KR20090058423A - 소디움 메타아르세나이트를 함유하는 ｃ형 바이러스성 간염치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소디움 메타아르세나이트를 함유하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소디움 메타아르세나이트(Sodium (meta)Arsenite)가 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타냄으로써 새로운 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물에 관한 것이다.

소디움 메타아르세나이트, C형 바이러스성 간염

Description

소디움 메타아르세나이트를 함유하는 Ｃ형 바이러스성 간염 치료용 조성물{Composition comprising Sodium (meta)Arsenite for treatment of Hepatitis C Virus}

본 발명은 소디움 메타아르세나이트를 함유하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물에 관한 것이다.

알려진 다른 간염바이러스(A, B, D, E형)와 달리 플라비바이러스 군(Flaviviridae family)의 헤파시바이러스 속(Hepacivirus genus)에 속한 작은 외피 보유 RNA 바이러스(enveloped RNA virus)인 HCV(Hepatitis C Virus)가 오염된 혈액이나 체액을 통해 감염되어 발병하는 전염성 C형 바이러스성 간염은 감염이 될 경우 약 85% 이상이 만성간염으로 발전하며, 그 예후도 좋지 않아 심지어 간경변, 간암 등 심각한 간 장해로 발전하기도 한다. WHO 발표에 의하면 현재 전 세계적으로 약 1억 7천만 명이 이미 감염되고, 매년 25,000명이 새로 감염되고 있는 것으로 추산하고 있고 국내만도 45만 명으로 알려지고 있다. 또한, HCV와 관련한 간장해로 인한 간 이식자가 이식자 전체의 약 40%에 달하고 있다.

1992년 혈액에 대한 HCV 스크리닝을 시작하면서 수혈을 통한 감염 위험이 많 이 줄어들었지만, 이미 이전에 감염된 사람 외에도 부적절한 약물 복용과 수직감염으로 인한 감염자, 스크리닝 시의 위음성(false negative) 판정으로 인한 수혈관리 상 문제점 등으로 새로 감염되는 수도 늘어나 사회적으로 큰 문제가 되고 있다.

특히, A형이나 B형 바이러스성 간염과 달리, C형 바이러스성 간염은 예방을 위한 백신도 아직 개발이 되지 않았고, 가까운 장래 실용화될 전망 또한 밝지 않다. 그 이유는 급속히 변이되는 바이러스의 다양성으로 면역시스템의 공격을 피하는 등 백신 개발에 있어서 난이점으로 작용하기 때문이다. 치료제 또한 알파인터페론, 리바비린(Rivavirin)이 상용화되고 있는 실정이나 가격이 고가이고, 그 외의 효과적인 치료 약물도 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 가격도 낮고, 독성이 적으면서 바이러스를 효과적으로 억제할 실용화 치료약물을 찾던 도중, 소디움 메타아르세나이트가 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 소디움 메타아르세나이트를 유효성분으로 함유하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 소디움 메타아르세나이트를 유효성분으로 함유하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 세포독성이 적으면서 항HCV에 대한 활성이 뛰어난 소디움 메타아르세나이트를 유효성분으로 사용함으로써 C형 바이러스성 간염 치료용에 매우 유용하리라 기대된다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 소디움 메타아르세나이트(Sodium (meta)Arsenite, 이하 SMA)가 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타냄으로써 새로운 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 소디움 메타아르세나이트는 메타아르세나이트 이온(AsO₂ ^-)을 포함하는 메타아르세너스산의 나트륨염으로서 삼산화비소를 수산화나트륨과 반응시켜 제조될 수 있으며, 현재까지 암 성장 억제활성 등이 알려져 있다.

본 발명에서는 소디움 메타아르세나이트의 세포독성과 C형 간염 바이러스 저해 효과를 확인한 결과, 0.5 μM 이하에서는 독성이 거의 없었으나 1 μM에서는 세포성장이 40% 억제되었고, 5 μM 이상의 농도에서는 세포 독성이 강해 세포의 성장이 완전히 정지되었다. 또한, 3일간 처리했을 때 처리하지 않은 세포 대비 50% 감소율을 보이는 농도(LD₅₀)는 약 3.5 μM으로 판단된다.

한편, SMA는 0.5 ~ 1 μM 농도로 24 시간처리에 의해 20 ~ 40%의 바이러스 억제 효과를 나타냈으며, 2.5 μM에서는 45 ~ 50%, 5 ~ 10 μM에서는 50 ~ 70%의 항바이러스 효과를 보였고, 바이러스 증식을 50% 저해할 수 있는 SMA의 농도는 약 2.0 μM로 판단된다.

즉, 소디움 메타아르세나이트가 항HCV에 대한 활성이 우수하여 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 소디움 메타아르세나이트를 유효성분으로 함유하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물을 포함한다.

유효성분으로 소디움 메타아르세나이트를 함유하는 의약품 제조시 상기 유효성분 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립제, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 조성물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 바람직하기로는 0.1 내지 30 mg/kg／1일이고, 더욱 바람직하기로는 0.5 내지 3 mg/kg／1일 범위 내에서 투여한다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 소디움 메타아르세나이트의 세포독성 확인

소디움 메타아르세나이트(Na-As, SMA)의 세포독성을 배양된 세포주 Huh-7에 대하여 MTT 분석을 통하여 분석하였다.

시험 당일 Huh-7 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 8 × 10⁴ 세포농도로 플레이팅(plating)하고, 그 다음날 SMA를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM의 농도로 세포에 다하고, 24, 48, 72 시간 경과 후 세포성장 정도를 MTT 분석을 통하여 실시하였다. 각 샘플당 3배수로 측정하여 평균값을 측정하였다. 분석한 결과는 각 농도별로 시간에 따른 성장곡선(도 1의 A)과 각 시간대별로 농도에 따른 대조군 대비 세포생존율 곡선(도 1의 B)으로 표시하였다. 별도로 해당 시간대 별로 세포이 상태를 사진촬영하였으며, 또한 세포핵을 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 염색약으로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, SMA는 0.5 μM 이하에서는 독성이 거의 없었으나 1 μM에서는 세포성장이 40% 억제되었고, 5 μM 이상의 농도에서는 세포 독성이 강해 세포의 성장이 완전히 정지되었다[도 1의 A]. 3일간 처리했을 때 처리하지 않은 세포 대비 50% 감소율을 보이는 농도(LD₅₀)는 약 3.5 μM으로 판단된다[도 1의 B]. SMA 처리 48시간 후 TPH사진 촬영 결과 1 μM에서는 별다른 독성을 볼 수 없었으나, 5 μM 이상에서는 독성이 있음을 명백하게 알 수 있었다[도 2]. DAPI에 의한 세포핵 염색 시험에서도 1 μM에서는 미세한 세포사멸이 일어났으나, 2.5 μM에서는 상당한 세포사멸 현상이 관찰되었다[도 3]

실시예 2: 소디움 메타아르세나이트의 간염 바이러스 저해 효과 확인

소디움 메타아르세나이트의 C형 간염 바이러스 저해 효과를 배양세포에서 측정하였다. Huh-7 세포에 전기충격방법으로 C형 간염바이러스의 전장(full-length) RNA를 도입하여 배양하고, 면역형광염색법으로 약 80% 이상의 세포에서 바이러스의 증식이 확인된 상태에 도달했을 때 SMA를 농도별로 처리하였다. 처리 후 일정 시간대에 바이러스 복제 정도를 바이러스 단백질, NS5A에 대한 면역블랏법[도 4 및 도 5]과 면역형광염색법[도 6]으로 확인하였다. 앞서 언급한 세포독성 결과를 바탕으로 1차적으로 세포독성이 없거나 매우 약한 범위에서(1 μM 이하) 그 효과를 측정하였고[도 4], 다음으로 세포독성으로 보이는 농도 까지 높여 시험하였다[도 5]. 면역블랏법에 의해 검출된 NS5A의 양적 변화를 SMA 농도별[도 7의 A] 및 처리시간별[도 7의 B]로 나타내었다.

그 결과, SMA 0.5 ~ 1 μM 농도로 24 시간처리에 의해 20 ~ 40%의 바이러스 억제 효과를 나타냈으며, 2.5 μM에서는 45 ~ 50%, 5 ~ 10 μM에서는 50 ~ 70%의 항바이러스 효과를 보였다[도 5]. 바이러스 증식을 50% 저해할 수 있는 SMA의 농도는 약 2.0 μM로 판단된다[도 7의 A]. 이 농도 수준에서는 세포독성 정도가 그다지 높지 않기 때문에 시험결과 나타난 SMA의 항바이러스 효과의 대부분은 직접적인 항바이러스 작용에 기인한다고 사료된다.

실시예 3: 마우스에 대한 아급성독성실험

5주령의 특정병원부재(SPF) CD-1마우스를 이용하여 경구투여에 의한 아급성독성시험을 실시하였다.

본 발명의 소디움 메타아르세나이트를 각각 10% 포도당용액에 녹여 각 군별로 10마리씩 10, 20, 40 및 80 mg/kg/일의 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 그 이후 14일 동안 회복기를 거쳐 29일째 되는 날 생화학적검사와 혈액학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 장기의 이상여부를 관찰하였다. 또한, 시험물질 투여 후 매일 임상증상, 체중변화, 동물의 폐사여부를 관찰하였다.

실험결과, 10, 20 및 40 mg/kg을 투여한 군에서는 모든 동물에서 특기할만한 임상증상을 나타낸 동물이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

또한, 80 mg/kg을 투여한 군에서 경구 투여 후 4일째 되는 날에 3마리가 폐사하였고, 7일째 되는 날 1마리가 폐사하였으며 나머지 중 4마리는 호흡곤란 등의 이상증상이 발생하였지만 사망은 하지 않았다.

본 발명의 아급성시험 결과, CD-1 마우스에서 경구로 투여시 모두 40 mg/kg까지는 독성변화를 나타내지 않았으며 경구투여 무해 용량은 40 mg/kg 이하인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1: 정제의 제조

한 정(200 mg)을 유효성분(소디움 메타아르세나이트) 100 mg과 유당 40 mg, 옥수수전분 51 mg, 콜로이드성 이산화규소 2 mg을 혼합하였다. 이 혼합물에 3% 폴리비닐피롤리돈 용액을 넣고 분쇄한 후, 14 메쉬체를 통과시켰다. 이를 건조시키고 다시 14 메쉬체를 통과시킨 후, 스테아린산 마그네슘 1 mg을 넣어서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 2: 주사제의 제조

한 앰플 10 ㎖ 중 유효성분(소디움 메타아르세나이트) 10 mg을 폴리옥시에틸렌수소화 카스터오일 200 mg에 용해시켜 주사용 증류수를 넣어 10 ㎖가 되게 하여 1 ㎖ 중 1 mg의 농도를 함유하는 주사제를 제조하였다.

도 1은 SMA 농도별 처리시간에 따른 Huh-7 세포 성장 저해 곡선(A)과 처리시간 별 농도에 따른 세포생존율(대조군 대비 %로 표시)(B)을 나타낸 것이다

도 2는 SMA 농도별 처리 48 시간 경과 후 세포사진을 나타낸 것이다.

도 3은 SMA 농도별 처리 48, 72 시간 후, DAPI 염색한 세포핵 사진이다[1 μM 이상에서 apoptotic fragmentation 현상이 관찰됨].

도 4와 도 5는 SMA의 면역블랏법에 의한 C형 간염 바이러스 단백질인 NS5A의 양적 변화를 측정한 것이다[Hsp70 및 α-투불린은 세포단백질로서 대조군으로 사용].

도 6은 SMA의 면역형광염색법에 의한 NS5A 양성세포를 측정한 것이다.

도 7은 SMA 농도(A) 및 처리시간(B) 별로 NS5A의 양적 변화를 나타낸 것이다.

Claims (1)

1. 소디움 메타아르세나이트(Sodium (meta)Arsenite)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 C형 바이러스성 간염 치료용 조성물.

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