ES2964286T3 - Método de tratamiento de la Esteatohepatitis no alcohólica avanzada - Google Patents

Abstract

Un método para tratar a un paciente diagnosticado con esteatohepatitis no alcohólica avanzada (NASH), comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula (I), un metabolito del compuesto de Fórmula (I), un éster de el compuesto de Fórmula (I), o un metabolito del éster del compuesto de Fórmula (I):. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Método de tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica avanzada

Campo

Esta tecnología se relaciona con métodos para inhibir o tratar la esteatohepatitis no alcohólica avanzada, afecciones que conducen a o surgen de ella, y/o efectos negativos de cada una de estas mediante la administración de ácidos fenoxialquilcarboxílicos tales como MN-001 y MN-002.

Antecedentes

La esteatohepatitis no alcohólica o NASH es una enfermedad hepática común, que se asemeja a una enfermedad hepática alcohólica, pero ocurre en personas que beben poco alcohol o no lo beben. La principal característica de la NASH es la grasa en el hígado, junto con la inflamación y el daño. La NASH puede progresar a NASH avanzada, que se caracteriza, entre otras cosas, por fibrosis hepática. La NASH avanzada y las afecciones que conducen a, o que surgen de la NASH avanzada, son un problema creciente en todo el mundo y afectan a personas de todas las edades. El documento US 2013/158123 A1 describe un método para tratar a un paciente que padece de enfermedad del hígado graso no alcohólica (NAFLD) o esteatohepatitis no alcohólica (NASH) que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula (I). JOEL E. LAVlNE Y OTROS: "Nonalcoholic fatty liver disease in the pediatric population", c LiNICS IN LIVER DiSeASE, vol. 8, no. 3, 2004-08-01, describen la especificidad de la NASH en la población pediátrica.

Resumen

La presente descripción proporciona un compuesto de Fórmula (I), un metabolito del compuesto de Fórmula (I), un éster del compuesto de Fórmula (I), o un metabolito del éster del compuesto de Fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los anteriores, en donde m es un número entero de 2 a 5 inclusive, y n es un número entero de 3 a 8 inclusive, X<1>y X<2>representan cada uno independientemente azufre, oxígeno, un grupo sulfinilo (-S(O)-) o un grupo sulfonilo (-S(O)<2>-), siempre y cuando X<1>y X<2>no sean simultáneamente oxígeno, para usar en el tratamiento de un paciente diagnosticado con esteatohepatitis no alcohólica avanzada (NASH), una progresión de NASH caracterizada por la fibrosis hepática,

en donde un metabolito es un compuesto donde el grupo -COCH<3>que se une al fenilo que contiene la porción -O-(CH<2>)nCO<2>H se metaboliza a un grupo 1-hidroxietilo.

En una modalidad particular, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IA)

En otra modalidad, el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IB):

Preferentemente, el compuesto se administra por vía oral, como una forma de dosificación sólida, tal como un comprimido o una cápsula, y, con mayor preferencia, el compuesto está presente en una forma cristalina ortorrómbica. El compuesto puede administrarse, además, como una forma de dosificación líquida. El compuesto puede administrarse en una cantidad que varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 mg/día, dividida en una, dos o tres porciones.

Aún en otra modalidad, el paciente diagnosticado con NASH avanzada exhibe uno o más de angiomas en forma de arañas, ascitis, esplenomegalia, borde hepático duro, eritema palmar, asterixis o hipertensión portal. El paciente puede exhibir, además, una o más cicatrices hepáticas, cirrosis o carcinoma hepatocelular (HCC). En algunos casos, el tratamiento es para reducir la fibrosis hepática en un paciente que padece NASH avanzada. Aún en otros casos, se reducen las cicatrices hepáticas del paciente. El paciente también puede ser un paciente pediátrico, un paciente joven o un paciente adulto.

Aún en otra una modalidad, el compuesto de Fórmula (I) es el compuesto de Fórmula (IA)

Aún en otra modalidad, el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IB):

( I B ) .

Aún en otra modalidad, el compuesto se formula en una composición terapéutica con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y B ilustran fotomicrografías de secciones hepáticas teñidas con HE de ratones tratados y no tratados.

La Figura 2 ilustra gráficamente la puntuación de Actividad de NAFLD (NAS) en ratones tratados y no tratados. La Figura 3 ilustra gráficamente las puntuaciones de esteatosis en ratones tratados y no tratados.

La Figura 4 ilustra gráficamente las puntuaciones de inflamación lobular en ratones tratados y no tratados. La Figura 5 ilustra gráficamente las puntuaciones de hinchazón de hepatocitos en ratones tratados y no tratados.

Las Figuras 6A y B ilustran fotomicrografías de secciones hepáticas teñidas con rojo sirio de ratones tratados y no tratados.

La Figura 7 ilustra gráficamente los porcentajes del área de fibrosis en ratones tratados y no tratados.

La Figura 8 ilustra gráficamente el área de inflamación en ratones tratados y no tratados.

Las Figuras 9 A y B ilustran fotomicrografías de secciones hepáticas inmunoteñidas para a-SMA de ratones tratados y no tratados.

Descripción detallada

A continuación se describen varias modalidades. Se debe señalar que las modalidades específicas no pretenden ser una descripción exhaustiva o una limitación de los aspectos más amplios discutidos en la presente descripción. Un aspecto descrito junto con una modalidad particular no se limita necesariamente a esa modalidad y puede practicarse con cualquier otra modalidad(es).

Definiciones

Como se usa en la presente descripción, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.

"Administrar' o "Administración de" un fármaco a un paciente (y equivalentes gramaticales de esta frase) incluyen tanto la administración directa, que incluye la autoadministración, como la administración indirecta, que incluye el acto de prescribir un fármaco. Por ejemplo, como se usa en la presente descripción, un médico que instruye a un paciente que se autoadministra un fármaco y/o proporciona a un paciente una receta para un fármaco está administrando el fármaco al paciente.

"NAH avanzada" se refiere a una progresión de la NASH que conduce a uno o más síntomas tales como angiomas en forma de araña, ascitis, esplenomegalia, borde duro del hígado, eritema palmar, asterixis, fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. La NASH avanzada se asocia, además, con síntomas tales como cirrosis e insuficiencia hepática, y con trasplante de hígado.

"Cx" cuando se coloca delante de un grupo se refiere al número de átomos de carbono en ese grupo que es X. "Alquilo" se refiere a un radical hidrocarbilo acíclico monovalente que tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.

"Arilo" se refiere a un radical hidrocarbilo aromático monovalente que tiene hasta 10 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de arilo incluyen fenilo y naftilo.

"Heteroarilo" se refiere a un grupo aromático de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, azufre dentro del anillo aromático, en donde átomo(s) de nitrógeno y/o azufre del heteroarilo están opcionalmente oxidados (por ejemplo, N-óxido, -S(O)- o -S(O)<2>-). Dichos grupos heteroarilo pueden tener un único anillo (por ejemplo, piridilo o furilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, indolizinilo o benzotienilo) en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos y/o contener un heteroátomo siempre y cuando el punto de unión sea a través de un átomo del grupo heteroarilo aromático. Los ejemplos no limitantes de heteroarilo incluyen piridilo, pirrolilo, indolilo, tiofenilo y furilo.

"Cicloalquilo" se refiere a un radical hidrocarbilo cíclico no aromático monovalente que tiene de 3-12 átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares.

"Heterociclilo" se refiere a un grupo cíclico no aromático monovalente de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, azufre dentro del ciclo, en donde el/los átomo(s) de nitrógeno y/o azufre del heteroarilo están opcionalmente oxidados (por ejemplo, N-óxido, -S(O)- o -S(O)<2>-). Tales grupos heteroarilo pueden tener un único anillo (por ejemplo, piperidinilo o tetrahidrofuranilo) o múltiples anillos condensados en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos y/o contener un heteroátomo siempre y cuando el punto de unión sea a través de un átomo del grupo heterociclilo no aromático. Los ejemplos no limitantes de heterociclilo incluyen pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, y similares.

"Amino" se refiere a -NH<2>.

"Alquilamino" se refiere a -NHRb, en donde Rb es alquilo C<1>-C<6>sustituido opcionalmente con 1-3 grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterociclilo.

"Dialquilamino" se refiere a -N(Rb)<2>, en donde Rb se define como anteriormente.

"Que comprende" significará que los métodos y las composiciones incluyen los elementos enumerados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir métodos y composiciones, significará excluir otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación del propósito indicado. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se define en la presente descripción no excluiría los contaminantes traza del método de aislamiento y purificación y los portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes y similares. “Que consiste en” significará excluir más que los elementos traza de otros ingredientes y etapas del método sustancial para administrar las composiciones de esta invención o etapas del proceso para producir una composición o lograr un resultado previsto. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos y frases de transición están dentro del alcance de esta invención.

"Cantidad eficaz" de un compuesto usado en la presente descripción es una cantidad que, cuando se administra a un paciente tratado como en la presente descripción, tendrá el efecto terapéutico previsto, por ejemplo, alivio, mejoría, alivio o eliminación de una o más manifestaciones de la afección médica en el paciente. El efecto terapéutico completo no sucede necesariamente por la administración de una dosis (o dosificación) y puede suceder solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.

"Esteatohepatitis no alcohólica" o NASH es una enfermedad hepática común, que se asemeja a una enfermedad hepática alcohólica, pero ocurre en personas que beben poco alcohol o no lo beben. La principal característica de la NASH es la grasa en el hígado, junto con la inflamación y el daño. La NASH puede conducir a cirrosis, en la que el hígado está dañado, tiene cicatrices y ya no puede funcionar correctamente. La NASH afecta del 2 al 5 por ciento de la población estadounidense. Actualmente, no existen tratamientos específicos para la NASH. De un 10 a un 20 por ciento adicional de los estadounidenses tienen grasa en su hígado, pero no hay inflamación sustancial o daño hepático, una afección llamada "enfermedad del hígado graso no alcohólica" (NAFLD). Aunque tener grasa en el hígado no es normal, por sí mismo probablemente provoque poco daño o daño permanente. Si se sospecha la presencia de grasa en función de los resultados de los análisis de sangre o de las exploraciones hepáticas, este problema se denomina NAFLD. Si se realiza una biopsia hepática en este caso, se mostrará que algunas personas tienen NASH mientras que otras tienen NAFLD.

La NASH generalmente se sospecha por primera vez en una persona que se descubre que tiene elevaciones en las pruebas hepáticas que se incluyen en los análisis de sangre de rutina, tales como alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST). Cuando una evaluación adicional no muestra ninguna razón evidente para la enfermedad hepática (tales como medicamentos, hepatitis viral o consumo excesivo de alcohol) y cuando los estudios por imágenes o rayos X del hígado muestran grasa, se sospecha que hay NASH. La NASH se diagnostica y se separa de la NAFLD mediante una biopsia hepática. Para una biopsia hepática, se inserta una aguja a través de la piel para extraer una pequeña porción del hígado. La NASH se diagnostica cuando el examen del tejido con un microscopio muestra grasa junto con inflamación y daño a las células hepáticas. Una biopsia puede proporcionar información sobre el tejido cicatricial que se ha desarrollado en el hígado.

La NASH puede, pero no siempre, empeorar lentamente, hasta desarrollar NASH avanzada, lo que causa que aparezcan cicatrices o fibrosis y se acumulen en el hígado. A medida que la fibrosis empeora, puede desarrollarse la cirrosis y el hígado se vuelve gravemente cicatricial, endurecido e incapaz de funcionar con normalidad. Una vez que se produce una cicatrización grave o cirrosis, pocos tratamientos pueden detener la progresión. Una persona con cirrosis puede experimentar retención de líquidos, pérdida de músculo, hemorragia de los intestinos e insuficiencia hepática. El trasplante de hígado es el único tratamiento para la cirrosis avanzada con insuficiencia hepática y el trasplante se realiza cada vez más en personas con NASH avanzada. Por ejemplo, la NASH se clasifica como una de las principales causas de cirrosis en los Estados Unidos, junto con la hepatitis C y la enfermedad hepática alcohólica.

En general, se ha demostrado que la morbilidad y la mortalidad son significativamente superiores en los pacientes con NASH en comparación con la población general. La enfermedad de las arterias coronarias y las neoplasias malignas seguida de la mortalidad relacionada con el hígado son las causas más frecuentes de muerte en pacientes con NASH. Los niños con NASH, además, tienen una duración de la supervivencia significativamente más corta en comparación con las personas de la población general.

De los pacientes con NASH avanzada, del 15 % al 25 % progresan a cirrosis y sus complicaciones durante 10 a 20 años. En el momento de la biopsia inicial, hasta un tercio de los pacientes con NASH tienen fibrosis hepática avanzada, mientras que entre el 10 % y el 15 % tenían cirrosis bien establecida. Ahora se reconoce que una gran parte de los pacientes con cirrosis criptogénica han progresado de NASH: la característica histológica de la esteatosis o la esteatohepatitis se reemplaza por una cirrosis suave.

Cuando aparece cirrosis, pueden estar presentes estigmas de enfermedad hepática crónica, tales como angiomas en forma de araña, ascitis, esplenomegalia, borde hepático duro, eritema palmar o asterixis. Los pacientes pueden presentar ictericia o prurito, o presentar una complicación de la hipertensión portal (por ejemplo, ascitis, hemorragia varicosa o encefalopatía).

La cirrosis en la NASH avanzada es un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). Se ha notificado una prevalencia de la CSH en hasta un 2,8 % en pacientes con NASH durante un periodo de 20 años. Los datos de pacientes japoneses indican que la tasa acumulada de HCC a los 5 años puede ser de hasta el 15 %. La cirrosis asociada a la NASH avanzada es una indicación creciente de trasplante de hígado.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a no tóxico y adecuado para la administración a un paciente, que incluye un paciente humano.

"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que no son tóxicas y son adecuadas para la administración a los pacientes. Los ejemplos no limitantes incluyen el metal alcalino, el metal alcalinotérreo y varias sales de amonio primarias, secundarias y terciarias. Cuando el éster del compuesto de Fórmula (I) incluye una porción catiónica, por ejemplo, cuando el éster incluye un éster de aminoácido, las sales de este pueden incluir varias sales de ácido carboxílico, ácido sulfónico y ácido minero. Ciertos ejemplos no limitantes de sales incluyen sales de sodio, potasio y calcio.

"Grupos de protección" se refiere a grupos funcionales bien conocidos, los cuales cuando se unen a un grupo funcional, hacen que el grupo funcional protegido resultante sea inerte a la reacción que se realizará en otras porciones de un compuesto y en la condición de reacción correspondiente, y los cuales pueden reaccionar para regenerar la funcionalidad original bajo condiciones de desprotección. El grupo de protección se selecciona para ser compatible con el resto de la molécula. Un "grupo de protección del ácido carboxílico" protege la funcionalidad carboxílica de los ácidos fenoxialquilcarboxílicos durante su síntesis. Los ejemplos no limitantes de grupos de protección del ácido carboxílico incluyen, bencilo, p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, alilo, benzhidrilo y tritilo. Se encuentran ejemplos adicionales de grupos de protección del ácido carboxílico en trabajos de referencia estándar tales como Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2da Ed., 1991, John Wiley & Sons y McOmie Protective Groups in Organic Chemistry, 1975, Plenum Press. Los métodos para proteger y desproteger los ácidos carboxílicos descritos en la presente descripción pueden encontrarse en la técnica, y específicamente en Greene y Wuts, arriba, y las referencias citadas en la misma.

"Tratar" una afección médica o un paciente se refiere a realizar acciones para obtener resultados beneficiosos o convenientes, que incluyen resultados clínicos. Para los propósitos de los diversos aspectos y las modalidades de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o convenientes incluyen, pero no se limitan a, reducción, alivio o mejoría de una o más manifestaciones de o efectos negativos de la NASH avanzada, mejora en uno o más resultados clínicos, disminución del alcance de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora, alivio, o estabilización del estado de la fibrosis y otros resultados beneficiosos descritos en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un compuesto de Fórmula (I):

o un metabolito de este, o un éster del compuesto de Fórmula (I) o el metabolito de este, o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de estos, en donde las variables se definen como en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "un metabolito de este" se refiere a un metabolito que muestra una actividad terapéutica sustancialmente similar a la de un compuesto de Fórmula (I). Los ejemplos no limitantes de tales metabolitos incluyen compuestos donde el grupo -COCH3, de un compuesto de Fórmula (I), que se une al fenilo que contiene la porción -O-(CH<2>)nCO<2>H se metaboliza a un grupo 1 -hidroxietilo (-CH(OH)Me).

Los metabolitos que contienen tal grupo 1 -hidroxietilo contienen un centro asimétrico en la posición 1 del grupo 1-hidroxietilo. Los enantiómeros y las mezclas correspondientes de estos, que incluyen las mezclas racémicas, se incluyen dentro de los metabolitos del compuesto de Fórmula (I) como se usa en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "un éster de este" se refiere a un éster del grupo hidroxi fenólico y/o un éster del ácido carboxílico mostrado en el compuesto de Fórmula (I), y un éster del grupo 1-hidroxietilo (un grupo hidroxi alifático) de un metabolito del compuesto de Fórmula (I). Un éster de los grupos fenólicos y/o hidroxi alifáticos puede incluir, sin limitación, como el ácido correspondiente, un ácido carboxílico RA-CO<2>H, en donde Ra es alquilo C<1>-C<6>, arilo, heteroarilo, cicloalquilo C<3>-C<12>, o heterociclilo C<2>-C<8>, en donde el alquilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterociclilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 4 grupos alquilo C<1>-C<3>, arilo, CO<2>H, amino, alquilamino o dialquilamino. También se contemplan otros ácidos, tales como ácidos mono, di o trifosfóricos. Un éster del ácido carboxílico puede incluir, sin limitación, como el alcohol correspondiente, un compuesto de fórmula RA-OH, en donde R<a>se define como anteriormente. En una modalidad, solo se esterifica el ácido carboxílico en la Fórmula (I). En otra modalidad, solo se esterifica el grupo hidroxi fenólico en la Fórmula (I). En otra modalidad, Ra es alquilo C<1>-C<4>. Como será evidente para el experto en la técnica, tales ésteres actúan como profármacos que se hidrolizanin vivopara liberar el compuesto de Fórmula (I) o una sal de este.

En una modalidad, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IA):

En otra modalidad, el metabolito del compuesto de Fórmula (I) y (IA) es un compuesto de Fórmula (IB):

En otra modalidad, el compuesto se administra por vía oral. En otra modalidad, el compuesto se administra como un comprimido o una cápsula. En otra modalidad, el compuesto de Fórmula (IA) está presente en forma polimórfica A que está sustancialmente libre de otras formas polimórficas. En otra modalidad, el compuesto se administra como una forma de dosificación líquida. En otra modalidad, el compuesto se administra en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 mg/día, dividida en una, dos o tres porciones.

La eficacia de un compuesto utilizado en la presente descripción puede evaluarse mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, en un modelo de NASH avanzada y afecciones hepáticas relacionadas inducido por estreptozocina.

Síntesis

La síntesis y determinada actividad biológica de los compuestos de Fórmula (I) se describen en la patente de Estados Unidos núm. 4,985,585. Por ejemplo, el compuesto de Fórmula (IA) se prepara al reaccionar un fenol de Fórmula (II):

en donde, R es un grupo de protección del ácido carboxílico, con un compuesto de Fórmula (III):

para proporcionar un compuesto de Fórmula (IC):

Los ejemplos no limitantes de grupos de protección de ácido, o grupos R, incluyen alquilo C<1>-C<6>, bencilo, benzhidrilo y tritilo, en donde el grupo bencilo, benzhidrilo o tritilo se sustituye opcionalmente con 1 a 6 grupos alquilo C<1>-C<6>, halo y/o alcoxi C<1>-C<6>. Será evidente para el experto en la técnica que puede usarse un grupo de salida diferente al grupo bromo de Fórmula (III). Los ejemplos no limitantes de otros grupos de salida incluyen cloro o tosilato.

La desprotección del ácido carboxílico protegido de Fórmula (IC) proporciona el compuesto de Fórmula (IA). Como es evidente con base en esta descripción, los compuestos de Fórmula (IC) son útiles en algunas modalidades de acuerdo con esta invención. Los ejemplos no limitantes de métodos de desprotección incluyen, hidrólisis alcalina e hidrogenolisis bajo H<2>y un catalizador tal como Pd/C o Pt/C.

Las reacciones se realizan en un solvente orgánico inerte, por ejemplo y sin limitación, acetona, metiletilcetona, dietilcetona o dimetilformamida. La reacción de desplazamiento nucleofílico puede realizarse a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente hasta la temperatura de reflujo del solvente, en presencia de una base inorgánica, tal como carbonato de potasio o carbonato de sodio, y opcionalmente en presencia de yoduro de potasio. Las reacciones se llevan a cabo durante un período de tiempo suficiente para proporcionar un producto sustancial como se determina por métodos bien conocidos tales como cromatografía en capa fina y 1H-NMR. Otros compuestos usados en la presente descripción se producen siguiendo los procedimientos descritos en la presente descripción y tras la sustitución adecuada de materiales de partida, y/o siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Ver también la patente de Estados Unidos núm. 5,290,812.

El compuesto de Fórmula (IA) se recristaliza en condiciones controladas para proporcionar un polimorfo ortorrómbico esencialmente puro, denominado cristales de Forma A (por ejemplo, 90 % o más, preferentemente al menos 95 % de Forma A). La forma polimórfica A y los procesos para producirla se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 7,060,854 y 7,064,146. Todas las formas polimórficas del compuesto de Fórmula (I) son activas, pero se prefiere la Forma A polimórfica. En determinadas condiciones, la solubilidad y la biodisponibilidad de este polimorfo es superior a los otros polimorfos y, por lo tanto, la Forma A puede ofrecer formulaciones sólidas mejoradas o formas de dosificación sólidas.

Pueden obtenerse cristales de Forma A, por ejemplo, al disolver el compuesto de Fórmula (IA) en 5 a 10 partes en peso de etanol a 25 °C - 40 °C para dar una solución de amarilla a naranja. La solución de etanol se carga con 1 a 10 partes de agua y se agita a 20 °C - 25 °C durante aproximadamente de 15 a 60 minutos y después a 5 °C - 10 °C durante un período adicional de 1 a 4 horas, preferentemente de 2,0 a 3,0 horas, lo que resulta en una suspensión blanquecina. A esta suspensión se añaden de 5 a 15 partes de agua y la mezcla se agita a 5°C - 10 °C durante 1 a 4 horas adicionales, preferentemente 1,5 a 2,0 horas. Un producto sólido, de blanco a blanquecino se aísla mediante filtración al vacío y la torta de filtro se lavó con agua y se secó al vacío a 25°C - 40 °C durante 12 a 24 horas.

Para los compuestos usados en la presente descripción que existen en formas enantioméricas, tales como determinados metabolitos del compuesto de Fórmula (I) (por ejemplo, el compuesto de Fórmula IB), los dos enantiómeros pueden resolverse ópticamente. Dicha resolución se realiza, por ejemplo, y sin limitación, al formar la sal diastereomérica de una base tal como (S)-(-)-1-(1-naftil)etilamina con el compuesto de ácido carboxílico correspondiente, o al separar los enantiómeros mediante el uso de cromatografía de columna quiral. Los productos intermedios de tales compuestos, que también existen en formas enantioméricas, pueden resolverse de manera similar.

Administración y formulación

Los compuestos usados en la presente descripción pueden administrarse por vía oral, o por inyección intravenosa, intramuscular y subcutánea, o por métodos transdérmicos. Los niveles de dosificación eficaces pueden variar ampliamente, por ejemplo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 mg al día. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 250 a 2000 mg, administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 100 a 500 mg, tal como 100, 200, 300, 400 o 500 mg administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 250 a 2000 mg, tal como 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 mg administrados en una, dos o tres porciones. En una modalidad, el intervalo de dosificación diario es de 1000 a 4000 mg, tales como 1000, 2000, 3000 o 4000 mg, administrados en una, dos o tres porciones. En otra modalidad, la dosificación es de 1000 mg dos veces al día. En otras modalidades, las dosificaciones adecuadas incluyen 1000 mg una v/d, 1000 mg dos v/d y 750 mg tres v/d.

Las cantidades reales dependerán de las circunstancias del paciente que se esté tratando. Como reconocen los expertos en la técnica, el médico responsable del tratamiento tendrá en cuenta muchos factores que modifican la acción de la sustancia activa, tales como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta y la afección del paciente, el momento de la administración, la velocidad y la vía de administración. Los expertos en la técnica pueden determinar las dosificaciones óptimas para un conjunto dado de afecciones mediante el uso de pruebas de determinación de la dosificación convencionales.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, que incluye líquidos, polvos, cremas, emulsiones, píldoras, trociscos, supositorios, suspensiones, soluciones y similares. Las composiciones terapéuticas que contienen los compuestos usados en la presente descripción normalmente se formularán con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la práctica conocida y establecida. En general, los comprimidos se forman mediante el uso de un portador tal como almidón modificado, solo o en combinación con carboximetilcelulosa (Avicel), por ejemplo, a aproximadamente un 10 % en peso. Las formulaciones se comprimen a una presión de 1000 a 3000 libras en el proceso de formación de comprimidos. Los comprimidos muestran preferentemente una dureza promedio de aproximadamente 1,5 a 8,0 kp/cm2, preferentemente de 5,0 a 7,5 kp/cm2. El tiempo de desintegración varía de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 15 o 20 minutos.

Las formulaciones para uso oral pueden proporcionarse como cápsulas de gelatina dura en donde los compuestos terapéuticamente activos usados en la presente descripción se mezclan con un diluyente sólido inerte tal como carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina suave en las cuales los compuestos se mezclan con un medio oleaginoso, por ejemplo, parafina líquida o aceite de oliva. Los portadores adecuados incluyen carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse como suspensiones acuosas mezcladas con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; agentes dispersantes o humectantes tales como fosfátidos de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido alcalino con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetileno-oxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo, monoleato de polioxietileno sorbitol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monoleato de polioxietileno sorbitán. Tales suspensiones acuosas pueden contener, además, uno o más conservantes, por ejemplo, etil- o -n-propil-p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol, sacarosa, sacarina o ciclamato de sodio o calcio.

Las formulaciones adecuadas incluyen además formas de dosificación de liberación sostenida, tales como las descritas en las patentes de Estados Unidos Núms. 4,788,055; 4,816,264; 4,828,836; 4,834,965; 4,834,985; 4,996,047; 5,071,646; y, 5,133,974.

Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones en forma líquida que incluyen emulsiones, jarabes, elíxires, soluciones acuosas o preparaciones en forma sólida las cuales están previstas a convertirse poco antes del uso en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones, por ejemplo, en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, por ejemplo, tales como lecitina, monooleato de sorbitán o acacia. Las soluciones acuosas pueden prepararse al disolver el componente activo en agua y añadir colorantes, sabores, agentes estabilizadores y espesantes adecuados. Las preparaciones en forma sólida pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizadores, tampones, edulcorantes naturales y artificiales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en contenedores de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, por ejemplo como soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos aceitosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y pueden contener agentes formulatorios, tales como agentes de conservación, de humectación, emulsificantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización a partir de una solución para la constitución antes de su uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril, libre de pirógenos.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para administración nasal. Las soluciones o las suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo, con un gotero, una pipeta o un pulverizador. Las formulaciones pueden proporcionarse en una forma de dosis única o multidosis. El paciente puede administrar un volumen adecuado predeterminado de la solución o la suspensión a través de un gotero o una pipeta. Un pulverizado puede administrarse por ejemplo por medio de un pulverizador de medición. Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para administración en aerosol, particularmente a las vías respiratorias e incluye la administración intranasal. El compuesto generalmente tendrá un tamaño de partícula pequeño, por ejemplo, del orden de 5 micras o menos. Dicho tamaño de partícula puede obtenerse por medios conocidos en la técnica, por ejemplo por micronización. El ingrediente activo se proporciona en un empaque presurizado con un propelente adecuado tal como un clorofluorocarbono (CFC), (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano), dióxido de carbono u otros gases adecuados. El aerosol puede contener convenientemente además un surfactante tal como lecitina. La dosis del fármaco puede controlarse mediante una válvula medidora. Alternativamente, los ingredientes activos pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base en polvo adecuada, tal como lactosa, almidón, derivados de almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidina. El portador en polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina o empaques tipo burbuja de los cuales el polvo puede administrarse por medio de un inhalador.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para administración tópica a la epidermis como ungüentos, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Las ungüentos y las cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas que incluyen agentes activos en una base saborizada, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que incluyen el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que incluyen el ingrediente activo en un portador líquido adecuado.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración como supositorios. En tal formulación, una cera de baja fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao se funde primero y el componente activo se dispersa homogéneamente, por ejemplo, por agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y se solidifica.

Los compuestos usados en la presente descripción pueden formularse para la administración vaginal. Pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen, además del ingrediente activo, tales portadores como se conoce en la técnica que son apropiados.

Cuando sea conveniente, las formulaciones pueden prepararse con recubrimientos entéricos adaptados para la administración sostenida o de liberación controlada del ingrediente activo. Un tipo común de formulación de liberación controlada que puede usarse para los propósitos de la presente invención incluye un núcleo inerte, tal como una esfera de azúcar, una primera capa, recubierta con una segunda capa interna que contiene el fármaco, y una membrana externa o una tercera capa que controla la liberación del fármaco desde la capa interna.

Los núcleos son, preferentemente, de un material soluble en agua o hinchable, y puede ser cualquier material que se usa convencionalmente como núcleos o cualquier otro material soluble en agua o hinchable en agua farmacéuticamente aceptable que se convierte en perlas o gránulos. Los núcleos pueden ser esferas de materiales tales como sacarosa/almidón (Sugar Spheres NF), cristales de sacarosa, o esferas extruidas y secas que, típicamente, incluyen excipientes tales como celulosa microcristalina y lactosa.

El material sustancialmente insoluble en agua en la primera capa es generalmente un polímero formador de película "GI insoluble" o "GI parcialmente insoluble" (disperso o disuelto en un solvente). Como ejemplos pueden mencionarse etilcelulosa, acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, polimetacrilatos tales como copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo (Eudragit NE-30-D) y copolímeros de metacrilato de amonio tipos A y B (Eudragit RL30D y RS30D), y elastómeros de silicona. Por lo general, se usa un plastificante junto con el polímero. Los plastificantes ilustrativos incluyen: dibutilsebacato, propilenglicol, trietilcitrato, tributilcitrato, aceite de ricino, monoglicéridos acetilados, trietilcitrato de acetilo, butilcitrato de acetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dibutilo, triacetina, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media).

La segunda capa que contiene el ingrediente activo puede incluir el ingrediente activo (fármaco) con o sin un polímero como un aglutinante. El aglutinante, cuando se usa, generalmente es hidrófilo pero puede ser soluble en agua o insoluble en agua. Los polímeros ilustrativos para usarse en la segunda capa que contiene el fármaco activo son polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, polialquilenglicol tal como polietilenglicol, gelatina, alcohol polivinílico, almidón y derivados de estos, derivados de celulosa, tales como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa, carboximetilhidroxietilcelulosa, polímeros de ácido acrílico, polimetacrilatos, o cualquier otro polímero farmacéuticamente aceptable. La relación entre el fármaco y el polímero hidrófilo en la segunda capa está generalmente en el intervalo de 1:100 a 100:1 (p/p).

Los polímeros adecuados para su uso en la tercera capa, o membrana, para controlar la liberación del fármaco pueden seleccionarse de polímeros insolubles en agua o polímeros con solubilidad dependiente del pH, tales como, por ejemplo, etilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, polimetacrilatos o mezclas de estos, opcionalmente combinados con plastificantes, tales como aquellos mencionados anteriormente.

Opcionalmente, la capa de liberación controlada incluye, además de los polímeros anteriores, otra(s) sustancia(s) con diferentes características de solubilidad, para ajustar la permeabilidad, y de esta manera la velocidad de liberación de la capa de liberación controlada. Los polímeros ilustrativos que pueden usarse como un modificador junto con, por ejemplo, la etilcelulosa incluyen: HPMC, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico, polímeros con solubilidad dependiente del pH, tales como ftalato de acetato de celulosa o copolímero de metacrilato de amonio y copolímero de ácido metacrílico o mezclas de estos. Los aditivos tales como sacarosa, lactosa y surfactantes de grado farmacéutico pueden incluirse, además, en la capa de liberación controlada, si es conveniente.

Además, en la presente descripción se proporcionan formas de dosificación unitaria de las formulaciones. En tales formas, la formulación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo (por ejemplo, y sin limitación, un compuesto de Fórmula (I) o un éster de este, o una sal de cada uno de estos). La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empaquetada, el empaque que contiene cantidades discretas de preparación, tales como comprimidos empaquetados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, oblea o pastilla en sí, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empaquetada.

Otros portadores farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editada por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edición, Easton, Pa.

La presente invención, descrita generalmente de esta manera, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a modo de ilustración y no están previstos para ser limitantes de la presente invención.

Ejemplos

Las siguientes abreviaturas se usan en el ejemplo y en cualquier otro lugar de la solicitud.

CCR: receptor de quimiocina CC

HE: Hematoxilina y eosina

HFD: Dieta rica en grasas

MCP: Proteína quimiotáctica de monocitos

MMLV-RT: transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Molony

NAFLDA: Enfermedad del hígado graso no alcohólica

NAS: Puntuación de actividad de la NAFLD

NASH: Esteatohepatitis no alcohólica

SD: Desviación Estándar

SMA: Actina de músculo liso

SPL: Sin patógenos específicos

STAM: Modelo de animal estélico

STZ: Estreptozotocina

TIMP : Inhibidor tisular de la metaloproteinasa

FLAP: Proteína Activadora de Cinco-lipoxigenasas

LTC4: Leucotrieno C4

Ejemplo 1: Tratamiento de la NASH avanzada

Se obtendrán ratones C57BL /6 sin patógenos y embarazadas de 15 días de SLC-Japan, Inc. La NASH se establecerá en ratones macho mediante una única inyección subcutánea de STZ (Sigma, Estados Unidos) después del nacimiento y la alimentación con una dieta rica en grasas (HFD; CLEA-Japan, Japón)ad libitumdespués de 4 semanas de edad (día 28 ± 2). Aleatorización de ratones en 6 grupos de 10 ratones de 8 semanas de edad (día 63 ± 2), el día antes del inicio del tratamiento. El peso corporal individual se medirá diariamente durante el periodo de tratamiento, la supervivencia, los signos clínicos y el comportamiento de los ratones se controlarán diariamente. Se usarán los siguientes grupos de estudio.

Grupo 1 (Normal): Diez ratones normales se alimentaron con una dieta normalad libitumsin ningún tratamiento hasta las 12 semanas de edad. Grupo 2 (Vehículo): Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo [0,3 % CMC] en un volumen de 10 mL/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Grupo 3 (dosis baja de MN-001): Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad. Grupo 4 (dosis intermedia de MN-001): Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 30 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad, Grupo 5 (dosis alta de MN-001): Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 100 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad. Grupo 6 (Telmisartán): Seis ratones con NASH se administraron por vía oral con agua pura complementada con Telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Los ratones en todos los grupos se sacrificarán para los siguientes ensayos a las 12 semanas de edad. Se medirá el peso hepático individual y se calculará la relación peso hepático- peso corporal. La hidroxiprolina en el hígado se cuantificará mediante un método de hidrólisis. Se realizaron análisis histopatológicos de secciones hepáticas con la tinción de HE de (de acuerdo con los métodos rutinarios) (para estimar la puntuación de actividad de NAFLD), tinción con rojo sirio (para estimar el porcentaje de área de fibrosis), inmunotinción F4/80 (para estimar el porcentaje de área de inflamación), inmunotinción con alfa-SMA (para estimar el porcentaje de área positiva para a-SMA). Los ensayos de expresión génica mediante el uso de ARN total del análisis por RT-PCR en tiempo real de hígado se realizará para TlM P-1, Colágeno Tipo 1, a-SMA, 5-lipoxigenasa, FLAP y LTC4 sintasa. Las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Los valores de p < 0,05 se considerarán estadísticamente significativos.

Ejemplo 2: Tratamiento de la NASH avanzada en humanos

Se asignaron aleatoriamente 250 adultos con síntomas asociados a la esteatohepatitis no alcohólica avanzada para recibir MN-001 o MN-002, cada uno a una dosis diaria de 500 mg, o placebo, durante un máximo de 6 meses. El resultado principal es una mejora en las características histológicas de la esteatohepatitis no alcohólica, según se evaluó con el uso de un compuesto de puntuaciones estandarizadas para uno o más de esteatosis, la inflamación lobular, la hinchazón hepatocelular, cirrosis y la fibrosis. Los resultados se analizan siguiendo métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

Ejemplo 3: Efectos terapéuticamente beneficiosos de MN-001 en el modelo STAM de esteatohepatitis no alcohólica avanzada

STAM™ es un modelo útil para la esteatohepatitis no alcohólica avanzada (NASH avanzada), los síntomas de esta y los trastornos hepáticos relacionados, generados por la combinación de intervenciones químicas y dietéticas en ratones C57BL/6. En este ejemplo, después de inducir la NASH, se dejó alcanzar una etapa avanzada, y los ratones se trataron a las 8-12 semanas. Se ha demostrado que Telmisartán tiene efectos anti-NASH, antifibrótico y antiinflamatorio en ratones STAM y, por lo tanto, se usó como control positivo en el presente estudio. De acuerdo con este estudio, y como se describe más abajo, el tratamiento con Telmisartán disminuyó significativamente el peso hepático, la NAS, el área de fibrosis y el área de inflamación en comparación con el grupo con vehículo de acuerdo con los datos notificados, lo que proporciona de esta manera evidencia de la utilidad del modelo de ratones STAM como se emplea en la presente descripción para demostrar la utilidad de un compuesto usado en esta invención. El tratamiento con dosis media y alta de MN-001 disminuyó significativamente la puntuación de la actividad de la NAFLD (NAS). La mejora en la NAS fue atribuible a la reducción de la inflamación lobular y a la hinchazón de los hepatocitos. Notablemente, las dosis media y alta de MN-001 redujeron significativamente la puntuación de hinchazón. Los resultados demuestran que MN-001 puede mejorar la patología de la NASH avanzada, por ejemplo, y sin limitación, mediante la inhibición del daño y la hinchazón de los hepatocitos. Como tal, MN- 001 mostró efectos anti-NASH y antifibróticos en etapas de NASH avanzada.

Materiales y métodos

Sustancia de prueba

Para preparar soluciones de dosificación, MN-001 se pesó y disolvió en CMC al 0,3%(vehículo). Telmisartán (Micardis®) se compró a Boehringer Ingelheim GmbH (Alemania) y se disolvió en agua pura.

Inducción de la NASH

La NASH se indujo en 50 ratones machos mediante una única inyección subcutánea de 200 mg de solución de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 2 días después del nacimiento y la alimentación con dieta rica en grasas (HFD, 57 kcal % grasa, cat#: HFD32, CLEA Japan, Japón) después de 4 semanas de edad.

Vía de administración del fármaco

El vehículo, MN-001, y Telmisartán se administraron por vía oral en un volumen de 10 mL/kg.

Dosis de tratamiento

MN-001 se administró en dosis de 10, 30 y 100 mg/kg una vez al día. Telmisartán se administró a una dosis de 10 mg/kg una vez al día.

Animales

En el estudio se emplearon ratones C57BL /6 (hembras embarazadas de 15 días).

Entorno

Los animales se mantuvieron en una instalación SPF en condiciones controladas de temperatura (23 ± 2°C), humedad (45 ± 10%), iluminación (ciclos de luz artificial y oscuridad de 12 horas; luz de 8:00 a 20:00) e intercambio de aire. Se mantuvo una alta presión en la sala experimental para evitar la contaminación de la instalación.

Cría de animales

Los animales se alojaron en jaulas de policarbonato KN-600 (Natsume Seisakusho, Japón) con un máximo de 4 ratones por jaula. Se usó Paper-Clean esterilizado (Japón SLC) para el encamado y se reemplazó una vez a la semana.

Comida y bebida

Se proporcionó HFD sólido esterilizadoad libitum,que se colocó en la tapa de metal en la parte superior de la jaula. Se proporcionó agua puraad libitumde una botella de agua equipada con un tapón de goma y un tubo de aspiración. Las botellas de agua se sustituyeron una vez a la semana, se limpiaron y esterilizaron en autoclave y se reutilizaron.

Identificación de animales y jaulas

Los ratones se identificaron mediante números grabados en los pendientes. Cada jaula se etiquetó con un código de identificación específico.

Medición de la bioquímica hepática

Medición del contenido de hidroxiprolina en el hígado

Para cuantificar el contenido de hidroxiprolina en el hígado, las muestras de hígado congeladas (32-40 mg) se procesaron mediante un método de hidrólisis ácida-alcalina de la siguiente manera. Las muestras de hígado se desgrasaron con acetona al 100 %, se secaron en el aire, se disolvieron en NaOH 2N a 65 °C y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Las muestras lisadas (400 mL) se hidrolizaron con ácido con 400 mL de HCl 6N a 121 °C durante 20 minutos, y se neutralizaron con 400 mL de NaOH 4N que contenía 10 mg/ml de carbono activado. Se añadió tampón AC (ácido acético 2,2 M/ácido cítrico 0,48 M, 400 mL) a las muestras, seguido de centrifugación para recolectar el sobrenadante. Se construyó una curva estándar de hidroxiprolina con diluciones en serie de trans-4-hydroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich) a partir de 16 mg/ml. Las muestras y los estándares preparados (cada uno de 400 mL) se mezclaron con 400 mL de solución de cloramina T (Wako Pure Chemical Industries, Japón) y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. Después, las muestras se mezclaron con la solución de Ehrlich (400 mL) y se calentaron a 65 °C durante 20 minutos para desarrollar el color. Después de enfriar las muestras en hielo y centrifugarlas para eliminar los precipitados, se midió la densidad óptica de cada sobrenadante a 560 nm. Las concentraciones de hidroxiprolina se calcularon a partir de la curva estándar de hidroxiprolina. Las concentraciones de proteínas de las muestras de hígado se determinaron mediante el uso de un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) y se usaron para normalizar los valores de hidroxiprolina calculados. Los niveles de hidroxiprolina en el hígado se expresaron como mg por mg de proteína.

Análisis histopatológicos

Para la tinción con HE, las secciones se cortaron a partir de bloques de parafina de tejido hepático prefijado en la solución de Bouin y se tiñeron con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals, Japón) y una solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). La puntuación de la actividad de la NAFLD (NAS) se calculó de acuerdo con los criterios de Kleiner (Kleiner DE. y otros, Hepatology, 2005; 41:1313). Para visualizar la deposición de colágeno, las secciones de hígado fijadas en Bouin se tiñeron con solución de picro-rojo sirio (Waldeck, Alemania). Para la inmunohistoquímica, las secciones se cortaron a partir de tejidos hepáticos congelados embebidos en el compuesto Tissue-Tek O.C.T. y se fijaron en acetona. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó mediante el uso de H2O2 al 0,03 % durante 5 minutos, seguido de la incubación con Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma, Japón) durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con una dilución de 200 veces de anticuerpo anti-a-SMA (Epitomics, Estados Unidos) o anti-F4/80 (BMA Biomedicals, Suiza) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (anticuerpo anti-rata generado en cabra-HRP, Invitrogen, Estados Unidos), se realizaron reacciones de enzima-sustrato mediante el uso de la solución 3,3'-diaminobenzidina/H2O2 (Nichirei, Japón).

Para el análisis cuantitativo del área de fibrosis, el área de inflamación y la semicuantificación de a-SMA, se capturaron imágenes de campo claro de secciones teñidas de rojo sirio, F4/80 e inmunoteñidas para a-SMA alrededor de la vena central mediante el uso de una cámara digital (DFC280; Leica, Alemania) con una ampliación de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron mediante el uso del programa ImageJ (National Institute of Health, Estados Unidos).

RT-PCR cuantitativo

El ARN total se extrajo de muestras de hígado mediante el uso de RNAiso (Takara Bio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un mg de ARN se transcribió de forma inversa mediante el uso de una mezcla de reacción que contiene MgCh 4,4 mM (F. Hoffmann- La Roche, Suiza), inhibidor de la ARNasa 40 U (Toyobo, Japón), dNTP 0,5 mM (Promega, Estados Unidos), hexámero aleatorio 6,28 mM (Promega), tampón de la primera hebra 5 x (Promega), ditiotreitol 10 mM (Invitrogen, Estados Unidos) y MMLV-RT 200 U (Invitrogen) en un volumen final de 20 mL. La reacción se llevó a cabo durante 1 hora a 37 °C, seguido de 5 minutos a 99 °C. La PCR en tiempo real se realizó mediante el uso de PCR en tiempo real DICE y la premezcla SYBR Taq (Takara Bio). Para calcular el nivel de expresión relativo del ARNm, la expresión de cada gen se normalizó con respecto a la del gen de referencia 36B4 (símbolo del gen: Rplp0). La información de los conjuntos de cebadores de PCR se describió en la Tabla 1.

Tabla 1. Información del cebador de PCR

gen ID de conjunto secuencia

36B4 MA057856 directoS’-TTCC A GGCTTTGG GC ATC A-3!

inverso5’-ATGTTCAGC ATGTTCAGC AGT GTG-3’TIMP-1 MA098519 directo5’-T GAGCCCTGCT CAGCAAAGA-31’

inverso5'-GAGGACCTGATCCGTCGACAA-3' [Colágeno de tipo 1 MA075477 directo5’-CC AACAAG GATGT C TG GTTAG GAG-3'inverso5’- G C AATG CTGTTCTTGCAGTGGTA-3"Alfa-SMA MA057911 directo5’-AAGAGCATCCGACACTGGTGAC-3’inverso¡EF-AGC AC AGC C TG AATAGCC ACATAC -3'5-Lipoxigenasa MA148345 directo5'-TTG GCAT CTAGGT GCAGT GTG-31

inversoEi’-TGCG G A AT C GG ATCATG G-T

FLAP MA159311 directoS’-CGG ACT GAT GTACCTGTTTGT GAG-3’inverso5 -ATC C GCTTGCC GAA G ATGTAG -3'LTC4 sintasa MA085965 directo5'-CTGTGGCTGGGAACATGAAG-3'

inverso5*-CCTTCGTGCAGAGATCACCTGTAG-3‘Pruebas estadísticas

Se realizaron análisis estadísticos mediante el uso de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni en GraphPad Prism 4 (Graph-Pad Software, Estados Unidos). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se asumió una tendencia o inclinación cuando una prueba t con una cola devolvió valores de P < 0,10. Los resultados se expresaron como la media ± SD.

Diseño experimental y tratamiento

Grupos de estudio

Grupo 1: Normal

Diez ratones normales se alimentaron con una dieta normalad libitumsin ningún tratamiento hasta las 12 semanas de edad.

Grupo 2: Vehículo

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo en un volumen de 10 mL/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Grupo 3: Dosis baja de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Grupo 4: Dosis intermedia de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 30 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Grupo 5: Dosis alta de MN-001

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con vehículo complementado con MN-001 a una dosis de 100 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

Grupo 6: Telmisartán

Diez ratones con NASH se administraron por vía oral con agua pura complementada con Telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde las 8 a las 12 semanas de edad.

La tabla 2 resume el esquema de tratamiento.

Tabla 2. Esquema de tratamiento

Monitoreo y sacrificio de animales

La viabilidad, los signos clínicos y el comportamiento se monitorearon diariamente. El peso corporal se registró antes del tratamiento. Los ratones se observaron para detectar signos clínicos significativos de toxicidad, cercanía a la muerte y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Los animales se sacrificaron por exanguinación mediante punción cardiaca directa bajo anestesia de éter (Wako Pure Chemical Industries).

Resultados

Análisis histológicos

Tinción con HE y puntuación de la actividad de la NAFLD (NAS)

La puntuación de actividad de la NAFLD (NAS) es una medida del alcance del daño hepático, por ejemplo, en un sujeto que padece NASH avanzada y una respuesta hepática dañada al tratamiento. Las fotomicrografías representativas de las secciones teñidas con HE se muestran en la Figura 1. Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron depósito de grasa micro y macrovesicular grave, hinchazón hepatocelular e infiltración de células inflamatorias. Consistente con estas observaciones, la NAS aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Todas las dosis de los grupos tratados con MN-001 mostraron mejoras marcadas en la hinchazón hepatocelular y en la infiltración de células inflamatorias. La NAS disminuyó significativamente en todas las dosis de los grupos tratados con MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. Ver, Tablas 3 y 4 más abajo y las Figuras 2-5.

T l . M r NA m n n NA r MN- 1

Tabla 4

Definición de componentes de la NAS_________________________

_______ Elemento__________Puntuación Alcance

Esteatosis 0 <5 %

1 5-33 %

2 >33-66 %

Hinchazón de hepatocitos 3 >66 %

0 Ninguno

1 Pocas células hinchadas

2 Muchas células/hinchazón prominente Inflamación lobular 0 Sin focos

1 <2 focos/200x

2 2-4 focos/200x

3 >4 focos/200x

Tinción con rojo sirio

En la Figura 6 se muestran fotomicrografías representativas de secciones de hígado teñidas con rojo sirio. Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un aumento de la deposición de colágeno en la región pericentral del lóbulo hepático en comparación con el grupo Normal. El porcentaje de área de fibrosis (área positiva para rojo sirio) aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área de fibrosis disminuyó significativamente en los grupos con Telmisartán, con dosis baja de MN-001 y con dosis alta de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. El área de fibrosis tendió a disminuir en el grupo con dosis intermedia dem N - 0 0 1en comparación con el grupo con vehículo. Ver, Tabla 5 y Figura 7.

Inmunotinción de FF4/80

Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un número y tamaño aumentados de células positivas para F4/80 en el lóbulo hepático en comparación con el grupo normal. El porcentaje del área de inflamación (área positiva para F4/80) aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área de inflamación tendió a disminuir en el grupo con Telmisartán. No hubo diferencias significativas en el área de inflamación entre el grupo con vehículo y cualquier dosis de los grupos tratados con MN-001, aunque se observó una mejoría en la Figura 8. Ver también la Tabla 5.

Inmunotinción para alfa-SMA

Las fotomicrografías representativas de las secciones inmunoteñidas para a-SMA se muestran en la Figura 9. Las secciones hepáticas del grupo con vehículo mostraron un aumento en el número de las células positivas para a-SMA en el lóbulo hepático en comparación con el grupo normal. El porcentaje de área positiva para a-SMA aumentó significativamente en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. El área positiva para a-SMA disminuyó significativamente en los grupos tratados con Telmisartán, con dosis baja y alta de MN-001 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en el área positiva para a-SMA entre el grupo con vehículo y el grupo con dosis intermedia de MN-001. Ver la Tabla 5 y la Figura 9.

Tabla 5. Análisis histoló icos

Análisis de la expresión génica

TIMP-1

Los niveles de expresión de ARNm de TINW-1 se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de TIMP-1 se regularon negativamente de modo significativo en los grupos con dosis baja de MN-001 y Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de TIMP-1 entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos.

Colágeno de tipo 1

Los niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 se regularon negativamente de modo significativo en el grupo Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. El grupo con dosis alta de MN-001 tendió a disminuir los niveles de expresión de ARNm de colágeno de tipo 1 en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos.

Alfa-SMA

Los niveles de expresión de ARNm de alfa-SMA se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de alfa-SMA se regularon negativamente de modo significativo en el grupo con Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de a-SMA entre el grupo con vehículo y cualquier dosis de los grupos tratados con MN-001.

Cinco-lipoxigenasa

Los niveles de expresión de ARNm de cinco-lipoxigenasa tendieron a aumentar en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de cinco-lipoxigenasa en los grupos con dosis alta de MN-001 y Telmisartán tienden a disminuir en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de 5-Lipoxygenase entre el grupo con vehículo y los grupos con dosis baja e intermedia de MN-001.

FLAP

Los niveles de expresión de ARNm de FLAP se regularon positivamente de modo significativo en el grupo con vehículo en comparación con el grupo normal. Los niveles de expresión de ARNm de FLAP en el grupo con dosis alta de MN-001 tendieron a aumentar en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de FLAP entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos.

LTC4 sintasa

Los niveles de expresión de ARNm de LTC4 tendieron a disminuir en el grupo Telmisartán en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de LTC4 sintasa entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos.

Cambios en el peso corporal y estado general

El peso corporal aumentó gradualmente durante el período de tratamiento en todos los grupos excepto en el grupo con Telmisartán. La media del peso corporal del grupo con vehículo fue menor que la del grupo normal a lo largo del periodo de tratamiento. La media del peso corporal del grupo con Telmisartán fue significativamente menor que la del grupo con vehículo desde el día 8 hasta el día 28. No hubo diferencias significativas en la media del peso corporal entre el grupo con vehículo y cualquiera de los grupos tratados con MN-001 durante el periodo de tratamiento. Uno del grupo con Telmisartán se encontró muerto el día 24. Ninguno de los animales mostró deterioro de su estado general.

Peso corporal en el día del sacrificio

El grupo con vehículo mostró una disminución significativa en la media del peso corporal en el día del sacrificio en comparación con el grupo con normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en la media del peso corporal en el día del sacrificio en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en la media del peso corporal el día del sacrificio entre el grupo con vehículo y cualquier dosis de los grupos tratados con MN-001.

Peso de hígado y relación peso corporal-hígado

El grupo con vehículo mostró un aumento significativo en la media del peso del hígado en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en la media del peso del hígado en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en la media del peso del hígado entre el grupo con vehículo y cualquier dosis de los grupos tratados con MN-001.

El grupo con vehículo mostró un aumento significativo en la media de la relación peso corporal-hígado en comparación con el grupo normal. El grupo con Telmisartán mostró una disminución significativa en la media de la relación peso corporal-hígado en comparación con el grupo con vehículo. No hubo diferencias significativas en media de la relación peso corporal-hígado entre el grupo con vehículo y cualquier dosis de los grupos tratados con MN-001.

Bioquímica hepática

Contenido de hidroxiprolina en el hígado

El grupo vehículo tendió a aumentar el contenido de hidroxiprolina en el hígado en comparación con el grupo con normal. No hubo diferencias significativas en el contenido de hidroxiprolina en el hígado entre el grupo con vehículo y cualquiera de los otros grupos.

Si bien se han ilustrado y descrito determinadas modalidades, debe entenderse que pueden realizarse cambios y modificaciones en las mismas de acuerdo con la experiencia ordinaria en la técnica sin apartarse de la tecnología en sus aspectos más amplios como se define en las siguientes reivindicaciones.

Las modalidades, descritas ilustrativamente en la presente descripción, pueden practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritos específicamente en la presente descripción. Por lo tanto, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. se leerán de forma amplia y sin limitación. Adicionalmente, los términos y expresiones empleados en la presente descripción se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de estas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la tecnología reivindicada. Adicionalmente, se entenderá que la frase "que consiste esencialmente en" incluye aquellos elementos específicamente enumerados y aquellos elementos adicionales que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la tecnología reivindicada. La frase "que consiste en" excluye cualquier elemento no especificado.

La presente descripción no debe limitarse en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud. Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones sin apartarse de su alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Los métodos y composiciones funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la descripción, además de los enumerados en la presente descripción, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las descripciones anteriores. Se pretende que tales modificaciones y variaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La presente descripción debe estar limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho tales reivindicaciones. Debe entenderse que esta descripción no se limita a métodos, reactivos, composiciones de compuestos o sistemas biológicos particulares, que por supuesto pueden variar. Debe entenderse, además, que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir únicamente modalidades particulares, y no pretende ser limitante.

Además, cuando las características o aspectos de la descripción se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la descripción de esta manera se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Como entenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos descritos en la presente descripción también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de estos. Puede reconocerse fácilmente que cualquier intervalo enumerado describe suficientemente y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, décimos, etcétera. Como un ejemplo no limitante, cada intervalo discutido en la presente descripción puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, un tercio medio y un tercio superior, etcétera. Como también entenderá un experto en la técnica, todos los lenguajes tales como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que" y similares, incluyen el número mencionado y se refieren a intervalos que pueden ser subsecuentemente divididos en subintervalos como se discutió anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual.

Las modalidades se exponen en las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de Fórmula (I), un metabolito del compuesto de Fórmula (I), un éster del compuesto de Fórmula (I), o un metabolito del éster del compuesto de Fórmula (I):

   o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los anteriores, en donde m es un número entero de 2 a 5 inclusive, y n es un número entero de 3 a 8 inclusive, X<1>y X<2>representan cada uno independientemente azufre, oxígeno, un grupo sulfinilo o un grupo sulfonilo, siempre y cuando X<1>y X<2>no sean simultáneamente oxígeno, para usar en el tratamiento de un paciente diagnosticado con esteatohepatitis no alcohólica avanzada (NASH), una progresión de la NASH caracterizada por fibrosis hepática, en donde un metabolito es un compuesto donde el grupo -COCH<3>que se une al fenilo que contiene la porción -O-(CH<2>)nCO<2>H se metaboliza a un grupo 1 -hidroxietilo.
2. 2. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el paciente diagnosticado con NASH avanzada exhibe uno o más de angiomas en forma de araña, ascitis, esplenomegalia, borde hepático duro, eritema palmar, asterixis, o hipertensión portal.
3. 3. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el tratamiento es para reducir la fibrosis hepática en un paciente que padece de NASH avanzada.
4. 4. El compuesto para un uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3, en donde el paciente diagnosticado con NASH avanzada exhibe uno o más de cicatrices hepáticas, cirrosis o carcinoma hepatocelular (HCC).
5. 5. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el tratamiento es para reducir las cicatrices hepáticas en un paciente que padece de NASH avanzada.
6. 6. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto de Fórmula (I) es de Fórmula (IA)
7. 7. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el compuesto está presente en una forma cristalina ortorrómbica.
8. 8. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el metabolito del compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IB):
9. 9. El compuesto para un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a<8>, en donde el compuesto se formula en una composición terapéutica con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables,
10. 10. El compuesto para un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el compuesto se administra por vía oral.
11. 11. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el compuesto se administra como un comprimido o una cápsula.
12. 12. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación<6>, en donde el compuesto se administra como una forma de dosificación líquida.
13. 13. El compuesto para un uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación<6>, en donde el compuesto se administra en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 mg/día, dividida en una, dos o tres porciones.