchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 970-979]. Cultivos tratados y sin tratar fueron fijados y tenido con metanol y Giemsa. El % de celulas infectadas y la media del numero de amastigotes por celula infectada se determino por el analisis de 200 celulas en un microscopio cada 48 horas.

En ensayos de crecimiento de parasitos en medios de cultivo de macrofagos J774.2 infectados con L. infantum y L. braziliensis, los compuestos 3 y 4 tambien reducen eficazmente la velocidad de infeccion y division de las formas intracelulares en relacion al control (ver FIG. 3 y 4). Los valores de estos ensayos son resultados de cuatro experimentos independientes. Los valores tlpicos del glucantime en estos ensayos fueron 24% (FIG. 3A), 30% (FIG. 3B), 22% (FIG. 4A) y 37% (FIG. 4B) [Marin, C. et al., Eur. J. Med. Chem. 2013, 62, 466-477].

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Ejemplo 7

Procedimiento de evaluacion de la capacidad de los compuestos 3 y 4 para inhibir la FeSOD de promastigotes de L. infantum y L. braziliensis en relacion a la CuZnSOD de eritrocitos humanos.

Metodologfa: El procedimiento utilizado para evaluar la capacidad de inhibition de la enzima FeSOD de las formas promastigote de L. infantum y L. braziliensis en relacion a la CuZnSOD de eritrocitos humanos fue el mismo descrito anteriormente en el caso de T. cruzi.

Paralelamente a como ocurre en los ensayos de T. cruzi, los dos compuestos seleccionados (3 y 4) inhiben eficaz y selectivamente la FeSOD de promastigotes de L. infantum y L. braziliensis en relacion a la CuZnSOD de eritrocitos humanos (ver FIG. 5).

Ejemplo 8

Procedimiento de evaluacion de la toxicidad de los compuestos 3 y 4 in vivo

Metodologia y resultados: Como modelo se utilizaron ratones albinos de la cepa Balb/c, lote de 5 animales de la misma edad (6-8 semanas) y peso (25-30 g) y de sexo femenino, a los cuales se les administro una dosis inicial de 100 mg/kg de cada compuesto en dlas alternativos con el objeto de averiguar la dosis letal 50 (DL50). En vista de que tras administrar 500 mg/kg peso no se alcanzaba ningun efecto toxico aparente ni la muerte de ningun ejemplar, se procedio a administrar dosis de 500 mg/kg de cada compuesto en dlas alternativos hasta alcanzar los 6 g/kg, donde se decidio cesar el experimento por considerar que estos niveles de administration del compuesto dejaban patente la "no toxicidad” de los mismos. A la semana del cese del tratamiento se realizo un analisis de parametros bioqulmicos de rutina y no se observo ninguna alteration significativa. La unica apreciacion fuera de la norma era que en los 15-20 minutos inmediatos tras la administracion de los compuestos los ratones mostraban cierta hiperactividad tras su traslado a la jaula, que cesaba tras este periodo y no dejaba ninguna secuela o cambio de comportamiento apreciable.

Los ensayos de toxicidad in vivo en modelo murino (ratones albinos de la cepa Balb/c) han dejado patente que a dosis comprendidas entre 500 mg/kg y 6 g/kg, los dos compuestos seleccionados (3 y 4) no producen efectos toxicos aparentes ni se produce la muerte de ningun animal.

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Ejemplo 9

Procedimiento de evaluacion in vivo de la actividad de los compuestos 3 y 4 en la fase aguda de la enfermedad de Chagas

Metodologia: Como modelo se utilizaron ratones albinos de la cepa Balb/c, lote de 6 animales de la misma edad (6-8 semanas) y peso (25-30 g), y de sexo femenino. Inicialmente se busco la dosis letal (DL50) de los compuestos seleccionados (como se ha visto en un ejemplo anterior), as! como su permanencia y estabilidad en suero. Como inoculo se utilizaron tripomastigotes metaclclicos. A cada animal se le inoculo 5 x 105 tripomastigotes metaclclicos, via intraperitoneal. Los animales de experimentation fueron tratados bajo las normas y principios de la gula internacional para la investigation biomedica con animales de experimentacion y con la autorizacion del Comite de Bioetica de la Universidad de Granada. Los lotes quedaron distribuidos de la siguiente manera: a) un lote para el estudio del desarrollo de la enfermedad [fase aguda y fase cronica (Ejemplo 10)], grupo control positivo compuesto por animales infectados y sin ningun tratamiento, y b) un segundo grupo de lotes: animales infectados y tratados con diferentes concentraciones de los compuestos objeto del estudio (un sublote por producto y concentration a ensayar).

La parasitemia, numero de parasitos circulantes, se cuantifico a traves de la camara de conteo de celulas hematicas. Se utilizo sangre periferica, obtenida por puncion de la vena maxilar, en tampon fosfato (PBS). Este conteo se realizo cada 3 dlas, durante 30 dlas (fin de la fase aguda). La administration de los productos se realizo al quinto dla de la infection y, una vez confirmada la parasitacion, se ensayaron diferentes concentraciones de los productos, de acuerdo con los datos de la DL50 y la posologla a la dosis establecida para cada producto y durante 5 dlas. Grupos similares de ratones fueron tratados con benznidazol (5 mg/Kg de peso/dla durante 5 dlas), en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente.

Los dos compuestos 3 y 4 mostraron una gran eficacia de inhibition de la parasitemia en la fase aguda (ver FIG. 6).

Ejemplo 10

Procedimiento de evaluacion in vivo de los compuestos 3 y 4 sobre los porcentajes de reactivation de la parasitemia despues de inmunosupresion en la fase cronica de la enfermedad de Chagas

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Metodologia: Tras el dla 60, los animales entran en fase cronica; al dla 120 del experimento se induce una situation de inmunosupresion con monohidrato de ciclofosfamida segun lo descrito [Cencig, S. et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 2011, 5, e1216]; finalmente tiene lugar el sacrificio de los animales para la extraction de tejidos y organos que seran sometidos a valoracion del efecto de los compuestos a nivel de la parasitemia tras el tratamiento, mediante conteo (fase aguda y cronica), ELISA (comparacion fase aguda y cronica) y PCR de tejidos (fase cronica).

Una vez alcanzado el dla 120 (fase cronica avanzada) los ratones fueron divididos en dos subgrupos, uno que se mantuvo bajo las mismas condiciones y otro que fue sometido a un tratamiento de inmunosupresion (inducida por monohidrato de ciclofosfamida). Esta variable anadida permitio determinar el grado de reactivation de la parasitemia y por tanto la curacion parasitologica o no de los ejemplares (ver FIG. 7, 8 y 9). En la FIG. 7, concretamente, se muestra el porcentaje de reactivacion de la parasitemia, por conteo en fresco de los ejemplares que fueron inmunosuprimidos (tanto tratados como controles); el porcentaje de reactivacion de la parasitemia, que en el control es del 60%, baja al 5% en presencia del compuesto 4, y al 24% en presencia del compuesto 3. En la FIG. 8 se observan las variaciones en las concentraciones de anticuerpos frente a T. cruzi, senal del estado inmunologico del raton; en ella se observa como alcanzada la fase cronica en situacion normal, tratados o no, se alcanza un equilibrio inmunologico (senal de cronificacion de la enfermedad); este estado de equilibrio es roto de modo artificial con la inmunosupresion, de modo que en la situacion control se produce un aumento considerable en los niveles de inmunoglobulinas como consecuencia de la presencia del parasito en sangre, mientras que en los tratados con los compuestos 3 y 4 los niveles se mantienen practicamente constantes, indicadores de una menor parasitemia. Son tambien especialmente notables los resultados del analisis post mortem que se muestran en la FIG. 9, en la que se comparan resultados de elimination de la parasitemia en tejidos del corazon de animales no inmunodeprimidos e inmunodeprimidos analizados mediante la tecnica PCR. En ausencia de inmunosupresion, tanto por tratamiento con el compuesto 3 como con el 4, no se detecta ninguna banda (senal de la disminucion de la parasitemia). Pero en tejidos del corazon procedentes de animales previamente inmunodeprimidos, en el caso de tratamiento con el compuesto 4 no se observa ninguna banda, mientras que en el caso de tratamiento con el compuesto 3 se observa una banda mas tenue, senal de una menor parasitemia con respecto al control.

Claims (21)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de un compuesto de formula general (I) o (II)

   imagen1

   donde:

   R1 y R2, pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo alquilo (C1-C10);

   R3 se selecciona de entre hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C10); y X+ es un cation monovalente farmaceuticamente aceptable; para la elaboration de un medicamento.
2. 2. Uso segun la reivindicacion 1, donde R3 es hidrogeno.
3. 3. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R1 y/o R2 es un grupo alquilo (C1-C4).
4. 4. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R1 y R2 son iguales.
5. 5. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde X+ es un cation alcalino.
6. 6. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde X+ se selecciona de entre Li+, Na+ o K+, preferiblemente Na+.
7. 7. Uso segun la reivindicacion 1, donde el compuesto se selecciona de entre: 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo;
8. 3.5- bis(metoxicarbonil)pirazolato sodico;

   1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo;
9. 3.5- bis(etoxi carbonil)pirazolato sodico;

   1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo;

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   3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sodico;

   1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de diisopropilo; y 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.
10. 8. Uso segun las reivindicacion anterior, donde el compuesto es 1H-pirazol-3,5- dicarboxilato de dietilo o 3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sodico.
11. 9. Uso de un compuesto de formula general (I) o (II) segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la elaboration de un medicamento para la prevention y/o el tratamiento de enfermedades parasitarias a traves de la inhibition de la enzima FeSOD parasitaria.
12. 10. Uso segun la reivindicacion anterior, donde las enfermedades son enfermedades causadas por un parasito de la clase Kinetoplastea.
13. 11. Uso segun la reivindicacion 10, donde el parasito es de la familia Trypanosomatidae.
14. 12. Uso segun la reivindicacion 11, donde los parasitos son de los generos Leishmania o Trypanosoma.
15. 13. Uso segun la reivindicacion 12, donde los parasitos son de las especies Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania tropica o Leishmania chagasi.
16. 14. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la enfermedad es tripanosomiasis.
17. 15. Uso segun la reivindicacion 14, donde la enfermedad es la enfermedad de Chagas.
18. 16. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la enfermedad es la leishmaniasis en humanos o animales.
19. 17. Composition farmaceutica que comprende al menos un compuesto de formula general (I) o (II) segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
20. 18. Composition farmaceutica segun revindication 17, que ademas comprende al menos otro principio activo antiparasitario.
21. 19. Compuesto seleccionado de entre:

    5 3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sodico;

    1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo;

    3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sodico; y 1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.

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