WO2016181005A1 - Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección - Google Patents

Oligoescuaramidas cíclicas como agentes de transfección Download PDF

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WO2016181005A1
WO2016181005A1 PCT/ES2016/070349 ES2016070349W WO2016181005A1 WO 2016181005 A1 WO2016181005 A1 WO 2016181005A1 ES 2016070349 W ES2016070349 W ES 2016070349W WO 2016181005 A1 WO2016181005 A1 WO 2016181005A1
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transfection agent
group
methyl
compound
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PCT/ES2016/070349
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English (en)
French (fr)
Inventor
Antoni COSTA TORRES
Carmen ROTGER PONS
Silvia FERNÁNDEZ DE MATTOS
Priam De Villalonga Smith
Original Assignee
Universitat De Les Illes Balears
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins

Definitions

  • the present invention relates to the use of cyclic oligoesquaramides formed by two squalamide units as vectors or transfection agents for the transport of genetic material, such as plasmids or oligonucleotides, into the cell interior.
  • Gene therapy is an emerging alternative for the treatment of diseases such as cancer, Parkinson's, Alzheimer's, AIDS, etc.
  • diseases such as cancer, Parkinson's, Alzheimer's, AIDS, etc.
  • An ideal vector must be able to compact the DNA or siRNA into stable nanoparticles in serum, protect the oligonucleotide from degradation, facilitate cell internalization and exit of endosomal pathway complexes, in addition to having low toxicity for transfected cells and The rest of the tissues.
  • Non-viral vectors have been developed as an alternative in order to reduce the levels of toxicity and immunogenicity.
  • Non-viral vectors can be grouped into four broad categories: water-soluble cationic polymers, lipids, dendrimers and nanomaterials. All of them have in common a remarkable structural complexity that in many cases hinders large-scale preparation or excessively makes the final product expensive. The effectiveness of these Agents are variable and some of them are marketed as transfection agents for routine use in research laboratories, but in most cases the problem of cytotoxicity has not been completely resolved.
  • the authors of the present invention provide cyclic oligoesquaramides of small size, that is to say those formed by two squaramide groups linked together by two aliphatic diamines containing tertiary nitrogens, which have negligible levels of toxicity and are capable of forming stable complexes in aqueous media with oxoanions such as phosphates.
  • the examples demonstrate the ability of the cyclic oligoesquaramide compounds of the present invention to form polycomplexes with plasmids and oligonucleotides and to act as efficient and low-toxic transfection agents.
  • the present invention relates to the use of a compound of general formula (I) or (II) as a non-viral transfection agent.
  • Ri and R 2 are equal or different and are selected from the list comprising an optionally substituted amino group aryl, aralkyl, heteroaryl and alkyl (d-do);
  • R 3 and R 4 are the same or different and are selected from the list comprising an aryl, aralkyl, heteroaryl and alkyl (d-do) group, optionally substituted by an amino group; Y
  • X is at least one counterion and can be selected from two monovalent anions (2X " ), equal or different, and a divalent anion (X 2" ).
  • Ri and R 2 are equal or different and are selected from the list comprising an alkyl (d-do), optionally substituted by an amino group, and aralkyl.
  • Ri and R 2 are the same or different and are selected from the list comprising an alkyl (d-do) group, optionally substituted by an amino group, and aralkyl; and / or R 3 and R 4 , are the same or different and are selected from the list comprising an alkyl (d-do) group, optionally substituted by an amino group, and aralkyl.
  • Ri and R 2 are the same or different and are selected from the list comprising an alkyl (d-do) group, optionally substituted by an amino group, and aralkyl; and R 3 and R 4 , are the same or different and they are selected from the list comprising an alkyl group (Ci-do), optionally substituted by an amino group, and aralkyl.
  • Ri and / or R 2 are a (C 1 -C 4) alkyl group, more preferably Ri and / or R 2 are a methyl.
  • Ri and R 2 are a methyl.
  • Ri or R 2 is an alkyl group (Ci-C 4 ) substituted with an amino terminal group, more preferably Ri or R 2 is - (CH 2 ) 3 -NHBoc, more preferably Ri is methyl and R 2 is - (CH 2 ) 3 -NHBoc.
  • Ri or R 2 is aralkyl, more preferably Ri or R 2 is benzyl, even more preferably Ri is methyl and R 2 is benzyl.
  • R 3 and / or R 4 are an alkyl group (Ci-C 4 ), more preferably R 3 and / or R 4 are a methyl, even more preferably R 3 and R 4 is methyl and in an even more preferred embodiment Ri and / or R 2 are an alkyl group (Ci-C 4 ), more preferably Ri and / or R 2 are a methyl and even more preferably Ri and R 2 are a methyl .
  • Ri, R 2 , R 3 and R 4 are a methyl.
  • the oxidation state of the compound of formula (II) with the two quaternary amino groups is +2, therefore, when the counterion (X) is monovalent, two anions are required to compensate for the positive charge (2X " ), these can be equal or different, and when the counterion (X) is divalent, an anion is required to compensate for the positive charge (X 2 " ).
  • the counterion is monovalent and is any biologically or pharmaceutically acceptable anion known to one skilled in the art.
  • anions Biologically or pharmaceutically acceptable may be ⁇ , CI “ , Br “ , F “ , CF3SO3 “ , CIO4 “ , PF 6 “ and BF 4 “ , acetate, malate, fumarate, citrate or oxalate, among others known to one skilled in the art
  • the counterion is selected from a halogen and even more preferably it is selected from and CI " .
  • X is 21 “ or 2CI " .
  • alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 10 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / -propyl, n-butyl, ferc- butyl, sec-butyl, n-pentyl.
  • the alkyl group has between 1 and 4 carbon atoms and more preferably they are selected from methyl, ethyl, n-propyl, and n-butyl.
  • the alkyl groups may be optionally substituted by at least one amino substituent, which in turn may optionally substituted, preferably the alkyl group may be optionally substituted by an amino terminal group, the amino group may be a primary amine (-NH 2 ), secondary (-NHR ') or tertiary (-NR'R "), where R' and R" are independently selected from an alkyl group (Ci-do), an aralkyl as defined in the invention, or from a group protective, preferably R 'and R "are independently selected from an alkyl group (Ci-C 4 ), benzyl or Boc ( ⁇ -butyloxycarbonyl).
  • protecting group refers to a group that blocks an organic functional group and that can be removed under controlled conditions.
  • the protecting groups, their relative reactivities and the conditions in which they remain inert are known to the person skilled in the art.
  • aryl refers in the present invention, aromatic rings, single or multiple, having between 5 and 18 carbon atoms in the part of the ring, such as but not limited to, phenyl, naphthyl, diphenyl, indenyl, phenanthryl , fluorenyl or anthracil.
  • aryl group has 5 to 7 carbon atoms and more preferably the aryl group is a phenyl.
  • heteroaryl refers, in the present invention, to aromatic heterocyclic rings (mono- or bicyclic) having between 5 and 10 members, including carbon atoms and at least 1 to 3 heteroatoms selected from N, O and S.
  • the heteroaryl group has between 5 and 6 members, for example pyridine.
  • aralkyl refers to an aryl group attached to a (C1-C4) alkyl group, for example but not limited to benzyl and phenethyl, preferably benzyl.
  • the compounds of formula (I) are selected from:
  • the compounds of formula (II) are selected from:
  • non-viral transfection agent refers in the present invention to any vector that has no viral component and is capable of introducing a nucleic acid molecule into a host cell and improving the efficiency of transfection of the same.
  • Non-viral transfection agents also have another series of advantages over viral analogs: a) ease of preparation (including multigram scale) and modification, b) greater flexibility with respect to the size of the genetic material to be transfected, c) are generally safe in vivo and d) do not cause a specific immune response and as a consequence, they can be administered repeatedly.
  • one aspect of the present invention relates to a non-viral transfection agent, from now on transfection agent of the invention, comprising at least one of the compounds, of general formula (I) or (II) , described above and at least one nucleic acid.
  • a nucleic acid or nucleic acid molecule comprises 2 or more covalently bonded nucleotide bases, which may be single stranded or double stranded, and may include, inter alia, RNA, RNA interference (silencing), micro RNA, DNA plasmids, Viral DNA, chromosome fragments, decoy nucleic acid, aptamers or hbozymes.
  • a third aspect of the present invention relates to the use of the non-viral transfection agent of the invention, for the preparation of a medicament, preferably used in gene therapy.
  • gene therapy is understood as the introduction of any type of genetic material (for example DNA, RNA, RNAi, siRNA, miRNA) into a cell with a curative objective.
  • Gene therapy can be used to obtain the desired therapeutic effect through different strategies, depending on the target disease. Gene therapy can be used to provide an absent gene in the receptor, or to complement or replace the defect in the function of a defective gene by inserting a normal copy of it into the cells. It is also possible to use gene therapy to obtain the opposite effect, that is, to inhibit or block the functioning of genes whose intervention contributes to the development of the disease. Alternatively, gene therapy can be used not to replace or inactivate the function of a gene, but to enter information that allows the cell to synthesize a protein with the desired therapeutic effect.
  • Gene therapy is useful for the treatment or prevention of a large number of diseases, known to a person skilled in the art, such as but not limited to adenosine deaminase deficiency (ADA), Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) , HIV infection, neurodegenerative diseases or cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising the non-viral transfection agent of the invention, and optionally at least one pharmaceutically acceptable additive and / or other active ingredient.
  • additive is meant any pharmaceutically acceptable and non-active substance known to any person skilled in the art and flavoring agents, colorants, antioxidants or sweeteners and the like may be included, which can be used alone or in a suitable combination thereof.
  • Non-limiting examples are lactose, dextrin, sucrose, mannitol, corn starch, sorbitol, microcrystalline cellulose and polyvinylpyrrolidone.
  • the non-viral transfection agents of the present invention can also be used for the preparation of compounds useful for performing diagnostic tests by medical imaging, in various pathologies.
  • another aspect of the invention relates to the use of the non-viral transfection agent for the preparation of probes for the diagnosis of diseases by imaging techniques.
  • the preparation of a contrast medium or imaging probe may comprise said non-viral transfection agent and a dye compound known to any person skilled in the art, and which could be, without being limited to a radiological, fluorescent dye compound, among others. , which can be used for observation and diagnosis using the detection techniques commonly used in the clinic.
  • a dye compound known to any person skilled in the art, and which could be, without being limited to a radiological, fluorescent dye compound, among others. , which can be used for observation and diagnosis using the detection techniques commonly used in the clinic.
  • Non-limiting examples of said marking compounds are gadolinium or iodine, although it may be anyone known to a person skilled in the art.
  • Another aspect of the invention relates to compound 1 of the formula
  • FIG. 1 Represents confocal fluorescence microscopy images showing the presence of fluorescent cells as a result of the transfection of plasmid pmax-GFP (pGFP) with compounds 1, 2, 3 and 5 and Lipofectam ina2000®.
  • FIG. 2 Represents a Western blot obtained from extracts of NIH3T3 and LN229 cells treated with Lipofectamine 2000® (lipo) and C2 as specific transfection agents and siRNAs to silence the expression of RhoE and FOX01 proteins, respectively.
  • FIG. 3 Shows the percent cell viability for U87MG and LN 229 cells after transfection of plasmid pmaxGFP with the commercial reagent Lipofectamine 2000® and compound 2 (C2). Cell viability is compared to control cells only treated with the plasmid.
  • FIG. 4 Shows the dose response. COS7 and U87MG cells transfected with pmaxGFP using different concentrations of compound 2 (C2). The transfection efficiency is compared with the results obtained with the commercial reagent lipofectamine 2000® according to the indications of the trader (Life Technologies).
  • r.t. means room temperature
  • Compound 2 (C2) is prepared as described in M. C. Rotger, et al. J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308. To a solution of compound A (0.21 g, 0.53 mmol) in ethanol (20 mL) is added dropwise a solution of 3,3'-diamino-N-methyldipropyl-methylamine (0.08 g, 0.53 mmol) in ethanol (5 mL). The reaction mixture is allowed to stir for 7 hours at room temperature.
  • the pale yellow colored precipitate is decanted by centrifugation and washed with ethanol (1 x 10 mL), acetone (2 x 10 mL), and dried to obtain the compound as a pale yellow solid (0.19 g, 80% of performance).
  • the diester A (1.8 g, 4.58 mmol) is heated in EtOH at 50 ° C until completely dissolved.
  • a solution of the monoprotected triamine tert-butyl (3- (bis (2-aminopropyl) amino) propyl) carbamate (1.32 g, 4.58 mmol) dissolved in EtOH (20 mL) is added dropwise thereto. The mixture is stirred for 16 hours at room temperature and under argon. The precipitate formed is filtered and washed with EtOH (4x10 ml) and diethylether (2x10 ml) to obtain a yellow solid.
  • transfection assays were performed in cell cultures (U87MG) using as a DNA model the plasmid pmax-GFP (Lonza) or the pGL3-control vector of Promega (p).
  • the plasmid pmax-GFP once inside the cell is transcribed and translated giving rise to the protein called GFP (Green Fluorescent Protein) which allows to directly quantify the effectiveness of the combined process of transport and transcription of DNA.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Lipofectamine 2000® (Life Technologies) has been used in parallel tests. with compounds 1 to 5, using 2 ⁇ _ of Lipofectamine 2000® reagent (Life Technologies) and following the merchant's specifications.
  • Lipofectamine was incubated with ⁇ g of plasmid (pmaxGFP, Lonza) in 200 ⁇ of Opti-MEM® medium (Life Technologies) for 30 minutes at room temperature. The solution is then mixed in a well of a plate (12 wells) with a suspension of 1 mL of cell culture at a concentration of 60,000 cells / well.
  • Lipofectamine 2000® is a commercial reagent widely used to perform this type of studies, according to the manufacturer's instructions should be used at doses between 2 and 5 ⁇ 5 of the solution, finding that for this application the most appropriate dose was 2 ⁇ of Lipofectamine 2000®
  • the efficiency of the transfection was determined by confocal fluorescence microscopy by taking images of the cultures after 48 hours of treatment with the transfection vectors. U87MG cells were treated with a concentration of 10 ⁇ of each compound 1 to 5 or with 2 ⁇ of Lipofectamine 2000® and 1 g of pmax-GFP for 48 h at 37 ° C and under humidified air containing 5% CO2 .
  • compound 2 (C2) was chosen for the following tests as a non-viral transfection agent. Optimization of the dose response of the transfection method.
  • plasmid pmaxGFP 1 g was mixed with different amounts of a 10 mM solution of compound or non-viral transfection agent 2 (C2) in 200 ⁇ _ of Opti-MEM® medium (Life Technologies) to obtain final concentrations of C2 in the transfection medium, when the total volume is 1200 ⁇ , between 5-30 ⁇ .
  • C2 compound or non-viral transfection agent 2
  • the mixtures were incubated 30 minutes at room temperature to induce complex formation.
  • the different solutions are mixed in different wells of a plate (12 wells) with a suspension of 1 mL of cell culture at an approximate concentration of 60,000 cells / well. Transfection efficiency was measured from images taken by confocal fluorescence microscopy after incubating the cultures for 48 (Leica Microsystem, Wetzlar, Germany).
  • plasmid pmaxGFP Longza
  • pGL3-control vector Promega (p) is mixed with 1.2 ⁇ of a 10 mM solution of any of compounds 1 to 5 of the invention, used as non-transfection agents viral, in 200 ⁇ of Opti-MEM® medium (Life Technologies).
  • siRNA-RhoE mouse
  • sRR-Fox01 human
  • Opti-MEM® medium both 50nM siRNA was mixed with the necessary amount of non-viral transfection agent 2 (C2) to obtain a final concentration of 10 ⁇ of C2 or 50nM siRNA with 2 ⁇ Lipofectamine 2000®.
  • C2 non-viral transfection agent 2
  • the samples were incubated for 30 minutes at room temperature. At the end of the incubation period the transfection mixture was added to a well of a plate to which the corresponding cell culture was added at an approximate concentration of 100,000 cell / well.
  • the membranes were incubated with a blocking buffer containing TBS (20mM This-HCL ph 7.5, 150mM NaCI), 0.02% Tween 20 and 5% skim milk dehydrated for 1 hour at room temperature. They were then incubated with the following antibodies: RhoE (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000), Foxol (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000) and beta-tubulin (T0198, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1/4000), at 4 ° C for 12 h.
  • RhoE Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000
  • Foxol Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000
  • beta-tubulin T0198, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1/4000
  • the membranes were then washed in 0.02% Tween 20 TBS and incubated with peroxidase-labeled secondary antibodies (Dako, Glostrup, Denmark, 1/2000) for 1 hour at room temperature. Finally the peroxidase reaction was detected by the chemiluminescent detection system (Millipore, Billerica, MA).
  • C2 was found to effectively transfect siRNAs (small interfering RNAs) by observing the silencing of protein expression such as FOX01 and RhoE (FIG. 2).
  • the figure shows the western blots obtained where the decrease in the expression levels of the silenced proteins
  • the effectiveness of the test conducted with C2 results from the same level or higher than the results obtained when using Lipofectamina2000® as a transfection agent.
  • the toxicity of the non-viral transfection agent C2 of the invention in transfected cells was determined and found to be much lower than that presented by Lipofectamine 2000®.
  • Cell viability was measured 48 h after treatment with Lipofectamine 2000® or with compound C2 and pmax-GFP, using the conditions determined as optimal for transfection ( ⁇ g plasmid and 10 ⁇ of C2 or 2 ⁇ of Lipofectamine 2000®, following the manufacturer's indications for this reagent) in two human glioma cell lines: U87MG and LN229.
  • the specified amounts of C2 and Lipofectamine 2000® were incubated in 200 ⁇ of Opti-MEM® for 30 minutes at room temperature with ⁇ g of plasmid pmaxGFP (Lonza).
  • C2 transfects nucleic acid, for example plasmids or siRNA, in different types of cell lines corresponding to solid tissues such as: U87MG, NIH3T3, LN229, COS7 and U20S, as well as primary human glioma cells.
  • nucleic acid for example plasmids or siRNA

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de oligoescuaramidas cíclicas formadas por dos unidades escuaramida como agentes de transfección para el transporte de material genético al interior celular.

Description

OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS COMO AGENTES DE TRANSFECCIÓN
DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere al uso de oligoescuaramidas cíclicas formadas por dos unidades escuaramida como vectores o agentes de transfección para el transporte de material genético, como plásmidos u oligonucleótidos, al interior celular. ESTADO DE LA TÉCNICA
La terapia génica constituye una alternativa emergente para el tratamiento de enfermedades como el cáncer, Parkinson, Alzheimer, SIDA, etc. Sin embargo, su desarrollo y aplicación clínica se ven frenados ante la falta de vectores eficaces y seguros para el transporte del material genético al interior de las células diana. Un vector ideal debe ser capaz de compactar el DNA o siRNA en nanopartículas estables en suero, proteger al oligonucleótido de la degradación, facilitar la internalización celular y salida de los complejos de la vía endosomal, además de tener una baja toxicidad para las células transfectadas y el resto de tejidos.
Aunque en la actualidad los virus y retrovirus modificados son los agentes de transfección más utilizados en ensayos clínicos, su uso en terapia génica resulta una vía poco adecuada debido a la alta toxicidad inherente a estos sistemas y el riesgo de carcinogénesis asociado a la posible inserción de material genético de forma aleatoria. Por ello, se han desarrollado como alternativa vectores no virales con el objetivo de reducir los niveles de toxicidad e inmunogenicidad. Los vectores no virales pueden agruparse en cuatro categorías amplias: polímeros catiónicos solubles en agua, lípidos, dendrímeros y nanomateriales. Todos ellos tienen en común una remarcable complejidad estructural que en muchos casos dificulta la preparación a gran escala o encarece excesivamente el producto final. La efectividad de estos agentes es variable y algunos de ellos se comercializan como agentes de transfección de uso rutinario en laboratorios de investigación, pero en la mayoría de los casos no se ha solventado completamente el problema de la citotoxicidad.
Por tanto, sería conveniente desarrollar pequeñas moléculas orgánicas con capacidad para transfectar y que no sean tóxicas para el organismo huésped. Estas moléculas deberán formar policomplejos estables con ácidos nucleicos y ser capaces de compactarlos y transportarlos al interior celular, solos o en combinación con otros agentes de transfección.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención proporcionan oligoescuaramidas cíclicas de pequeño tamaño, es decir aquellas formadas por dos grupos escuaramida unidos entre sí mediante dos diaminas alifáticas que contienen nitrógenos terciarios, que presentan niveles de toxicidad despreciables y son capaces de formar complejos estables en medios acuosos con oxoaniones como los fosfatos. En los ejemplos se demuestra la capacidad de los compuestos oligoescuaramídicos cíclicos de la presente invención para formar policomplejos con plasmidos y oligonucleótidos y para actuar como agentes de transfección eficientes y poco tóxicos.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II) como agente de transfección no-viral. R
Figure imgf000004_0001
(l) (ii) donde:
Ri y R2, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino;
R3 y R4, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino; y
X es al menos un contraión y se puede seleccionar de entre dos aniones monovalentes (2X"), ¡guales o diferentes, y un anión divalente (X2").
En una realización preferida de los compuestos de fórmula (I), Ri y R2, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y aralquilo.
En una realización preferida de los compuestos de fórmula (II), Ri y R2, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y aralquilo; y/o R3 y R4, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y aralquilo. Más preferiblemente Ri y R2, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y aralquilo; y R3 y R4, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo alquilo (C-i-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino, y aralquilo.
En una realización más preferida de los compuestos de fórmula (I) o (II), Ri y/o R2 son un grupo alquilo (C1-C4), más preferiblemente Ri y/o R2 son un metilo.
En otra realización preferida de los compuestos de fórmula (I) o (II), Ri y R2 son un metilo. En otra realización preferida de los compuestos de fórmula (I) o (II), Ri o R2 son un grupo alquilo (Ci-C4) sustituido con un grupo amino terminal, más preferiblemente Ri o R2 son -(CH2)3-NHBoc, más preferiblemente Ri es metilo y R2 es -(CH2)3-NHBoc. En otra realización preferida de los compuestos de fórmula (I) o (II), Ri o R2 son aralquilo, más preferiblemente Ri o R2 son bencilo, aún más preferiblemente Ri es metilo y R2 es bencilo.
En otra realización preferida de los compuestos de fórmula (II), R3 y/o R4 son un grupo alquilo (Ci-C4), más preferiblemente R3 y/o R4 son un metilo, aún más preferiblemente R3 y R4 son metilo y en una realización aún más preferida Ri y/o R2 son un grupo alquilo (Ci-C4), más preferiblemente Ri y/o R2 son un metilo y aún más preferiblemente Ri y R2 son un metilo. En una realización más preferida de los compuestos de fórmula (II), R-i, R2, R3 y R4 son un metilo.
El estado de oxidación del compuesto de fórmula (II) con los dos grupos amino cuaternarios es de +2, por tanto, cuando el contraion (X) es monovalente se precisan de dos aniones para compensar la carga positiva (2X"), estos pueden ser ¡guales o diferentes, y cuando el contraion (X) es divalente se precisan de un anión para compensar la carga positiva (X2"). En una realización preferida el contraion es monovalente y es cualquier anión biológica o farmacéuticamente aceptable conocido por un experto en la materia. Ejemplos de aniones biológica o farmacéuticamente aceptables pueden ser Γ, CI", Br", F", CF3SO3", CIO4", PF6 " y BF4 ", acetato, malato, fumarato, citrato u oxalato, entre otros conocidos por un experto en la materia. Preferiblemente el contraión se selecciona de un halógeno y aún más preferiblemente se selecciona de y CI". En una realización más preferida del compuesto de fórmula (II), X es 21" o 2CI".
El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, ferc-butilo, sec-butilo, n-pentilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono y más preferiblemente se seleccionan entre metilo, etilo, n-propilo, y n-butilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por al menos un sustituyente amino, que a su vez puede opcionalmente sustituido, preferiblemente el grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido por un grupo amino terminal, el grupo amino puede ser una amina primaria (-NH2), secundaria (-NHR') o terciana (-NR'R"), donde R' y R" se seleccionan independientemente de entre un grupo alquilo (C-i-do), un aralquilo como se ha definido en la invención, o de un grupo protector, preferiblemente R' y R" se seleccionan independientemente de entre un grupo alquilo (Ci-C4), bencilo o Boc (í-butiloxicarbonilo).
Por "grupo protector" se refiere a un grupo que bloquea un grupo funcional orgánico y que puede eliminarse en condiciones controladas. Los grupos protectores, sus reactividades relativas y las condiciones en la que permanecen inertes son conocidas por el experto en la materia. Se pueden seleccionar, sin limitarse, los grupos protectores de nitrógeno a carbamatos de fórmula -(0=)C- O-R, donde R es un grupo arilo, un aralquilo, o un alquilo (C1-C-10), definidos en la invención, preferiblemente R es bencilo, -C(CH3)3 o -CH2CH3, y aún más preferiblemente el grupo protector es Boc; o un sulfonato de fórmula - (0=)S(=0)-R, donde R es un grupo arilo, un aralquilo, o un alquilo (C1-C-10), definidos en la invención, preferiblemente R es -CH3 o tosilato. Por "arilo" se refiere en la presente invención, a anillos aromáticos, sencillos o múltiples, que tienen entre 5 a 18 átomos de carbono en la parte del anillo, tales como pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo.
Por "heteroarilo" se refiere, en la presente invención, a anillos heterocíclicos aromáticos (mono- o bicíclicos) que tienen entre 5 y 10 miembros, entre ellos átomos de carbono y al menos entre 1 a 3 heteroátomos seleccionados de entre N, O y S. Preferiblemente el grupo heteroarilo tiene entre 5 y 6 miembros, por ejemplo piridina.
Por "aralquilo" se refiere a un grupo arilo unido a un grupo alquilo (C1 -C4), por ejemplo pero sin limitarse bencilo y fenetilo, preferiblemente es bencilo.
En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I) se seleccionan de entre:
Figure imgf000007_0001
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (II) se seleccionan de
Figure imgf000008_0001
4 5
Por "agente de transfección no-viral" se refiere, en la presente invención a todo vector que no tenga ningún componente vírico y que sea capaz de introducir una molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora y de mejorar la eficiencia de la transfección de los mismos.
Los agentes de transfección no viral presentan además otra serie de ventajas respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no provocan una respuesta inmune específica y como consecuencia, pueden ser administrados repetidamente.
Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un agente de transfección no-viral, a partir de ahora agente de transfección de la invención, que comprende al menos uno de los compuestos, de fórmula general (I) o (II), descritos anteriormente y al menos un ácido nucleico.
Un ácido nucleico o molécula de ácido nucleico comprende 2 o más bases de nucleótido unidas covalentemente, que puede ser de cadena sencilla o cadena doble, pudiendo incluir entre otras ADN, ARN, ARN de interferencia (silenciamiento), micro ARN, plásmidos de ADN, ADN viral, fragmentos de cromosomas, ácido nucleico señuelo, aptámeros o hbozimas. Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del agente de transfección no-viral de la invención, para la elaboración de un medicamento, preferiblemente utilizados en terapia génica. En la presente invención se entiende por terapia génica la introducción de cualquier tipo de material genético (por ejemplo DNA, RNA, RNAi, siRNA, miRNA) en el interior de una célula con un objetivo curativo. Se puede emplear terapia génica para obtener el efecto terapéutico deseado a través de distintas estrategias, dependiendo de la enfermedad objetivo. Se puede emplear terapia génica para aportar un gen ausente en el receptor, o bien para complementar o sustituir el defecto en la función de un gen defectuoso introduciendo una copia normal de éste en las células. También es posible emplear terapia génica para obtener el efecto contrario, es decir, inhibir o bloquear el funcionamiento de genes cuya intervención contribuye al desarrollo de la enfermedad. Alternativamente, se puede emplear terapia génica no para sustituir o inactivar la función de un gen, sino para introducir la información que permita a la célula sintetizar una proteína con el efecto terapéutico deseado.
La terapia génica es útil para el tratamiento o la prevención de un gran número de enfermedades, conocidas por un experto en la materia, como por ejemplo pero sin limitarse a la deficiencia en adenosíndeaminasa (ADA), el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), infección por VIH, enfermedades neurodegenerativas o cáncer. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el agente de transfección no-viral de la invención, y opcionalmente al menos un aditivo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo. Por aditivo se entiende a cualquier sustancia farmacéuticamente aceptable y no activa conocidas por cualquier experto en la materia y se pueden incluir agentes aromatizantes, colorantes, antioxidantes o edulcorantes y similares, que pueden ser usados solos o en una combinación adecuada de los mismos. Ejemplos, no limitantes, son lactosa, dextrina, sacarosa, manitol, almidón de maíz, sorbitol, celulosa microcristalina y polivinilpirrolidona.
Los agentes de transfeccion no-viral de la presente invención se pueden utilizar también para la preparación de compuestos útiles para la realización de pruebas diagnósticas mediante imagen médica, en diversas patologías.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso del agente de transfeccion no-viral para la elaboración de sondas para el diagnóstico de enfermedades mediante técnicas de imagen.
La preparación de un medio de contraste o sonda de imagen puede comprender dicho agente de transfeccion no-viral y un compuesto de mareaje conocido por cualquier experto en la materia, y que podría ser, sin limitarse a compuesto de mareaje radiológico, fluorescente, entre otros, que puede ser utilizado para la observación y diagnóstico mediante las técnicas de detección habitualmente utilizadas en clínica. Ejemplos no limitantes de dichos compuestos de mareaje son gadolinio o yodo, aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia.
Otro aspecto más de la invención se refiere al compuesto 1 de fórmula
Figure imgf000010_0001
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Representa imágenes de microscopía confocal de fluorescencia donde se observa la presencia de células fluorescentes como resultado de la transfección del plásmido pmax-GFP (pGFP) con los compuestos 1 , 2, 3 y 5 y Lipofectam ina2000®.
FIG. 2 Representa un Western blot obtenido a partir de extractos de células NIH3T3 y LN229 tratadas con Lipofectamina 2000® (lipo) y C2 como agentes de transfección y siRNAs específicos para silenciar la expresión de las proteínas RhoE y FOX01 , respectivamente.
FIG. 3 Muestra el tanto por ciento de viabilidad celular para células U87MG y LN 229 después de la transfección del plásmido pmaxGFP con el reactivo comercial Lipofectamina 2000® y el compuesto 2 (C2). La viabilidad celular se compara frente a células control solo tratadas con el plásmido.
FIG. 4 Muestra la dosis respuesta. Células COS7 y U87MG transfectadas con el pmaxGFP utilizando diferentes concentraciones del compuesto 2 (C2). La eficiencia de transfección se compara con los resultados obtenidos con el reactivo comercial lipofectamina 2000® según las indicaciones del comerciante (Life Technologies).
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Síntesis del compuesto 1
A continuación se muestra el es uema sintético del compuesto 1 :
Figure imgf000012_0001
donde r.t. significa temperatura ambiente.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 2,75 mmol de la diescuaramida diester(A) en 50 mi de etanol (EtOH). Mediante un embudo de adición, y en atmósfera de argón, se añade gota a gota, muy lentamente, una disolución de 2,75 mmol de N-N'-Bis-(2-aminopropil)]-bencilamina(B), disuelta en 50 mi de etanol. Transcurrida la adición, dejamos en agitación durante 12 h. Pasado ese tiempo aparece un precipitado blanco, el cual se aisla mediante decantación. Se lava con etanol (3 x 10 mi) y se seca. Seguidamente se disuelve el producto con agua a pH 2, y se va añadiendo NaOH 0, 1 N, gota a gota, hasta pH 10. El precipitado formado se centrifuga y se lava con agua (2 x 10 mi) y acetona (10 mi) obteniendo la oligoescuaramida cíclica 1 . Rendimiento: 66,00%. P. f.: 216- 218°C. RMN-1 H (DMSO-d6) δ: 7,77 (bb, 4H, COCNHCH2); 7,54-7,44 (bb, 5H, Ar); 3,53 (bb, 8H, COCNHCH2CH2); 3,50 (bb, 2H, NCH2Ar); 3,21 (bb, 8H, CH2CH2N); 2,89 (s, 3H, NCH3); 2,07 (bb, 8H, COCNHCH2CH2CH2N) ppm. RMN-13C (DMSO-d6) δ: 27,24; 44,34; 52,85; 56, 13; 60,26; 130,75; 131 ,89; 132,81 ; 133,53; 169,72; 179,84 ppm. EM (MALDI-TOF): m/z(%) calculada para C28H38N604/H+: 522,3027; encontrada: 523,3004. El compuesto A (diéster N,N-bis((2-etoxi-3,4-dioxo-1 - ciclobutenil)aminopropil)metilamina) se preparó siguiendo la metodología descrita en Rotger, M. C, et al., J. Org. Chem.2004, 69, 2302-2308. El compuesto B ([N-N'-Bis-(2-aminopropil)]-bencilamina) se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en Bergeron, R. J., et al., Synthesis, 1981 , 9, 732-733 y Bergeron, R. J., Garlich, J. R., Synthesis. 1984, 9, 782-784.
Síntesis del compuesto 2 (C2)
Figure imgf000013_0001
El compuesto 2 (C2) se prepara según lo descrito en M. C. Rotger, et al. J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308. A una disolución del compuesto A (0,21 g, 0,53 mmol) en etanol (20 mL) se adiciona gota a gota una disolución de 3,3'-diamino-N-metildipropil)-metilamina (0,08 g, 0,53 mmol) en etanol (5 mL). La mezcla de reacción se deja agitando durante 7 horas a temperatura ambiente. Entonces el precipitado de color amanllo pálido se decanta mediante centrifugación y se lava con etanol (1 x 10 mL), acetona (2 x 10 mL), y seca para obtener el compuesto como un sólido de color amarillo pálido (0.19 g, 80% de rendimiento).
Mp > 320 °C con descomposición; 1H NMR (300 MHz,DMSO-cí6): δ = 8.0-7.2 (br s, 4H, NH), 3.60 (br s, 8H, CH2), 2,43 (t, J = 7.1 Hz, 8H, CH2), 2.22 (s, 6H, CH3), 1 .74 (t, J = 6.2 Hz, 8H, CH2); 13C NMR (300MHz, D20/DCI): δ = 184.3, 170.9, 56.3, 41 .8, 27.9; IR (KB Br): 3172, 2956, 1797, 1638, 1574 cm"1; MS (FAB+, matrix NOBA) m/z (%): 447 (MH+, 50); análisis elemental caled (%) de C22H34N6O4: C 59.17, H 7.67; 18,82; encontrado: C 57.81 , H 7.57, N 18.22.
Síntesis del compuesto 3
Figure imgf000014_0001
3
La síntesis del compuesto 3 se describe en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
El diéster A (1 ,8 g, 4,58 mmol) se calienta en EtOH a 50°C hasta su completa disolución. Sobre esta se añade gota a gota una disolución de la triamina monoprotegida terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato (1 ,32 g, 4,58 mmol) disuelta en EtOH (20 mi). La mezcla se agita durante 16 horas a temperatura ambiente y en atmósfera de argón. El precipitado formado se filtra y se lava con EtOH (4x10 mi) y dietileter (2x10 mi) obteniendo un sólido amarillo. Éste se lava con acetona a reflujo (3x20 mi) y se seca a vacío obteniendo un sólido amarillo pálido (1 ,82 g, 3,09 mmol). Rdto: 67% 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1 ,37 (s, 9H, C(CH3)3), 1 ,47 (br, 2H, CH2CH2NHBoc), 1 ,64 (br, 8H, CH2CH2CH2), 2, 1 1 (s, 3H, NCH3), 2,33 (br, 10H, NCH2), 2,91 (br, 2H, CH2NHBoc), 3,50 (br, 8H, CH2NH(Sq)), 6,75 (br, 1 H, NHBoc), 7,40 (br, 4H, NH(Sq)). 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ = 26,7, 28,0, 28,2, 38,0, 41 ,7, 50,4, 54,2, 77,3, 155,6, 167,8, 182,3. HRMS (ESI) cale, para 612,3486 (M+Na+;
Figure imgf000014_0002
encontrado: 612,3480.
Síntesis de terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato. La síntesis del terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato se realiza siguiendo los métodos descritos en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546. Síntesis del compuesto 4
Figure imgf000015_0001
La síntesis del compuesto 4 se describe en Prohens, R., et al., Chem. Commun., 2001 , 1456-1457, mediante la adición de 7,8 equivalentes (5,6 mmol) de ioduro de metilo a una suspensión de 2 (320 mg, 0,72 mmmol) en DMF (70 mL). La disolución se mantiene a 70 °C durante 12 horas. Finalmente se obtienen un precipitado que se decanta por centrifugación, se lava con acetona (5 x 10 mL), obteniéndose 416 mg de 4 como un sólido amarillo. Rendimiento 80 %. Mp: descompone >250 °C, 1H RMN (300 MHz, D20): δ = 3,71 (t, 8H, J = 5.7 HZ), 3.58 (m, 8H), 3,15 (s, 12H), 2,12 (s, 8H,) ppm. 13C RMN (75 MHz, D20): δ = 27,1 , 43,7, 53,9, 64,3, 171 ,3, 184,6. IR (KBr): 3453, 3179,2949,1797, 1653,1581 , cm"1. Análisis elemental calculado para C24N6O4H 0 l2 : C 39,47; H 5,52; N: 11 , 51 Experimental: C 39,20; H 5,56; N: 11 , 34
Síntesis del compuesto 5
Figure imgf000016_0001
5
La síntesis del compuesto 5 se describe en A. Sampedro, et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
El compuesto 4 (204 mg, 0,28 mmol) se disuelve en H20 (15 mi) y la solución se filtra para eliminar restos insolubles. Se añade una disolución acuosa de NH4PF6 (0,4 mi, 1 ,2M) obteniendo un precipitado amarillo que se filtra y lava con H20 (5 mi). El precipitado se suspende en agua destilada (10 mi) y se añade una resina de intercambio iónico en su forma cloruro (Amberlite® IRA- 400, 0,5 g). La mezcla se agita suavemente durante 24 horas, se filtra y la disolución acuosa se liofiliza para obtener el producto 5 como un sólido blanco (120 mg, 0,22 mmol). Rdto: 78%
ENSAYOS BIOLOGICOS
Evaluación de la capacidad de los compuestos 1 a 5 de la invención como agentes de transfección no-viral
Se evaluó la capacidad de actuar como agentes de transfección no-viral de los compuestos de la invención. Para ello se realizaron ensayos de transfección en cultivos celulares (U87MG) utilizando como modelo de ADN el plásmido pmax- GFP (Lonza) o el pGL3-control vector de Promega (p). El plásmido pmax-GFP una vez en el interior celular se transcribe y traduce dando lugar a la proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein) lo que permite cuantificar de forma directa la eficacia del proceso combinado de transporte y transcripción del ADN. Con fines comparativos y a modo de control se ha utilizado Lipofectamina2000® (Life Technologies) en ensayos paralelos a los realizados con los compuestos 1 a 5, utilizando 2 μΙ_ de reactivo Lipofectamina2000® (Life Technologies) y siguiendo las especificaciones del comerciante. La Lipofectamina se incubó con ^g de plásmido (pmaxGFP, Lonza) en 200 μί de medio Opti-MEM® (Life Technologies) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente la disolución se mezcla en un pocilio de una placa (12 pocilios) con una suspensión de 1 mL de cultivo celular a una concentración de 60.000 células/pocilio. La Lipofectamina 2000® es un reactivo comercial ampliamente utilizado para realizar este tipo de estudios, según las instrucciones del fabricante debe utilizarse a dosis de entre 2 y 5 μΙ de la disolución, encontrando que para esta aplicación la dosis más adecuada fue de 2μΙ de Lipofectamina 2000®. La eficacia de la transfeccion se determinó por microscopía confocal de fluorescencia tomando imágenes de los cultivos después de 48h del tratamiento con los vectores de transfeccion. Se trataron células U87MG con una concentración 10 μΜ de cada compuesto 1 a 5 o con 2μΙ de Lipofectamina 2000® y 1 g de pmax-GFP durante 48 h a 37 °C y bajo aire humificado que contiene 5% CO2. Después del periodo de incubación se evalúa el grado de transfeccion mediante microscopía confocal y citometria de flujo para el pmaxGFP . Se observó que para los compuestos 1 a 5 se han obtenido niveles de transfeccion similares o superiores a los obtenidos utilizando la Lipofectamina2000® y como control se utilizó el plásmido pmaxGFP sin vector de transfeccion (Figura 1 ). En la figura 1 se muestran las imágenes con los compuestos 1 a 3 y 5, para el compuesto 4 se obtuvo un resultado similar al compuesto 5.
De entre los compuestos con mayor eficiencia de transfeccion se eligió el compuesto 2 (C2) para los siguientes ensayos como agente de transfeccion no- viral. Optimización de la dosis-respuesta del método de transfeccion.
1 g de plásmido pmaxGFP se mezcló con diferentes cantidades de una disolución 10 mM del compuesto o agente de transfeccion no-viral 2 (C2) en 200μΙ_ de medio Opti-MEM® (Life Technologies) para obtener concentraciones finales de C2 en el medio de transfección, cuando el volumen total sea 1200 μί, comprendidas entre 5-30μΜ. Las mezclas se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente para inducir la formación del complejo. Transcurrido dicho tiempo las distintas disoluciones se mezclan en diferentes pocilios de una placa (12 pocilios) con una suspensión de 1 mL de cultivo celular a una concentración aproximada de 60.000 células/pocilio. La eficacia de transfección se midió a partir de las imágenes tomadas por microscopía confocal de fluorescencia después de incubar los cultivos durante 48 (Leica Microsystem, Wetzlar, Germany).
Se comprobó que la mejor relación dosis respuesta para la transfección se alcanza al tratar los cultivos celulares U87MG y COS7 a una concentración de 10 μΜ de C2 y 1 μg de plásmido pmaxGFP durante 48 h (Fig. 4). Esta dosis implica, una relación N/P (Nitrógeno/Fosfato) aproximadamente de 2, inferior a las establecidas en otros reactivos de transfección.
Método de transfección en cultivo celular
^g de plásmido pmaxGFP (Lonza) o del pGL3-control vector, Promega (p) se mezcla con 1 ,2 μΙ de una disolución 10 mM de cualquiera de los compuestos 1 a 5 de la invención, utilizados como agentes de transfección no-viral, en 200μί de medio Opti-MEM®-(Life Technologies). Se lleva a cabo el mismo protocolo que se describe en el ejemplo "Evaluación de la capacidad de los compuestos 1 a 5 de la invención como agentes de transfección no-viral", con la peculiaridad de que después del periodo de incubación se evalúa el grado de transfección mediante microscopía confocal y citometria de flujo para el pmaxGFP; y se mide los niveles de luminiscencia utilizando el kit (Promega, Madison, Wl) para el pGL3-control vector, Promega (p). Detección de la expresión de RhoE y FOX01 en cultivos celulares transfectados con el correspondiente siRNA
Para evaluar la capacidad del agente de transfección no-viral C2 de la invención para transfectar siRNA, utilizamos a modo de modelo los siguientes: siRNA-RhoE (ratón) (Dharmacom) y s¡RNA-Fox01 (humano) (Dharmacom). En 500μΙ de medio Opti-MEM®, se mezclaron tanto 50nM siRNA con la cantidad necesaria del agente de transfeccion no-viral 2 (C2) para obtener una concentración final de 10μΜ de C2 o 50nM siRNA con 2μΙ Lipofectamina 2000®. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de incubación la mezcla de transfeccion se adicionó a un pocilio de una placa a la que se añadió el correspondiente cultivo celular en una concentración aproximada de 100.000 célula/pocilio. Para este procedimiento se utilizaron placas de 6 pocilios. Los cultivos se incubaron durante 48 horas. Cómo control (C) se utilizó el mismo número de células por pocilio incubadas durante 48 h solo con los siRNA, sin usar C2. Se lisaron con un tampón que contiene inhibidores de proteasas. El contenido proteínico se midió mediante el método de Bradford. El lisado celular se separa mediante electroforesis en gel de 10% SDS-poliacrilamida durante 90 minutos a 120V. Después las proteínas fueron transferidas a una membrana PDVF (Millipore, Billerica, MA) durante 2 horas a 60V. Las membranas se incubaron con un tampón de bloqueo que contenía TBS (20mM This-HCL ph 7,5, 150mM NaCI), 0,02% Tween 20 y 5% leche desnatada deshidratada durante 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente se incubaron con los siguientes anticuerpos: RhoE (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000), Foxol (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, 1/1000) y beta-tubulina (T0198, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1/4.000), a 4°C durante 12 h. Después las membranas se lavaron en TBS 0,02% Tween 20 y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (Dako, Glostrup, Denmark, 1/2000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente la reacción de la peroxidasa se detectó mediante el sistema de detección quimioluminiscente (Millipore, Billerica, MA).
Se comprobó que el C2 transfecta de forma efectiva siRNAs (pequeños ARNs de interferencia) al observar el silenciamiento de la expresión de proteínas como FOX01 y RhoE (FIG. 2). En la figura se muestran los western blots obtenidos donde se aprecia la disminución en los niveles de expresión de las proteínas silenciadas. La efectividad del ensayo realizado con C2 resulta del mismo nivel o superior que los resultados obtenidos al utilizar Lipofectamina2000® como agente de transfección. Viabilidad Celular
Se determinó la toxicidad del agente de transfección no-viral C2 de la invención en células transfectadas y se comprobó que es mucho menor que la que presenta la Lipofectamina2000®. La viabilidad celular se midió 48 h después del tratamiento con Lipofectamina2000® o con el compuesto C2 y pmax-GFP, utilizando las condiciones determinadas como óptimas para la transfección (^g plásmido y 10 μΜ de C2 o 2 μί de Lipofectamina 2000®, siguiendo las indicaciones del fabricante para este reactivo) en dos líneas celulares de glioma humano: U87MG y LN229. Las cantidades especificadas de C2 y Lipofectamina 2000® se incubaron en 200μί de Opti-MEM® durante 30 minutos a temperatura ambiente con ^g del plásmido pmaxGFP (Lonza). Después se transfirieron a los respectivos pocilios (placa de 12 pocilios) a los que se añadió 1 mL de una suspensión de cultivo celular a una concentración aproximada de 60.000 células/pocilio. Las placas se incubaron durante 48 h y finalizado este periodo se determinó la viabilidad celular. Para ello, las células se tripsinizaron e incubaron en 25 μΜ de medio de cultivo con 25μΜ del reactivo CelITiter- Glo (Promega). La luminiscencia generada se midió utilizando un lector de places Synergy Mx microplate reader (Biotek, Winooski, VT). Las lecturas se realizaron por triplicado. Los resultados se recogen en la Tabla 1 y FIG. 3.
Tabla 1 . Porcentaje de células viables transfectadas
Línea Celular Lipofectamina200 C2
0®
U87MG 25% 85%
LN229 65% 90% Además, se comprobó que C2 transfecta ácido nucleico, por ejemplo plásmidos o siRNA, en diferentes tipos de líneas celulares correspondientes a tejidos sólidos como son: U87MG, NIH3T3, LN229, COS7 y U20S, así como células primarias de glioma humano.
Se obtuvieron también niveles de transfección muy adecuados con otros plásmidos, como por ejemplo, el pGL3 (Luciferase repórter vector) registrando niveles de transfección 10 veces más altos al utilizar C2 como agente de transfección no-viral que con la Lipofectamina2000®.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II)
Figure imgf000022_0001
(i) (II) donde: Ri y R2, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (d-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino,;
R3 y R4, son ¡guales o diferentes y se seleccionan de la lista que comprende un grupo arilo, aralquilo, heteroarilo y alquilo (C-i-do), opcionalmente sustituido por un grupo amino; y
X es al menos un contraión,
como agente de transfección no-viral.
2. Uso según la reivindicación 1 , donde Ri y/o R2 son un grupo alquilo (Ci-C4) o aralquilo.
3. Uso según la reivindicación 2, donde Ri y/o R2 son un metilo,
4. Uso según la reivindicación 3, donde Ri y R2 son un metilo.
5. Uso según la reivindicación 2, donde Ri o R2 son un grupo alquilo (Ci-C4) sustituido con un grupo amino terminal.
6. Uso según la reivindicación 5, donde Ri o R2 son -(CH2)3-NHBoc.
7. Uso según cualquiera de las reivindicacionesl a 3, donde Ri o R2 son un aralquilo.
8. Uso según la reivindicación 7, donde Ri o R2 son un bencilo.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ri es metilo y R2 es -(CH2)3-NHBoc.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ri es metilo y R2 es un bencilo.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y/o R4 son un grupo alquilo (Ci-C4).
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y/o R4 son un metilo.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 y R4 son metilo.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el contraión se selecciona de entre dos aniones monovalentes, ¡guales o diferentes, o un anión divalente.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el contraión se selecciona de un halógeno.
16. Uso según la reivindicación 15, donde el contraión X es 2 o 2CI".
17. Uso según la reivindicación 1 donde los compuestos de fórmula (I) se seleccionan de entre:
Figure imgf000024_0001
18. Uso según la reivindicación 1 donde los compuestos de fórmula (II) seleccionan de entre:
Figure imgf000024_0002
19. Agente de transfeccion no-viral que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) o (II), según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y al menos un ácido nucleico.
20. Agente de transfeccion según la reivindicación anterior, donde el ácido nucleico es de cadena sencilla o de cadena doble y preferiblemente se selecciona de entre ADN, ARN, ARN de interferencia (silenciamiento), micro ARN, plásmidos de ADN, ADN viral, fragmentos de cromosomas, ácido nucleico señuelo, aptámeros o ribozimas.
21. Composición farmacéutica que comprende al menos un agente de transfeccion no-viral según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20.
22. Uso del agente de transfeccion no-viral según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboración de un medicamento.
23. Uso del agente de transfección no-viral según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboración de un medicamento para terapia génica.
24. Uso del agente de transfección no-viral según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de deficiencia en adenosíndeaminasa (ADA), el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), infección por VIH, enfermedades neurodegenerativas o cáncer.
25. Uso del agente de transfección no viral según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, para la elaboración de sondas para el diagnóstico de enfermedades mediante técnicas de imagen.
26. Compuesto de fórmula:
Figure imgf000025_0001
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2340979A1 (es) * 2008-12-10 2010-06-11 Universitat De Les Illes Balears Uso de compuestos cicloescuaramidicos como agentes antitumorales.
WO2011034051A1 (ja) * 2009-09-15 2011-03-24 参天製薬株式会社 新規環状スクアリン酸アミド誘導体
ES2525079A1 (es) * 2013-05-16 2014-12-17 Universitat De Les Illes Balears Actividad antiparasitaria de escuaramidas

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