ES2917982T3

ES2917982T3 - Método para tratar trastornos hepáticos

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Publication number: ES2917982T3
Application number: ES15735507T
Authority: ES
Inventors: Kazuko Matsuda
Original assignee: Medicinova Inc
Current assignee: Medicinova Inc
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2035-01-07
Also published as: CN105934243A; CA2935933C; JP2019218379A; EP3091972B1; CA2935933A1; TW201609081A; KR102352729B1; US8962687B2; US20140155484A1; BR112016015712A2; WO2015105874A1; KR20160099716A; EP3091972A1; JP2017502056A; EP3091972A4; US20150209314A1; BR112016015712A8

Abstract

Un compuesto de fórmula (i) o un metabolito de la misma, o un éster del compuesto de fórmula (i) o el metabolito de la misma, o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los mismos, en el que M, N, X1 y X2 están como se definen en este documento, es útil para inhibir la esteatosis hepática, la inflamación lobular, el globo hepático y las cicatrices hepáticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para tratar trastornos hepáticos

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los ácidos fenoxialquilcarboxílicos tales como MN-001 y MN-002 para su uso en métodos de tratamiento de la hinchazón hepática.

Antecedentes de la invención

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a la acumulación de grasa en el hígado que no está relacionada con el consumo de alcohol. La grasa puede acumularse como un resultado de la obesidad, la diabetes u otras afecciones. En un pequeño número de personas, la NAFLD progresa a inflamación hepática, cicatrices y, finalmente, insuficiencia hepática. Esta forma grave de la enfermedad se denomina a veces esteatohepatitis no alcohólica (NASH). La NAFLD y la NASH, así como las afecciones que desembocan en una o más de ellas, son un problema creciente en todo el mundo y afectan a personas de todas las edades. La NAFLD y la NASH son actualmente el indicador de aumento más rápido para el trasplante de hígado. El documento núm. US 2013/158123 describe el uso de un compuesto de Fórmula (I) general para el tratamiento de afecciones hepáticas en general. Puneet Puri y otros (Clinical Liver Disease, vol. 1, núm. 4, 1 de septiembre de 2012 (2012-09-01), páginas 99-103) describen las formas de esteatosis hepática que pueden venir con hepatocitos hinchados. Caldwell y otros (Journal of Hepatology, vol. 53, núm. 4, 2010, páginas 719-723) informan de que la hinchazón hepática se ha demostrado que se correlaciona con la fibrosis y que se asocia con una lesión al citoesqueleto. Lavine y otros, (JAMA. 27 de abril de 2011; 305(16): 1659-1668) discuten el uso de vitamina E o de metformina, en relación con el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico, y enseñan que el tratamiento con vitamina E condujo a una mejora significativa en la hinchazón hepatocelular, al igual que el fármaco metformina.

Resumen de la invención

farmacéuticamente aceptable de cada uno de los mismos, en donde m es un número entero de 2 a 5, y n es un número entero de 3 a 8, X1 y X2 representan cada uno independientemente un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un grupo sulfinilo (-S(O)-) o un grupo sulfonilo (-S(O)2-), siempre y cuando X1 y X2 no sean simultáneamente átomos de oxígeno, para su uso como un medicamento para inhibir la hinchazón hepática, en donde el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto en donde el grupo -COCH3 del compuesto de Fórmula (I) que se une al fenilo que contiene el resto -O-(CH2)nCO2H se metaboliza a un grupo 1 -hidroxietilo (-CH(OH)Me), en donde el éster del compuesto de Fórmula (I) es un éster del grupo hidroxi fenólico y/o un éster del ácido carboxílico mostrado en el compuesto de Fórmula (I), y un éster del grupo 1 -hidroxietilo de un metabolito del compuesto Fórmula (I), en donde un éster de los grupos fenólicos y/o hidroxi alifáticos incluye como el ácido correspondiente un ácido carboxílico Ra-CO2H, en donde un éster del ácido carboxílico incluye como el alcohol correspondiente un compuesto de fórmula Ra-OH, en donde Ra es alquilo C1-C4.

Como se usa en la presente descripción, "esteatosis" (también llamada cambio graso, degeneración grasa o degeneración adiposa) es un proceso que describe la retención anormal de lípidos dentro de una célula, preferentemente, la célula hepática. En determinadas modalidades preferidas, la hinchazón hepática no se asocia con una ingesta excesiva de alcohol; en otras palabras, es sustancialmente de naturaleza no alcohólica.

En una modalidad preferida, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IA) (o MN-001):

En otra modalidad preferida, el metabolito del compuesto de Fórmula (I) y (IA) es un compuesto de Fórmula (IB) (o MN-002):

La Figura 1 ilustra gráficamente las puntuaciones de esteatosis en ratones tratados y sin tratar.

La Figura 2 ilustra gráficamente las puntuaciones de inflamación lobular en ratones tratados y sin tratar. La Figura 3 ilustra gráficamente las puntuaciones de hinchazón de hepatocitos en ratones tratados y sin tratar. La Figura 4 ilustra gráficamente los porcentajes del área de fibrosis en ratones tratados y sin tratar.

La Figura 5 ilustra gráficamente el área de inflamación en ratones tratados y sin tratar.

La Figura 6 ilustra gráficamente el contenido de hidroxiprolina en el hígado en ratones tratados y sin tratar.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se usa en la presente descripción, y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.

"Administrar" o "administración de" un fármaco a un paciente (y equivalentes gramaticales de esta frase) incluyen tanto la administración directa, que incluye la autoadministración, como la administración indirecta, que incluye la prescripción de un fármaco. Por ejemplo, como se usa en la presente descripción, un médico que instruye a un paciente que se autoadministra un fármaco y/o proporciona a un paciente una receta para un fármaco está administrando el fármaco al paciente.

"C^x" cuando se coloca antes de que un grupo se refiere al número de átomos de carbono en ese grupo que es X.

"Alquilo" se refiere a un radical hidrocarbilo acíclico monovalente que tiene de 1-12 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.

"Arilo" se refiere a un radical hidrocarbilo aromático monovalente que tiene hasta 10 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de arilo incluyen fenilo y naftilo.

"Heteroarilo" se refiere a un grupo aromático de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, azufre dentro del anillo aromático, en donde átomo(s) de nitrógeno y/o azufre del heteroarilo están opcionalmente oxidados (por ejemplo, N-óxido, -S(O)- o -S(O)2-). Dichos grupos heteroarilo pueden tener un único anillo (por ejemplo, piridilo o furilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, indolizinilo o benzotienilo) en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos y/o contener un heteroátomo siempre y cuando el punto de unión sea a través de un átomo del grupo heteroarilo aromático. Los ejemplos no limitantes de heteroarilo incluyen piridilo, pirrolilo, indolilo, tiofenilo y furilo.

"Cicloalquilo" se refiere a un radical hidrocarbilo cíclico no aromático monovalente que tiene de 3-12 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares.

"Heterocidilo" se refiere a un grupo cíclico no aromático monovalente de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, azufre dentro del ciclo, en donde átomo(s) de nitrógeno y/o azufre del heterociclilo están opcionalmente oxidados (por ejemplo, N-óxido, - S(O)- o -S(O)2-). Dichos grupos heterociclilo pueden tener un único anillo (por ejemplo, piperidinilo o tetrahidrofuranilo) o múltiples anillos condensados en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos y/o contener un heteroátomo siempre y cuando el punto de unión sea a través de un átomo del grupo heterociclilo no aromático. Los ejemplos no limitantes de heterociclilo incluyen pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, y similares.

"Amino" se refiere a -NH2.

"Alquilamino" se refiere a -NHRb, en donde Rb es alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con 1-3 grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterociclilo.

"Dialquilamino" se refiere a -N(Rb)2, en donde Rb se define como anteriormente.

"Que comprende" significará que los métodos y las composiciones incluyen los elementos citados, pero no excluyen a otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir métodos y composiciones, significará excluir otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación del propósito indicado. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se define en la presente descripción no excluiría los contaminantes traza del método de aislamiento y purificación y los portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina amortiguada con fosfato, conservantes y similares. "Que consiste en' significará excluir más de elementos traza de otros ingredientes y etapas del método sustancial para administrar las composiciones de esta invención o etapas del proceso para producir una composición o lograr un resultado previsto.

"Cantidad eficaz" de un compuesto usado en la presente descripción es una cantidad que, cuando se administra a un paciente con NAFLD o NASH, tendrá el efecto terapéutico previsto, por ejemplo, alivio, mejora, paliación o eliminación de una o más manifestaciones de la afección médica en el paciente. El efecto terapéutico completo no se produce necesariamente por la administración de una dosis (o dosificación) y puede ocurrir solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.

"Esteatohepatitis no alcohólica" o NASH es una enfermedad hepática común, que se asemeja a una enfermedad hepática alcohólica, pero ocurre en personas que beben poco alcohol o no lo beben. La principal característica de la NASH es la grasa en el hígado, junto con la inflamación y el daño. La NASH puede provocar cirrosis, en la que el hígado está permanentemente dañado y tiene cicatrices y ya no puede funcionar correctamente. La NASH afecta del 2 al 5 por ciento de la población estadounidense. Actualmente, no existen tratamientos específicos para la NASH. De un 10 a un 20 por ciento adicional de los estadounidenses tienen grasa en su hígado, pero no hay inflamación sustancial o daño hepático, una afección llamada "enfermedad del hígado graso no alcohólico" (NAFLD). Aunque tener grasa en el hígado no es normal, por sí mismo probablemente provoque poco daño o daño permanente. Si se sospecha la presencia de grasa en función de los resultados de los análisis de sangre o de las exploraciones hepáticas, este problema se denomina NAFLD. Si se realiza una biopsia hepática en este caso, se mostrará que algunas personas tienen NASH mientras que otras tienen NAFLD.

La NASH generalmente se sospecha por primera vez en una persona que se descubre que tiene elevaciones en las pruebas hepáticas que se incluyen en los análisis de sangre de rutina, tales como alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST). Cuando una evaluación adicional no muestra ninguna razón evidente para la enfermedad hepática (tales como medicamentos, hepatitis viral o consumo excesivo de alcohol) y cuando los estudios por imágenes o rayos X del hígado muestran grasa, se sospecha que hay NASH. La NASH se diagnostica y se separa de la NAFLD mediante una biopsia hepática. Para una biopsia hepática, se inserta una aguja a través de la piel para extraer una pequeña porción del hígado. La NASH se diagnostica cuando el examen del tejido con un microscopio muestra grasa junto con inflamación y daño a las células hepáticas. Si el tejido muestra grasa sin inflamación ni daño, se diagnostica NAFLD. Una información importante obtenida de la biopsia es si se ha desarrollado tejido cicatricial en el hígado.

La NASH puede empeorar lentamente y hace que aparezcan cicatrices o fibrosis y se acumulen en el hígado. A medida que la fibrosis empeora, se desarrolla la cirrosis; el hígado se vuelve gravemente cicatricial, endurecido e incapaz de funcionar con normalidad. Una vez que se produce una cicatrización grave o cirrosis, pocos tratamientos pueden detener la progresión. Una persona con cirrosis experimenta retención de líquidos, pérdida de músculo, hemorragia de los intestinos e insuficiencia hepática. El trasplante de hígado es el único tratamiento para la cirrosis avanzada con insuficiencia hepática y el trasplante se realiza cada vez más en personas con NASH. Por ejemplo, la NASH se clasifica como una de las principales causas de cirrosis en los Estados Unidos, detrás de la hepatitis C y la enfermedad hepática alcohólica.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a no tóxico y adecuado para su administración a un paciente, que incluye un paciente humano.

"Sales farmacéuticamente aceptables" se refieren a sales que no son tóxicas y son adecuadas para la administración a los pacientes. Los ejemplos no limitantes incluyen el metal alcalino, el metal alcalinotérreo y varias sales de amonio primarias, secundarias y terciarias. Cuando el éster del compuesto de Fórmula (I) incluye una porción catiónica, por ejemplo, cuando el éster incluye un éster de aminoácido, las sales del mismo pueden incluir varias sales de ácido carboxílico, ácido sulfónico y ácido minero. Determinados ejemplos no limitantes de sales incluyen sales de sodio, potasio y calcio.

"Grupos de protección" se refieren a grupos funcionales bien conocidos que, cuando se unen a un grupo funcional, hacen que el grupo funcional protegido resultante sea inerte a la reacción que se llevará a cabo en otras porciones de un compuesto y en la condición de reacción correspondiente, y que pueden reaccionar para regenerar la funcionalidad original en condiciones de desprotección. El grupo de protección se selecciona para ser compatible con el resto de la molécula. Un "grupo de protección del ácido carboxílico" protege la funcionalidad carboxílica de los ácidos fenoxialquilcarboxílicos durante su síntesis. Los ejemplos no limitantes de grupos de protección del ácido carboxílico incluyen, bencilo, p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, alilo, benzhidrilo y tritilo. Se encuentran ejemplos adicionales de grupos de protección del ácido carboxílico en trabajos de referencia estándar tales como Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2da Ed., 1991, John Wiley & Sons y McOmie Protective Groups in Organic Chemistry, 1975, Plenum Press. Los métodos para proteger y desproteger los ácidos carboxílicos descritos en la presente descripción pueden encontrarse en la técnica, y específicamente en Greene y Wuts, arriba, y las referencias citadas en la misma.

"Tratar" una afección médica o un paciente se refiere a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, que incluyen los resultados clínicos. Para los propósitos de los diversos aspectos y las modalidades de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluye, pero no se limita a, reducción, alivio o mejora de una o más manifestaciones o efectos negativos de la hinchazón hepática, mejora en uno o más resultados clínicos, disminución del alcance de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora, paliación, o estabilización del estado de la enfermedad y otros resultados beneficiosos descritos en la presente descripción.

Modalidades preferidas

farmacéuticamente aceptable de cada uno de los mismos, en donde m es un número entero de 2 a 5, y n es un número entero de 3 a 8, X1 y X2 representan cada uno independientemente un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un grupo sulfinilo o un grupo sulfonilo, siempre y cuando X 1 y X2 no sean simultáneamente átomos de oxígeno, para su uso como un medicamento para inhibir la hinchazón hepática, en donde el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto en donde el grupo -COCH3 del compuesto de Fórmula (I) que se une al fenilo que contiene el resto -O-(CH2)nCO2H se metaboliza a un grupo 1-hidroxietilo (-CH(OH)Me), en donde el éster del compuesto de Fórmula (I) es un éster del grupo hidroxi fenólico y/o un éster del ácido carboxílico mostrado en el compuesto de Fórmula (I), y un éster del grupo 1-hidroxietilo de un metabolito del compuesto de Fórmula (I), en donde un éster de grupos fenólicos y/o hidroxi alifáticos incluye como el ácido correspondiente un ácido carboxílico RA-CO2H, en donde un éster del ácido carboxílico incluye como el alcohol correspondiente un compuesto de fórmula R^a-OH, en donde R^aes alquilo C1-C4.

Como se usa en la presente descripción, "un metabolito del mismo" se refiere a un metabolito que muestra una actividad terapéutica sustancialmente similar a la de un compuesto de Fórmula (I). Los ejemplos no limitantes de tales metabolitos incluyen compuestos donde el grupo -COCH3, de un compuesto de Fórmula (I), que se une al fenilo que contiene el resto -O-(CH2)nCO2H se metaboliza a un grupo 1-hidroxietilo (-CH(OH)Me).

Los metabolitos que contienen tal grupo 1-hidroxietilo contienen un centro asimétrico en la posición 1 del grupo 1-hidroxietilo. Los enantiómeros y las mezclas correspondientes de los mismos, que incluyen las mezclas racémicas, se incluyen dentro de los metabolitos del compuesto de Fórmula (I) como se usa en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "un éster del mismo" se refiere a un éster del grupo hidroxi fenólico y/o un éster del ácido carboxílico mostrado en el compuesto de Fórmula (I), y un éster del grupo 1-hidroxietilo (un grupo hidroxi alifático) de un metabolito del compuesto de Fórmula (I). Un éster de los grupos fenólicos y/o hidroxi alifáticos puede incluir, sin limitación, como el ácido correspondiente, un ácido carboxílico RA-CO2H, en donde R^aes alquilo C1-C6, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C3-C12, o heterociclilo C2-C8, en donde el alquilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterociclilo están opcionalmente sustituidos con 1-4 grupos alquilo C1-C3, arilo, CO2H, amino, alquilamino o dialquilamino. También se contemplan otros ácidos, tales como ácidos mono, di o trifosfóricos. Un éster del ácido carboxílico puede incluir, sin limitación, como el alcohol correspondiente, un compuesto de la fórmula R^a-OH, en donde Ra se define como anteriormente. En una modalidad, solo se esterifica el ácido carboxílico en la Fórmula (I). En otra modalidad, solo se esterifica el grupo hidroxi fenólico en la Fórmula (I). En otra modalidad, Ra es alquilo C1-C4. Como será evidente para el experto en la técnica, tales ésteres actúan como profármacos que se hidrolizan in vivo para liberar el compuesto de Fórmula (I) o una sal del mismo.

En una modalidad preferida, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IA):

En otra modalidad preferida, el metabolito del compuesto de Fórmula (I) y (IA) es un compuesto de Fórmula (IB):

otra modalidad, el compuesto se administra por vía oral. En otra modalidad, el compuesto se administra como un comprimido o una cápsula. En otra modalidad, el compuesto de Fórmula (IA) está presente en forma polimórfica A que está sustancialmente libre de otras formas polimórficas. En otra modalidad, el compuesto se administra como una forma de dosificación líquida. En otra modalidad, el compuesto se administra en una cantidad de 100 a 4000 mg/día, dividida en una, dos o tres porciones.

Sin estar obligados por la teoría, los compuestos usados en la presente descripción son eficaces en el tratamiento de NAFLD y/o NASH debido en parte a su actividad antiinflamatoria. Se cree que varios sitios receptores pueden bloquearse por los compuestos usados en la presente descripción. Pocos, si los hay, de los inhibidores conocidos de la enfermedad inflamatoria encarnan todos los siguientes sitios de actividad en una sola molécula: inhibición de 1) síntesis de leucotrienos, 2) receptores de leucotrienos D-4, 3) receptores de leucotrienos E-4, 4) pDE III de AMPc, 5) PDE IV de AMPc, 6) síntesis de tromboxano A-2, 7) migración de eosinófilos y 8) migración de linfocitos T. Los mecanismos anteriores están involucrados y cooperan en diferentes grados y con diferentes especificidades entre la amplia variedad de células que interactúan en la llamada "cascada inflamatoria", para producir un resultado similar a la fisión. Al bloquear una amplia variedad de sitios de acción, se contempla que los compuestos usados en la presente descripción son eficaces para tratar la NAFLD y/o la NASH.

La eficacia de un compuesto usado en la presente descripción puede probarse mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, en el modelo de ratones STAM como se describe en la presente descripción más abajo, o adaptando el procedimiento descrito en "Protection from liver fibrosis by a peroxisome proliferator-activated receptor ó agonist", Keiko Iwaisako y otros, PNAS 2012, 109 (21) E1369-E1376.

Síntesis

La síntesis y determinada actividad biológica de los compuestos de Fórmula (I) se describen en la patente de Estados

tritilo, en donde el grupo bencilo, benzhidrilo, o tritilo se sustituye opcionalmente con 1 -6 grupos alquilo C1-C6, halo y/o alcoxi C1-C6. Será evidente para el experto en la técnica que puede usarse un grupo de salida diferente al grupo bromo de Fórmula (III). Los ejemplos no limitantes de tales otros grupos de salida incluyen cloro o tosilato.

La desprotección del ácido carboxílico protegido de Fórmula (IC) proporciona el compuesto de Fórmula (IA). Como es evidente con base en esta descripción, los compuestos de Fórmula (IC) son en algunas modalidades útiles de acuerdo con esta invención. Los ejemplos no limitantes de métodos de desprotección incluyen, hidrólisis alcalina e hidrogenolisis bajo H2 y un catalizador tales como Pd/C o Pt/C.

Las reacciones se llevan a cabo en un solvente orgánico inerte, por ejemplo y sin limitación, acetona, metiletilcetona, dietetilcetona o dimetilformamida. La reacción de desplazamiento nucleofílico puede llevarse a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente hasta la temperatura de reflujo del solvente, en presencia de una base inorgánica, tal como carbonato de potasio o carbonato de sodio, y opcionalmente en presencia de yoduro de potasio. Las reacciones se llevan a cabo durante un período de tiempo suficiente para proporcionar un producto sustancial como se determina por métodos bien conocidos tales como cromatografía de capa fina y 1H-NMR. Otros compuestos usados en la presente descripción se producen siguiendo los procedimientos descritos en la presente descripción y tras la sustitución adecuada de materiales de partida, y/o siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Véase también la patente de Estados Unidos núm. 5,290,812.

El compuesto de Fórmula (IA) se recristaliza en condiciones controladas para proporcionar un polimorfo ortorrómbico esencialmente puro, denominado cristales de Forma A (por ejemplo, 90 % o más, preferentemente al menos 95 % de Forma A). La forma polimórfica A y los procesos para producirla se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 7,060,854 y 7,064,146. Todas las formas polimórficas del compuesto de Fórmula (I) son activas, pero se prefiere la Forma A polimórfica. En determinadas condiciones, la solubilidad y la biodisponibilidad de este polimorfo es superior a los otros polimorfos y, por lo tanto, la Forma A puede ofrecer formulaciones sólidas mejoradas.

Pueden obtenerse cristales de Forma A, por ejemplo, al disolver el compuesto de Fórmula (IA) en 5 a 10 partes en peso de etanol a 25-40 °C para dar una solución de amarilla a naranja. La solución de etanol se carga con 1 -10 partes de agua y se agita a 20-25 °C durante aproximadamente 15-60 minutos y luego a 5-10 °C durante un período adicional de 1-4 horas, preferentemente 2,0-3,0 horas, lo que resulta en una suspensión blanquecina. A esta suspensión se añaden 5-15 partes de agua y la mezcla se agita a 5-10 °C durante 1-4 horas adicionales, preferentemente 1,5-2,0 horas. Un producto sólido, de blanco a blanquecino se aísla mediante filtración al vacío y la torta de filtro se lava con agua y se seca al vacío a 25-40 °C durante 12-24 horas.

Para los compuestos usados en la presente descripción que existen en formas enantioméricas, tales como determinados metabolitos del compuesto de Fórmula (I) (por ejemplo, el compuesto de Fórmula IB), los dos enantiómeros pueden resolverse ópticamente. Dicha resolución se realiza, por ejemplo, y sin limitación, al formar la sal diastereomérica de una base tal como (S)-(-)-1-(1-naftil)etilamina con el compuesto de ácido carboxílico correspondiente, o al separar los enantiómeros mediante el uso de cromatografía de columna quiral. Los productos intermedios de dichos compuestos, que también existen en formas enantioméricas, pueden resolverse de manera similar.

Administración y formulación

Los compuestos usados en la presente descripción pueden administrarse por vía oral, o por inyección intravenosa, intramuscular y subcutánea, o métodos transdérmicos. Los niveles de dosificación eficaces pueden variar ampliamente, por ejemplo, de aproximadamente 100 a 4000 mg al día. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 250 a 2000 mg, administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 100 a 500 mg, tal como 100, 200, 300, 400 o 500 mg administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 250 a 2000 mg, tales como 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 mg administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 1000 a 4000 mg, tales como 1000, 2000, 3000 o 4000 mg, administrados en una, dos o tres porciones. En otra modalidad, la dosificación es de 1000 mg dos veces al día. En otras modalidades, las dosificaciones adecuadas incluyen 1000 mg una v/d, 1000 mg dos v/d y 750 mg tres v/d.

Las cantidades reales dependerán de las circunstancias del paciente que se esté tratando. Como reconocen los expertos en la técnica, el médico responsable del tratamiento tendrá en cuenta muchos factores que modifican la acción de la sustancia activa, tales como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta y la condición del paciente, el momento de la administración, la velocidad y la vía de administración. Las dosis óptimas para un conjunto dado de condiciones pueden determinarse por los expertos en la técnica mediante el uso de pruebas de determinación de la dosificación convencionales.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, que incluye líquidos, polvos, cremas, emulsiones, píldoras, tabletas, supositorios, suspensiones, soluciones, y similares. Las composiciones terapéuticas que contienen los compuestos usados en la presente descripción normalmente se formularán con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la práctica conocida y establecida. En general, los comprimidos se forman mediante el uso de un portador tal como almidón modificado, solo o en combinación con un 10 % en peso de carboximetilcelulosa (Avicel). Las formulaciones se comprimen a una presión de 1000 a 3000 libras en el proceso de formación de comprimidos. Los comprimidos muestran preferentemente una dureza promedio de aproximadamente 1,5 a 8,0 kp/cm2, preferentemente de 5,0 a 7,5 kp/cm2. El tiempo de desintegración varía de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 15 o 20 minutos.

Las formulaciones para uso oral pueden proporcionarse como cápsulas de gelatina dura en donde los compuestos terapéuticamente activos usados en la presente descripción se mezclan con un diluyente sólido inerte tal como carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina suave en las que los compuestos se mezclan con un medio oleaginoso, por ejemplo, parafina líquida o aceite de oliva. Los portadores adecuados incluyen carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de baja fusión, manteca de cacao y similares.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse como suspensiones acuosas en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, tragacanto de goma y acacia de goma; agentes dispersantes o humectantes tales como la fosfatida que se produce de forma natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido alcalino con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetileno-oxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo, monoleato de polioxietileno sorbitol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monoleato de polioxietileno sorbitán. Dichas suspensiones acuosas pueden contener además uno o más conservantes, por ejemplo, etil- o -n-propil-p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol, sacarosa, sacarina o ciclamato de calcio o sodio.

Las formulaciones adecuadas incluyen además formas de dosificación de liberación sostenida, tales como las descritas en las patentes de Estados Unidos núms. 4,788,055; 4,816,264; 4,828,836; 4,834,965; 4,834,985; 4,996,047; 5,071,646; y 5,133,974.

Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones en forma líquida que incluyen emulsiones, siropes, elixires, soluciones acuosas o preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse poco antes del uso en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones, por ejemplo, en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, por ejemplo, tales como lecitina, monooleato de sorbitán o acacia. Las soluciones acuosas pueden prepararse al disolver el componente activo en agua y añadir colorantes, sabores, agentes estabilizadores y espesantes adecuados. Las preparaciones en forma sólida pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizadores, amortiguadores, edulcorantes naturales y artificiales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en envases de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, por ejemplo como soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos aceitosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y pueden contener agentes formulatorios, tales como agentes de conservación, de humectación, emulsificantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización a partir de una solución para la constitución antes de su uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril, libre de pirógenos.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para su administración tópica a la epidermis como ungüentos, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Las ungüentos y las cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden agentes activos en una base con sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador líquido adecuado.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración como supositorios. En tal formulación, una cera de baja fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao se funde primero y el componente activo se dispersa homogéneamente, por ejemplo, por agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y se solidifica.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración vaginal. Pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contengan además del ingrediente activo tales portadores como se conoce en la técnica que son apropiados.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración nasal. Las soluciones o las suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo, con un gotero, una pipeta o un pulverizador. Las formulaciones pueden proporcionarse en una forma de dosis única o multidosis. El paciente puede administrar un volumen adecuado predeterminado de la solución o la suspensión a través de un gotero o una pipeta. Un pulverizado puede administrarse por ejemplo por medio de un pulverizador de medición.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración de aerosol, particularmente al tracto respiratorio e incluyen la administración intranasal. El compuesto generalmente tendrá un tamaño de partícula pequeño, por ejemplo, del orden de 5 micras o menos. Dicho tamaño de partícula puede obtenerse por medios conocidos en la técnica, por ejemplo por micronización. El ingrediente activo se proporciona en un empaque presurizado con un propelente adecuado tal como un clorofluorocarbono (CFC), (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano), dióxido de carbono u otros gases adecuados. El aerosol puede contener convenientemente además un surfactante tal como lecitina. La dosis del fármaco puede controlarse mediante una válvula medidora. Alternativamente, los ingredientes activos pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base en polvo adecuada tales como lactosa, almidón, derivados de almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidina. El portador en polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina o empaques tipo burbuja de los cuales el polvo puede administrarse por medio de un inhalador.

Cuando se desea, las formulaciones pueden prepararse con recubrimientos entéricos adaptados para la administración de liberación sostenida o controlada del ingrediente activo. Un tipo común de formulación de liberación controlada que puede usarse para los propósitos de la presente invención comprende un núcleo inerte, tal como una esfera de azúcar, una primera capa, recubierta con una segunda capa interna que contiene el fármaco, y una membrana externa o una tercera capa que controla la liberación del fármaco desde la capa interna.

Los núcleos son preferentemente de un material soluble en agua o hinchable, y puede ser cualquier material que se usa convencionalmente como núcleos o cualquier otro material soluble en agua o hinchable en agua aceptable farmacéuticamente que se convierte en perlas o gránulos. Los núcleos pueden ser esferas de materiales tales como sacarosa/almidón (Sugar Spheres NF), cristales de sacarosa, o esferas extruidas y secas típicamente compuestas de excipientes tales como celulosa microcristalina y lactosa.

El material sustancialmente insoluble en agua en la primera capa es generalmente una película que forma polímero "GI insoluble" o "GI parcialmente insoluble" (disperso o disuelto en un solvente). Como ejemplos puede mencionarse etilcelulosa, acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, polimetacrilatos tales como copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo (Eudragit NE-30-D) y copolímeros de metacrilato de amonio tipos A y B (Eudragit RL30D y RS30D), y los elastómeros de silicona. Por lo general, se usa un plastificante junto con el polímero. Los plastificantes ilustrativos incluyen: dibutilsebacato, propilenglicol, trietilcitrato, tributilcitrato, aceite de ricino, monoglicéridos acetilados, trietilcitrato de acetilo, butilcitrato de acetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dibutilo, triacetina, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media).

La segunda capa que contiene el ingrediente activo puede comprender el ingrediente activo (fármaco) con o sin un polímero como un aglutinante. El aglutinante, cuando se usa, generalmente es hidrófilo pero puede ser soluble en agua o insoluble en agua. Los polímeros ilustrativos que se usarán en la segunda capa que contiene el fármaco activo son polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, polialquilenglicol tal como polietilenglicol, gelatina, alcohol polivinílico, almidón y derivados del mismo, derivados de celulosa, tales como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa, carboximetilhidroxietilcelulosa, polímeros de ácido acrílico, polimetacrilatos, o cualquier otro polímero farmacéuticamente aceptable. La relación entre el fármaco y el polímero hidrófilo en la segunda capa está generalmente en el intervalo de 1:100 a 100:1 (p/p).

Los polímeros adecuados para su uso en la tercera capa, o membrana, para controlar la liberación del fármaco pueden seleccionarse de polímeros insolubles en agua o polímeros con solubilidad dependiente del pH, tales como, por ejemplo, etilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, polimetacrilatos o las mezclas de los mismos, opcionalmente combinados con plastificantes, tales como aquellos mencionados anteriormente.

Opcionalmente, la capa de liberación controlada comprende, además de los polímeros anteriores, otra(s) sustancia(s) con diferentes características de solubilidad, para ajustar la permeabilidad, y de esta manera la velocidad de liberación, de la capa de liberación controlada. Los polímeros ilustrativos que pueden usarse como un modificador junto con, por ejemplo, la etilcelulosa incluyen: HPMC, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico, polímeros con solubilidad dependiente del pH, tales como ftalato de acetato de celulosa o copolímero de metacrilato de amonio y copolímero de ácido metacrílico o la mezcla del mismo. Los aditivos tales como sacarosa, lactosa y surfactantes de grado farmacéutico también pueden incluirse en la capa de liberación controlada, si se desea.

También se proporcionan en la presente descripción formas de dosificación unitaria de las formulaciones. En tales formas, la formulación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo (por ejemplo, y sin limitación, un compuesto de Fórmula (I) o un éster del mismo, o una sal de cada uno de los mismos). La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empaquetada, el empaque que contiene cantidades discretas de preparación, tales como comprimidos empaquetados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, oblea o pastilla en sí, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empaquetada.

Otros portadores farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editada por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edición, Easton, Pa.

Ejemplos

Ejemplo 1: Tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) (Ejemplo de referencia)

Se asignan aleatoriamente 250 adultos con esteatohepatitis no alcohólica para recibir MN-001 o MN-002, cada uno a una dosis diaria de 500 mg, o placebo, durante un máximo de 6 meses. El resultado principal es una mejora en las características histológicas de la esteatohepatitis no alcohólica, según se evaluó con el uso de un compuesto de puntuaciones estandarizadas para la esteatosis, la inflamación lobular, la hinchazón hepatocelular y/o la fibrosis. Los resultados se analizan siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

Ejemplo 2: Tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) (Ejemplo de referencia)

Se realiza un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en 50 pacientes con NAFLD diagnosticado por ultrasonido (US) y confirmado por biopsia hepática (40 pacientes). Los pacientes se aleatorizaron para recibir MN-001 o MN-002 (cada uno a una dosis diaria de 500 mg durante un máximo de 6 meses) o placebo. Todos los pacientes participan en un programa de pérdida de peso conductual idéntico. Todos los pacientes se someten a una evaluación mensual por US abdominal. También se monitorean los niveles de enzimas hepáticas, los perfiles lipídicos, los niveles de insulina y los parámetros antropométricos, y todos los pacientes se someten a una evaluación de seguimiento nutricional. Los pacientes también se someten a una segunda biopsia hepática al final del estudio. Los niveles séricos de alanina transaminasa y la esteatosis por US se miden como criterios de valoración no limitantes. Los resultados se analizan siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

Ejemplo 3: Efectos terapéuticamente beneficiosos de MN-001 en el modelo STAM de esteatohepatitis no alcohólica

STAMTM es un modelo para la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), los síntomas de la misma y los trastornos hepáticos relacionados, generados por la combinación de intervenciones químicas y dietéticas en ratones C57BL/6. Se ha demostrado que Telmisartán tiene efectos anti-NASH, antifibrótico y antiinflamatorio en ratones STAM y, por lo tanto, se usó como control positivo en el presente estudio. De acuerdo con este estudio, y como se describe a más abajo, el tratamiento con Telmisartán disminuyó significativamente el peso hepático, la ⁿA ^s, el área de fibrosis y el área de inflamación en comparación con el grupo con vehículo de acuerdo con los datos notificados, lo que proporciona de esta manera evidencia de la utilidad del modelo de ratones STAM como se emplea en la presente descripción para demostrar la utilidad de un compuesto usado en esta invención.

El tratamiento con MN-001 redujo significativamente el área de fibrosis en comparación con el vehículo de una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra el efecto antifibrótico de MN-001 en el presente estudio. Una dosis alta de MN-001 tendió a reducir el contenido de hidroxiprolina en el hígado, lo que respalda su propiedad antifibrótica. El tratamiento con dosis alta de MN-001 disminuyó significativamente la puntuación de la actividad de la NAFLS (NAS). La mejora en la NAS fue atribuible, por ejemplo, a la reducción de la inflamación lobular y a la hinchazón de hepatocitos. Notablemente, una dosis alta de MN-001 redujo significativamente la puntuación de hinchazón. Dado que la hinchazón de hepatocitos se deriva del daño hepatocelular inducido por el estrés oxidativo y se asocia con la progresión de la enfermedad de la NASH (Fujii H y otros, J. Atheroscler. Thromb. 2009; 16:893, Rangwala F y otros, J. Pathol. 2011; 224:401), se contempla, sin estar obligados por la teoría, que MN-001 puede mejorar la patología de la NASH mediante la inhibición del daño de los hepatocitos y la hinchazón.

El tratamiento con dosis baja de MN-001 redujo significativamente el área de inflamación en comparación con el vehículo, lo que demuestra el efecto antiinflamatorio de MN-001.

En conclusión, MN-001, administrado en varias dosis, mostró uno o más de los efectos anti-NASH, antifibrótico y antiinflamatorio en el presente estudio. Estos y otros resultados se discuten más abajo.

Materiales y métodos

Sustancia de prueba

MN-001 se proporcionó por MediciNove Inc. Para preparar la solución de dosificación, MN-001 se pesó y se disolvió en metilcelulosa al 0,2 % (vehículo). Telmisartán (Micardis®) se compró a Boehringer Ingelheim GmbH (Alemania) y se disolvió en agua pura.

Inducción de la NASH

La NASH se indujo en 50 ratones machos mediante una única inyección subcutánea de 200 mg de solución de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 2 días después del nacimiento y alimentación con dieta rica en grasas (HFD, 57 kcal % grasa, cat#: HFD32, CLEA Japan, Japón) después de 4 semanas de edad. Se usaron diez camadas machos, alimentadas con dieta normal y sin tratamiento con STZ, para el grupo normal.

Vía de administración del fármaco

El vehículo, MN-001, y Telmisartán se administraron por vía oral en un volumen de 10 ml/kg.

Dosis de tratamiento

MN-001 se administró en dosis de 10, 30 y 100 mg/kg una vez al día. Se administró Telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día.

Animales

Se obtuvieron ratones C57BL/6 (hembras embarazadas de 15 días) de Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japón). Todos los animales usados en el estudio se alojaron y se cuidaron de acuerdo con las directrices de la Sociedad Farmacológica Japonesa para el Uso de Animales.

Entorno

Los animales se mantuvieron en una instalación SPF en condiciones controladas de temperatura (23 ± 2 °C), humedad (45 ± 10 %), iluminación (ciclos de luz artificial y oscuridad de 12 horas; luz de 8:00 a 20:00) e intercambio de aire. Se mantuvo una alta presión (206 ± Pa) en la sala experimental para evitar la contaminación de la instalación.

Cría de animales

Los animales se alojaron en jaulas de policarbonato KN-600 (Natsume Seisakusho, Japón) con un máximo de 4 ratones por jaula. Se usó PULMASp esterilizado (Material Research Center, Japón) para la cama de paja y se reemplazó una vez a la semana.

Comida y bebida

Se proporcionó HFD sólido esterilizado ad libitum, que se colocó en la tapa de metal en la parte superior de la jaula. Se proporcionó agua pura ad libitum de una botella de agua equipada con un tapón de goma y un tubo de aspiración. Las botellas de agua se sustituyeron una vez a la semana, se limpiaron y esterilizaron en autoclave y se reutilizaron.

Identificación de animales y jaulas

Los ratones se identificaron mediante números grabados en los pendientes. Cada jaula se etiquetó con un código de identificación específico.

Medición de sangre completa y bioquímica plasmática

Se midió la glucosa en sangre sin estar en ayunas en sangre completa mediante el uso de LIFE CHECK (EIDIA, Japón). Para la bioquímica plasmática, la sangre se recogió en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical, Japón) y se centrifugó a 1000xg durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Los niveles de ALT y AST en plasma se midieron mediante FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm, Japón).

Medición de la bioquímica hepática

Contenido de hidroxiprolina en el hígado

Para cuantificar el contenido de hidroxiprolina en el hígado, las muestras de hígado congeladas (32-40 mg) se procesaron mediante un método de hidrólisis ácida-alcalina de la siguiente manera. Las muestras de hígado se desgrasaron con acetona al 100 %, se secaron en el aire, se disolvieron en NaOH 2N a 65 °C y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Las muestras lisadas (400 j l) se hidrolizaron con ácido con 400 j l de HCl 6N a 121 °C durante 20 minutos, y se neutralizaron con 400 j l de NaOH 4N que contenía 10 mg/ml de carbono activado. Se añadió amortiguador de AC (ácido acético 2,2 M/ácido cítrico 0,48 M, 400 j l) a las muestras, seguido de centrifugación para recoger el sobrenadante. Se construyó una curva estándar de hidroxiprolina con diluciones en serie de trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich) a partir de 16 jg/ml. Las muestras y los estándares preparados (cada uno de 400 j l) se mezclaron con 400 j l de solución de cloramina T (Wako Pure Chemical Industries) y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se mezclaron con la solución de Ehrlich (400 j l) y se calentaron a 65 °C durante 20 minutos para desarrollar el color. Después de enfriar las muestras en hielo y centrifugarlas para eliminar los precipitados, se midió la densidad óptica de cada sobrenadante a 560 nm. Las concentraciones de hidroxiprolina se calcularon a partir de la curva estándar de hidroxiprolina. Las concentraciones de proteínas de las muestras de hígado se determinaron mediante el uso de un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) y se usaron para normalizar los valores de hidroxiprolina calculados. Los niveles de hidroxiprolina en el hígado se expresaron como jg por mg de proteína.

Análisis histopatológicos

Para la tinción con HE, las secciones se cortaron a partir de bloques de parafina de tejido hepático lateral izquierdo prefijado en la solución de Bouin y se tiñeron con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals, Japón) y una solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). La NAS se calculó de acuerdo con los criterios de Kleiner (Kleiner DE. y otros, Hepatology, 2005; 41:1313). Para visualizar la deposición de colágeno, las secciones de hígado lateral izquierdo fijo de Bouin se tiñeron con solución de picro-rojo sirio (Waldeck, Alemania).

Para la inmunohistoquímica, las secciones se cortaron a partir de tejidos hepáticos laterales izquierdos congelados incrustados en el compuesto Tissue-Tek O.C.T. y se fijaron en acetona. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó mediante el uso de H2O2 al 0,03 % durante 5 minutos, seguido de la incubación con Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma, Japón) durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con una dilución de 200 veces de anticuerpo anti-a-SMA (Epitomics, Estados Unidos) o anti-F4/80 (BMA Biomedicals, Suiza) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (anticuerpo anti-rata de cabra-HRP, Invitrogen, Estados Unidos), se realizaron reacciones de enzima-sustrato mediante el uso de la solución 3,3'-diaminobenzidina/H2O2 (Nichirei, Japón).

Para el análisis cuantitativo del área de fibrosis, el área de inflamación y la semicuantificación de a-SMA, se capturaron imágenes de campo claro de secciones teñidas de rojo sirio, F4/80 y a-SMA-inmunoteñidas alrededor de la vena central mediante el uso de una cámara digital (DFC280; Leica, Alemania) con una ampliación de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron mediante el uso del programa ImageJ (National Institute of Health, Estados Unidos).

RT-PCR cuantitativa

El ARN total se extrajo de muestras de hígado mediante el uso de RNAiso (Takara Bio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un jg de ARN se transcribió de forma inversa mediante el uso de una mezcla de reacción que contiene MgCh 4,4 mM (Roche, Suiza), inhibidor de la ARNasa 40 U (Toyobo, Japón), dNTP 0,5 mM (Promega, Estados Unidos), hexámero aleatorio 6,28 jM (Promega), 5 x primer amortiguador de cadena (Promega), ditiotreitol 10 mM (Invitrogen) y MMLV-RT 200 U (Invitrogen) en un volumen final de 20 pl. La reacción se llevó a cabo durante 1 hora a 37 °C, seguido de 5 minutos a 99 °C. La PCR en tiempo real se realizó mediante el uso de PCR en tiempo real DICE y la premezcla SYBR Taq (Takara Bio). Para calcular el nivel de expresión de ARNm relativo, la expresión de cada gen se normalizó a la del gen de referencia 36B4 (símbolo del gen: Rplp0). La información de los conjuntos de cebadores de PCR y la disposición de la placa se describió en la Tabla 1.

Pruebas estadísticas

Se realizaron análisis estadísticos mediante el uso de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni en GraphPad Prism 4 (Graph-Pad Software, Estados Unidos). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se asumió una tendencia o inclinación cuando una prueba t con una cola devolvió valores de P < 0,10. Los resultados se expresaron como media ± SD.

Diseño experimental y tratamiento

Grupos de estudio

Grupo 1: Normal

Diez ratones normales se alimentaron con una dieta normal ad libitum sin ningún tratamiento hasta las 9 semanas de edad.

Grupo 2: Vehículo

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo en un volumen de 10 ml/kg una vez al día desde las 6 a las 9 semanas de edad.

Grupo 3: Dosis baja de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 6 a las 9 semanas de edad.

Grupo 4: Dosis intermedia de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 30 mg/kg una vez al día desde las 6 a las 9 semanas de edad.

Grupo 5: Dosis alta de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 100 mg/kg una vez al día desde las 6 a las 9 semanas de edad.

Grupo 6: Telmisartán

Seis ratones con NASH se administraron por vía oral con agua pura complementada con Telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 6 a las 9 semanas de edad. La tabla de más abajo resume el calendario de tratamiento.

Monitoreo y sacrificio de animales

La viabilidad, los signos clínicos y el comportamiento se monitorearon diariamente. El peso corporal se registró antes del tratamiento. Los ratones se observaron para detectar signos clínicos significativos de toxicidad, cercanía a la muerte y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Los animales se sacrificaron por exanguinación mediante punción cardiaca directa bajo anestesia de éter (Wako Pure Chemical Industries).

Resultados

Análisis histológicos

Tinción con HE y puntuación de la actividad de la NAFLD

Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron depósito de grasa micro y macrovesicular grave, hinchazón hepatocelular e infiltración de células inflamatorias. En consonancia con estas observaciones, la NAS aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró notables mejoras en la hinchazón hepatocelular y la infiltración de células inflamatorias, con una reducción significativa en la NAS en comparación con el grupo con vehículo. El grupo con dosis alta de MN-001 mostró mejoras marcadas en la hinchazón hepatocelular y mejoras moderadas en la infiltración de células inflamatorias. La NAS disminuyó significativamente en el grupo con dosis alta de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. Los grupos con dosis baja e intermedia de MN-001 mostraron una disminución moderada en la hinchazón hepatocelular en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en la NAS entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 0,0 ± 00, Vehículo: 5,3 ± 0,5, dosis baja de MN-001: 4,7 ± 0,5, dosis intermedia de MN-001: 4,7 ± 0,5, dosis alta de MN-001: 3,3 ± 0,8, Telmisartán: 2,6 ± 0,7). Consulte las Figuras 1-3 y las Tablas más abajo.

Una tabla de la puntuación de la actividad de la NAFLD (NAS)

Definición de componentes de la ÑAS

Elemento Puntuación Alcance

0 <5%

Esteatosis _{1 5-33%}

2 >33-56%

3 >e«%

O Ninguno

Hinchazón de

_nepatocitos1 Pocas células hinchadas

Muchas células/hinchazón

₀Sin focos

Inflamación 1 <2 focos/200x

^lobular2 2-4 focos/200x

3 >4 focos/200x

Tinción con rojo sirio

Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un aumento de la deposición de colágeno en la región pericentral del lóbulo hepático en comparación con el grupo normal. El porcentaje de área de fibrosis (área positiva para rojo sirio) aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área de fibrosis disminuyó significativamente tanto en el grupo con Telmisartán como en los grupos de tratamiento con MN-001 en comparación con el grupo con vehículo (Normal: 0,29 ± 0,08 %, Vehículo: 0,97 ± 0,19 %, Dosis baja de MN-001: 0,76 ± 0,19 %, Dosis intermedia de MN-001: 0,76 ± 0,16 %, Dosis alta de MN-001: 0,69 ± 0,18 %, Telmisartán: 0,62 ± 0,09 %). Ver la Figura 4.

Inmunotinción de F4/80

Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un número y tamaño aumentados de células positivas para F4/80 en el lóbulo hepático en comparación con el grupo normal. El porcentaje del área de inflamación (área positiva para F4/80) aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área de inflamación disminuyó significativamente tanto en el grupo con Telmisartán como en los grupos con dosis baja de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No se produjo ninguna diferencia significativa en el área de inflamación entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 3,26 ± 0,66 %, Vehículo: 6,56 ± 1,19 %, Dosis baja de MN-001: 5,18 ± 0,85 %, Dosis intermedia de MN-001: 6,33 ± 0,84 %, Dosis alta de MN-001: 6,31 ± 0,76 %, Telmisartán: 4,46 ± 0,88 %). Ver la Figura 5.

Inmunotinción con alfa-SMA

Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un aumento de las células positivas para a-SMA en el lóbulo hepático en comparación con el grupo normal. El porcentaje de área positiva para a-SMA aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área positiva para a-SMA tendió a disminuir en los grupos con dosis baja y alta de m N-001 en comparación con el grupo con vehículo. No se produjeron diferencias significativas en el área positiva para a-SMA entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 0,07 ± 0,03 %, Vehículo: 0,15 ± 0,08 %, Dosis baja de MN-001: 0,10 ± 0,05 %, Dosis intermedia de MN-001: 0,11 ± 0,04 %, Dosis alta de MN-001: 0,11 ± 0,04 %, Telmisartán: 0,12 ± 0,05 %).

Cambios en el peso corporal y estado general

El peso corporal aumentó gradualmente durante el período de tratamiento en todos excepto en el grupo con Telmisartán. El peso corporal promedio del grupo con vehículo fue menor que el del grupo normal a lo largo del periodo de tratamiento. El peso corporal promedio del grupo con Telmisartán fue significativamente menor que el del grupo con vehículo desde el día 11 hasta el día 22. No hubo diferencias significativas en el peso corporal promedio entre el grupo con vehículo y ninguno de los otros grupos durante el periodo de tratamiento. En el presente estudio, ninguno de los animales mostró deterioro de su estado general.

Peso corporal en el día del sacrificio

El peso corporal promedio en el sacrificio fue significativamente menor en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en el peso corporal promedio en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en el peso corporal promedio entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 25,0 ± 0,4 g, Vehículo: 20,5 ± 1,9 g, Dosis baja de MN-001: 21,1 ± 1,3 g, Dosis intermedia de MN-001: 20,3 ± 1,0 g, Dosis alta de MN-001: 20,6 ± 1,5 g, Telmisartán: 18,0 ± 1,9 g).

Peso de hígado y relación peso corporal-hígado

El peso de hígado promedio aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en el peso de hígado promedio en comparación con el grupo con vehículo. El peso de hígado tendió a disminuir en el grupo con dosis intermedia de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en el peso de hígado promedio entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1083 ± 83 mg, Vehículo: 1555 ± 112 mg, Dosis baja de MN-001: 1567 ± 165 mg, Dosis intermedia de MN-001: 1439 ± 118 mg, Dosis alta de MN-001: 1480 ± 145 mg, Telmisartán: 1172 ± 90 mg).

La relación peso corporal-hígado aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en la relación peso corporal-hígado promedio en comparación con el grupo con vehículo. La relación peso corporal-hígado tendió a disminuir en los grupos con dosis intermedia y alta de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No se produjeron diferencias significativas en la relación peso corporal-hígado promedio entre el grupo con vehículo y el grupo con dosis baja de MN-001 (Normal: 4,3 ± 0,3 %, Vehículo: 7,6 ± 0,6 %, Dosis baja de m N-001: 7,4 ± 0,8 %, Dosis intermedia de MN-001: 7,1 ± 0,5 %, Dosis alta de MN-001: 7,2 ± 0,6 %, Telmisartán: 6,5 ± 0,4 %).

Sangre completa y bioquímica

Los niveles de glucosa en sangre completa (Figura 3.1 y Tabla 3) aumentaron significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de glucosa en sangre entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 192 ± 40 mg/dl, Vehículo: 632 ± 95 mg/dl, Dosis baja de MN-001: 614 ± 98 mg/dl, Dosis intermedia de MN-001: 609 ± 78 mg/dl, Dosis alta de MN-001: 671 ± 124 mg/dl, Telmisartán: 876 ± 29/dl).

ALT en plasma

Los niveles de ALT en plasma tienden a aumentar en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de ALT en plasma tendieron a disminuir en el grupo con Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de ALT en plasma entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 31 ± 10 U/l, Vehículo: 51 ± 22 U/l, Dosis baja de MN-001: 71 ± 60 U/l, Dosis intermedia de MN-001: 48 ± 23 U/l, Dosis alta de MN-001: 54 ± 11 U/l, Telmisartán: 37 ± 6 U/l).

AST en plasma

Los niveles de AST en plasma tienden a disminuir en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de AST en plasma tendieron a aumentar en los grupos con dosis intermedia y alta de MN-001 y alto en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de AST en plasma entre el grupo con vehículo y el grupo con dosis baja de MN-001 (Normal: 300 ± 77 U/l, Vehículo: 193 ± 95 U/l, Dosis baja de MN-001: 214 ± 210 U/l, Dosis intermedia de MN-001: 270 ± 114 U/l, Dosis alta de MN-001: 385 ± 183 U/l, Telmisartán: 190 ± 28/l).

Contenido de hidroxiprolina en el hígado

No hubo diferencias significativas en el contenido de hidroxiprolina en el hígado entre el grupo normal y el grupo con vehículo. El contenido de hidroxiprolina en el hígado tendió a aumentar en el grupo con Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. El contenido de hidroxiprolina en el hígado tendió a disminuir en el grupo con dosis alta de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en el contenido de hidroxiprolina en el hígado entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 0,61 ± 0,12 pg/mg de proteína, Vehículo: 0,67 ± 0,16 pg/mg de proteína, Dosis baja de MN-001: 0,78 ± 0,34 pg/mg de proteína, Dosis intermedia de MN-001: 0,63 ± 0,12 pg/mg de proteína, Dosis alta de MN-001: 0,55 ± 0,14 pg/mg de proteína, Telmisartán: 0,87 ± 0,23 pg/mg de proteína). Ver la Figura 6.

Análisis de la expresión génica

Alfa-SMA

Los niveles de expresión de ARNm de alfa-SMA tendieron a regularse positivamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de alfa-SMA tendieron a regularse positivamente en el grupo con Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de a-SMA entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1,00 ± 0,44, Vehículo: 4,08 ± 2,56, Dosis baja de MN-001: 36,8 ± 111, Dosis intermedia de MN-001: 3,13 ± 2,52, Dosis alta de MN-001: 5,78 ± 3,45, Telmisartán: 5,21 ± 1,43).

TNF-a

Los niveles de expresión de ARNm de TNF-a tendieron a regularse positivamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de TNF-a entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1,00 ± 0,48, Vehículo: 9,88 ± 19,3, Dosis baja de MN-001: 3,42 ± 2,53, Dosis intermedia de MN-001: 7,97 ± 9,30, Dosis alta de MN-001: 9,74 ± 3,34, Telmisartán: 8,35 ± 2,84).

CCR2

Los niveles de expresión de ARNm de CCR2 se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de CCR2 se regularon negativamente de modo significativo en los grupos con dosis baja e intermedia de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de CCR2 entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1,00 ± 0,27, Vehículo: 6,83 ± 9,89, Dosis baja de MN-001: 0,13 ± 0,09, Dosis intermedia de MN-001: 0,22 ± 0,35, Dosis alta de MN-001: 3,86 ± 1,43, Telmisartán: 3,21 ± 0,85).

MCP-1

Los niveles de expresión de ARNm de MCP-1 se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de MCP-1 se regularon negativamente de modo significativo en el grupo con dosis baja de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. Los niveles de expresión de ARNm de MCP-1 tienden a regularse negativamente en los grupos con dosis alta de MN-001 y Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo.

No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de MCP-1 entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1,00 ± 0,35, Vehículo: 2,17 ± 42,2, Dosis baja de MN-001: 1,97 ± 2,06, Dosis intermedia de MN-001: 4,00 ± 7,78, Dosis alta de MN-001: 3,64 ± 1,52, Telmisartán: 2,69 ± 0,95).

Colágeno de tipo 1

Los niveles de expresión de ARNm de colágeno de tipo 1 tendieron a regularse positivamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de colágeno de tipo 1 fueron significativos

TIMP-1

Los niveles de expresión de ARNm de TIMP-1 se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de TIMP-1 se regularon negativamente de modo significativo en los grupos con dosis baja e intermedia de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de TIMP-1 entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos (Normal: 1,00 ± 0,37, Vehículo: 9,78 ± 7,28, Dosis baja de MN-001: 2,20 ± 1,52, Dosis intermedia de MN-001: 3,64 ± 1,66, Dosis alta de MN-001: 10,6 ± 5,83, Telmisartán: 7,82 ± 2,62).

En conclusión, MN-001, administrado en varias dosis, mostró uno o más de los efectos anti-NASH, antifibrótico y antiinflamatorio en el presente estudio.

Claims

REIVINDICACIONES

o un metabolito del mismo, o un éster del compuesto de Fórmula (I) o el metabolito del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los mismos, en donde m es un número entero de 2 a 5, y n es un número entero de 3 a 8, X1 y X2 cada uno representa independientemente un átomo de azufre, átomo de oxígeno, grupo de sulfinilo o un grupo sulfonilo, siempre y cuando X1 y X2 no sean simultáneamente átomos de oxígeno, para su uso como un medicamento para inhibir la hinchazón hepática,

en donde el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto en donde el grupo -COCH3 del compuesto de Fórmula (I) que se une al fenilo que contiene el resto -O-(CH2)nCO2H se metaboliza a un grupo 1 -hidroxietilo (-CH(OH)Me),

en donde el éster del compuesto de Fórmula (I) es un éster del grupo hidroxi fenólico y/o un éster del ácido carboxílico mostrado en el compuesto de Fórmula (I), y un éster del grupo 1 -hidroxietilo de un metabolito del compuesto de Fórmula (I), en donde un éster de los grupos fenólicos y/o hidroxi alifáticos incluye como el ácido correspondiente un ácido carboxílico RA-CO2H, en donde un éster del ácido carboxílico incluye como el alcohol correspondiente un compuesto de fórmula Ra-OH, en donde Ra es alquilo C1-C4.
2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de Fórmula (I) es de Fórmula
3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el compuesto está en una forma polimórfica ortorrómbica A que está sustancialmente libre de otras formas polimórficas.
4. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el metabolito del compuesto de Fórmula
5. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto se administra por vía oral, preferentemente como un comprimido o una cápsula.
6. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto se administra como una forma de dosificación líquida.
7. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto se administra en una cantidad de 100 a 4000 mg/día, dividida en una, dos o tres porciones.
8. Una composición terapéutica que comprende un compuesto como se define en la reivindicación 1, para su uso como se define en la reivindicación 1,

en donde la composición terapéutica se formula con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables.