ES2589504B1 - Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección - Google Patents

Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección Download PDF

Info

Publication number
ES2589504B1
ES2589504B1 ES201530636A ES201530636A ES2589504B1 ES 2589504 B1 ES2589504 B1 ES 2589504B1 ES 201530636 A ES201530636 A ES 201530636A ES 201530636 A ES201530636 A ES 201530636A ES 2589504 B1 ES2589504 B1 ES 2589504B1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
use according
transfection agent
methyl
compound
viral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES201530636A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2589504A1 (es
Inventor
Antoni COSTA TORRES
Carmen ROTGER PONS
Silvia Fernández De Mattos
Priam De Villalonga Smith
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitat de les Illes Balears
Original Assignee
Universitat de les Illes Balears
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitat de les Illes Balears filed Critical Universitat de les Illes Balears
Priority to ES201530636A priority Critical patent/ES2589504B1/es
Priority to PCT/ES2016/070349 priority patent/WO2016181005A1/es
Publication of ES2589504A1 publication Critical patent/ES2589504A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2589504B1 publication Critical patent/ES2589504B1/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección.#La presente invención se refiere al uso de oligoescuaramidas cíclicas formadas por dos unidades escuaramida como agentes de transfección para el transporte de material genético al interior celular.

Description

5
10
15
20
25
30
35
Oligoescuaramidas ciclicas como agentes de transfeccion
DESCRIPCION
La presente invention se refiere al uso de oligoescuaramidas dclicas formadas por dos unidades escuaramida como vectores o agentes de transfeccion para el transporte de material genetico, como plasmidos u oligonucleotidos, al interior celular.
ESTADO DE LA TECNICA
La terapia genica constituye una alternativa emergente para el tratamiento de enfermedades como el cancer, Parkinson, Alzheimer, SIDA, etc. Sin embargo, su desarrollo y aplicacion clmica se ven frenados ante la falta de vectores eficaces y seguros para el transporte del material genetico al interior de las celulas diana. Un vector ideal debe ser capaz de compactar el DNA o siRNA en nanoparticulas estables en suero, proteger al oligonucleotido de la degradation, facilitar la internalization celular y salida de los complejos de la via endosomal, ademas de tener una baja toxicidad para las celulas transfectadas y el resto de tejidos.
Aunque en la actualidad los virus y retrovirus modificados son los agentes de transfeccion mas utilizados en ensayos clmicos, su uso en terapia genica resulta una via poco adecuada debido a la alta toxicidad inherente a estos sistemas y el riesgo de carcinogenesis asociado a la posible insertion de material genetico de forma aleatoria. Por ello, se han desarrollado como alternativa vectores no virales con el objetivo de reducir los niveles de toxicidad e inmunogenicidad. Los vectores no virales pueden agruparse en cuatro categorias amplias: polimeros cationicos solubles en agua, lipidos, dendrimeros y nanomateriales. Todos ellos tienen en comun una remarcable complejidad estructural que en muchos casos dificulta la preparation a gran escala o encarece excesivamente el producto final. La efectividad de estos agentes es variable y algunos de ellos se comercializan como agentes de transfeccion de uso rutinario en laboratorios de investigation, pero en la mayoria de los casos no se ha solventado completamente el problema de la citotoxicidad.
Por tanto, seria conveniente desarrollar pequenas moleculas organicas con capacidad para transfectar y que no sean toxicas para el organismo huesped. Estas moleculas deberan formar policomplejos estables con acidos nucleicos y ser capaces de
5
10
15
20
25
compactarlos y transportarlos al interior celular, solos o en combination con otros agentes de transfection.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
Los autores de la presente invention proporcionan oligoescuaramidas ticlicas de pequeno tamano, es decir aquellas formadas por dos grupos escuaramida unidos entre si mediante dos diaminas alifaticas que contienen nitrogenos terciarios, que presentan niveles de toxicidad despreciables y son capaces de formar complejos estables en medios acuosos con oxoaniones como los fosfatos. En los ejemplos se demuestra la capacidad de los compuestos oligoescuaramidicos dclicos de la presente invencion para formar policomplejos con plasmidos y oligonucleotidos y para actuar como agentes de transfeccion eficientes y poco toxicos.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de formula general (I) o (II) como agente de transfeccion no-viral.
imagen1
(I)
O. .0
HN
RiN<j/
r3/N\
HN.
R2
NH
K
/ R4 NH
O O
X
(II)
donde:
R1 y R2, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino;
R3 y R4, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino; y
X es al menos un contraion y se puede seleccionar de entre dos aniones monovalentes (2X"), iguales o diferentes, y un anion divalente (X2-).
5
10
15
20
25
30
35
En una realization preferida de los compuestos de formula (I), R1 y R2, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y arilo.
En una realizacion preferida de los compuestos de formula (II), R1 y R2, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y arilo; y/o R3 y R4, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y arilo. Mas preferiblemente R1 y R2, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y arilo; y R3 y R4, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y arilo.
En una realizacion mas preferida de los compuestos de formula (I) o (II), R1 y/o R2 son un grupo alquilo (C1-C4), mas preferiblemente R1 y/o R2 son un metilo.
En otra realizacion preferida de los compuestos de formula (I) o (II), R1 y R2 son un metilo.
En otra realizacion preferida de los compuestos de formula (I) o (II), R1 o R2 son un grupo alquilo (C1-C4) sustituido con un grupo amino terminal, mas preferiblemente R1 o R2 son -(CH2)3-NHBoc, mas preferiblemente R1 es metilo y R2 es -(CH2)3-NHBoc.
En otra realizacion preferida de los compuestos de formula (I) o (II), R1 o R2 son arilo, mas preferiblemente R1 o R2 son bencilo, aun mas preferiblemente R1 es metilo y R2 es bencilo.
En otra realizacion preferida de los compuestos de formula (II), R3 y/o R4 son un grupo alquilo (C1-C4), mas preferiblemente R3 y/o R4 son un metilo, aun mas preferiblemente R3 y R4 son metilo y en una realizacion aun mas preferida R1 y/o R2 son un grupo alquilo (C1-C4), mas preferiblemente R1 y/o R2 son un metilo y aun mas preferiblemente R1 y R2 son un metilo.
En una realizacion mas preferida de los compuestos de formula (II), R1, R2, R3 y R4 son un metilo.
5
10
15
20
25
30
35
El estado de oxidacion del compuesto de formula (II) con los dos grupos amino cuaternarios es de +2, por tanto, cuando el contraion (X) es monovalente se precisan de dos aniones para compensar la carga positiva (2X-), estos pueden ser iguales o diferentes, y cuando el contraion (X) es divalente se precisan de un anion para compensar la carga positiva (X2-). En una realization preferida el contraion es monovalente y es cualquier anion biologica o farmaceuticamente aceptable conocido por un experto en la materia. Ejemplos de aniones biologica o farmaceuticamente aceptables pueden ser I-, Cl-, Br-, F-, CF3SO3-, ClO4-, PF6- y BF4-, acetato, malato, fumarato, citrato u oxalato, entre otros conocidos por un experto en la materia. Preferiblemente el contraion se selecciona de un halogeno y aun mas preferiblemente se selecciona de I- y Cl-. En una realizacion mas preferida del compuesto de formula (II), X es 2I-o 2Cl-.
El termino "alquilo” se refiere en la presente invention a cadenas alifaticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n- propilo, /-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 atomos de carbono y mas preferiblemente se seleccionan entre metilo, etilo, n-propilo, y n-butilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por al menos un sustituyente amino, que a su vez puede opcionalmente sustituido, preferiblemente el grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido por un grupo amino terminal, el grupo amino puede ser una amina primaria (-NH2), secundaria (-NHR’) o terciaria (-NR’R’’), donde R’ y R’’ se seleccionan independientemente de entre un grupo alquilo (C1-C10), un aralquilo como se ha definido en la invencion, o de un grupo protector, preferiblemente R’ y R’’ se seleccionan independientemente de entre un grupo alquilo (C1-C4), bencilo o Boc (t- butiloxicarbonilo).
Por "grupo protector” se refiere a un grupo que bloquea un grupo funcional organico y que puede eliminarse en condiciones controladas. Los grupos protectores, sus reactividades relativas y las condiciones en la que permanecen inertes son conocidas por el experto en la materia. Se pueden seleccionar, sin limitarse, los grupos protectores de nitrogeno a carbamatos de formula -(O=)C-O-R, donde R es un grupo arilo, un aralquilo, o un alquilo (C1-C10), definidos en la invencion, preferiblemente R es bencilo, -C(CH3)3 o -CH2CH3, y aun mas preferiblemente el grupo protector es Boc; o
un sulfonato de formula -(O=)S(=O)-R, donde R es un grupo arilo, un aralquilo, o un alquilo (C1-C10), definidos en la invencion, preferiblemente R es -CH3o tosilato.
Por "arilo” se refiere en la presente invencion, a anillos aromaticos, sencillos o 5 multiples, que tienen entre 5 a 18 atomos de carbono en la parte del anillo, tales como pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 atomos de carbono y mas preferiblemente el grupo arilo es un fenilo.
10 Por "heteroarilo” se refiere, en la presente invencion, a anillos heterodclicos aromaticos (mono- o bidclicos) que tienen entre 5 y 10 miembros, entre ellos atomos de carbono y al menos entre 1 a 3 heteroatomos seleccionados de entre N, O y S. Preferiblemente el grupo heteroarilo tiene entre 5 y 6 miembros, por ejemplo piridina.
15 Por "aralquilo” se refiere a un grupo arilo unido a un grupo alquilo (C1-C4), por ejemplo pero sin limitarse bencilo y fenetilo, preferiblemente es bencilo.
En una realizacion preferida, los compuestos de formula (I) se seleccionan de entre:
imagen2
1 2 3
En otra realizacion preferida, los compuestos de formula (II) se seleccionan de entre:
5
10
15
20
25
CL yO
NH
HN
^3^^©/ vn pi_|
> r r rCH3
h3c \ / 'ch3
HN NH
0 0
y
CX yO
HN NH
H3CNij/ Wv rH
>cr ci-nxh
h3c \ /'ch
HN NH
o o
3
4
5
Por "agente de transfeccion no-viral” se refiere, en la presente invention a todo vector que no tenga ningun componente vmco y que sea capaz de introducir una molecula de acido nucleico en una celula hospedadora y de mejorar la eficiencia de la transfeccion de los mismos.
Los agentes de transfeccion no viral presentan ademas otra serie de ventajas respecto a los analogos vmcos: a) facilidad en la preparacion (incluso a escala multigramo) y modificacion, b) mayor flexibilidad con respecto al tamano del material genetico a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no provocan una respuesta inmune espedfica y como consecuencia, pueden ser administrados repetidamente.
Por tanto, un aspecto de la presente invencion se refiere a un agente de transfeccion no-viral, a partir de ahora agente de transfeccion de la invencion, que comprende al menos uno de los compuestos, de formula general (I) o (II), descritos anteriormente y al menos un acido nucleico.
Un acido nucleico o molecula de acido nucleico comprende 2 o mas bases de nucleotido unidas covalentemente, que puede ser de cadena sencilla o cadena doble, pudiendo incluir entre otras ADN, ARN, ARN de interferencia (silenciamiento), micro ARN, plasmidos de ADN, ADN viral, fragmentos de cromosomas, acido nucleico senuelo, aptameros o ribozimas.
Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere al uso del agente de transfeccion no-viral de la invencion, para la elaboracion de un medicamento, preferiblemente utilizados en terapia genica.
5
10
15
20
25
30
En la presente invention se entiende por terapia genica la introduction de cualquier tipo de material genetico (por ejemplo DNA, RNA, RNAi, siRNA, miRNA) en el interior de una celula con un objetivo curativo. Se puede emplear terapia genica para obtener el efecto terapeutico deseado a traves de distintas estrategias, dependiendo de la enfermedad objetivo. Se puede emplear terapia genica para aportar un gen ausente en el receptor, o bien para complementar o sustituir el defecto en la funcion de un gen defectuoso introduciendo una copia normal de este en las celulas. Tambien es posible emplear terapia genica para obtener el efecto contrario, es decir, inhibir o bloquear el funcionamiento de genes cuya intervention contribuye al desarrollo de la enfermedad. Alternativamente, se puede emplear terapia genica no para sustituir o inactivar la funcion de un gen, sino para introducir la information que permita a la celula sintetizar una protema con el efecto terapeutico deseado.
La terapia genica es util para el tratamiento o la prevention de un gran numero de enfermedades, conocidas por un experto en la materia, como por ejemplo pero sin limitarse a la deficiencia en adenosmdeaminasa (ADA), el smdrome de Wiskott-Aldrich (WAS), infection por VIH, enfermedades neurodegenerativas o cancer.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que comprende el agente de transfection no-viral de la invencion, y opcionalmente al menos un aditivo farmaceuticamente aceptable y/u otro principio activo.
Por aditivo se entiende a cualquier sustancia farmaceuticamente aceptable y no activa conocidas por cualquier experto en la materia y se pueden incluir agentes aromatizantes, colorantes, antioxidantes o edulcorantes y similares, que pueden ser usados solos o en una combination adecuada de los mismos. Ejemplos, no limitantes, son lactosa, dextrina, sacarosa, manitol, almidon de maiz, sorbitol, celulosa microcristalina y polivinilpirrolidona.
Los agentes de transfeccion no-viral de la presente invencion se pueden utilizar tambien para la preparation de compuestos utiles para la realization de pruebas diagnosticas mediante imagen medica, en diversas patologias.
5
10
15
20
25
Por tanto, otro aspecto de la invention se refiere al uso del agente de transfection noviral para la elaboration de sondas para el diagnostico de enfermedades mediante tecnicas de imagen.
La preparation de un medio de contraste o sonda de imagen puede comprender dicho agente de transfeccion no-viral y un compuesto de marcaje conocido por cualquier experto en la materia, y que podria ser, sin limitarse a compuesto de marcaje radiologico, fluorescente, entre otros, que puede ser utilizado para la observation y diagnostico mediante las tecnicas de detection habitualmente utilizadas en clmica. Ejemplos no limitantes de dichos compuestos de marcaje son gadolinio o yodo, aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia.
Otro aspecto mas de la invencion se refiere al compuesto 1 de formula
imagen3
1
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Representa imagenes de microscopia confocal de fluorescencia donde se observa la presencia de celulas fluorescentes como resultado de la transfeccion del plasmido pmax-GFP (pGFP) con los compuestos 1,2, 3 y 5 y Lipofectamina2000®.
5
10
15
20
25
FIG. 2 Representa un Western blot obtenido a partir de extractos de celulas NIH3T3 y LN229 tratadas con Lipofectamina 2000® (lipo) y C2 como agentes de transfeccion y siRNAs espedficos para silenciar la expresion de las protemas RhoE y FOXO1, respectivamente.
FIG. 3 Muestra el tanto por ciento de viabilidad celular para celulas U87MG y LN 229 despues de la transfeccion del plasmido pmaxGFP con el reactivo comercial Lipofectamina 2000® y el compuesto 2 (C2). La viabilidad celular se compara frente a celulas control solo tratadas con el plasmido.
FIG. 4 Muestra la dosis respuesta. Celulas COS7 y U87MG transfectadas con el pmaxGFP utilizando diferentes concentraciones del compuesto 2 (C2). La eficiencia de transfeccion se compara con los resultados obtenidos con el reactivo comercial lipofectamina 2000® segun las indicaciones del comerciante (Life Technologies).
EJEMPLOS
A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
Sintesis del compuesto 1
A continuacion se muestra el esquema sintetico del compuesto 1:
,o
o H
H?N
Ov
N v N \ / | H O
A
+
N
imagen4
NH?
imagen5
donde r.t. significa temperatura ambiente.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 2,75 mmol de la diescuaramida diester(A) en 50 ml de etanol (EtOH). Mediante un embudo de adicion, y en atmosfera
5
10
15
20
25
30
de argon, se anade gota a gota, muy lentamente, una disolucion de 2,75 mmol de N- N’-Bis-(2-aminopropil)]-bencilamina(B), disuelta en 50 ml de etanol. Transcurrida la adicion, dejamos en agitacion durante 12 h. Pasado ese tiempo aparece un precipitado blanco, el cual se aisla mediante decantacion. Se lava con etanol (3 x 10 ml) y se seca. Seguidamente se disuelve el producto con agua a pH 2, y se va anadiendo NaOH 0,1 N, gota a gota, hasta pH 10. El precipitado formado se centrifuga y se lava con agua (2 x 10 ml) y acetona (10 ml) obteniendo la oligoescuaramida dclica 1. Rendimiento: 66,00%. P. f.: 216-218°C. RMN-1H (DMSO-d6) 5: 7,77 (bb, 4H, COCNHCH2); 7,54-7,44 (bb, 5H, Ar); 3,53 (bb, 8H, COCNHCH2CH2); 3,50 (bb, 2H, NCH2Ar); 3,21 (bb, 8H, CH2CH2N); 2,89 (s, 3H, NCH3); 2,07 (bb, 8H, COCNHCH2CH2CH2N) ppm. RMN-13C (DMSO-d6) 5: 27,24; 44,34; 52,85; 56,13; 60,26; 130,75; 131,89; 132,81; 133,53; 169,72; 179,84 ppm. EM (MALDI-TOF): m/z(%) calculada para C28H38N6O4/H+: 522,3027; encontrada: 523,3004.
El compuesto A (diester N,N-bis((2-etoxi-3,4-dioxo-1-
ciclobutenil)aminopropil)metilamina) se preparo siguiendo la metodologia descrita en Rotger, M. C., et al., J. Org. Chem.2004, 69, 2302-2308. El compuesto B ([N-N’-Bis-(2- aminopropil)]-bencilamina) se sintetizo siguiendo el procedimiento descrito en Bergeron, R. J., et al., Synthesis, 1981, 9, 732-733 y Bergeron, R. J., Garlich, J. R., Synthesis. 1984, 9, 782-784.
Sintesis del compuesto 2 (C2)
Ov .0
W'
HN
/
h3c-n
\
HN.
NH
\
n-ch3
/
NH
o o
2
El compuesto 2 (C2) se prepara segun lo descrito en M. C. Rotger, et al. J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308.
A una disolucion del compuesto A (0,21 g, 0,53 mmol) en etanol (20 mL) se adiciona gota a gota una disolucion de 3,3’-diamino-N-metildipropil)-metilamina (0,08 g, 0,53 mmol) en etanol (5 mL). La mezcla de reaccion se deja agitando durante 7 horas a
5
10
15
20
25
30
temperatura ambiente. Entonces el precipitado de color amarillo palido se decanta mediante centrifugacion y se lava con etanol (1 x 10 mL), acetona (2 x 10 mL), y seca para obtener el compuesto como un solido de color amarillo palido (0.19 g, 80% de rendimiento).
Mp > 320 °C con descomposicion; 1H NMR (300 MHz,DMSO-cf6): 5 = 8.0-7.2 (br s, 4H, NH), 3.60 (br s, 8H, CH2), 2,43 (t, J = 7.1 Hz, 8H, CH2), 2.22 (s, 6H, CH3), 1.74 (t, J = 6.2 Hz, 8H, CH2); 13C NMR (300MHz, D2O/DCl): 5 = 184.3, 170.9, 56.3, 41.8, 27.9; IR (KB Br): 3172, 2956, 1797, 1638, 1574 cm-1; MS (FAB+, matrix NOBA) m/z (%): 447 (MH+, 50); analisis elemental calcd (%) de C22H34N6O4: C 59.17, H 7.67; 18,82; encontrado: C 57.81, H 7.57, N 18.22.
Sintesis del compuesto 3

O. .O
HN NH

/ \

H3C-N N

\ /
HN NH
O O
NHBoc
3
La smtesis del compuesto 3 se describe en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
El diester A (1,8 g, 4,58 mmol) se calienta en EtOH a 50°C hasta su completa disolucion. Sobre esta se anade gota a gota una disolucion de la triamina monoprotegida terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato (1,32 g, 4,58 mmol) disuelta en EtOH (20 ml). La mezcla se agita durante 16 horas a temperatura ambiente y en atmosfera de argon. El precipitado formado se filtra y se lava con EtOH (4x10 ml) y dietileter (2x10 ml) obteniendo un solido amarillo. Este se lava con acetona a reflujo (3x20 ml) y se seca a vado obteniendo un solido amarillo palido (1,82 g, 3,09 mmol). Rdto: 67%
1H RMN (300 MHz, DMSO-da): 5 = 1,37 (s, 9H, C(C^3), 1,47 (br, 2H, CH2CH2NHBoc), 1,64 (br, 8H, CH2CH2CH2), 2,11 (s, 3H, NCH3), 2,33 (br, 10H, NCH2),
5
10
15
20
25
2,91 (br, 2H, C^NHBoc), 3,50 (br, 8H, C^NH(Sq)), 6,75 (br, 1H, NHBoc), 7,40 (br, 4H, NH(Sq)). 13C RMN (75 MHz, DMSO-da): 5 = 26,7, 28,0, 28,2, 38,0, 41,7, 50,4, 54,2, 77,3, 155,6, 167,8, 182,3. HRMS (ESI) calc. para 612,3486 (M+Na+; C29H47N7NaO6+) encontrado: 612,3480.
Smtesis de terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato.
La smtesis del terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato se realiza siguiendo los metodos descritos en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
Smtesis del compuesto 4
CL .0
HN NH
h3CxG/ W ri_,
> r r rCH
h3c \ / CH
HN NH
0 0
3
3
4
La smtesis del compuesto 4 se describe en Prohens, R., et al., Chem. Commun., 2001, 1456-1457, mediante la adicion de 7,8 equivalentes (5,6 mmol) de ioduro de metilo a una suspension de 2 (320 mg, 0,72 mmmol) en DMF (70 mL). La disolucion se mantiene a 70 °C durante 12 horas. Finalmente se obtienen un precipitado que se decanta por centrifugacion, se lava con acetona (5 x 10 mL), obteniendose 416 mg de 4 como un solido amarillo. Rendimiento 80 %. Mp: descompone >250 °C, 1H RMN (300 MHz, D2O): 5 = 3,71 (t, 8H, J = 5.7 HZ), 3.58 (m, 8H), 3,15 (s, 12H), 2,12 (s, 8H,) ppm. 13C RMN (75 MHz, D2O): 5 = 27,1,43,7, 53,9, 64,3, 171,3, 184,6. IR (KBr): 3453, 3179,2949,1797,1653,1581,cm-1. Analisis elemental calculado para C24N6O4H10 I2 : C 39,47; H 5,52; N: 11, 51 Experimental: C 39,20; H 5,56; N: 11, 34
Smtesis del compuesto 5
5
10
15
20
25
30
CL ,0
HN
NH
;nci- ci¥ch
H3C' \ / 'CH
HN NH
o o
3
5
La smtesis del compuesto 5 se describe en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
El compuesto 4 (204 mg, 0,28 mmol) se disuelve en H2O (15 ml) y la solucion se filtra para eliminar restos insolubles. Se anade una disolucion acuosa de NH4PF6 (0,4 ml, 1,2M) obteniendo un precipitado amarillo que se filtra y lava con H2O (5 ml). El precipitado se suspende en agua destilada (10 ml) y se anade una resina de intercambio ionico en su forma cloruro (Amberlite® IRA-400, 0,5 g). La mezcla se agita suavemente durante 24 horas, se filtra y la disolucion acuosa se liofiliza para obtener el producto 5 como un solido blanco (120 mg, 0,22 mmol). Rdto: 78%
ENSAYOS BIOLOGICOS
Evaluacion de la capacidad de los compuestos 1 a 5 de la invencion como agentes de transfeccion no-viral
Se evaluo la capacidad de actuar como agentes de transfeccion no-viral de los compuestos de la invencion. Para ello se realizaron ensayos de transfeccion en cultivos celulares (U87MG) utilizando como modelo de ADN el plasmido pmax-GFP (Lonza) o el pGL3-control vector de Promega (p). El plasmido pmax-GFP una vez en el interior celular se transcribe y traduce dando lugar a la protema denominada GFP (Green Fluorescent Protein) lo que permite cuantificar de forma directa la eficacia del proceso combinado de transporte y transcripcion del ADN. Con fines comparativos y a modo de control se ha utilizado Lipofectamina2000® (Life Technologies) en ensayos paralelos a los realizados con los compuestos 1 a 5, utilizando 2 ^L de reactivo Lipofectamina2000® (Life Technologies) y siguiendo las especificaciones del comerciante. La Lipofectamina se incubo con 1^g de plasmido (pmaxGFP, Lonza) en 200 ^L de medio Opti-MEM® (Life Technologies) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente la disolucion se mezcla en un pocillo de una placa (12
5
10
15
20
25
30
35
pocillos) con una suspension de 1 mL de cultivo celular a una concentration de 60.000 celulas/pocillo. La Lipofectamina 2000® es un reactivo comercial ampliamente utilizado para realizar este tipo de estudios, segun las instrucciones del fabricante debe utilizarse a dosis de entre 2 y 5 ^l de la disolucion, encontrando que para esta aplicacion la dosis mas adecuada fue de 2^l de Lipofectamina 2000®. La eficacia de la transfection se determino por microscopia confocal de fluorescencia tomando imagenes de los cultivos despues de 48h del tratamiento con los vectores de transfeccion.
Se trataron celulas U87MG con una concentracion 10 ^M de cada compuesto 1 a 5 o con 2^l de Lipofectamina 2000® y 1 ^g de pmax-GFP durante 48 h a 37 °C y bajo aire humificado que contiene 5% CO2. Despues del periodo de incubation se evalua el grado de transfeccion mediante microscopia confocal y citometria de flujo para el pmaxGFP . Se observo que para los compuestos 1a 5 se han obtenido niveles de transfeccion similares o superiores a los obtenidos utilizando la Lipofectamina2000® y como control se utilizo el plasmido pmax-GFP sin vector de transfeccion (Figura 1). En la figura 1 se muestran las imagenes con los compuestos 1 a 3 y 5, para el compuesto 4 se obtuvo un resultado similar al compuesto 5.
De entre los compuestos con mayor eficiencia de transfeccion se eligio el compuesto 2 (C2) para los siguientes ensayos como agente de transfeccion no-viral.
Optimization de la dosis-respuesta del metodo de transfeccion.
1^g de plasmido pmaxGFP se mezclo con diferentes cantidades de una disolucion 10 mM del compuesto o agente de transfeccion no-viral 2 (C2) en 200^L de medio Opti- MEM® (Life Technologies) para obtener concentraciones finales de C2 en el medio de transfeccion, cuando el volumen total sea 1200 ^L, comprendidas entre 5-30^M. Las mezclas se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente para inducir la formation del complejo. Transcurrido dicho tiempo las distintas disoluciones se mezclan en diferentes pocillos de una placa (12 pocillos) con una suspension de 1 mL de cultivo celular a una concentracion aproximada de 60.000 celulas/pocillo. La eficacia de transfeccion se midio a partir de las imagenes tomadas por microscopia confocal de fluorescencia despues de incubar los cultivos durante 48 (Leica Microsystem, Wetzlar, Germany).
5
10
15
20
25
30
35
Se comprobo que la mejor relation dosis respuesta para la transfection se alcanza al tratar los cultivos celulares U87MG y COS7 a una concentration de 10 ^M de C2 y 1 ^g de plasmido pmaxGFP durante 48 h (Fig. 4). Esta dosis implica, una relacion N/P (Nitrogeno/Fosfato) aproximadamente de 2, inferior a las establecidas en otros reactivos de transfeccion.
Metodo de transfeccion en cultivo celular
1^g de plasmido pmaxGFP (Lonza) o del pGL3-control vector, Promega (p) se mezcla con 1,2 ^l de una disolucion 10 mM de cualquiera de los compuestos 1 a 5 de la invention, utilizados como agentes de transfeccion no-viral, en 200^L de medio Opti- MEM®-(Life Technologies). Se lleva a cabo el mismo protocolo que se describe en el ejemplo “Evaluation de la capacidad de los compuestos 1 a 5 de la invencion como agentes de transfeccion no-viral”, con la peculiaridad de que despues del periodo de incubation se evalua el grado de transfeccion mediante microscopia confocal y citometria de flujo para el pmaxGFP; y se mide los niveles de luminiscencia utilizando el kit (Promega, Madison, WI) para el pGL3-control vector, Promega (p).
Detection de la expresion de RhoE y FOXO1 en cultivos celulares transfectados con el correspondiente siRNA
Para evaluar la capacidad del agente de transfeccion no-viral C2 de la invencion para transfectar siRNA, utilizamos a modo de modelo los siguientes: siRNA-RhoE (raton) (Dharmacom) y siRNA-Fox01 (humano) (Dharmacom). En 500^l de medio Opti- MEM®, se mezclaron tanto 50nM siRNA con la cantidad necesaria del agente de transfeccion no-viral 2 (C2) para obtener una concentracion final de 10^M de C2 o 50nM siRNA con 2^l Lipofectamina 2000®. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de incubation la mezcla de transfeccion se adiciono a un pocillo de una placa a la que se anadio el correspondiente cultivo celular en una concentracion aproximada de 100.000 celula/pocillo. Para este procedimiento se utilizaron placas de 6 pocillos. Los cultivos se incubaron durante 48 horas. Como control (C) se utilizo el mismo numero de celulas por pocillo incubadas durante 48 h solo con los siRNA, sin usar C2. Se lisaron con un tampon que contiene inhibidores de proteasas. El contenido protemico se midio mediante el metodo de Bradford. El lisado celular se separa mediante electroforesis en gel de 10% SDS-poliacrilamida durante 90 minutos a 120V. Despues las protemas fueron transferidas a una membrana PDVF (Millipore, Billerica, MA) durante 2 horas a 60V. Las membranas se incubaron con un tampon de bloqueo que
5
10
15
20
25
30
35
conterna TBS (20mM This-HCL ph 7,5, 150mM NaCI), 0,02% Tween 20 y 5% leche desnatada deshidratada durante 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente se incubaron con los siguientes anticuerpos: RhoE (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000), Foxo1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000) y beta-tubulina (T0198, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1/4.000), a 4°C durante 12 h. Despues las membranas se lavaron en TBS 0,02% Tween 20 y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (Dako, Glostrup, Denmark, 1/2000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente la reaccion de la peroxidasa se detecto mediante el sistema de detection quimioluminiscente (Millipore, Billerica, MA).
Se comprobo que el C2 transfecta de forma efectiva siRNAs (pequenos ARNs de interferencia) al observar el silenciamiento de la expresion de protemas como FOXO1 y RhoE (FIG. 2). En la figura se muestran los western blots obtenidos donde se aprecia la disminucion en los niveles de expresion de las protemas silenciadas. La efectividad del ensayo realizado con C2 resulta del mismo nivel o superior que los resultados obtenidos al utilizar Lipofectamina2000® como agente de transfection.
Viabilidad Celular
Se determino la toxicidad del agente de transfeccion no-viral C2 de la invencion en celulas transfectadas y se comprobo que es mucho menor que la que presenta la Lipofectamina2000®. La viabilidad celular se midio 48 h despues del tratamiento con Lipofectamina2000® o con el compuesto C2 y pmax-GFP, utilizando las condiciones determinadas como optimas para la transfeccion (1^g plasmido y 10 ^M de C2 o 2 ^L de Lipofectamina 2000®, siguiendo las indicaciones del fabricante para este reactivo) en dos lmeas celulares de glioma humano: U87MG y LN229. Las cantidades especificadas de C2 y Lipofectamina 2000® se incubaron en 200^L de Opti-MEM® durante 30 minutos a temperatura ambiente con 1^g del plasmido pmaxGFP (Lonza). Despues se transfirieron a los respectivos pocillos (placa de 12 pocillos) a los que se anadio 1mL de una suspension de cultivo celular a una concentration aproximada de 60.000 celulas/pocillo. Las placas se incubaron durante 48 h y finalizado este periodo se determino la viabilidad celular. Para ello, las celulas se tripsinizaron e incubaron en 25 ^M de medio de cultivo con 25^M del reactivo CellTiter- Glo (Promega). La luminiscencia generada se midio utilizando un lector de places Synergy Mx microplate reader (Biotek, Winooski, VT). Las lecturas se realizaron por triplicado. Los resultados se recogen en la Tabla 1 y FIG. 3.
Tabla 1. Porcentaje de celulas viables transfectadas
Llnea Celular
Lipofectamina2000® C2
U87MG
25% 85%
LN229
65% 90%
5 Ademas, se comprobo que C2 transfecta acido nucleico, por ejemplo plasmidos o siRNA, en diferentes tipos de lmeas celulares correspondientes a tejidos solidos como son: U87MG, NIH3T3, LN229, COS7 y U2OS, asi como celulas primarias de glioma humano.
10 Se obtuvieron tambien niveles de transfeccion muy adecuados con otros plasmidos, como por ejemplo, el pGL3 (Luciferase reporter vector) registrando niveles de transfeccion 10 veces mas altos al utilizar C2 como agente de transfeccion no-viral que con la Lipofectamina2000®.
15

Claims (26)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Uso de un compuesto de formula general (I) o (II)
    imagen1
    CL o
    W'
    HN
    Rin€/
    .N
    r3^ \
    HN.
    NH
    k
    r2
    / R4 NH
    O O
    X
    (I) (II)
    donde: R1 y R2, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo,heteroarilo y alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino,;
    R3 y R4, son iguales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (C1-C10), opcionalmente sustituido por un grupo amino; y
    X es al menos un contraion, como agente de transfeccion no-viral.
  2. 2. Uso segun la reivindicacion 1, donde R1 y/o R2 son un grupo alquilo (C1-C4) o arilo.
  3. 3. Uso segun la reivindicacion 2, donde R1 y/o R2 son un metilo,
  4. 4. Uso segun la reivindicacion 3, donde R1 y R2 son un metilo.
  5. 5. Uso segun la reivindicacion 2, donde R1 o R2 son un grupo alquilo (C1-C4)
    sustituido con un grupo amino terminal.
  6. 6. Uso segun la reivindicacion 5, donde R1 o R2 son -(CH2)3-NHBoc.
  7. 7. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones1 a 3, donde R1 o R2 son un arilo.
  8. 8. Uso segun la reivindicacion 7, donde R1 o R2 son un bencilo.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  9. 9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R1 es metilo y R2 es - (CH2)3-NHBoc.
  10. 10. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R1 es metilo y R2 es un bencilo.
  11. 11. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y/o R4 son un grupo alquilo (C1-C4).
  12. 12. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y/o R4 son un metilo.
  13. 13. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y R4 son metilo.
  14. 14. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el contraion se selecciona de entre dos aniones monovalentes, iguales o diferentes, o un anion divalente.
  15. 15. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el contraion se selecciona de un halogeno.
  16. 16. Uso segun la reivindicacion 15, donde el contraion X es 2I- o 2Cl-.
  17. 17. Uso segun la reivindicacion 1 donde los compuestos de formula (I) se seleccionan de entre:
    imagen2
    o. .O
    HN
    /
    h3c-n
    N
    HN.
    NH
    \
    N-
    /
    NH
    O O
    NHBoc
    y
  18. 18. Uso segun la reivindicacion 1 donde los compuestos de formula (II) se seleccionan de entre:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen3
  19. 19. Agente de transfeccion no-viral que comprende al menos un compuesto de formula general (I) o (II), segun se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y al menos un acido nucleico.
  20. 20. Agente de transfeccion segun la reivindicacion anterior, donde el acido nucleico es de cadena sencilla o de cadena doble y preferiblemente se selecciona de entre ADN, ARN, ARN de interferencia (silenciamiento), micro ARN, plasmidos de ADN, ADN viral, fragmentos de cromosomas, acido nucleico senuelo, aptameros o ribozimas.
  21. 21. Composition farmaceutica que comprende al menos un agente de transfeccion noviral segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20.
  22. 22. Uso del agente de transfeccion no-viral segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboration de un medicamento.
  23. 23. Uso del agente de transfeccion no-viral segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboracion de un medicamento para terapia genica.
  24. 24. Uso del agente de transfeccion no-viral segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento o la prevention de deficiencia en adenosmdeaminasa (ADA), el smdrome de Wiskott- Aldrich (WAS), infection por VIH, enfermedades neurodegenerativas o cancer.
  25. 25. Uso del agente de transfeccion no viral segun cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboracion de sondas para el diagnostico de enfermedades mediante tecnicas de imagen.
  26. 26. Compuesto de formula:
    imagen4
ES201530636A 2015-05-11 2015-05-11 Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección Active ES2589504B1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530636A ES2589504B1 (es) 2015-05-11 2015-05-11 Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección
PCT/ES2016/070349 WO2016181005A1 (es) 2015-05-11 2016-05-09 Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530636A ES2589504B1 (es) 2015-05-11 2015-05-11 Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2589504A1 ES2589504A1 (es) 2016-11-14
ES2589504B1 true ES2589504B1 (es) 2017-08-24

Family

ID=57247395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES201530636A Active ES2589504B1 (es) 2015-05-11 2015-05-11 Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2589504B1 (es)
WO (1) WO2016181005A1 (es)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2340979B1 (es) * 2008-12-10 2011-06-02 Universitat De Les Illes Balears Uso de compuestos cicloescuaramidicos como agentes antitumorales.
WO2011034051A1 (ja) * 2009-09-15 2011-03-24 参天製薬株式会社 新規環状スクアリン酸アミド誘導体
ES2525079B1 (es) * 2013-05-16 2016-01-18 Universitat De Les Illes Balears Actividad antiparasitaria de escuaramidas

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016181005A1 (es) 2016-11-17
ES2589504A1 (es) 2016-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2934810T3 (es) Moléculas químicas que inhiben el mecanismo de empalme para tratar enfermedades causadas por anomalías de empalme
ES2744827T3 (es) Polímero derivado de la polietilenimina lineal para la transferencia de genes
BR112019026226A2 (pt) composições compreendendo curóns e usos dos mesmos
Wan et al. Multifunctional peptide-lipid nanocomplexes for efficient targeted delivery of DNA and siRNA into breast cancer cells
Jiang et al. Specially-made lipid-based assemblies for improving transmembrane gene delivery: comparison of basic amino acid residue rich periphery
Wang et al. Functionalized O-carboxymethyl-chitosan/polyethylenimine based novel dual pH-responsive nanocarriers for controlled co-delivery of DOX and genes
Gaspar et al. Biofunctionalized nanoparticles with pH-responsive and cell penetrating blocks for gene delivery
Obata et al. Plasmid DNA-encapsulating liposomes: effect of a spacer between the cationic head group and hydrophobic moieties of the lipids on gene expression efficiency
WO2021218249A1 (zh) 多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用
McCrudden et al. Gene therapy with RALA/iNOS composite nanoparticles significantly enhances survival in a model of metastatic prostate cancer
Zheng et al. Reducible amino acid based cationic lipids as highly efficient and serum‐tolerant gene vectors
CN103893124A (zh) 基于协同组装的基因治疗药物递送系统
Tripathi et al. Hydrophobic and membrane permeable polyethylenimine nanoparticles efficiently deliver nucleic acids in vitro and in vivo
Mahato et al. Tetramethylguanidinium‐polyallylamine (Tmg‐PA): A new class of nonviral vector for efficient gene transfection
Meka et al. Asymmetric cationic lipid based non-viral vectors for an efficient nucleic acid delivery
US10045945B2 (en) Tetrary gene delivery system for gene therapy and methods of its use
Xiao et al. Poly (amidoamine) dendrimers modified with 1, 2-epoxyhexane or 1, 2-epoxydodecane for enhanced gene delivery applications
US10597678B2 (en) Bis-alkoxyl amide alkyl cationic peptide lipids, synthesis method thereof, and application thereof
ES2589504B1 (es) Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección
Zhao et al. Zn-Promoted gene transfection efficiency for non-viral vectors: A mechanism study
EP3141582B1 (en) Synthesis and use of polyalkylamines
Ailincai et al. Dynamic constitutional chemistry towards efficient nonviral vectors
Sewbalas et al. Enhancement of transfection activity in HEK293 cells by lipoplexes containing cholesteryl nitrogen-pivoted aza-crown ethers
Gerile et al. Head group configuration increases the biocompatibility of cationic lipids for nucleic acid delivery
US9907861B2 (en) High molecular weight arginine-grafted bioreducible polymers

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 2589504

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B1

Effective date: 20170824