ES2525079B1

ES2525079B1 - Actividad antiparasitaria de escuaramidas

Info

Publication number: ES2525079B1
Application number: ES201330699A
Authority: ES
Inventors: Maria del Carmen Rotger Pons; Antonio Costa Torres; Manuel SÁNCHEZ MORENO; Clotilde MARÍN SÁNCHEZ
Original assignee: Universitat de les Illes Balears; Universidad de Granada
Current assignee: Universitat de les Illes Balears; Universidad de Granada
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2016-01-18
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: WO2014184416A1; ES2525079A1

Abstract

Actividad antiparasitaria de escuaramidas.#La presente invención se refiere a la síntesis y uso de compuestos de base escuaramida para el tratamiento de enfermedades de origen parasitario como son la Tripanosomiasis americana también conocida como enfermedad de Chagas o la Leishmaniasis.

Description

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Actividad antiparasitaria de escuaramidas DESCRIPCION

La presente invencion se refiere a la sintesis y uso de compuestos de base escuaramida para el tratamiento de enfermedades de origen parasitario como son la Tripanosomiasis americana tambien conocida como enfermedad de Chagas o la Leishmaniasis.

ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR

Las enfermedades olvidadas (Neglecteddiseases) son enfermedades que afectan a millares de personas en todo el mundo, pero que no disponen de tratamientos eficaces o adecuados. En su mayorfa se trata de enfermedades tropicales infecciosas que afectan fundamentalmente a la poblacion mas pobre, como por ejemplo la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, que ocasionan un impacto devastador en la humanidad. Estas enfermedades infecciosas estan causadas por parasitos protozoarios que afectan especialmente a los paises menos desarrollados, representando un problema grave de salud publica en el mundo. Se estima que casi el 50% de la poblacion mundial esta expuesta a este riesgo de contraer estas infecciones, y que aproximadamente 500 millones de personas sufren cada ano patologfas relacionadas con este tipo de enfermedades.

En la actualidad no existe tratamiento eficaz frente a estas enfermedades olvidadas, ya que, son de larga duracion y algunos son de obligada administracion parenteral o intravenosa, ademas de tener una elevada toxicidad (pancreatitis y toxicidad cardiovascular) con lo que pueden conllevar un efecto letal. Con lo que, se acentua el problema sanitario al no haber terapias efectivas o la resistencia a los pocos farmacos accesibles existentes.

La enfermedad de Chagas esta causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi que se transmite de forma natural a traves de las deyecciones de una chinche triatomina hematofaga (Hemipterareduviidae). Otras vias de transmision son por transfusion de sangre infectada, el trasplante de organos e incluso de madres a hijos

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mediante el embarazo y la lactancia, o por via oral a traves de alimentos contaminados. En esta enfermedad se distinguen dos fases, la fase aguda en la que el parasito se multiplica activamente dentro de las celulas del hospedador y se detectan altos niveles de parasitemia en sangre; y la fase cronica, que desarrollan el 30% de los infectados, en la que el nivel de parasitemia se reduce a niveles subpatentes en sangre pero los parasitos forman pseudoquistes en diferentes organos como corazon, esofago y colon, ocasionando cardiopatfas, megasindromes digestivos. Se trata de una enfermedad endemica en la mayor parte de America Latina y se ha clasificado por la WHO como la tercera enfermedad tropical mas extendida despues de la malaria y la esquistosomiasis. Se ha estimado que alrededor de 100 millones de personas estan en peligro de ser infectadas y que hay entre 15 y 20 millones de personas infectadas. 50,000 personas mueren cada ano como resultado de la infeccion de este parasito.

Desafortunadamente, el tratamiento para la enfermedad de Chagas utilizado en la actualidad es muy limitado y no se ha desarrollado una vacuna efectiva. Los agentes terapeuticos desarrollados hasta la actualidad se basan en estructuras nitro- heterociclicas como el nitrofurano (nifurtimox) o el derivado del nitroimidazol (benznidazol). Tanto el nifurtimox como el benznidazol solo son efectivos frente a la fase aguda de la enfermedad, demostrando tener una eficacia muy limitada en la fase cronica. Ademas son muy toxicos y causan efectos secundarios severos como pancreatitis y toxicidad cardiaca.

La leishmaniasis, causada por la infeccion de diferentes especies de protozoos del genero Leishmania es una enfermedad cosmopolita. Alrededor de 20 millones de personas padecen esta enfermedad, la cual se transmite a traves de la picadura de dipteros del genero Phlebotomus o Lutzomyia. La leishmaniasis se puede presentar en diferentes manifestaciones clinicas: visceral, cutanea o mucocutanea, siendo la visceral la forma mas grave de la enfermedad.

El tratamiento de la leishmaniasis es complicado y ademas, esta enfermedad presenta una morbilidad sustancial por lo que a menudo se requieren terapias expeditivas. En la leishmanaiosis se utilizan desde hace mas de 70 anos derivados pentavalentes del antimonio como: Estibogluconato sodico (Pentostan) o la Meglumina antimoniato (Glucantime). Otros medicamentos utilizados son: Anfotericina B (AmBiosome®) que

se administra durante un maximo de 10 dias y no presentan toxicidad pero, es sumamente caro (1,500 a 2,400$ por tratamiento); la miltefosina que de administracion oral pero el tratamiento dura 4 semanas y tiene restricciones de uso para gestantes y ninos; la pentamidina y el Ketoconazol. Este problema se agrava dado que las 5 infecciones repetidas de la poblacion o los tratamientos inefectivos han ocasionado la resistencia de los parasitos a estas terapias.

Por lo tanto, resulta necesario obtener nuevos agentes terapeuticos mas efectivos tanto en las fases agudas como cronicas de las enfermedades mencionadas, y que 10 ademas sean activos frente cepas resistentes a los tratamientos habituales. Ademas es importante que presenten una menor toxicidad con el objetivo de disminuir los efectos secundarios adversos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION 15

En la presente invencion se proporciona unos compuestos de base escuaramida como agentes antiparasitarios, en particular para el tratamiento de la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas.

20 Por tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de formula general (I):

°v y°

\____/

Ri

N------R,

Ra

(I)

donde:

Ri se selecciona de entre -NRaRb o -ORc, donde:

Ra se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); preferiblemente hidrogeno o alquilo (C1-C3); mas preferiblemente hidrogeno o metilo.

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Rb se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido, preferiblemente fenilo, -(CH2)X-NR1'R1" o -(CH2)X-CO2R1"'; x tiene un valor de 0 a 5 y Ri', R1”y Ri'" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1- C5);

Rc se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); preferiblemente entre hidrogeno o alquilo (C1-C3); mas preferiblemente es hidrogeno;

R2 se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido; heterociclo, opcionalmente sustituido; aralquilo (C1-C5), opcionalmente sustituido; alquilo (C1-C20), preferiblemente alquilo (C4-C15); -(CH2)x-NR2'R2''; o -(CH2)y-R4, donde x tiene un valor de 0 a 5, y tiene un valor de 0 a 5 y R2'y R2'' se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5);

R3 se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); preferiblemente hidrogeno o alquilo (C1-C3); mas preferiblemente hidrogeno y metilo; aun mas preferiblemente hidrogeno;

R4 es el grupo de formula (II):

imagen1

donde: X se selecciona de la lista que comprende -NR4'-, -CH- y arilo, opcionalmente sustituido; R4' se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); y R1, R3 e y se han definido anteriormente;

o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevention de enfermedades parasitarias.

En una realization preferida, cuando Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr': x puede tener los valores 1, 2 o 3, mas preferiblemente 2 o 3, y Rry R1'' se seleccionan independientemente entre un grupo alquilo(C1-C4); mas preferiblemente metilo o butilo; o

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x puede ser 0 y R1' y R1" se seleccionan independientemente entre hidrogeno o alquilo(C1-C3), mas preferiblemente R1' y R1" son hidrogeno, y en este caso Rb es - NH2.

En una realizacion preferida, cuando Rb es el grupo -(CH2)x-CO2Rr”; R1'" es preferiblemente hidrogeno, metilo o etilo y mas preferiblemente hidrogeno y x tiene el valor de 1,2 o 3.

El termino “alquilo” se refiere en la presente invencion a cadenas alifaticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 20 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n- propilo, /-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 5, y mas preferiblemente entre 1 y 3, atomos de carbono o entre 4 y 15 atomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o mas sustituyentes tales como halogeno, hidroxilo, azida, acido carboxilico arilo, hidroxilo, amino, amido, ester, carboxilico, eter, tiol, acilamino o carboxamido, que a su vez pueden opcionalmente estar sustituidos. Preferiblemente el grupo alquilo no esta sustituido.

El termino “arilo” se refiere en la presente invencion a una cadena carbociclica aromatica, que tiene de 6 a 18 atomos de carbono, pudiendo ser de anillo unico o multiple, en este ultimo caso con anillos separados y/o condensados. Un ejemplo, no limitante, de arilo es un grupo fenilo, naftilo, indenilo, etc....El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido por al menos un grupo seleccionado de entre un hidroxilo, ester, carboxilo, alquilo o grupo -(CH2)x-NR'R", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R' y R'' se seleccionan independientemente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5). Preferiblemente el grupo arilo es un fenilo, en donde el grupo fenilo puede contener 1 o mas sustituyentes segun se han descrito anteriormente y preferiblemente esta sustituido por un grupo ester, hidroxilo, -NH2, -CH2-NH2, o -N(CH3)2.

El termino “aralquilo” se refiere, en la presente invencion, a una cadena alifatica de entre 1 y 5 atomos de carbono en el que al menos uno de los hidrogenos se ha sustituido por un grupo arilo, con las acepciones anteriores. Como por ejemplo, pero sin limitarse, un grupo benciloofenetilo. Estos grupos aralquilo pueden, a su vez, estar opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo, hidroxi, nitro, amino o halogeno. Preferiblemente es un grupo bencilo, opcionalmente sustituido, y mas preferiblemente es un grupo bencilo que no esta sustituido.

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El termino “heterociclo” se refiere, en la presente invencion, a un radical de cadena carbociclica y que consiste en atomos de carbono, entre 3 y 6, mas preferiblemente 5 o 6, donde al menos un atomo de carbono es sustituido por un heteroatomo seleccionados del grupo que consiste en nitrogeno, oxigeno o azufre. Esta cadena carbociclica puede estar insaturada, saturada o parcialmente saturada. Preferiblemente esta saturada. Puede estar opcionalmente sustituida porl o mas sustituyentes del grupo formado por alquilo, hidroxi, nitro, amino, halogeno, arilo o aralquilo. Preferiblemente es un grupo piperidina, y mas preferiblemente sustituida por un grupo bencilo, y aun mas preferiblemente en la posicion 1.

En otra realizacion preferida, cuando R2 es -(CH2)y-R4 y el compuesto es de formula (III):

o.

‘ .0

imagen2

—^-H2C-j—X-----^-CH2^—

3

(III)

imagen3

N

y | r

Ra

donde: X, y, R1 y R3 se han definido anteriormente.

Cuando X es un grupo arilo, preferiblemente es un grupo fenilo, opcionalmente sustituido, mas preferiblemente sin sustituir, y aun mas preferiblemente y es 1, 2 o 3, mas preferiblemente y es 1.

Cuando X es el grupo -CH-, preferiblemente y es 1,2 o 3, mas preferiblemente 1.

Cuando X es -NR4'-, R4' preferiblemente se selecciona entre hidrogeno o un alquilo (C1-C3), preferiblemente metilo o etilo, mas preferiblemente es metilo. En una realizacion aun mas preferida y es 2, 3 o 4, aun mas preferiblemente y es 3.

En una realizacion mas preferida, R3 es hidrogeno en el compuesto de formula (III).

En una realizacion aun mas preferida, R es -NRaRb, Ra es metilo y Rb es el grupo - (CH2)x-NRi'Ri", donde R-i' y R-i" son metilo y x es 2 o 3.

Los compuestos, de formula general (I) como de formula general (III) pueden estar en 5 forma de sales de halogeno, como por ejemplo, pero sin limitarse a ioduros, cloruros o fluoruros, preferiblemente las sales son de ioduro.

Los compuestos de formula (I), y en particular algunos de formula (III), se pueden seleccionar de lista que comprende:

10 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (2), 3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1,2-diona (5), 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (3), 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (4), 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (6),

15 3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (9), 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (8), 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (7), 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (10), ioduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- 20 trimetiletanamonio (13),

benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino) (18), ioduro de 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (11)

imagen4

25 ioduro de 2-((2-(bencilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (12)

imagen5

acido 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)acetico (14)

5

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O. .0

K

/—N N'

H02C h H

14

acido 3-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)propanoico (15)

O. .0

K

H02C^/^N N'

H H

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acido 4-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)butanoico (16)

0. ,0

ho2c

~N N'

H H

16

3-((4-(dimetilamino)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (17)

o. .o

HO

17 H

/

f NV

3-hidroxi-4-((2-hidroxifenil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (19)

o. ,o

HO' 'N^V U 19 HO

imagen6

3-((4-(aminometil)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (20)

o. -O

HO' 'N --%Jj NH2

on H 20

J

4,4'-(((metilazanediil)bis(propano-3,1-diil))bis(azanediil))bis(3-((3- (dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona) (21)

o

o.

imagen7

o.

. N

N H

H

N

I

21

imagen8

O

N .

H N' H

ioduro de 3,3'-(((((metilazanediil)bis(propano-3,1-diil))bis(azanediil))bis(3,4- dioxociclobut-1-en-2,1-diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetilpropan-1-amonio) (22)

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imagen9

4,4'-(propano-1,3-diilbis(azanediil))bis(3-((3-dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3-en- 1,2-diona) (23)

N H H

,£f

H N H

23

\.

/ - '; y

ioduro de 2,2'-((((1,3-fenilenebis(metilene))bis(azanediil))bis(3,4-dioxociclobut-1-en- 2,1-diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetiletanamonio) (24)

imagen10

N

~N H

i- r+ h

A-

imagen11

-A1

imagen12

Para los compuestos descritos en la presente invencion se ha demostrado que son utiles para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades parasitarias.

Por “enfermedad parasitaria”, se entiende en la presente invencion a una enfermedad infecciosa causada por protozoos, vermes (cestodos, trematodos, nematodos) o artropodos. En particular los parasitos son protozoos, por tanto, se puede decir que los compuestos son antiprotozoarios. En una realizacion mas preferida los parasitos pertenecen a la familia Trypanosomatidae, mas preferiblemente los parasitos son del genero Trypanosoma o Leishimania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse,Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.

Las enfermedades parasitarias a tratar podrian ser leishmaniosis (o leishmaniasis) o tripanosomiosis (o tripanosomiasis). “Leishmaniosis” es una enfermedad causada por un protozoo del genero Leishmania y transmitido, principalmente por mosquitos flebotomos o jejenes. Esta enfermedad se produce en humanos y animales

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vertebrados, como pueden sermarsupiales, canidos, roedores y primates. Y “tripanosomiasis” son enfermedades producidas en humanos o animales vertebrados que son causadas por parasitos protozoarios del genero Trypanosoma, entre ellas se puede encontrar la tripanosomiasis humana africana, tambien conocida como enfermedad del sueno, la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas o la tripanosomiasis en animales o Nagana.

En una realizacion preferida de la presente invencion los compuestos descritos en la presente invencion se usan para el tratamiento y/o la prevencion de la leishmaniosis o la enfermedad de Chagas.

Un segundo aspecto de la presente invencion es un compuesto de formula general (IV):

o

N------R2

r3

(IV)

donde:

R1 es un grupo -NRaRb, donde:

Ra es un alquilo C1-C3; preferiblemente Ra es un metilo y

Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr\ donde x tiene un valor de 0 a 5 y RYy R1" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5);

R2 se selecciona de un grupo alquilo (C1-C20), preferiblemente alquilo (C4-C12), o un grupo -(CH2)X-NR2'R2"; x tiene un valor de 0 a 5, preferiblemente de 1 a 5, mas preferiblemente de 2, 3, o 4, mas preferiblemente 3, y R2' y R2" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5), preferiblemente entre hidrogeno y alquilo (C1-C3), mas preferiblemente metilo; y

R3 se selecciona de entre hidrogeno o un alquilo (C1-C5), preferiblemente hidrogeno o alquilo (C1-C3); mas preferiblemente hidrogeno o metilo; o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables.

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En una realizacion preferida Rb es el grupo -(CH2)X-NR1'R1", x tiene un valor de 1 a 5 y R-i'y R1" se seleccionan de manera independiente un alquilo (C1-C3), mas preferiblemente Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr\ x tiene un valor de 1 a 5 y Rry R1" son metilo, aun mas preferiblemente x es 2, 3 o 4, y aun mas preferiblemente x es 3.

En otra realizacion preferida Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr\ x es 0 y Rry R1" se seleccionan de manera independiente un alquilo (C1-C3), mas preferiblemente R1'y R1" son hidrogeno.

En una realizacion mas preferida, el compuesto de formula (IV) se selecciona de la lista que comprende:

3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (2), 3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1,2-diona (5), 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (3), 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (4), y 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (6).

Mas preferiblemente el compuesto es 3-(butilamino)-4-((3- (dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento de obtencion de los compuestos de formula (IV) que comprende la etapa de:

-hacer reaccionar un ester de monoescuaramida de formula general (V) con una amina de formula general (VI):

imagen13

imagen14

Donde: Et es etilo y Ra, Rb, R2 y R3 se ha descrito anteriormente para el compuesto de formula general (IV). Dicha reaccion tiene lugar preferiblemente a temperatura ambiente y entre 9 y 20 horas. De manera opcional se puede proceder a una etapa

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posterior de filtrado, previamente con o sin evaporacion del disolvente, y/o posterior secado del compuesto de formula (IV) obtenido.

El procedimiento de la presente invencion puede tener una etapa previa de obtencion del compuesto de formula general (V) que comprende:

hacer reaccionar un escuaramato de dietilo de formula (VIII) con una amina de formula (VII)

imagen15

OEt

imagen16

imagen17

OEt

(VIII) (V)

Donde: Et es etilo y Ra y Rb se ha descrito anteriormente para el compuesto de formula general (IV). Dicha reaccion tiene lugar preferiblemente a temperatura ambiente y entre 9 y 20 horas. De manera opcional se puede proceder a una etapa posterior de filtrado, previamente con o sin evaporacion del disolvente, y/o posterior secado del compuesto de formula (V) obtenido.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a los compuestos que se seleccionan de la lista que comprende:

3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (9), 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (8), 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (7), 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (10),

Ioduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (13), y

Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino) (18).

Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos un compuesto de formula general (IV) o a los compuestos descritos en el cuarto aspecto de la invencion, junto con al menos un vehiculo farmaceuticamente aceptable, opcionalmente esta composicion puede incluir otro principio activo, por ejemplo otro compuesto antiparasitario.

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Un sexto aspecto mas de la presente invencion se refiere al uso de los compuestos de formula general (IV) o a los compuestos descritos en el cuarto aspecto de la invencion, para la elaboracion de un medicamento.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Representa la evolucion de los niveles de parasitemia en sangre a lo largo del tiempo en ratones infectados y no tratados (control) y ratones infectados y tratados con los compuestos 2, 7, 8 y 22.

Fig. 2. Resultados in vivo despues de la inmunosupresion para ratones no tratados (control) y tratados con 40 mg/kg de compuesto 2. (A) Reactivacion de la parasitemia en sangre despues de los ciclos de inmunosupresion. (B) Diferencias en los niveles de IgG medidos mediante ensayos ELISA en ratones control (no IS) e inmunosuprimidos (IS) (C) Amplificacion por PCR despues de la purificacion del ADN total de los corazones de los ratones.

EJEMPLOS

SINTESIS COMPUESTOS

Metodo general para la obtencion de las mono escuaramidasdisecundarias

imagen18

imagen19

6,4 mmol de amina en 30 mL de eter dietflico se adicionan gota a gota a una disolucion de escuarato de etilo (1 g, 5,8 mmol) en 10 mL de eter dietflico a 5 temperatura ambiente. La reaccion se deja agitando a temperatura ambiente durante 12 h. Transcurrido este periodo de tiempo, en algunos casos se observa la aparicion de un precipitado de color amarillo palido. El solido se filtra y se lava con eter dietflico (3 x 10 mL), obteniendose la monoescuaramidaester en un rendimiento que oscila dependiendo de la amina utilizada entre el 60-90%. Alternativamente, si el producto de 10 reaccion permanece en disolucion, se evapora el disolvente y el solido obtenido se lava con n-pentano (3 x 10 mL) o se purifica mediante cromatograffa en columna (SiO4, AcOEt/ EtOH 1%).

1,1 mmol de amina en (20 ml) de etanol se adiciona gota a gota a un disolucion de 15 mono escuaramidaester (1 mmol) en 10 mL de etanol. La reaccion se deja a temperatura ambiente durante 12 h. Transcurrido este periodo de tiempo, en algunos casos se observa la aparicion de un precipitado de color amarillo palido. El solido se filtra y se lava con etanol (3 x 10 mL), obteniendose la monoescuaramidadisecundaria en un rendimiento que oscila dependiendo de la amina utilizada entre el 60-90%. 20 Alternativamente, si el producto de reaccion permanece en disolucion, se evapora el disolvente y el solido obtenido se lava con n-pentano (3 x 10 mL).

3-((3-(dimetilamino)propil)(metill)amino)-4-etoxiciclobut-3-en-1,2-diona (1)

O.

EtO N'

25

,N

\

5

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30

1 se ha preparado como se indica en el metodo general a partir de escuarato de dietilo (0,50 g, 2,94 mmol) en acetonitrilo (25 mL) y N1,N1,N3-trimetilpropano-1,3-diamina (0,3 g, 2,65 mmol) en acetonitrilo (5 mL). Se evapora el disolvente y se purifica mediante cromatograffa en columna SiO4 CH2Cl2-EtOH 10%. Se obtiene 1 ( 0,63 g, 12.6 mmol) como aceite incoloro. Rendimiento 90%.

1HRMN (CDCl3) 5 = 4.76 (2 H, J = 7.2 Hz, q), 3.72 (1H J = 6.9 Hz, t), 3.45 (1H J =7.2 Hz, q), 3.34 (1.5 H, s), 3.16 (1.5 H, s). 2.37 (2H, J = 6.6, t), 2.28 (3H, s), 2.23 (3 H, s), 1.85 (2 H, m), 1.50 (3 H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C NMR (CDCla, 75 MHz): 188.3, 188.0,

181.5, 175.6, 175.5, 171.6, 171.3, 68.7, 55.4, 49.7, 49.0, 44.4, 36.0, 35.6, 25.0, 24.8, 15.2 ppm.

3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (2)

imagen20

imagen21

2 se ha preparado como se indica en el metodo general a partir 1 (0,37 g, 1,55 mmol) en etanol (5 mL) y n-butilamina (0,13 g, 1,8 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 2 (0,40 g , 1,53 mmol) como solido blanco. Rendimiento 85 %.

1HRMN (CDCla) 5 = 8.36 (1H, br), 3.67 (2 H , J = 6.3 Hz, q), 3.34 (3 H, s), 2.37 (2 H, m), 2.23 ( 6 H, s), 1.75 (2 H, m), 1.55 (2 H, m), 1.26 (2 H, m), 0.95 ( 3H, J = 4.5 Hz, t) ppm. 13C RMN (DMSO- de) 5 = 183.7, 183.6, 169.4, 168.8, 54.5, 48.66, 45.2, 44.9,

36.5, 34.0, 24.1, 20.2, 14.2 ppm. HRMS calc para C14H26N3O2 [MH+] 268.2025 exp.

268.2022

De manera alternativa el compuesto 2 se preparo a partir de escuarato de etilo (0,50 g, 2,94 mmol) y N 1,N 1,N 3-trimetilpropano-1,3-diamina (0,33 g, 2,65 mmol), se mezclan y agitan a temperatura ambiente durante 2 h. Seguidamente se anade n-butilamina ( 0.23 g, 3.2 mmol) y se calienta agitando a 80 °C durante 2 h. El crudo se purifica mediante cromatograffa en columna (Al2O3, CH2Cl2/EtOH 5%) obteniendose 2 como solido blanco. Rendimiento 96 %.

3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (3)

imagen22

mmol) en etanol (5 mL) y octilamina (0,34 g, 2,4 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 3 (0,57 g, 1,68 mmol) como solido blanco. Rendimiento 70 %.

5 1HRMN (CDCl3) 5 = 8.36 (1 H,s), 3.66 (2 H, J = 6.3 Hz, q), 3.30 (5 H, m), 2.36 ( 2 H J =

5.7 Hz, t), 2.22 (6 H s), 1.74 (2 H, m), 1.56 ( 2 H, m), 1.30 (20 H, s), 0.88 (3H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C RMN (CDCla) 5 = 183.3, 168.4, 54.8, 54.2, 49.11, 45.19, 44.6, 32.1, 32.0, 30.1, 30.0, 29.9, 27.1, 23.8, 23.1, 14.5 ppm. HRMS calc para C18H34N3O2 [MH+] 324.2651 exp. 324.2653.

10

3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona

(4)

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15 en dietileter (5 mL) y dodecilamina (0,43 g, 2,3 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 4 (0,63 g, 1,65 mmol) como un aceite incoloro. Rendimiento 80 %.

1HRMN (CDCla) 5 = 8.36 (1 H,s), 3.67 (2 H, J = 6.3 Hz, q), 3.30 (5 H, m), 2.36 ( 2 H J =

5.7 Hz, t), 2.22 (6 H s), 1.74 (2 H, m), 1.56 ( 2H, m), 1.30 (28 H, s), 0.88 (3H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C NMR (CDCfe, 75 MHz): 5 = 182.7, 168.5, 168.0, 54.2, 48.4, 44.6, 44.4, 20 35.9, 31.6, 31.3, 29.3, 29.0, 26.3, 23.8, 22.4, 13.3 ppm HRMS calc para C22H42N3O2

[MH+] 380.3266 exp. 380.3277

3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1,2-diona (5)

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5

10

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25

5 se ha preparado como se indica en el metodo general a partir de 1 (0,38 g, 1,94 mmol) en dietileter (5 mL) y N-metilhidrazina (0,08 g, 1,76 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 5 (0,21 g, 1,05 mmol) como un solido rojizo. Rendimiento 60%.

1HRMN (CDCl3) 5 = 6.19 (1 H, s), 4.04 (2 H, s), 3.64 (2 H, J = 6.9 Hz, q), 3.50 (3 H, s), 1.58 (2 H, m), 1.38 (2 H, m), 0.94 (3H, J = 4.5 Hz, t) ppm. 13CRMN (CDCl3) 5 = 181.8, 180.9, 169.0, 168.5, 44.7, 43.4, 33.8, 20.0, 14.1 ppm. HRMS calc para C« H30N6O4 Na [2MNa+] 417.2234 exp. 417.2226.

3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (6)

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imagen26

imagen27

Escuarato de dietilo (0,29 g, 1,71 mmol) y N1,N1,N3-trimetilpropano-1,3-diamina (0,44 g, 3,76 mmol) en etanol (20 mL). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el residuo obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 6 (0,40 g, 1,28 mmol) como un solido blanco. Rendimiento 75% 1HRMN (CDCl3) 5 = 3.71 (4 H, J = 7.2 Hz t), 3.17 (6 H,s), 2.29 (4 H, J = 7.20 Hz, t), 2.21 (12 H, s), 1.80 (4 H, m) ppm. 13CRMN (CDCla) 5 = 184.4, 168.6, 56.8, 51.6, 45.9,

40.1,26.7 ppm. HRMS calc para C16 H31N4O2 [MH+] 311.2444 exp. 311.2447

3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (7)

/

N

O. .0

'W'

N N

H H

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7 se preparo a partir de n-butilescuaramidadietilester (preparado siguiendo el procedimiento descrito en M. C. Rotger, M. N. Pina, A. Frontera, G. Martorell, P. Ballester, P. M. Deya, A. Costa; J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308) (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dimetiletano-1,2-diamina (0,22 g, 2,53 mmol) en etanol (20 mL). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el solido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 7 ( 0,51 g, 2,12 mmol) como solido blanco. Rendimiento 84%.

5

10

15

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1HRMN (DMSO-de) 5 = 7.58 (1 H, br), 7.43 (1 H, br), 3.70 ( 2 H, J = 5.3 Hz, d), 3.61 (2 H m), 2.49 (2H J = 5.9 Hz, t), 2,27 (6 H, s) 1,56 (2 H m), 1,41 (2 H, m), 0.99 ( 3 H, J = 7.3 Hz, t) ppm. 13C RMN (DMSO- d6) 5 =182.4, 167.7, 167.5, 59.2, 45.0,42.8, 41.0, 32.8, 19.0, 13.5, ppm. HRMS calc para C12 H24^O2Na [MNa+] 262.1531 exp. 262.1540

3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona (8)

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8 se preparo a partir de n-butilescuaramidadietilester (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dibutilpropano-1,3-diamina (0,48 g, 2,6 mmol) en etanol (20 mL). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el solido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 8 (0,69 g, 2,01 mmol) como solido blanco. Rendimiento 80%.

1HRMN (CDCls) 5 = 7.87 (1 H, br), 7.50 (1 H, br), 3.65 (4 H, m), 2.52 (2 H, J =6.8 Hz, t), 3.39 (4 H J = 7.11 Hz t), 1.78 (2 H, m), 1.62 (2H, m), 1,34 (14H, m), 0.92 (9 H, m). 13C NMR (CDCls, 75 MHz): 5 = 182.5, 182.4, 168.2, 168.1, 53.9, 51.5, 44.6, 43.5, 33.4, 29.2, 28.4, 20.9, 19.8, 14.3, 13.9 ppm. HRMS calc para C19H36 N3O2 [MH+] 338.2808, exp. 338.2795.

3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (9)

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Escuarato de etilo (0,5 g, 2,94 mmol), y anilina (0,28 g, 3 mmol) en etanol (20 ml) se dejan durante 12h a reflujo. Se elimina el disolvente y el solido obtenido se redisuelve en etanol (20 ml) con 1 equivalente de 4-amino-1-benzilpiperidinasa y se deja durante 12 h a temperatura ambiente. Se elimina el disolvente y se lava con n-pentano. Se obtiene 9 (0,78 g, 2,20 mmol) como solido blanco. Rendimiento 75%.

1HRMN (DMSO-de) 5 = 7.65 (1H, br), 7.31 (9H, m), 4.68 (2H, J = 6 Hz, d), 3.74 (1 H, br), 3.74 (2H, s), 2.70 (2H, s), 2.03 (2 H, m), 1.81 (2 H, m), 1.45 (2H, m) ppm. 13C RMN

5

10

15

20

(DMSO-de) 5 = 188.0, 187.90, 172.8, 144.5, 143.9, 134.5, 134.3, 133.8, 133.3, 131.1,

132.5, 67.6, 56.8, 56.1, 52.4, 38.6 ppm. HRMS calc para C22H23N3O2 [MH+] 376.2025 exp. 376.2023.

3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona (10)

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10 se preparo a partir de N,N dimetiletanodiaminadietilester (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dimetiletano-1,2-diamina (0,22 g, 2,53 mmol) en etanol (20 mL). Se deja a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el solido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 10 (0,87 g, 2,12 mmol) como solido blanco. Rendimiento 84%.

1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 5 = 7.46 (br, 1H), 7.31 (br, 1H), 3.6-3.58 (br, 2H), 3.48-3.46 (br, 2H), 2.38 (m, 2H), 2.16 (s, 6H), 1.49 (br, 2H), 1.23 (br, 26H), 0.84 (m, 3H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz): 182.6, 182.3, 168.2, 168.1, 59.8, 45.6, 44. 9, 42.4, 32.1, 31.4, 29.9, 29.5, 26.8, 22.8, 14.2 ppm. HRMS calc. for C24H46N3O2 408.35900; found 408.35834 [M+H]+.

loduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (13)

imagen32

La escuaramida 10 (0,5 g, 1,2 mmol) se suspende en una mezcla de 20 mL de acetona anhidro y 10 mL de DMF anhidro junto con yoduro de metilo (0,5 g, 3,6 mmol). La mezcla se deja a reflujo durante 12 h. Al calentar la mezcla se observa la disolucion de los reactivos. A medida que transcurre la reaccion se forma un precipitado. Finalizado el tiempo de reaccion se filtra el precipitado y se lava con acetona (5 x 10 mL), obteniendose 13 (0,49 g, 0,9 mmol) como un solido amarillo claro. Rendimiento 90%.

5

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30

1H NMR (DMSO-de, 300 MHz): 5 = 7.52 (br, 1H), 7.40 (br, 1H), 3.95-3.93 (br, 2H), 3.5 (br, 4H), 3.11 (m, 9H), 1.49 (s, 2H), 1.23 (br, 26 H), 0.84 (br, 3H). 13C NMR (DMSO-de, 75 MHz): 182.9, 182.3, 168.4, 166.9, 65.0, 52.7, 43.3, 37.4, 31.2, 30.6, 29.0, 28.6, 25.8, 22.0, 13.9. HRMS calc. for C25H48N3O2 422.3759; found 422.3747 [M-I]+.

Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino) (18)

o. .0

W'

HO

N'

H

imagen33

I

CO,Et

En un matraz de fondo redondo de 10 mL se mezclan etil-4-aminobenzoato (41 mg, 0,25 mmol, con acido escuaarico (57 mg, 0,5 mmol) y 5 mL de agua. La mezcla se deja a reflujo durante 3 h. Trnascurrido este tiempo, la mezcla de reaccion se diluye con 20 mL de NaHCO3 5%. Se hacen cuatro extracciones con 20 mL de eter dietflico cada una. La fase acuosa se acidifica con HCl 3N (10 mL), y se hacen diez extracciones con eter dietflico. La fase organica se seca con Na2SO4 anhidro y se concentra. El producto se obtiene como un solido amarillo (48 mg, 73% de rendimiento).

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 = 10.60 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.7, 2H), 7.56 (d, J = 7.8, 2H), 4.27 (m, 2H), 1.29 (t, J = 6.9, 3H). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) 5 = 189.9, 185.2, 171.2, 165.3, 143.3, 130.6, 130.4, 123.5, 118.0, 60.3, 14.2. IR (KBr, v cm-1): 3474,

3233, 3104, 2935, 1804, 1699, 1610, 1574, 1531, 1458, 1280, 1113. HRMS (ESI, modo positivo): m/z calculado para C26H23N2O10Na, [2M+Na]+: 523.1353; experimental: 523.1346. Punto de fusion: descomposicion sobre 230 °C.

ENSAYOS BIOLOGICOS

CULTIVO PARASITOLOGICO (PARA LEISHMANIA SPP)

Formas promastigotas de las especies Leishmania infantum (MCAN/ES/2001/UCM-10) y Leishmania braziliensis (MHOM/BR/1975/M2904), fueron cultivadas in vitro en esterilidad, a 28° C en medio de cultivo monofasico MTL (Medium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Perez y col., 1986) enriquecido con el 10 % (v/v) de suero bovino fetal inactivado frente al complemento (SBF-I) a 56°C/30 minutos. El inoculo de parasitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 celulas/ml en 5 ml de medio en frascos de plastico Falcon® de 25 cm2, y mantenidos en una estufa a 28°C. (Gonzalez P, Marin C, et al.,

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Int J AntimicroAgents 2005;25:136-141). Los cultivos se realizaron de manera rutinaria, y renovando el medio cada dos dias consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios.

CULTIVOS CELULARES Y ENSAYO DE CITOTOXICIDAD.

Los macrofagos J774.2 fueron reclonados desde J774.2 (Europeancollection of cell cultures (ECACC) numero 91051511) originales de un tumor de hembra de raton de la cepa Balb/c, manteniendo los cultivos entre 3-9 x 105 celulas/ml a 37°C y a 5% de CO2 en medio de cultivo MEM + Glutamina suplementado con un 20 % de SBF-I. El protocolo para trabajar con las celulas en cultivo fue despegandolas del frasco de cultivo donde se encontraban adheridas mediante soporte fno y golpes secos. Se decantaron las celulas y se centrifugaron durante 5 minutos a 800 rpm. Se resuspendieron las celulas en medio de cultivo fresco para proceder a su contaje, mediante tincion con azul de tripan (dilucion 1:1) y en camara hemocitometrica de Neubauer, para los estudios posteriores (Sanchez-Moreno M, et al., J AntimicrobChemother 2012; 67:387-397). Estos ensayos se realizaron mediante citometna de flujo. Macrofagos de la lmea J774.2, se depositaron en un steriling (Universal Tube®) y se centrifugaron a 800 rpm durante 10 min, el sobrenadante se descarto y las celulas se resuspendieron en medio MEM + Glutamina + 20 % SBF-I. Se depositaron 1x104 celulas/ml en cada pocillo con medio en una placa de titulacion de 24 pocillos, se incubaron durante 24 h a 37°C en atmosfera humeda enriquecida con 5% CO2. Esto se realizo para que se fijasen las celulas. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25, 10 y 1 pM. A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la preparacion de las muestras para su lectura en el citometro de flujo.

El metodo seguido para la preparacion de muestras es el descrito por Sanchez- Moreno M, et al., J AntimicrobChemother 2012; 67:387-397, partiendo de las celulas y el medio presente en los pocillos, a las cuales se le adiciono 100 pl de solucion de ioduro de propidio (PI, 100 \g/ml) (Sigma Chemical Co), incubandose a 28°C en oscuridad unos 10 minutos, posteriormente, se anadio 100 pl de diacetato de fluorescema (FDA) (Sigma Chemical Co) en solucion (100ng/ml) volviendose a incubar

5

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35

a 28°C en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedio a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se analizaron los resultados en el citometro teniendo en cuenta que las celulas con la membrana plasmatica intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las celulas danadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculo el porcentaje de viabilidad. El numero de celulas muertas se determino por comparacion con los cultivos controles.

ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO: FORMAS EXTRACELULARES Ensayo sobre formas promastigotas

Las formas promastigotas de L. infantum y L. braziliensis cultivadas de la forma anteriormente descrita, fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugacion a 1500 rpm durante 10 min. Se resuspendieron en medio fresco. La concentracion de parasitos fue contada en una camara hemocitometrica de Neubauer y se sembraron en una placa de 24 pocillos a razon de una concentracion de 5 x 104 parasitos por pocillo. Los compuestos a ensayar se disolvieron con DMSO puro a una concentracion de DMSO de 0,01% (v/v), a la cual, este disolvente no es toxico ni tiene ningun efecto sobre el crecimiento de los parasitos. Los compuestos fueron anadidos al medio de cultivo en la placa de 24 pocillos a una concentracion final de: 100, 50, 25, 10 y 1 pM, y a un volumen final por pocillo de 500 pl. El efecto de cada producto sobre el crecimiento de las formas promastigotas, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluo a las 72 horas, usando una camara hemocitometrica de Neubauer, y el efecto leishmanicida se expreso como la IC50 (concentracion requerida para dar una inhibicion del 50%, calculado por el analisis de la regresion lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) (Gonzalez P, Marin et al. Int J AntimicroAgents 2005;25:136-141).

ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO: FORMAS INTRACELULARES.

Ensayo sobre formas amastigotas

Los macrofagos se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridos mediante soporte frio y golpes secos. Para ello, se elimino el medio de cultivo, seguidamente se cubrio la superficie celular con EDTA-tripsina y se incubo en frio durante 5 minutos segun la metodologfa expuesta anteriormente. Tras ello, se paso a

un frasco de fondo conico de 25 ml de capacidad (Steriling) para centrifugarlos a 800 rpm durante 5 minutos, retirandose el sobrenadante y resuspendiendolos en MEM + Glutamina con 20% SBF-I. Se cuentan en camara de Neubauer y se cultivan en placas de 24 pocillos a razon de 1 x 103 celulas, en las que previamente se habia introducido 5 un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm en cada pocillo. Para su adherencia, se dejaron crecer las celulas 24 h a 37°C en 5% CO2.

Una vez adheridas las celulas, se infectaron “in vitro”: Macrofagos J774.2 con 1x105 parasitos/pocillo de formas promastigotas metaciclicas en fase estacionaria de 10 crecimiento de L. infantum. La infeccion se mantiene durante 24 horas para que el parasito entre a la celula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para calcular la IC50 (50, 25, 10 y 1 pM). A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la retirada de los cristales.

15

Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les anadio DPX (Panreac®), medio de montaje para microscopfa. Se tineron con Giemsa, para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyo 0,2 ml de Azur-Eosina-Azul de Metileno 20 solucion segun Giemsa DC (Codigo 251338) con 2 ml de tampon Sorensen (dilucion 1:10), se mezclo bien y se cubrio la preparacion dejando colorear durante 20 minutos. Se lavo con agua destilada. Se dejo escurrir y secar en posicion vertical. Por ultimo se examino con el objetivo de inmersion y se conto el numero de amastigotas intracelulares en un total de 200 celulas (Gonzalez P, et al.Int J AntimicroAgents 25 2005;25:136-141).

Los resultados de estos ensayos se muestran en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1.- Actividad y toxicidad encontradas para los compuestos escuaramidicos estudiados sobre formas extracelulares e intracelulares de Leishmania spp.

Productos: IC50 (MM)a Toxicidad





: IC5oMacrofag

: L.infantum L. braziliensis os (pM)b

: Promastig Amastigo Promastigot Amastigote

: ote te e

Glucatim®: 18,0±3,1 24,2±2,6 25,6±1,6 30,4±6,1 15,2± 1,0

(9): 68,5±7,4 31,7±2,5 39,2±4,1 35,8±5,2 257,9±16,4

(8): 97,7±8,5 32,5±1,6 75,1±8,8 34,7±6,7 162,3±15,1

(7): 72,3±6,4 35,2±1,2 21,0±3,1 21,1±1,7 156,8±10,4

(10): 65,9±4,5 37,7±1,4 14,9±2,2 17,6±0,6 100,4±5,1

(13): 16,3±0,8 31,3±2,4 24,0±1,2 30,1±2,3 351,1±22,5

(11): 40,5±3,7 30,5±1,1 60,1±6,3 40,5±7,3 79,1±6,1

(12): 39,4±4,4 29,5±2,1 35,1±2,7 30,6±1,5 94,3±4,7

(14): 55,3±6,6 46,8±5,7 39,9±4,1 29,6±1,6 83,2±6,0

(15): 57,2±3,3 40,7±2,8 39,3±2,0 23,5±1,8 28,7±2,1

(16): 31,1±1,6 27,4±0,8 38,3±0,8 22,0±2,7 61,4±5,7

(2): 18,0±3,6 15,1±0,8 17,3±1,4 16,8±0,8 406,1±21,4

(17): 85,0±5,5 64,3±3,7 15,9±1,7 22,3±0,6 66,8±4,8

(18): 19,9±1,1 30,0±1,4 22,2±3,5 25,8±2,7 318,4±17,8

(19): 33,3±4,6 27,1±1,8 15,6±1,2 19,4±0,9 70,1±6,3

(20): 25,2±3,6 23,5±1,5 36,8±1,5 34,2±0,8 56,4±3,7

(21): 38,3±1,9 22,6±1,8 39,5±2,2 27,3±1,6 57,2±5,2

(22): 19,3±0,8 15,7±0,7 17,5±1,3 16,7±0,5 330,0±27,8

(23): 23,8±1,4 20,0±0-7 25,2±2,1 22,4±1,3 41,7±6,2

(24): 33,3±4,3 25,4±1,2 26,7±1,5 29,6±1,8 90,4±6,6

Resultado de tres experimentos independientes. a IC50 = Concentracion necesaria para 5 obtener el 50 % de Inhibicion, calculada por analisis linear de regresion del valor Kc a las concentraciones empleadas de (1, 10, 25, 50 y 100 pM). b Frente a Macrofagos J774.2 despues de 72 h de cultivo.

Tabla 2.- Indice de Selectividad (IS) encontrados para los compuestos escuaramidicos estudiados sobre formas extracelulares e intracelulares de Leishmania spp.

Productos ISc

L.infantum L. braziliensis

: Promastigote Amastigote Promastigote Amastigote

Glucatim®: 0,8 0,6 0,6 0,5

(9): 3,8 (5) 8,1 (13) 6,6 (11) 7,2 (14)

(8): 1,7 (2) 5,0 (8) 2,2 (4) 4,7(9)

(7): 2,2 (3) 4,4 (7) 7,5 (12) 7,4 (15)

(10): 1,5 (2) 2,7 (4) 6,7 (11) 5,7 (9)

(13): 21,5 (27) 11,2 (19) 14,6 (24) 11,7 (23)

(11): 1,9 (2) 2,6 (4) 1,3 (2) 1,9 (4)

(12): 2,4 (3) 3,2 (5) 2,7 (5) 3,1 (6)

(14): 1,5 (2) 1,8 (3) 2,1 (3) 2,8 (6)

(15): 0,5 (1) 0,7 (1) 0,7 (1) 1,2 (2)

(16): 2,0 (2) 2,2 (4) 1,6 (3) 2,8 (6)

(2): 22,6 (28) 26,9 (45) 23,5 (39) 24,2 (48)

(17): 0,8 (1) 1,0 (2) 4,2 (7) 4,2 ((8)

(18): 16,0 (20) 10,6 (18) 14,3 (24) 12,3 (25)

(19): 2,1 (3) 2,6 (4) 4,5 (7) 3,6 (7)

(20): 2,2 (3) 2,4 (4) 1,5 (3) 1,6 (3)

(21): 1,5 (2) 2,5 (4) 1,4 (2) 2,1 (4)

(22): 17,1 (21) 21,0 (35) 18,8 (31) 19,8 (33)

(23): 1,8 (2) 2,1 (3) 1,6 (3) 1,9 (4)

(24): 2,7 (3) 3,6 (6) 3,4 (6) 3,0 (6)

5 clndice de Selectividad= IC50 de los macr6fagos/IC50 de las formas extracelulares e

intracelulares de los parasitos. Entre parentesis: Numero de veces que la IS de los compuestos es superior a la IS de la droga de referencia.

Algunos compuestos escuaramidicos se han evaluado frente a formas extracelulares 10 e intracelulares de Leishmania spp (L. infantum y L. braziliensis), obteniendose los

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indices IC50 como indicadores de la actividad de los compuestos frente al protozoo, los indices de toxicidad IC50 frente a macrofagos y el indice de selectividad obtenido como IS= IC50 frente a macrofagos /IC50 frente formas extracelulares e intracelulares de los parasitos. En este estudio los valores obtenidos se comparan con los correspondientes a la droga referencia, Glucatime, utilizada comunmente en el tratamiento de la leishmania.

El analisis de los resultados obtenidos indica que en general los compuestos estudiados son activos frente a las formas intracelulares y extracelulares del parasito utilizadas con valores de IC50 hasta cuatro veces superiores a los valores obtenidos para el compuesto referencia. Ademas en este caso se han obtenido valores de IC50 frente a macrofagos entre 10 y 25 veces superiores al del compuesto referencia, lo cual indica que los nuevos compuestos presentan una baja toxicidad frente a los macrofagos, lo cual constituye una ventaja a la hora de su uso como agentes terapeuticos. Por lo tanto y a partir de dichos valores se han obtenido indices de selectividad con valores entre 20 y 50 para un grupo de los compuestos estudiados.

CULTIVO PARASITOLOGICO (paraTrypanosoma cruzi)

Se utilizo Trypanosoma cruzi cepa tipo I (IRHOD/CO/2008/SN3) (Tellez- Meneses y col, Acta Trop 2008; 108:26-34) cuyo origen geografico es Guajira (Colombia) y su origen biologico Rhodniusprolixus en las formas de desarrollo: epimastigotas, tripomastigotas y amastigotas. El cultivo de las formas epimastigotas de T. cruzi se realizo in vitro en esterilidad en medio de cultivo monofasico MTL (Medium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Perez y col., 1986) enriquecido con el 10% (v/v) de Suero Bovino Fetal (SBF-I) inactivado a 56°C/ 30 minutos. El inoculo de parasitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 celulas/ml en 5 ml de medio en frascos de plastico Falcon® de 25 cm2 y se mantuvieron en una estufa a 28°C. Los cultivos se realizaron de manera rutinaria consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios. (Tellez-Meneses J,y col. Acta Trop 2008; 108:26-34).

CULTIVOS CELULARES Y ENSAYO DE CITOTOXICIDAD.

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Las celulas Vero fueron establecidas desde el rinon de un mono Verde Africano adulto, manteniendo los cultivos a una densidad 1 x 104 celulas/cm2 a 37°C y 5% de CO2. El procedimiento para trabajar con las celulas en cultivo fue tripsinizar las celulas adheridas mediante lavado con PBS y anadiendo la cantidad suficiente de tripsina/EDTA (200ml de PBS + 0,1 g de EDTA y 200 ml de PBS + 0,5 g de tripsina. Se mezclan las dos soluciones. pH= 7,2-7,4 y se filtra). Se incubaron durante 5-10 minutos las celulas. Se decantaron las celulas y se centrifugaron durante 5 minutos a 800 rpm. Se resuspendieron las celulas en un medio de cultivo nuevo. Como medio de cultivo se utilizo RPMI suplementado con un 10 % de suero bovino fetal inactivado (SBF-I). (Sanchez-Moreno M, y col. J AntimicrobChemother 2012;67:387-397).Las celulas Vero, se depositaron en un esterlin y se centrifugaron a 800 rpm durante 10 min, el sobrenadante se descarto y las celulas se resuspendieron en medio RPMI. Se depositaron 1x104 celulas/ml en cada pocillo de una placa de titulacion de 24 pocillos, se incubaron durante 24 h a 37°C en atmosfera humeda enriquecida con 5% CO2. Esto se realizo para que se fijasen las celulas. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25 y 10 pM. A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la preparacion de las muestras para su lectura en el citometro de flujo. El metodo seguido es el descrito por Marin C, y col. J Nat Prod. 2011 Apr 25;74(4):744-50, partiendo de las celulas y el medio presente en los pocillos, a las cuales se le adiciono 100 pl de solucion de ioduro de propidio (PI, 100 pg/ml) (Sigma Chemical Co), incubandose a 28°C en oscuridad unos 10 minutos, posteriormente, se anadio 100 pl de diacetato de fluoresceina (FDA) (Sigma Chemical Co) en solucion (100ng/ml) volviendose a incubar a 28°C en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedio a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se analizaron los resultados teniendo en cuenta que las celulas con la membrana plasmatica intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las celulas danadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculo el porcentaje de viabilidad. El numero de celulas muertas se determino por comparacion con los cultivos controles. (Marin C, y col. J Nat Prod 2011; 74:744-750).

ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO: FORMAS EXTRACELULARES.

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Transformacion de formas epimastigotas a formas trypomastigotasmetaciclicas

La metaciclogenesis fue inducida a un cultivo de 5 dias (fase estacionaria), tras ser centrifugado a 7000 g durante 10 min a 10°C. Los parasitos fueron incubados 2h a 28°C a una densidad de 5 x 108 parasitos/ml en medio TAU (190 mMNaCI, 17 mMKCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 8 mMphosphate buffer, pH 6.0). Despues, los parasitos se incubaban a la dilucion 1:100 durante 96h a 28°C en medio TAU3AAG (TAU suplementado con 10 mM L-prolina, 50 mM L-glutamato sodico, 2 mM L-aspartato sodicoy10 mM D-glucosa) en frascos de cultivo de 25 ml en posicion horizontal impidiendo que supere 1cm de profundidad del medio. (Cardoso J, y col. Mem Inst Oswaldo Cruz 2010; 5:1026-32).

Formas epimastigotas

Las formas epimastigotas de T. cruzi cultivadas de la forma anteriormente descrita fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugacion a 1500 rpm durante 10 min. El numero de parasitos fue contado en una camara hemocitometrica de Neubauer y sembrados en una placa de 24 pocillos a razon de una concentracion de 5x104 parasitos/ml en cada pocillo.

Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO a una concentracion de 0,01% (v/v) concentracion a la cual este disolvente no es toxico ni tiene ningun efecto sobre el crecimiento de los parasitos. Los compuestos fueron anadidos al medio de cultivo a una concentracion final de: 100, 50, 25, 10 y 1 pM. El efecto de cada compuesto sobre el crecimiento de las formas epimastigotas, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluo a las 72 h, usando una camara hemocitometrica de Neubauer y el efecto tripanocida se expreso como la IC50 (concentracion requerida para dar una inhibicion del 50%, calculado por el analisis de la regresion lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) (Sanchez-Moreno M, y col.. J Med Chem. 2011; 54:9709).

Formas Trypomastigotas

La actividad (porcentaje de reduccion de parasitos) es comparado con el control despues de realizar la metodologfa descrita por (Junior CO, y col. BiomedPharmacother 2010; 64:624-6) con algunas modificaciones realizadas en el laboratorio. El ensayo se lleva a cabo usando sangre infectada de raton Balb/c que ha

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sido obtenida durante los dias de maxima parasitemia (dia 7 aprox. post infeccion). La sangre infectada fue diluida con sangre no infectada para obtener una concentracion de 1-4 x 106 trypomastigotas/ml, entonces se dilufa 1:2 con RPMI 1640 medium- GIBCO. Soluciones stock de los compuestos a ensayar se preparan al mismo tiempo en DMSO. Una muestra de sangre infectada y la droga se anaden a una placa de 96 pocillos hasta un volumen final de 200 pl y a las concentraciones de compuesto de 1, 10, 25, 50 y 100 mM, a fin de calcular la IC50 para cada uno y posteriormente las placas se incubaron a 4 °C durante 24 h. Los experimentos se repitieron tres veces. Cada muestra se examino microscopicamente (OLYMPUS CX41) para el recuento de parasitos utilizando la camara de Neubauer.

ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO: FORMAS INTRACELULARES.

Ensayo de amastigotas

Las celulas Vero se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridos mediante tripsinizacion. Para ello, se elimino el medio de cultivo, seguidamente se cubrio la superficie celular con EDTA-tripsina y se incubo en frio durante 5 minutos segun la metodologfa expuesta anteriormente. Tras ello, se paso a un frasco de fondo conico de 25 ml de capacidad (Steriling) para centrifugarlos a 800 rpm durante 5 minutos, retirandose el sobrenadante y se cuentan en camara de Neubauer. Resuspendiendo las celulas a una concentracion de 1x104 celulas/ml en medio RPMI para las celulas Vero, cultivandose en placas de 24 pocillos, en las que previamente se habfa introducido un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm en cada pocillo. Para su adherencia, se dejaron crecer las celulas 24 h a 37°C en 5% CO2.

Una vez adheridas las celulas, se infectaron “in vitro” las celulas Vero con 5x104 celulas/ml de formas tripomastigotas de T. cruzi, obtenidos segun la metodologfa citada anteriormente. La infeccion se mantiene durante 24 horas para que el parasito entre a la celula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiro y se adiciono medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para sacar la IC50 (100, 50, 25, 10 y 1 pM). A las 72 horas de la incubacion, se procedio a la retirada de los cristales.

Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les anadio DPX (Panreac®), medio de

montaje para microscopfa. Se tineron con Giemsa, para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyo 0,2 ml de Azur-Eosina-Azul de Metileno solucion segun Giemsa DC (Codigo 251338) con 2 ml de tampon Sorensen (dilucion 1:10), se mezclo bien y se cubrio la preparacion dejando colorear durante 20 minutos. 5 Se lavo con agua destilada. Se dejo escurrir y secar en posicion vertical. Por ultimo se examino con el objetivo de inmersion y se conto el numero de amastigotas intracelulares en un total de 200 celulas.

Los datos obtenidos en los ensayos anteriores se resumen en la Tabla 3.

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Tabla 3.- Actividad in vitro, toxicidad e indice de selectividad de los compuestos escuaramidicos evaluados en formas extracelulares e intracelulares de Trypanosoma cruzi.

: IC50 (pM)a Toxicidad ISc



: IC50 Epimastigote Amastigote

Compuesto: Epimastigote Amastigote Cel. Vero intracelular


: intracelular (pM)b

Benznidazol: 15,9±1,1 23,3±4,6 13,6±0,9 0,8 0,6

(9): 96,9±4,2 34,7±1,3 337,5±18,5 3,5 (4) 9,7 (16)

(8): 21,1±3,8 6,0±0,4 147,8±8,4 13,3 (17) 24,6 (41)

(7): 17,5±7,0 14,3±6,4 260,2±11,3 14,9 (19) 18,25 (30)

(10): 49,8±2,7 22,4±1,7 90,1±6,2 1,8 (2) 3,4 (6)

(13): 44,9±3,0 26,3±1,5 151,4±7,4 3,4 (4) 5,7 (10)

(11): 107,2±6,3 38,5±5,7 57,6±6,8 0,5 (1) 1,5 (2)

(12): 60,8±1,4 39,2±2,0 74,2±3,2 1,2 (1) 1,9 (3)

(14): 35,7±1,1 23,8±2,5 54,8±3,4 1,5 (2) 2,3 (4)

(15): 45,5±2,7 23,4±0,7 25,3±1,6 0,6 (1) 1,1 (2)

(16): 17,3±2,0 66,9±1,2 21,6±3,1 1,2 (2) 0,3 (1)

(2): 11,4±0,4 14,5±0,4 453,1±22,6 39,8 (50) 31,2 (52)

(17): 15,9±0,3 10,1±1,0 12,9±1,2 0,8 (1) 1,3 (2)

(18): 50,8±4,1 44,0±1,9 228,3±12,5 4,5 (6) 5,2 (9)

(19): 26,3±2,0 18,4±0,8 21,5±1,2 0,8 (1) 1,2 (2)

(20): 89,1±4,5 72,6±5,3 36,6±3,0 0,4 (0) 0,5 (0)

(21): 20,4±3,0 17,4±0,3 28,6±0,7 1,4 (2) 1,6 (3)

(22): 18,5±1,1 17,1±0,4 300,7±22,7 16,2 (20) 17,5 (29)

(23): 96,2±7,2 46,0±2,6 11,4±0,5 0,1 (1) 0,2 (1)

(24): 118,9±7,8 43,9±2,7 73,1±5,3 0,6 (1) 1,7 (3)

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Los resultados representan la media obtenida en cuatro experimentos separados. a. IC50 = concentracion requerida para dar el 50% de inhibicion, calculada por analisis de regresion lineal a partir de los valores Kc en las concentraciones utilizadas (1, 10, 25, 50 and 100 pM).b Frente a celulas Vero despues de 72 h de incubacion.c Indice de

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selectividad =IC50 Celulas Vero/IC50formas extracelulares e intracelulares del parasito. Entre parentesis: numero de veces que el compuesto excede el indice de selectividad de la droga referencia (para formas extracelulares e intracelulares del Trypanosoma cruzi).

Tablas 4 y 5 - Actividad in Vitro, Toxicidad e Indice de Selectividad encontrados para los compuestos 3 a 6 en formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi.

Tabla 4


: IC50 (pM)a Toxicidad

Comp.: Epimastigote Intracelular Trypomastigotes Toxicidad

: formas amastigote IC50


: formas Macrofagos




: (pM)

5: 190,59 12,25 180 960,99

4: 175,33 2,17 34 21,06

3: 164,81 21,75 176 497,67

6: 157,7 15,95 1000 327,76


: Tabla 5


: ISc

mpuesto: Epimastigote Intracelular Trypomastigotes

: formas amastigote


: formas

5: 5,04(6) 78,00(130) 5,33 (9)

4: 0,12 (1) 9,70(16) 0,63(1)

3: 3,01(4) 22.88 (38) 2,82(5)

6: 2.08(3) 20,54 (34) 1(1)

aIC50 = la concentracion requerida para obtener el 50% de inhibicion, calculada por regresion linear del analisis de los valores Kc a las concentraciones empleadas (1, 10, 25, 50 and 100 pM). bSobre celulas Vero despues de 72 h de cultivo.

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clndice de Selectividad=IC50 Celulas Vero/IC50 formas extracelulares e intracelulares parasitarias. Entre parentesis: numero de veces que el compuesto supera al indice IS de la droga de referencia.

Estos valores se han comparado con los valores obtenidos para el Benznidazol ya que se trata del farmaco comunmente utilizado para el tratamiento de esta enfermedad. Los resultados obtenidos indican que en general los compuestos escuaramidicos son menos toxicos que el Benznidazol frente a celulas Vero con valores de IC50 entre 10 y 30 veces superiores que el IC50 del compuesto referencia. En algunos casos como el compuesto (8), (7) o (2) su actividad es mucho mayor que el compuesto referencia ya que presentan valores de IC50 menores tanto en formas extracelulares como intracelulares. De acuerdo con estos resultados estos compuestos tienen indices de efectividad elevados con valores de indices de selectividad comprendidos entre 20 y 50. Todo ello indica que dichos compuestos presentan una actividad adecuada para su uso como agentes anti T. cruzi.

Ensayos In vivo de la actividad tripanocida

Los ensayos in vivo se realizaron para la determinacion de los siguientes aspectos: -determinacion del efecto de los compuestos usados en los niveles de parasitemia despues del tratamiento, calculando la actividad parasitaria en una camara de Neubaues como marcador de la fase aguda,

-medida de la reactivacion de la parasitemia despues de la inmunosupresion como marcador de la fase cronica,

-realizacion de ensayos ELISA para determinar la respuesta inmunologica y comparar los niveles de IgG en las fases aguda y cronica,

-deteccion de la presencia del parasito mediante PCR en organos y

-estudio del nivel de dano en el tejido cardiaco mediante estudios histopatologicos.

Grupos de tres ratones hembra BALB/c de entre 6-8 semanas de edad y peso 20-25 g, se mantuvieron bajo condiciones estandar. Se infectaron mediante via intraperitoneal con 1 x 105 formas sanguineas de T. cruzi. Los animales se dividieron en los siguientes grupos:

(I) Grupo 1: no infectado (no infectado y no tratado)

(II) Grupo 2: no tratado ( infectado con T. cruzi pero no tratado)

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(III) Grupo 3: tratado (infectado y tratado con 1 mg/kg peso/dia durante 5 dias consecutivos, 5-10 dias despues de la infeccion, mediante via intraperitoneal, con los compuestos probados y benzinidazol).

Una muestra sanguinea (5 pL) se extrajo de la vena mandibular de cada raton tratado y se diluyo a concentracion 1: 100 con PBS. El numero de formas trypomastigote de T. cruzi se registro cada 2 dias desde los 5 a 60 dias post-infeccion utilizando una camara de Neubauer. El numero de parasitos se expresa como parasitos/mL.

Los anticuerpos frente al Trypanosoma cruzi presentes en el suero circulatorio, en los dias 40 y 120 post-infeccion se evaluaron cuantitativamente mediante ensayos ELISA (enzyme-linked immunoassay). El suero se obtuvo a partir de la sangre por centrifugacion y se diluyo a concentracion 1:80 en PBS. El antigeno se compone de una isoforma excretada de enzima Fe-SOD de epimastigotes T. cruzi. Los resultados obtenidos se expresan como la relacion entre la absorcion de cada muestra a 490 nm respecto al valor maximo estimado. El valor maximo estimado se calcula como la media de los valores obtenidos en los controles negativos (no tratados) mas tres veces la desviacion estandar.

Despues del dia 150 post-infeccion, los grupos de ratones tratados cuyos niveles de parasitemia hubieron decrecido de forma significativa se sometieron a tres ciclos de inmunosupresion con monohidrato de ciclofosfamida. El experimento finalizo con la sangria completa de los ratones y la extraccion de los organos objetivo, corazon e higado. La sangre recogida se uso para el control del tanto por ciento de reactivacion de los niveles de parasitemia y para la determinacion de la concentracion de Ig-G en el suero mediante ensayos ELISA como se ha indicado anteriormente y con el objetivo de conocer el perfil del cambio en el nivel de antigenos asociado a la presencia del parasito en sangre. Finalmente, tras la extraccion de los corazones e higados, estos se cortaron longitudinalmente. Una de las mitades se utilizo para obtener el DNA total y despues se llevo a cabo una PCR para un fragmento en el gen SOD del T. cruzi de acuerdo a un par de cebadores disenados TciSOD_d: ATG GTC TTC AGC ATT CCT CC (SEQ NO: 1), TciSOD_r: GTT GAT CTC GTC GGC AAC TT (SEQ NO: 2) que permite la deteccion del DNA del T. cruzi en diferentes muestras biologicas. La otra mitad del organo, en el caso del higado, se utilizo para llevar acabo analisis

histopatologicos, por lo que se lavo en PBS trio (0° C) y se fijo en una disolucion tampon con un 10% de formalina. Los tejidos se deshidrataron y fueron embebidos en parafina. Se cortaron secciones de 4-5 pm de grosor y se tineron con Tricomo, siguiendo el protocolo de Masson. Los portaobjedos con muestras se marcaron para 5 un analisis ciego. Los examenes histologicos se realizaron utilizando un microscopio optico convencional. Cada muestra se visualizo a menos en 30 campos diferentes (aumentos totales: x 40, x 100, x 200 y x 400) Las alteraciones histologicas recibieron una puntuacion de 0 (-) a 5 (+++++), donde 0 representa la ausencia de alteraciones y 5 representa las alteraciones mas severas.

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Como definition de cura, se consideran curados aquellos animales inoculados con T. cruzi y tratados cuya parasitemia no se repite despues de los ciclos de inmunosupresion y cuyas secciones histologicas no presentan nidos amastigote u otra forma de parasitos.

15

Estos experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobacion de la Comision de Etica de la Universidad de Granada.

Los resultados in vivo durante la fase aguda de la infection muestran que el 20 compuesto 2 fue el que redujo en mayor porcentaje la parasitemia (67%) (Figura 1). Los estudios de la fase cronica muestra que el compuesto 2 solamente se reactiva en un porcentaje minimo (3,1%, Figura 2A) tras la inmunosupresion, en comparacion con el control donde se reactiva practicamente el 100%, este resultado se confirma con el mantenimiento de los niveles de IgG (Figura 2B). Mediante los estudios de PCR se 25 demuestra la practicamente curacion, tanto en ratones tratados con el producto 2 y no inmunodeprimidos como los tratados e inmunodeprimidos:

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

1. Uso de un compuesto de formula general (I):

°v s°

V-/

‘N-

(I)

donde:

R1 se selecciona de entre -NRaRb o -ORc, donde: Ra se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); Rb se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido, -(CH2)X-NR1'R1" o -(CH2)X-CO2R1'"; x tiene un valor de 0 a 5 y Ri', R1" y R1"' se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); Rc se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5);

R2 se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido; heterociclo, opcionalmente sustituido; aralquilo (C1-C5), opcionalmente sustituido; alquilo (C1-C20); -(CH2)X-NR2'R2''; o -(CH2)y-R4, donde y tiene un valor de 0 a 5, x tiene un valor de 0 a 5 y R2'y R2'' se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5);

R3 se selecciona de entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); y R4 es el grupo de formula (II):

imagen1

donde: X se selecciona de la lista que comprende -NR4'-, -CH- y arilo, opcionalmente sustituido; y donde R4' se selecciona de entre hidrogeno y alquilo

(C1-C5),

imagen2

5

10

15

20

25

30

o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades parasitarias.
2. Uso segun la reivindicacion anterior, donde Ra es hidrogeno o metilo.
3. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde Rb es fenilo.
4. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Rb es el grupo.-(CH2)x-

NR-i'R-i" y Ri', R1" y x esta definido en la reivindicacion 1.
5. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, donde R1 y R1'' se seleccionan de manera independiente entre alquilo (C1-C4).
6. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, donde R1 y R1'' son metilo o butilo.
7. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4 a 6, donde x es 2 o 3.
8. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 4, donde Rb es -NH2.
9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Rb es el grupo -(CH2)x- CO2R1''', x tiene el valor de 1,2 o 3 y R1''' es hidrogeno.
10. Uso segun la reivindicacion 1, donde R1 es -OH.
11. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 es hidrogeno o metilo.
12. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R2 es un grupo piperidina, opcionalmente sustituido.

5

10

15

20

25

30
13. Uso segun la reivindicacion anterior, donde la piperidina esta sustituida por un grupo bencilo.
14. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde R2 es un grupo fenilo, opcionalmente sustituido.
15. Uso segun la reivindicacion anterior, donde el grupo fenilo esta sustituido por al menos un grupo seleccionado de la lista que comprende hidroxilo, ester o grupo - (CH2)x-NR'R", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R'y R" se seleccionan independientemente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5).
16. Uso segun la reivindicacion anterior, donde el grupo fenilo esta sustituido por un ester, hidroxilo, -NH2, -CH2-NH2, o -N(CH3)2.
17. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde R2 es un grupo alquilo (C4-C15).
18. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde R2 es bencilo, opcionalmente sustituido.
19. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde R2 es -(CH2VR4 y el compuesto es de formula (III):

.0 o.

o. ^ "-0

imagen3

—^-H2C-j—X-----^-CH2^------

imagen4

(III)

donde: X, y, R1 y R3 se han definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
20. Uso segun la reivindicacion anterior, donde X es un fenilo, opcionalmente sustituido.

5

10

15

20

25

30
21. Uso segun la reivindicacion 19, donde X es el grupo -CH-.
22. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, donde y es 1.
23. Uso segun la reivindicacion 19 donde X es -NR4'-, donde R4' esta definido en la reivindicacion 1.
24. Uso segun la reivindicacion anterior, donde R4' es metilo.
25. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde y es 3.
26. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, donde R3 es hidrogeno.
27. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, donde R1 es -NRaRb, Ra es metilo y Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr\ donde Rr y R1" son metilo y x es 2 o 3.
28. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los compuestos estan en forma de sales de halogeno.
29. Uso segun la reivindicacion 1, donde el compuesto se selecciona de lista que comprende:

3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona ioduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N trimetiletanamonio

benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino) ioduro de 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N-

5

10

15

20

25

30

trimetiletanamonio;

ioduro de 2-((2-(bencilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio;

acido 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)acetico; acido 3-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)propanoico; acido 4-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino)butanoico; 3-((4-(dimetilamino)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona 3-hidroxi-4-((2-hidroxifenil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-((4-(aminometil)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona; 4,4'-(((metilazanediil)bis(propano-3,1-diil))bis(azanediil))bis(3-((3- (dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona);

ioduro de 3,3'-(((((metilazanediil)bis(propano-3,1-diil))bis(azanediil))bis(3,4- dioxociclobut-1-en-2,1-diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetilpropan-1-amonio);

4,4'-(propano-1,3-diilbis(azanediil))bis(3-((3-dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3- en-1,2-diona); y

ioduro de 2,2'-((((1,3-fenilenebis(metilene))bis(azanediil))bis(3,4-dioxociclobut-1-en- 2,1-diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetiletanamonio).
30. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad parasitaria es una enfermedad parasitaria protozoaria.
31. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los parasitos pertenecen a la familia Trypanosomatidae, preferiblemente del genero Leishmania o Trypanosoma, mas particularmente la especie Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmaniainfantum o Leishmaniabrazilensis.
32. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad es leishmaniasis o tripanosomiasis.
33. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las enfermedades son leishmaniosis o enfermedad de Chagas.
34. Un compuesto de formula general (IV):

5

10

15

20

25

cl yo

(IV)

donde:

Ri es un grupo -NRaRb, donde: Ra es un alquilo C1-C3; y Rb es el grupo -(CH2)x- NR1'R1", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R1'y R1" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5);

R2 se selecciona de un grupo alquilo (C1-C20) o un grupo -(CH2)x-NR2'R2"; x tiene un valor de 0 a 5 y R2'y R2" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C5); y

R3 se selecciona de entre hidrogeno o un alquilo (C1-C5); o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables.

imagen5
35. Compuesto segun la reivindicacion anterior, donde Ra es un metilo.
36. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NR1'R1", x tiene un valor de 1 a 5 y R1'y R1" se seleccionan de manera independiente un alquilo (C1-C3).
37. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NR1'R1", x tiene un valor de 1 a 5 y R1'y R1" son metilo.
38. Compuesto segun la reivindicacion anterior, donde x es 3.
39. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NRrRr'; x es 0 y Rry R1" son hidrogeno.
40. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, donde R2 es un alquilo (C4-C12).

5

10

15

20

25

30
41. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, donde R2 es un grupo -(CH2)x-NR2'R2"; x tiene un valor de 1 a 5 y R2'y R2" se seleccionan de manera independiente entre hidrogeno y alquilo (C1-C3).
42. Compuesto segun la reivindicacion anterior, donde x es 3 y R2'y R2"son metilo.
43. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, donde R3 es hidrogeno o metilo.
44. Compuesto segun la reivindicacion 34, seleccionado de la lista que comprende: 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona; y 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona.
45. Compuesto seleccionado de la lista que comprende: 3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1,2-diona; 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1,2-diona; loduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio; y

Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1-il)amino).
46. Procedimiento de obtencion de un compuesto de formula (IV) segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 44, que comprende hacer reaccionar un ester de monoescuaramida de formula general (V) con una amina de formula general (VI):

imagen6

imagen7

donde: Et es etilo y Ra, Rb, R2 y R3 se han descrito en las reivindicaciones 34 a 44.
47. Composicion farmaceutica que comprende un compuesto descrito segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 45, junto con al menos un vehiculo

5 farmaceuticamente aceptable.
48. Uso del compuesto descrito segun cualquiera de las reivindicaciones 34 a 45, para la elaboracion de un medicamento.

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