WO2014184416A1 - Actividad antiparasitaria de escuaramidas - Google Patents
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- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
- A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
- A61K31/24—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group having an amino or nitro group
- A61K31/245—Amino benzoic acid types, e.g. procaine, novocaine
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C221/00—Preparation of compounds containing amino groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
- C07C2601/04—Systems containing only non-condensed rings with a four-membered ring
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Definitions
- the present invention relates to the synthesis and use of squamide-based compounds for the treatment of diseases of parasitic origin such as American trypanosomiasis also known as Chagas disease or Leishmaniasis.
- STATE OF THE TECHNIQUE Forgotten diseases are diseases that affect thousands of people worldwide, but do not have effective or adequate treatments. They are mostly infectious tropical diseases that fundamentally affect the poorest population, such as Leishmaniasis and Chagas disease, which have a devastating impact on civilization. These infectious diseases are caused by protozoan parasites that especially affect less developed countries, representing a serious public health problem in the world. It is estimated that almost 50% of the world's population is exposed to this risk of contracting these infections, and that approximately 500 million people suffer from pathologies related to this type of disease every year.
- Chagas disease is caused by the hemo-flagellated protozoan Trypanosoma cruzi that is transmitted naturally through the injections of a hematophagous triatomine bug (Hemipterareduviidae). Other routes of transmission are by transfusion of infected blood, organ transplantation and even from mothers to children through pregnancy and lactation, or orally through contaminated food.
- Hemipterareduviidae hematophagous triatomine bug
- the acute phase in which the parasite actively multiplies within the host cells and high levels of blood parasitemia are detected
- the chronic phase which develop 30% of the infected, in which the level of parasitemia is reduced to subpatent blood levels but the parasites form pseudocysts in different organs such as heart, esophagus and colon, causing heart disease, digestive megasyndromes.
- nifurtimox nitrofuran
- benznidazole nitroimidazole derivative
- Leishmaniasis caused by the infection of different protozoan species of the genus Leishmania is a cosmopolitan disease. Around 20 million people suffer from this disease, which is transmitted through the bite of Diptera of the genus Phiebotomus or Lutzomyia. Leishmaniasis can occur in different clinical manifestations: visceral, cutaneous or mucocutaneous, with visceral being the most severe form of the disease.
- leishmaniasis The treatment of leishmaniasis is complicated and in addition, this disease has a substantial morbidity, so expedited therapies are often required.
- pentavalent derivatives of antimony have been used for more than 70 years, such as: Sodium stibogluconate (Pentostan) or Antimoniate Meglumine (Glucantime).
- Other medications used are: Amphotericin B (AmBiosome®) which is administered for a maximum of 10 days and does not present toxicity but is extremely expensive ($ 1,500 to $ 2,400 per treatment); the miltefosina that of oral administration but the treatment lasts 4 weeks and has restrictions of use for pregnant women and children; Pentamidine and Ketoconazole.
- Squaramide-based compounds are provided in the present invention as antiparasitic agents, in particular for the treatment of leishmaniasis and Chagas disease.
- a first aspect of the present invention relates to the use of a compound of general formula (I):
- Ri is selected from -NR to R b or -OR c , where:
- R a is selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ); preferably hydrogen or alkyl (CrC 3 ); more preferably hydrogen or methyl.
- R b is selected from the list comprising aryl, optionally substituted, preferably phenyl, - (CH 2 ) x-NR 1 ' R 1 " or - (CH 2 ) x-C0 2 Ri “' ; x has a value of 0 to 5 and R, R ' and R / " are independently selected from hydrogen and alkyl (CC 5 );
- R c is selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ); preferably between hydrogen or alkyl (CrC 3 ); more preferably it is hydrogen;
- R 2 is selected from the list comprising aryl, optionally substituted; heterocycle, optionally substituted; aralkyl (CrC 5 ), optionally substituted; (C 1 -C 20 ) alkyl, preferably (C 4 -C 15 ) alkyl; - (CH 2 ) X -NR 2 ' R 2 " ; or - (CH 2 ) and -R 4 , where x has a value from 0 to 5, and has a value of 0 to 5 and R 2 ' and R 2 " are independently selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 );
- R 3 is selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ); preferably hydrogen or alkyl (CrC 3 ); more preferably hydrogen and methyl; even more preferably hydrogen;
- R 4 is the group of formula (II):
- X is selected from the list comprising -NR 4 ' -, -CH- and aryl, optionally substituted;
- R 4 ' is selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ); and
- RR 3 ey have been defined above;
- R b is the group - (CH 2 ) x-NR 1 ' R 1 " :
- x may have the values 1, 2 or 3, more preferably 2 or 3, and R and R / ' are independently selected from an alkyl group (CrC 4 ); more preferably methyl or butyl; or
- R and R / ' are independently selected from hydrogen or alkyl (CrC 3 ), more preferably R and R / ' are hydrogen, and in this case R b is - NH 2 .
- R b is the group - (CH 2 ) x -C0 2 Ri "' ;
- R / " is preferably hydrogen, methyl or ethyl and more preferably hydrogen and x has the value of 1, 2 or 3.
- alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 20 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / -propyl, n-butyl, ferc- butyl, sec-butyl, n-pentyl.
- group alkyl has between 1 and 5, and more preferably between 1 and 3, carbon atoms or between 4 and 15 carbon atoms.
- the alkyl groups may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxyl, azide, aryl carboxylic acid, hydroxyl, amino, amido, ester, carboxylic, ether, thiol, acylamino or carboxamide, which in turn may optionally be substituted. .
- substituents such as halogen, hydroxyl, azide, aryl carboxylic acid, hydroxyl, amino, amido, ester, carboxylic, ether, thiol, acylamino or carboxamide, which in turn may optionally be substituted.
- the alkyl group is not substituted.
- aryl refers in the present invention to an aromatic carbocyclic chain, having from 6 to 18 carbon atoms, being able to be single or multiple ring, in the latter case with separate and / or condensed rings.
- a non-limiting example of aryl is a phenyl, naphthyl, indenyl group, etc ...
- the aryl group may be optionally substituted by at least one group selected from a hydroxyl, ester, carboxyl, alkyl or group - (CH 2 ) X -NR ' R " , where x has a value of 0 to 5 and R ' and R " are independently selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ).
- the aryl group is a phenyl, wherein the phenyl group may contain 1 or more substituents as described above and is preferably substituted by an ester, hydroxyl, -NH 2 , -CH 2 -NH 2 , or -N ( CH 3 ) 2 .
- aralkyl refers, in the present invention, to an aliphatic chain of between 1 and 5 carbon atoms in which at least one of the hydrogens has been replaced by an aryl group, with the above meanings.
- aryl group As for example, but not limited to a benzylophenethyl group.
- These aralkyl groups may, in turn, be optionally substituted by an alkyl, hydroxy, nitro, amino or halogen group.
- it is an optionally substituted benzyl group, and more preferably it is an unsubstituted benzyl group.
- heterocycle refers, in the present invention, to a carbocyclic chain radical and consisting of carbon atoms, between 3 and 6, more preferably 5 or 6, where at least one carbon atom is substituted by a heteroatom. selected from the group consisting of nitrogen, oxygen or sulfur.
- This carbocyclic chain may be unsaturated, saturated or partially saturated.
- Preferably it is saturated. It may be optionally substituted by 1 or more substituents of the group consisting of alkyl, hydroxy, nitro, amino, halogen, aryl or aralkyl. Preferably it is a piperidine group, and more preferably substituted by a benzyl group, and even more preferably in position 1.
- R 2 is - (CH 2 ) and -R 4 and the compound is of formula (III):
- X is an aryl group, it is preferably a phenyl group, optionally substituted, more preferably unsubstituted, and even more preferably and is 1, 2 or 3, more preferably and is 1.
- R 4 ' is preferably selected from hydrogen or an alkyl (CC 3 ), preferably methyl or ethyl, more preferably it is methyl. In an even more preferred embodiment and is 2, 3 or 4, even more preferably and is 3.
- R 3 is hydrogen in the compound of formula (III).
- R is -NR to R b
- R a is methyl
- R b is the group - (CH 2 ) X -NR 1 ' R 1 " , where R / and R / ' are methyl and x is 2 or 3.
- the compounds, of general formula (I) and of general formula (I II) may be in the form of halogen salts, such as, but not limited to iodides, chlorides or fluorides, preferably the salts are iodide.
- parasites in the present invention an infectious disease caused by protozoa, vermes (cestodes, trematodes, nematodes) or arthropods.
- the parasites are protozoa, therefore, it can be said that the compounds are antiprotozoal.
- the parasites belong to the family Trypanosomatidae, more preferably the parasites are of the genus Trypanosoma or Leishimania.
- Species thereof may be, but are not limited to, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropic or Leishmania chagasi, among others, known to a person skilled in the art.
- leishmaniosis is a disease caused by a protozoan of the genus Leishmania and transmitted, mainly by sandfly mosquitoes or jejenes. This disease occurs in humans and vertebrate animals, such as sermarsupials, canids, rodents and primates.
- trypanosomiasis are diseases produced in humans or vertebrate animals that are caused by protozoan parasites of the genus Trypanosoma, among them you can find African human trypanosomiasis, also known as sleeping sickness, American trypanosomiasis or Chagas disease or trypanosomiasis in Animals or Nagana
- the compounds described in the present invention are used for the treatment and / or prevention of leishmaniasis or Chagas disease.
- a second aspect of the present invention is a compound of the general formula
- Ri is a group -NR a R b , where:
- R a is a CrC 3 alkyl; preferably R a is a methyl and
- R b is the group - (CH 2 ) x-NR 1 ' R 1 " , where x has a value of 0 to 5 and R and R / ' are independently selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 );
- R 2 is selected from a (C 1 -C 20 ) alkyl group, preferably (C 4 -C 12 ) alkyl, or a group - (CH 2 ) x-NR 2 ' R2 " ; x has a value of 0 to 5 , preferably 1 to 5, more preferably 2, 3, or 4, more preferably 3, and R 2 ' and R 2 " are independently selected from hydrogen and alkyl (CrC 5 ), preferably between hydrogen and alkyl (CrC 3 ), more preferably methyl; Y
- R 3 is selected from hydrogen or an alkyl (CrC 5 ), preferably hydrogen or alkyl (CrC 3 ); more preferably hydrogen or methyl;
- R b is the group - (CH 2 ) X -NR / R / ' , x has a value of 1 to 5 and R / and Ri " one (C1-C3) alkyl is independently selected, plus preferably R b is the group - (CH 2 ) X -NR / R / ' , x has a value of 1 to 5 and R / and R / ' are methyl, even more preferably x is 2, 3 or 4, and still more preferably x is 3.
- R b is the group - (CH 2 ) X -NR / R / ' , x is 0 and R / and R / ' an (C1-C3) alkyl is independently selected , more preferably R / and R / ' are hydrogen.
- the compound of formula (IV) is selected from the list:
- a third aspect of the present invention relates to a process for obtaining the compounds of formula (IV) comprising the step of:
- Et is ethyl and R a , R b , R 2 and 3 have been described above for the compound of general formula (IV).
- Said reaction preferably takes place at room temperature and between 9 and 20 hours.
- a subsequent filtration step can be carried out, previously with or without evaporation of the solvent, and / or subsequent drying of the compound of formula (IV) obtained.
- the process of the present invention may have a previous step of obtaining the compound of general formula (V) comprising:
- a fourth aspect of the present invention relates to the compounds that are selected from the list:
- a fifth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula (IV) or to the compounds described in the fourth aspect of the invention, together with at least one pharmaceutically acceptable carrier, optionally this composition may include another active ingredient, for example another antiparasitic compound.
- a sixth aspect of the present invention relates to the use of the compounds of general formula (IV) or to the compounds described in the fourth aspect of the invention, for the preparation of a medicament.
- Fig. 1 Represents the evolution of blood parasitemia levels over time in infected and untreated (control) mice and mice infected and treated with compounds 2, 7, 8 and 22.
- Fig. 2. Results in vivo after immunosuppression for untreated (control) mice treated with 40 mg / kg of compound 2.
- A Reactivation of blood parasitemia after immunosuppression cycles.
- B Differences in IgG levels measured by ELISA assays in control (non-IS) and immunosuppressed (IS) mice
- C PCR amplification after purification of the total DNA from the hearts of the mice.
- reaction product remains in solution, the solvent is evaporated and the solid obtained is washed with n-pentane (3 x 10 mL) or purified by column chromatography (Si0 4, AcOEt / 1% EtOH).
- compound 2 was prepared from ethyl squarate (0.50 g, 2.94 mmol) and N 1 , N 1 , N 3 -trimethylpropane-1,3-diamine (0.33 g, 2, 65 mmol), mixed and stirred at room temperature for 2 h. Then n-butylamine (0.23 g, 3.2 mmol) is added and heated under stirring at 80 e C for 2 h. The crude is purified by column chromatography (Al 2 0 3 , CH 2 CI 2 /5% EtOH) to obtain 2 as a white solid. 96% yield.
- 5 has been prepared as indicated in the general method from 1 (0.38 g, 1.94 mmol) in diethyl ether (5 ml_) and N-methylhydrazine (0.08 g, 1.76 mmol) in ethanol ( 15 ml_). 5 (0.21 g, 0.05 mmol) is obtained as a reddish solid. 60% yield.
- Squaramide 10 (0.5 g, 1.2 mmol) is suspended in a mixture of 20 mL of anhydrous acetone and 10 mL of anhydrous DMF together with methyl iodide (0.5 g, 3.6 mmol). The mixture is allowed to reflux for 12 h. When the mixture is heated, the reagents dissolve. As the reaction proceeds a precipitate forms. After the reaction time, the precipitate is filtered and washed with acetone (5 x 10 mL), yielding 13 (0.49 g, 0.9 mmol) as a light yellow solid. Yield 90%.
- ethyl-4-aminobenzoate (41 mg, 0.25 mmol) is mixed with squaric acid (57 mg, 0.5 mmol) and 5 mL of water. The mixture is allowed to reflux for 3 h. Trnascurrido this time, the reaction mixture is diluted with 20 mL of NaHC0 3 5%. four extractions with 20 mL of diethyl each ether are made. the aqueous phase was acidified with HCl 3N (10 mL), and they make ten extractions with diethyl ether. The organic phase is dried with anhydrous Na 2 S0 4 and concentrated.The product is obtained as a yellow solid (48 mg, 73% yield).
- MTL single phase culture medium Medium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Perez et al., 1986
- SBF-I inactivated fetal bovine serum against complement
- the inoculum of parasites to start the culture was 5 x 10 4 cells / ml in 5 ml of medium in 25 cm 2 Falcon® plastic bottles, and kept in an oven at 28 e C. (González P, Mar ⁇ n C, et al., Int J AntimicroAgents 2005; 25: 136-141). The cultures were performed routinely, and the medium was renewed every two days, achieving the exponential growth of the flagellate until the necessary cell mass was obtained for subsequent studies.
- J774.2 macrophages were recloned from J774.2 (Europeancollection of cell cultures (ECACC) number 9105151 1) originals of a mouse female tumor of the Balb / c strain, keeping the cultures between 3-9 x 10 5 cells / ml at 37 e C and 5% C0 2 in MEM + culture medium supplemented with 20% SBF-I.
- the protocol to work with the cells in culture was taking them off the culture bottle where they were attached by cold support and dry blows. The cells were decanted and centrifuged for 5 minutes at 800 rpm.
- the cells were resuspended in fresh culture medium for counting, by staining with trypan blue (1: 1 dilution) and in a hemocytometric chamber of Neubauer, for subsequent studies (Sánchez-Moreno M, et al., J AntimicrobChemother 2012; 67: 387-397). These tests were performed by flow cytometry. Macrophages of the J774.2 line, were deposited in a steriling (Universal Tube®) and centrifuged at 800 rpm for 10 min, the supernatant was discarded and the cells were resuspended in MEM + Glutamine + 20% SBF-I medium.
- results were analyzed in the cytometer taking into account that the cells with the intact plasma membrane have a green fluorescence, while the damaged or dead cells have a red fluorescence. The percentage of viability was calculated. The number of dead cells was determined by comparison with the control cultures.
- the compounds were added to the culture medium in the 24-well plate at a final concentration of: 100, 50, 25, 10 and 1 ⁇ , and at a final volume per well of 500 ⁇ .
- the macrophages took off from the culture bottle where they were attached by cold support and dry blows. For this, the culture medium was removed, then the cell surface was covered with EDTA-trypsin and incubated cold for 5 minutes according to the methodology set forth above. After that, it was transferred to a 25 ml conical bottom flask (Steriling) to centrifuge them at 800 rpm for 5 minutes, removing the supernatant and resuspending them in MEM + Glutamine with 20% SBF-I. They are counted in a Neubauer chamber and grown in 24-well plates at a rate of 1 x 10 3 cells, in which a 12 mm round glass coverslip had previously been introduced into each well. For adhesion, cells were grown 24 h at 37 e C in 5% C0 2 .
- Table 1 Activity and toxicity found for squamidic compounds studied on extracellular and intracellular forms of Leishmania spp.
- c Selectivity index- IC 50 of macrophages / IC 50 of intracellular extracellular forms of parasites. In parentheses: Number of times the SI of I compounds is greater than the SI of the reference drug.
- the values obtained are compared with those corresponding to the reference drug, Glucatime, commonly used in the treatment of leishmania.
- the analysis of the results obtained indicates that in general the compounds studied are active against the intracellular and extracellular forms of the parasite used with IC 50 values up to four times higher than the values obtained for the reference compound. Furthermore, in this case, IC 50 values have been obtained against macrophages between 10 and 25 times higher than that of the reference compound, which indicates that the new compounds have a low toxicity against macrophages, which constitutes an advantage when its use as therapeutic agents. Therefore, and from these values, selectivity indices with values between 20 and 50 have been obtained for a group of the compounds studied.
- Trypanosoma cruzi strain type I was used (IRHOD / CO / 2008 / SN3) (Tellez-Meneses et al, Acta Trop 2008; 108: 26-34) whose geographical origin is Guajira (Colombia) and its biological origin f ⁇ hodniusprolixus in the forms of development: epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes.
- the culture of the epimastigote forms of T was used (IRHOD / CO / 2008 / SN3) (Tellez-Meneses et al, Acta Trop 2008; 108: 26-34) whose geographical origin is Guajira (Colombia) and its biological origin f ⁇ hodniusprolixus in the forms of development: epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes.
- the culture of the epimastigote forms of T was used (IRHOD / CO / 2008 / SN3) (Tellez-
- cruzi was carried out in sterility in vitro in a single-phase MTL culture medium (Medium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Pérez et al., 1986) enriched with 10% (v / v) Fetal Bovine Serum (SBF-I) inactivated at 56 e C / 30 minutes.
- the inoculum of parasites to start the culture was 5 x 10 4 cells / ml in 5 ml of medium in 25 cm 2 Falcon® plastic bottles and kept in an oven at 28 e C. The cultures were routinely carried out. achieving the exponential growth of the flagellates until obtaining the necessary cellular mass for the later studies. (Téllez-Meneses J, et al. Acta Trop 2008; 108: 26-34).
- Vero cells were established from the kidney of an adult African Green monkey, maintaining the cultures at a density of 1 x 10 4 cells / cm 2 at 37 e C and 5% C0 2 .
- the cells were resuspended in a new culture medium.
- RPMI supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum (SBF-I) was used as culture medium.
- SBF-I inactivated fetal bovine serum
- Vero cells were deposited in a sterlin and centrifuged at 800 rpm for 10 min, the supernatant was discarded and the cells were resuspended in RPMI medium.
- 1 x 10 4 cells / ml were deposited in each well of a 24-well titration plate, incubated for 24 h at 37 e C in a humid atmosphere enriched with 5% C0 2 . This was done to fix the cells.
- the parasites were incubated at 1: 100 dilution for 96h at 28 e C in TAU3AAG medium (TAU supplemented with 10 mM L-proline, 50 mM sodium L-glutamate, 2 mM sodium L-aspartate and I mM D-glucose) in 25 ml culture jars in a horizontal position preventing it from exceeding 1 cm deep from the medium.
- TAU3AAG medium TAU supplemented with 10 mM L-proline, 50 mM sodium L-glutamate, 2 mM sodium L-aspartate and I mM D-glucose
- Epimastigote forms of T. cruzi cultured in the manner described above were collected in their exponential phase of growth by centrifugation at 1500 rpm for 10 min. The number of parasites was counted in a hemocytometric chamber of Neubauer and seeded in a 24-well plate at a concentration of 5x10 4 parasites / ml in each well.
- the compounds to be tested were dissolved in DMSO at a concentration of 0.01% (v / v) concentration at which this solvent is not toxic or has any effect on the growth of parasites.
- the compounds were added to the culture medium at a final concentration of: 100, 50, 25, 10 and 1 ⁇ .
- the effect of each compound on the growth of epimastigote forms, at the different concentrations tested, was evaluated at 72 h, using a Neubauer hemocytometric chamber and the trypanocidal effect was expressed as IC 50 (concentration required to give an inhibition of 50%, calculated by the analysis of the linear regression of the K c at the concentrations tested) (Sánchez-Moreno M, et al. J Med Chem. 201 1; 54: 970-9).
- the activity is compared with the control after performing the methodology described by (Junior CO, et al. BiomedPharmacother 2010; 64: 624-6) with some modifications made in the laboratory.
- the test is carried out using infected Balb / c mouse blood that has been obtained during the days of maximum parasitemia (day 7 approx. Post infection).
- the infected blood was diluted with uninfected blood to obtain a concentration of 1 -4 x 10 6 trypomastigotas / ml, then diluted 1: 2 with RPMI 1640 medium-GIBCO.
- Stock solutions of the compounds to be tested are prepared at the same time in DMSO.
- a sample of infected blood and the drug are added to a 96-well plate to a final volume of 200 ⁇ and to compound concentrations of 1, 10, 25, 50 and 100 mM, in order to calculate the IC50 for each and subsequently the plates were incubated at 4 e C for 24 h. The experiments were repeated three times. Each sample was examined microscopically (OLYMPUS CX41) for the parasite count using the Neubauer chamber.
- Vero cells were detached from the culture flask where they were attached by trypsinization. For this, the culture medium was removed, then the cell surface was covered with EDTA-trypsin and incubated cold for 5 minutes according to the methodology set forth above. After that, it was transferred to a conical bottom flask of 25 ml capacity (Steriling) to centrifuge them at 800 rpm for 5 minutes, removing the supernatant and counted in Neubauer chamber. The cells were resuspended at a concentration of 1 x 10 4 cells / ml in RPMI medium for Vero cells, grown in 24-well plates, in which a 12 mm round glass cover glass had previously been introduced into each well. For adhesion, cells were grown 24 h at 37 e C in 5% C0 2 .
- the Vero cells were infected "in vitro" with 5x10 4 cells / ml of trypomastigote forms of T. cruzi, obtained according to the methodology cited above. The infection is maintained for 24 hours for the parasite to enter the cell. After this time the culture medium was removed and fresh medium was added with the products to be tested, at the concentrations necessary to remove the IC50 (100, 50, 25, 10 and 1 ⁇ ). 72 hours after incubation, the crystals were removed.
- Table 3 In vitro activity, toxicity and selectivity index of the squamid compounds evaluated in extracellular and intracellular forms of Trypanosoma cruzi.
- Table 5 at IC 50 the concentration required to obtain 50% inhibition, calculated by linear regression of the analysis of the Kc values at the concentrations used (1, 10, 25, 50 and 100 ⁇ ).
- Selectivity index IC 50 Vero cells / IC 50 parasitic extracellular and intracellular forms. In parentheses: number of times the compound exceeds the IS index of the reference drug.
- mice were kept under standard conditions. They were infected intraperitoneally with 1 x 10 5 blood forms of T. cruzi. The animals were divided into the following groups:
- Group 3 treated (infected and treated with 1 mg / kg weight / day for 5 consecutive days, 5-10 days after infection, intraperitoneally, with the tested compounds and benzinidazole).
- a blood sample (5 ⁇ ) was extracted from the mandibular vein of each treated mouse and diluted to 1: 100 concentration with PBS.
- the number of trypomastigote forms of T. cruzi was recorded every 2 days from 5 to 60 days post-infection using a Neubauer chamber.
- the number of parasites is expressed as parasites / mL.
- the antibodies against Trypanosoma cruzi present in the circulatory serum, on days 40 and 120 post-infection were quantitatively evaluated by ELISA (enzyme-linked immunoassay) assays.
- the serum was obtained from the blood by centrifugation and diluted to a concentration of 1: 80 in PBS.
- the antigen is composed of an excreted isoform of Fe-SOD enzyme from T. cruzi epimastigotes.
- the results obtained are expressed as the ratio between the absorption of each sample at 490 nm with respect to the maximum estimated value.
- the maximum estimated value is calculated as the average of the values obtained in the negative controls (not treated) plus three times the standard deviation.
- mice After day 150 post-infection, the groups of treated mice whose levels of parasitemia had decreased significantly underwent three cycles of immunosuppression with cyclophosphamide monohydrate. The experiment ended with the complete bleeding of the mice and the extraction of the target organs, heart and liver. The collected blood was used for the control of the percent reactivation of parasitemia levels and for the determination of serum Ig-G concentration by ELISA assays as indicated above and in order to know the profile of the change in the level of antigens associated with the presence of the parasite in blood. Finally, after the extraction of the hearts and livers, these were cut longitudinally. One of the halves was used to obtain the total DNA and then a PCR was carried out for a fragment in the SOD gene of T.
- TciSOD_d ATG GTC TTC AGC ATT CCT CC
- TciSOD_r GTT GAT CTC GTC GGC AAC TT
- the other half of the organ, in the case of the liver, is used to carry out histopathological analyzes, so it was washed in cold PBS (0 e C) and fixed in a buffer solution with 10% formalin.
- the tissues were dehydrated and embedded in paraffin Sections 4- 5 ⁇ thick and stained with Trichome, following Masson's protocol. Slides with samples were marked for blind analysis. Histological examinations were performed using a conventional optical microscope.
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Abstract
La presente invención se refiere a la síntesis y uso de compuestos de base escuaramida para el tratamiento de enfermedades de origen parasitario como son la Tripanosomiasis americana también conocida como enfermedad de Chagas o la Leishmaniasis.
Description
ACTIVIDAD ANTIPARASITARIA DE ESCUARAMIDAS
La presente invención se refiere a la síntesis y uso de compuestos de base escuaramida para el tratamiento de enfermedades de origen parasitario como son la Tripanosomiasis americana también conocida como enfermedad de Chagas o la Leishmaniasis.
ESTADO DE LA TÉCNICA Las enfermedades olvidadas (Neglecteddiseases) son enfermedades que afectan a millares de personas en todo el mundo, pero que no disponen de tratamientos eficaces o adecuados. En su mayoría se trata de enfermedades tropicales infecciosas que afectan fundamentalmente a la población más pobre, como por ejemplo la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, que ocasionan un impacto devastador en la humanidad. Estas enfermedades infecciosas están causadas por parásitos protozoarios que afectan especialmente a los países menos desarrollados, representando un problema grave de salud pública en el mundo. Se estima que casi el 50% de la población mundial está expuesta a este riesgo de contraer estas infecciones, y que aproximadamente 500 millones de personas sufren cada año patologías relacionadas con este tipo de enfermedades.
En la actualidad no existe tratamiento eficaz frente a estas enfermedades olvidadas, ya que, son de larga duración y algunos son de obligada administración parenteral o intravenosa, además de tener una elevada toxicidad (pancreatitis y toxicidad cardiovascular) con lo que pueden conllevar un efecto letal. Con lo que, se acentúa el problema sanitario al no haber terapias efectivas o la resistencia a los pocos fármacos accesibles existentes.
La enfermedad de Chagas está causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi que se transmite de forma natural a través de las deyecciones de una chinche triatomina hematófaga (Hemipterareduviidae). Otras vías de transmisión son por transfusión de sangre infectada, el trasplante de órganos e incluso de madres a hijos mediante el embarazo y la lactancia, o por vía oral a través de alimentos contaminados. En esta enfermedad se distinguen dos fases, la fase aguda en la que el parásito se multiplica activamente dentro de las células del hospedador y se detectan altos niveles de parasitemia en sangre; y la fase crónica, que desarrollan el 30% de los
infectados, en la que el nivel de parasitemia se reduce a niveles subpatentes en sangre pero los parásitos forman pseudoquistes en diferentes órganos como corazón, esófago y colón, ocasionando cardiopatías, megasíndromes digestivos. Se trata de una enfermedad endémica en la mayor parte de América Latina y se ha clasificado por la WHO como la tercera enfermedad tropical más extendida después de la malaria y la esquistosomiasis. Se ha estimado que alrededor de 100 millones de personas están en peligro de ser infectadas y que hay entre 15 y 20 millones de personas infectadas. 50,000 personas mueren cada año como resultado de la infección de este parásito. Desafortunadamente, el tratamiento para la enfermedad de Chagas utilizado en la actualidad es muy limitado y no se ha desarrollado una vacuna efectiva. Los agentes terapéuticos desarrollados hasta la actualidad se basan en estructuras nitro- heterocíclicas como el nitrofurano (nifurtimox) o el derivado del nitroimidazol (benznidazol). Tanto el nifurtimox como el benznidazol solo son efectivos frente a la fase aguda de la enfermedad, demostrando tener una eficacia muy limitada en la fase crónica. Además son muy tóxicos y causan efectos secundarios severos como pancreatitis y toxicidad cardiaca.
La leishmaniasis, causada por la infección de diferentes especies de protozoos del género Leishmania es una enfermedad cosmopolita. Alrededor de 20 millones de personas padecen esta enfermedad, la cual se transmite a través de la picadura de dípteros del género Phiebotomus o Lutzomyia. La leishmaniasis se puede presentar en diferentes manifestaciones clínicas: visceral, cutánea o mucocutánea, siendo la visceral la forma más grave de la enfermedad.
El tratamiento de la leishmaniasis es complicado y además, esta enfermedad presenta una morbilidad sustancial por lo que a menudo se requieren terapias expeditivas. En la leishmanaiosis se utilizan desde hace más de 70 años derivados pentavalentes del antimonio como: Estibogluconato sódico (Pentostan) o la Meglumina antimoniato (Glucantime). Otros medicamentos utilizados son: Anfotericina B (AmBiosome®) que se administra durante un máximo de 10 días y no presentan toxicidad pero, es sumamente caro (1 ,500 a 2,400$ por tratamiento); la miltefosina que de administración oral pero el tratamiento dura 4 semanas y tiene restricciones de uso para gestantes y niños; la pentamidina y el Ketoconazol. Este problema se agrava dado que las infecciones repetidas de la población o los tratamientos inefectivos han ocasionado la resistencia de los parásitos a estas terapias.
Por lo tanto, resulta necesario obtener nuevos agentes terapéuticos más efectivos tanto en las fases agudas como crónicas de las enfermedades mencionadas, y que además sean activos frente cepas resistentes a los tratamientos habituales. Además es importante que presenten una menor toxicidad con el objetivo de disminuir los efectos secundarios adversos.
DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se proporciona unos compuestos de base escuaramida como agentes antiparasitarios, en particular para el tratamiento de la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I):
donde:
Ri se selecciona de entre -NRaRb o -ORc, donde:
Ra se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); preferiblemente hidrógeno o alquilo (CrC3); más preferiblemente hidrógeno o metilo.
Rb se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido, preferiblemente fenilo, -(CH2)x-NR1 'R1 " o -(CH2)x-C02Ri"'; x tiene un valor de 0 a 5 y R , R 'y R/" se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (C C5);
Rc se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); preferiblemente entre hidrógeno o alquilo (CrC3); más preferiblemente es hidrógeno;
R2 se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido; heterociclo, opcionalmente sustituido; aralquilo (CrC5), opcionalmente sustituido; alquilo (C1-C20), preferiblemente alquilo (C4-C15); -(CH2)X-NR2 'R2 "; o -(CH2)y-R4, donde x tiene un valor
de 0 a 5, y tiene un valor de 0 a 5 y R2 'y R2 " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5);
R3 se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); preferiblemente hidrógeno o alquilo (CrC3); más preferiblemente hidrógeno y metilo; aún más preferiblemente hidrógeno;
R4 es el grupo de fórmula (II):
(II)
donde: X se selecciona de la lista que comprende -NR4 '-, -CH- y arilo, opcionalmente sustituido; R4 ' se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); y R R3 e y se han definido anteriormente;
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades parasitarias.
En una realización preferida, cuando Rb es el grupo -(CH2)x-NR1 'R1 ":
x puede tener los valores 1 , 2 o 3, más preferiblemente 2 o 3, y R y R/' se seleccionan independientemente entre un grupo alquilo(CrC4); más preferiblemente metilo o butilo; o
x puede ser 0 y R y R/' se seleccionan independientemente entre hidrógeno o alquilo(CrC3), más preferiblemente R y R/' son hidrógeno, y en este caso Rb es - NH2.
En una realización preferida, cuando Rb es el grupo -(CH2)x-C02Ri "'; R/" es preferiblemente hidrógeno, metilo o etilo y más preferiblemente hidrógeno y x tiene el valor de 1 , 2 o 3.
El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n- propilo, /-propilo, n-butilo, ferc-butilo, sec-butilo, n-pentilo. Preferiblemente el grupo
alquilo tiene entre 1 y 5, y más preferiblemente entre 1 y 3, átomos de carbono o entre 4 y 15 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico arilo, hidroxilo, amino, amido, éster, carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido, que a su vez pueden opcionalmente estar sustituidos. Preferiblemente el grupo alquilo no está sustituido.
El término "arilo" se refiere en la presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o condensados. Un ejemplo, no limitante, de arilo es un grupo fenilo, naftilo, indenilo, etc....El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido por al menos un grupo seleccionado de entre un hidroxilo, éster, carboxilo, alquilo o grupo -(CH2)X-NR'R", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R' y R" se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo (CrC5). Preferiblemente el grupo arilo es un fenilo, en donde el grupo fenilo puede contener 1 o más sustituyentes según se han descrito anteriormente y preferiblemente está sustituido por un grupo éster, hidroxilo, -NH2, -CH2-NH2, o -N(CH3)2.
El término "aralquilo" se refiere, en la presente invención, a una cadena alifática de entre 1 y 5 átomos de carbono en el que al menos uno de los hidrógenos se ha sustituido por un grupo arilo, con las acepciones anteriores. Como por ejemplo, pero sin limitarse, un grupo benciloofenetilo. Estos grupos aralquilo pueden, a su vez, estar opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo, hidroxi, nitro, amino o halógeno. Preferiblemente es un grupo bencilo, opcionalmente sustituido, y más preferiblemente es un grupo bencilo que no está sustituido.
El término "heterociclo" se refiere, en la presente invención, a un radical de cadena carbocíclica y que consiste en átomos de carbono, entre 3 y 6, más preferiblemente 5 o 6, donde al menos un átomo de carbono es sustituido por un heteroátomo seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno o azufre. Esta cadena carbocíclica puede estar insaturada, saturada o parcialmente saturada.
Preferiblemente está saturada. Puede estar opcionalmente sustituida por1 o más sustituyentes del grupo formado por alquilo, hidroxi, nitro, amino, halógeno, arilo o aralquilo. Preferiblemente es un grupo piperidina, y más preferiblemente sustituida por un grupo bencilo, y aún más preferiblemente en la posición 1 .
En otra realización preferida, cuando R2 es -(CH2)y-R4 y el compuesto es de fórmula (III):
(II I) donde: X, y, Ri y R3 se han definido anteriormente.
Cuando X es un grupo arilo, preferiblemente es un grupo fenilo, opcionalmente sustituido, más preferiblemente sin sustituir, y aún más preferiblemente y es 1 , 2 o 3, más preferiblemente y es 1 .
Cuando X es el grupo -CH-, preferiblemente y es 1 , 2 o 3, más preferiblemente 1 . Cuando X es -NR4 '-, R4 ' preferiblemente se selecciona entre hidrógeno o un alquilo (C C3), preferiblemente metilo o etilo, más preferiblemente es metilo. En una realización aún más preferida y es 2, 3 o 4, aún más preferiblemente y es 3.
En una realización más preferida, R3 es hidrógeno en el compuesto de fórmula (I I I).
En una realización aún más preferida, R es -NRaRb, Ra es metilo y Rb es el grupo - (CH2)X-NR1 'R1 ", donde R/ y R/' son metilo y x es 2 o 3.
Los compuestos, de fórmula general (I) como de fórmula general (I II) pueden estar en forma de sales de halógeno, como por ejemplo, pero sin limitarse a ioduros, cloruros o fluoruros, preferiblemente las sales son de ioduro.
Los compuestos de fórmula (I), y en particular algunos de fórmula (II I), se pueden seleccionar de lista:
3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (2), 3-(butilamino)-4-(1 -metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (5),
3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (3), 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (4), 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (6),
3-((1 -benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (9),
3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (8),
3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (7),
3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (10), ioduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (13),
benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino) (18),
ioduro de 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (1 1 )
ioduro de 2-((2-(bencilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (12)
ácido 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxo no)acético (14)
ácido 3-((2-(butilamino)-3,4-dioxo no)propanoico (15)
ácido 4-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)butanoico (16)
3-((4-(dimetilamino)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1 ,2-diona (17)
3-hidroxi-4-((2-hidroxifenil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (19)
3-((4-(aminometil)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1 ,2-diona (20)
4,4'-(((metilazanediil)bis(propano-3,1 -diil))bis(azanediil))bis(3-((3- (dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona) (21 )
ioduro de 3,3'-(((((metilazanediil)bis(propano-3,1 -diil))bis(azanediil))bis(3,4- dioxociclobut-1 -en-2,1 -diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetilpropan-1 -amonio)
4,4'-(propano-1 ,3-diilbis(azanediil))bis(3-((3-dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3- 1 ,2-diona) (23)
ioduro de 2,2'-((((1 ,3-fenilenebis(metilene))bis(azanediil))bis(3,4-dioxociclobut-1 - 2,1 -diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetiletanamonio) (24)
Por "enfermedad parasitaria", se entiende en la presente invención a una enfermedad infecciosa causada por protozoos, vermes (cestodos, tremátodos, nematodos) o artrópodos. En particular los parásitos son protozoos, por tanto, se puede decir que los compuestos son antiprotozoarios. En una realización más preferida los parásitos pertenecen a la familia Trypanosomatidae, más preferiblemente los parásitos son del género Trypanosoma o Leishimania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania trópica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.
Las enfermedades parasitarias a tratar podrían ser leishmaniosis (o leishmaniasis) o tripanosomiosis (o tripanosomiasis). "Leishmaniosis" es una enfermedad causada por un protozoo del género Leishmania y transmitido, principalmente por mosquitos flebótomos o jejenes. Esta enfermedad se produce en humanos y animales vertebrados, como pueden sermarsupiales, cánidos, roedores y primates. Y "tripanosomiasis" son enfermedades producidas en humanos o animales vertebrados que son causadas por parásitos protozoarios del género Trypanosoma, entre ellas se puede encontrar la tripanosomiasis humana africana, también conocida como enfermedad del sueño, la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas o la tripanosomiasis en animales o Nagana.
En una realización preferida de la presente invención los compuestos descritos en la presente invención se usan para el tratamiento y/o la prevención de la leishmaniosis o la enfermedad de Chagas.
Un segundo aspecto de la presente invención es un compuesto de fórmula general
(IV):
(IV)
donde:
Ri es un grupo -NRaRb, donde:
Ra es un alquilo CrC3; preferiblemente Ra es un metilo y
Rb es el grupo -(CH2)x-NR1 'R1 ", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R y R/' se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5) ;
R2 se selecciona de un grupo alquilo (C1 -C20), preferiblemente alquilo (C4-C12), o un grupo -(CH2)x-NR2 'R2"; x tiene un valor de 0 a 5, preferiblemente de 1 a 5, más preferiblemente de 2, 3, o 4, más preferiblemente 3, y R2 ' y R2 " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5) , preferiblemente entre hidrógeno y alquilo (CrC3) , más preferiblemente metilo; y
R3 se selecciona de entre hidrógeno o un alquilo (CrC5) , preferiblemente hidrógeno o alquilo (CrC3) ; más preferiblemente hidrógeno o metilo;
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida Rb es el grupo -(CH2)X-NR/R/', x tiene un valor de 1 a 5 y R/y Ri " se seleccionan de manera independiente un alquilo (C1 -C3) , más preferiblemente Rb es el grupo -(CH2)X-NR/R/', x tiene un valor de 1 a 5 y R/y R/' son metilo, aún más preferiblemente x es 2, 3 ó 4, y aún más preferiblemente x es 3. En otra realización preferida Rb es el grupo -(CH2)X-NR/R/', x es 0 y R/y R/' se seleccionan de manera independiente un alquilo (C1 -C3) , más preferiblemente R/y R/' son hidrógeno.
En una realización más preferida, el compuesto de fórmula (IV) se selecciona de la lista:
- 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (2),
- 3-(butilamino)-4-(1 -metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (5),
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (3),
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (4), y
- 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (6).
Más preferiblemente el compuesto es 3-(butilamino)-4-((3- (dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (IV) que comprende la etapa de:
- hacer reaccionar un éster de monoescuaramida de fórmula general (V) con una amina de fórmula general (VI):
(V) (IV)
Donde: Et es etilo y Ra, Rb, R2 y 3 se ha descrito anteriormente para el compuesto de fórmula general (IV). Dicha reacción tiene lugar preferiblemente a temperatura ambiente y entre 9 y 20 horas. De manera opcional se puede proceder a una etapa posterior de filtrado, previamente con o sin evaporación del disolvente, y/o posterior secado del compuesto de fórmula (IV) obtenido.
El procedimiento de la presente invención puede tener una etapa previa de obtención del compuesto de fórmula general (V) que comprende:
- hacer reaccionar un escuaramato de dietilo de formula (VIII) con una amina de fórmula (VII)
(VIII) (V)
Donde: Et es etilo y Ra y Rb se ha descrito anteriormente para el compuesto de fórmula general (IV). Dicha reacción tiene lugar preferiblemente a temperatura ambiente y entre 9 y 20 horas. De manera opcional se puede proceder a una etapa posterior de filtrado, previamente con o sin evaporación del disolvente, y/o posterior secado del compuesto de fórmula (V) obtenido.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a los compuestos que se seleccionan de la lista:
- 3-((1 -benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (9), - 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (8),
- 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (7),
- 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (10), loduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (13), y
- Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino) (18).
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (IV) o a los compuestos descritos en el cuarto aspecto de la invención, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente esta composición puede incluir otro principio activo, por ejemplo otro compuesto antiparasitario.
Un sexto aspecto más de la presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (IV) o a los compuestos descritos en el cuarto aspecto de la invención, para la elaboración de un medicamento.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Representa la evolución de los niveles de parasitemia en sangre a lo largo del tiempo en ratones infectados y no tratados (control) y ratones infectados y tratados con los compuestos 2, 7, 8 y 22.
Fig. 2. Resultados in vivo después de la inmunosupresión para ratones no tratados (control) y tratados con 40 mg/kg de compuesto 2. (A) Reactivación de la parasitemia en sangre después de los ciclos de inmunosupresión. (B) Diferencias en los niveles de IgG medidos mediante ensayos ELISA en ratones control (no IS) e inmunosuprimidos (IS) (C) Amplificación por PCR después de la purificación del ADN total de los corazones de los ratones.
EJEMPLOS
SINTESIS DE COMPUESTOS
Método general para la obtención de las mono escuaramidasdisecundarias
Rb = H, Me Rb = H, R3 - H
Rb = H, R3 =Me Rb = Me, R3 = Me
6,4 mmol de amina en 30 mL de éter dietílico se adicionan gota a gota a una disolución de escuarato de etilo (1 g, 5,8 mmol) en 10 mL de éter dietílico a temperatura ambiente. La reacción se deja agitando a temperatura ambiente durante 12 h. Transcurrido este periodo de tiempo, en algunos casos se observa la aparición de un precipitado de color amarillo pálido. El sólido se filtra y se lava con éter dietílico (3 x 10 mL), obteniéndose la monoescuaramidaester en un rendimiento que oscila dependiendo de la amina utilizada entre el 60-90%. Alternativamente, si el producto de reacción permanece en disolución, se evapora el disolvente y el sólido obtenido se lava con n-pentano (3 x 10 mL) o se purifica mediante cromatografía en columna (Si04, AcOEt/ EtOH 1 %).
1 ,1 mmol de amina en (20 mi) de etanol se adiciona gota a gota a un disolución de mono escuaramidaester (1 mmol) en 10 mL de etanol. La reacción se deja a temperatura ambiente durante 12 h. Transcurrido este periodo de tiempo, en algunos casos se observa la aparición de un precipitado de color amarillo pálido. El sólido se
filtra y se lava con etanol (3 x 10 mL), obteniéndose la monoescuaramidadisecundaria en un rendimiento que oscila dependiendo de la amina utilizada entre el 60-90%. Alternativamente, si el producto de reacción permanece en disolución, se evapora el disolvente y el sólido obtenido se lava con n-pentano (3 x 10 mL).
3-((3-(dimetilamino)propil)(metill)amino)-4-etoxiciclobut-3-en-1 ,2-diona (1)
1 se ha preparado como se indica en el método general a partir de escuarato de dietilo (0,50 g, 2,94 mmol) en acetonitrilo (25 mL) y N1 ,N1 ,N3-trimetilpropano-1 ,3-diamina (0,3 g, 2,65 mmol) en acetonitrilo (5 mL). Se evapora el disolvente y se purifica mediante cromatografía en columna Si04 CH2CI2-EtOH 10%. Se obtiene 1 ( 0,63 g, 12.6 mmol) como aceite incoloro. Rendimiento 90%.
1 HRMN (CDCI3) δ = 4.76 (2 H, J = 7.2 Hz, q), 3.72 (1 H J = 6.9 Hz, t), 3.45 (1 H J =7.2 Hz, q), 3.34 (1 .5 H, s), 3.16 (1 .5 H, s). 2.37 (2H, J = 6.6, t), 2.28 (3H, s), 2.23 (3 H, s), 1 .85 (2 H, m), 1 .50 (3 H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C NMR (CDCI3, 75 MHz): 188.3, 188.0, 181 .5, 175.6, 175.5, 171 .6, 171 .3, 68.7, 55.4, 49.7, 49.0, 44.4, 36.0, 35.6, 25.0, 24.8, 15.2 ppm. 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (2)
2 se ha preparado como se indica en el método general a partir 1 (0,37 g, 1 ,55 mmol) en etanol (5 mL) y n-butilamina (0,13 g, 1 ,8 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 2 (0,40 g , 1 ,53 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 85 %.
1 HRMN (CDCI3) δ = 8.36 (1 H, br), 3.67 (2 H , J = 6.3 Hz, q), 3.34 (3 H, s), 2.37 (2 H, m), 2.23 ( 6 H, s), 1 .75 (2 H, m), 1 .55 (2 H, m), 1 .26 (2 H, m), 0.95 ( 3H, J = 4.5 Hz, t) ppm. 13C RMN (DMSO- d6) δ = 183.7, 183.6, 169.4, 168.8, 54.5, 48.66, 45.2, 44.9,
36.5, 34.0, 24.1 , 20.2, 14.2 ppm. HRMS cale para Ci4H26N302 [MH+] 268.2025 exp. 268.2022
De manera alternativa el compuesto 2 se preparó a partir de escuarato de etilo (0,50 g, 2,94 mmol) y N 1 ,N 1 ,N 3-trimetilpropano-1 ,3-diamina (0,33 g, 2,65 mmol), se mezclan y agitan a temperatura ambiente durante 2 h. Seguidamente se añade n-butilamina ( 0.23 g, 3.2 mmol) y se calienta agitando a 80 eC durante 2 h. El crudo se purifica mediante cromatografía en columna (Al203, CH2CI2/EtOH 5%) obteniéndose 2 como sólido blanco. Rendimiento 96 %.
3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (3)
3 se ha preparado como se indica en el método general a partir de 1 (0,54 g, 2,25 mmol) en etanol (5 mL) y octilamina (0,34 g, 2,4 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 3 (0,57 g, 1 ,68 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 70 %.
1 HRMN (CDCI3) δ = 8.36 (1 H,s), 3.66 (2 H, J= 6.3 Hz, q), 3.30 (5 H, m), 2.36 ( 2 H J = 5.7 Hz, t), 2.22 (6 H s), 1 .74 (2 H, m), 1 .56 ( 2 H, m), 1 .30 (20 H, s), 0.88 (3H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C RMN (CDCI3) δ = 183.3, 168.4, 54.8, 54.2, 49.1 1 , 45.19, 44.6, 32.1 , 32.0, 30.1 , 30.0, 29.9, 27.1 , 23.8, 23.1 , 14.5 ppm. HRMS cale para Ci8H34N302 [MH+] 324.2651 exp. 324.2653.
3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (4)
4 se ha preparado como se indica en el método general a partir de 1 (0,5 g, 2,1 mmol) en dietileter (5 mL) y dodecilamina (0,43 g, 2,3 mmol) en etanol (15 mL). Se obtiene 4 (0,63 g, 1 ,65 mmol) como un aceite incoloro. Rendimiento 80 %.
1 HRMN (CDCI3) δ = 8.36 (1 H,s), 3.67 (2 H, J= 6.3 Hz, q), 3.30 (5 H, m), 2.36 ( 2 H J = 5.7 Hz, t), 2.22 (6 H s), 1 .74 (2 H, m), 1 .56 ( 2H, m), 1 .30 (28 H, s), 0.88 (3H, J = 6.3 Hz, t) ppm. 13C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ = 182.7, 168.5, 168.0, 54.2, 48.4, 44.6, 44.4, 35.9, 31 .6, 31 .3, 29.3, 29.0, 26.3, 23.8, 22.4, 13.3 ppm HRMS cale para C22H42N3O2 [MH+] 380.3266 exp. 380.3277
3-(butilamino)-4-(1-metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (5)
5 se ha preparado como se indica en el método general a partir de 1 (0,38 g, 1 ,94 mmol) en dietiléter (5 ml_) y N-metilhidrazina (0,08 g, 1 ,76 mmol) en etanol (15 ml_). Se obtiene 5 (0,21 g, 1 ,05 mmol) como un sólido rojizo. Rendimiento 60%.
1 HRMN (CDCI3) δ = 6.19 (1 H, s), 4.04 (2 H, s), 3.64 (2 H, J = 6.9 Hz, q), 3.50 (3 H, s), 1 .58 (2 H, m), 1 .38 (2 H, m), 0.94 (3H, J = 4.5 Hz, t) ppm. 13CRMN (CDCI3) δ = 181 .8, 180.9, 169.0, 168.5, 44.7, 43.4, 33.8, 20.0, 14.1 ppm. HRMS cale para Ci8 H3oN604 Na [2MNa+] 417.2234 exp. 417.2226.
3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (6)
Escuarato de dietilo (0,29 g, 1 ,71 mmol) y N1 ,N1 ,N3-trimetilpropano-1 ,3-diamina (0,44 g, 3,76 mmol) en etanol (20 ml_). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el residuo obtenido se lava con n-pentano (3x15 ml_). Se obtiene 6 (0,40 g, 1 ,28 mmol) como un sólido blanco. Rendimiento 75% 1 HRMN (CDCI3) δ = 3.71 (4 H, J = 7.2 Hz t), 3.17 (6 H,s), 2.29 (4 H, J = 7.20 Hz, t), 2.21 (12 H, s), 1 .80 (4 H, m) ppm. 13CRMN (CDCI3) δ = 184.4, 168.6, 56.8, 51 .6, 45.9, 40.1 , 26.7 ppm. HRMS cale para Ci6 H3iN402 [MH+] 31 1 .2444 exp. 31 1 .2447
3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (7)
7 se preparó a partir de n-butilescuaramidadietilester (preparado siguiendo el procedimiento descrito en M. C. Rotger, M. N. Piña, A. Frontera, G. Martorell, P. Ballester, P. M. Deyá, A. Costa; J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308) (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dimetiletano-1 ,2-diamina (0,22 g, 2,53 mmol) en etanol (20 mL). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el sólido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 7 ( 0,51 g, 2,12 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 84%.
1 HRMN (DMSO-d6) δ = 7.58 (1 H, br), 7.43 (1 H, br), 3.70 ( 2 H, J = 5.3 Hz, d), 3.61 (2 H m), 2.49 (2H J = 5.9 Hz, t), 2,27 (6 H, s) 1 ,56 (2 H m), 1 ,41 (2 H, m), 0.99 ( 3 H, J = 7.3 Hz, t) ppm. 13C RMN (DMSO- d6) δ =182.4, 167.7, 167.5, 59.2, 45.0,42.8, 41 .0, 32.8, 19.0, 13.5, ppm. HRMS cale para C12 H24N302Na [MNa+] 262.1531 exp. 262.1540
3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (8)
8 se preparó a partir de n-butilescuaramidadietilester (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dibutilpropano-1 ,3-diamina (0,48 g, 2,6 mmol) en etanol (20 mL). Se dejan a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el sólido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 8 (0,69 g, 2,01 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 80%.
1 HRMN (CDCI3) δ = 7.87 (1 H, br), 7.50 (1 H, br), 3.65 (4 H, m), 2.52 (2 H, J =6.8 Hz, t), 3.39 (4 H J = 7.1 1 Hz t), 1 .78 (2 H, m), 1 .62 (2H, m), 1 ,34 (14H, m), 0.92 (9 H, m). 13C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ = 182.5, 182.4, 168.2, 168.1 , 53.9, 51 .5, 44.6, 43.5, 33.4, 29.2, 28.4, 20.9, 19.8, 14.3, 13.9 ppm. HRMS cale para C19H36 N302 [MH+] 338.2808, exp. 338.2795.
3-((1-benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona (9)
Escuarato de etilo (0,5 g, 2,94 mmol), y anilina (0,28 g, 3 mmol) en etanol (20 mi) se dejan durante 12h a reflujo. Se elimina el disolvente y el sólido obtenido se redisuelve en etanol (20 mi) con 1 equivalente de 4-amino-1 -benzilpiperidinasa y se deja durante 12 h a temperatura ambiente. Se elimina el disolvente y se lava con n-pentano. Se obtiene 9 (0,78 g, 2,20 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 75%.
1 HRMN (DMSO-d6) δ = 7.65 (1 H, br), 7.31 (9H, m), 4.68 (2H, J = 6 Hz, d), 3.74 (1 H, br), 3.74 (2H, s), 2.70 (2H, s), 2.03 (2 H, m), 1 .81 (2 H, m), 1 .45 (2H, m) ppm. 13C RMN (DMSO-d6) δ = 188.0, 187.90, 172.8, 144.5, 143.9, 134.5, 134.3, 133.8, 133.3, 131 .1 , 132.5, 67.6, 56.8, 56.1 , 52.4, 38.6 ppm. HRMS cale para C22H23N3O2 [MH+] 376.2025 exp. 376.2023.
3-((2-(dimetilam ,2-diona (10)
10 se preparó a partir de N,N dimetiletanodiaminadietilester (5,50 g, 2,53 mmol) y N, N dimetiletano-1 ,2-diamina (0,22 g, 2,53 mmol) en etanol (20 mL). Se deja a temperatura ambiente durante 12h. Seguidamente se elimina el disolvente y el sólido obtenido se lava con n-pentano (3x15 mL). Se obtiene 10 (0,87 g, 2,12 mmol) como sólido blanco. Rendimiento 84%.
1 H NMR (CDCI3, 300 MHz): δ = 7.46 (br, 1 H), 7.31 (br, 1 H), 3.6-3.58 (br, 2H), 3.48-3.46 (br, 2H), 2.38 (m, 2H), 2.16 (s, 6H), 1 .49 (br, 2H), 1 .23 (br, 26H), 0.84 (m, 3H). 13C NMR (CDCI3, 75 MHz): 182.6, 182.3, 168.2, 168.1 , 59.8, 45.6, 44. 9, 42.4, 32.1 , 31 .4, 29.9, 29.5, 26.8, 22.8, 14.2 ppm. HRMS cale, for C24H46N3O2 408.35900; found 408.35834 [M+H]+. loduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1-en-1-il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio (13)
La escuaramida 10 (0,5 g, 1 ,2 mmol) se suspende en una mezcla de 20 mL de acetona anhidro y 10 mL de DMF anhidro junto con yoduro de metilo (0,5 g, 3,6 mmol). La mezcla se deja a reflujo durante 12 h. Al calentar la mezcla se observa la disolución de los reactivos. A medida que transcurre la reacción se forma un precipitado. Finalizado el tiempo de reacción se filtra el precipitado y se lava con acetona (5 x 10 mL), obteniéndose 13 (0,49 g, 0,9 mmol) como un sólido amarillo claro. Rendimiento 90%.
1 H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 7.52 (br, 1 H), 7.40 (br, 1 H), 3.95-3.93 (br, 2H), 3.5 (br, 4H), 3.1 1 (m, 9H), 1 .49 (s, 2H), 1 .23 (br, 26 H), 0.84 (br, 3H). 13C NMR (DMSO-d6, 75 MHz): 182.9, 182.3, 168.4, 166.9, 65.0, 52.7, 43.3, 37.4, 31 .2, 30.6, 29.0, 28.6, 25.8, 22.0, 13.9. HRMS cale, for C25H48N3O2 422.3759; found 422.3747 [M-l]+.
Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1-en-1 -il)amino) (18)
En un matraz de fondo redondo de 10 mL se mezclan etil-4-aminobenzoato (41 mg, 0,25 mmol, con ácido escuaárico (57 mg, 0,5 mmol) y 5 mL de agua. La mezcla se deja a reflujo durante 3 h. Trnascurrido este tiempo, la mezcla de reacción se diluye con 20 mL de NaHC03 5%. Se hacen cuatro extracciones con 20 mL de éter dietílico cada una. La fase acuosa se acidifica con HCI 3N (10 mL), y se hacen diez extracciones con éter dietílico. La fase orgánica se seca con Na2S04 anhidro y se concentra. El producto se obtiene como un sólido amarillo (48 mg, 73% de rendimiento).
1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6) <5 = 10.60 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 8.7, 2H), 7.56 (d, J = 7.8, 2H), 4.27 (m, 2H), 1 .29 (t, J = 6.9, 3H). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) <5 = 189.9, 185.2, 171 .2, 165.3, 143.3, 130.6, 130.4, 123.5, 1 18.0, 60.3, 14.2. IR (KBr, v cm_1): 3474, 3233, 3104, 2935, 1804, 1699, 1610, 1574, 1531 , 1458, 1280, 1 1 13. HRMS (ESI, modo positivo): m/z calculado para C26H23N2OioNa, [2M+Na]+: 523.1353; experimental: 523.1346. Punto de fusión: descomposición sobre 230 °C.
ENSAYOS BIOLOGICOS
CULTIVO PARASITOLÓGICO (PARA LEISHMANIA SPP)
Se cultivaron in vitro formas promastigotas de las especies Leishmania infantum (MCAN/ES/2001 /UCM-10) y Leishmania braziliensis (MHOM/BR/1975/M2904), en esterilidad, a 28e C en medio de cultivo monofásico MTL (Médium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Perez y col., 1986) enriquecido con el 10 % (v/v) de suero bovino fetal inactivado frente al complemento (SBF-I) a 56eC/30 minutos. El inoculo de parásitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 células/ml en 5 mi de medio en frascos de plástico Falcon® de 25 cm2, y mantenidos en una estufa a 28eC. (González P, Marín C, et al., Int J AntimicroAgents 2005;25:136-141 ). Los cultivos se realizaron de manera rutinaria, y renovando el medio cada dos días consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios.
CULTIVOS CELULARES Y ENSAYO DE CITOTOXICIDAD.
Los macrofagos J774.2 fueron reclonados desde J774.2 (Europeancollection of cell cultures (ECACC) número 9105151 1 ) originales de un tumor de hembra de ratón de la cepa Balb/c, manteniendo los cultivos entre 3-9 x 105 células/ml a 37eC y a 5% de C02 en medio de cultivo MEM + Glutamina suplementado con un 20 % de SBF-I. El protocolo para trabajar con las células en cultivo fue despegándolas del frasco de cultivo donde se encontraban adheridas mediante soporte frío y golpes secos. Se decantaron las células y se centrifugaron durante 5 minutos a 800 rpm. Se resuspendieron las células en medio de cultivo fresco para proceder a su contaje, mediante tinción con azul de tripán (dilución 1 :1 ) y en cámara hemocitométrica de Neubauer, para los estudios posteriores (Sánchez-Moreno M, et al., J AntimicrobChemother 2012; 67:387-397). Estos ensayos se realizaron mediante citometría de flujo. Macrofagos de la línea J774.2, se depositaron en un steriling (Universal Tube®) y se centrifugaron a 800 rpm durante 10 min, el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en medio MEM + Glutamina + 20 % SBF-I. Se depositaron 1 x104 células/ml en cada pocilio con medio en una placa de titulación de 24 pocilios, se incubaron durante 24 h a 37eC en atmósfera húmeda enriquecida con 5% C02. Esto se realizó para que se fijasen las células. Transcurrido este tiempo
el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25, 10 y 1 μΜ. A las 72 horas de la incubación, se procedió a la preparación de las muestras para su lectura en el citómetro de flujo. El método seguido para la preparación de muestras es el descrito por Sánchez- Moreno M, et al., J AntimicrobChemother 2012; 67:387-397, partiendo de las células y el medio presente en los pocilios, a las cuales se le adicionó 100 μΙ de solución de ioduro de propidio (Pl, 100 \g/ml) (Sigma Chemical Co), incubándose a 28eC en oscuridad unos 10 minutos, posteriormente, se añadió 100 μΙ de diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma Chemical Co) en solución (100ng/ml) volviéndose a incubar a 28eC en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedió a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se analizaron los resultados en el citómetro teniendo en cuenta que las células con la membrana plasmática intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las células dañadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculó el porcentaje de viabilidad. El número de células muertas se determinó por comparación con los cultivos controles.
ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VÍTRO: FORMAS EXTRACELULARES Ensayo sobre formas promastigotas
Las formas promastigotas de L. infantum y L. braziliensis cultivadas de la forma anteriormente descrita, fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. Se resuspendieron en medio fresco. La concentración de parásitos fue contada en una cámara hemocitométrica de Neubauer y se sembraron en una placa de 24 pocilios a razón de una concentración de 5 x 104 parásitos por pocilio. Los compuestos a ensayar se disolvieron con DMSO puro a una concentración de DMSO de 0,01 % (v/v), a la cual, este disolvente no es tóxico ni tiene ningún efecto sobre el crecimiento de los parásitos. Los compuestos fueron añadidos al medio de cultivo en la placa de 24 pocilios a una concentración final de: 100, 50, 25, 10 y 1 μΜ, y a un volumen final por pocilio de 500 μΙ. El efecto de cada producto sobre el crecimiento de las formas promastigotas, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluó a las 72 horas, usando una cámara hemocitométrica de Neubauer, y el efecto leishmanicida se expresó como la IC50 (concentración requerida para dar una inhibición del 50%, calculado por el análisis de
la regresión lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) (González P, Marín et al. Int J AntimicroAgents 2005;25:136-141 ).
ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VÍTRO: FORMAS INTRACELULARES.
Ensayo sobre formas amastigotas
Los macrófagos se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridos mediante soporte frío y golpes secos. Para ello, se eliminó el medio de cultivo, seguidamente se cubrió la superficie celular con EDTA-tripsina y se incubó en frío durante 5 minutos según la metodología expuesta anteriormente. Tras ello, se pasó a un frasco de fondo cónico de 25 mi de capacidad (Steriling) para centrifugarlos a 800 rpm durante 5 minutos, retirándose el sobrenadante y resuspendiéndolos en MEM + Glutamina con 20% SBF-I. Se cuentan en cámara de Neubauer y se cultivan en placas de 24 pocilios a razón de 1 x 103 células, en las que previamente se había introducido un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm en cada pocilio. Para su adherencia, se dejaron crecer las células 24 h a 37eC en 5% C02.
Una vez adheridas las células, se infectaron "in vitro": Macrófagos J774.2 con 1 x105 parásitos/pocilio de formas promastigotas metacíclicas en fase estacionaria de crecimiento de L. infantum. La infección se mantiene durante 24 horas para que el parásito entre a la célula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para calcular la IC50 (50, 25, 10 y 1 μΜ). A las 72 horas de la incubación, se procedió a la retirada de los cristales.
Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les añadió DPX (Panreac®), medio de montaje para microscopía. Se tiñeron con Giemsa, para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyó 0,2 mi de Azur-Eosina-Azul de Metileno solución según Giemsa DC (Código 251338) con 2 mi de tampón Sorensen (dilución 1 :10), se mezcló bien y se cubrió la preparación dejando colorear durante 20 minutos. Se lavó con agua destilada. Se dejó escurrir y secar en posición vertical. Por último se examinó con el objetivo de inmersión y se contó el número de amastigotas intracelulares en un total de 200 células (González P, et al. Int J AntimicroAgents 2005;25:136-141 ).
Los resultados de estos ensayos se muestran en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1 .- Actividad y toxicidad encontradas para los compuestos escuaramídicos estudiados sobre formas extracelulares e intracelulares de Leishmania spp.
Resultado de tres experimentos Independientes. a IC50 = Concentración necesaria para obtener el 50 % de Inhibición, calculada por análisis linear de regresión del valor Kc a las concentraciones empleadas de (1 , 1 0, 25, 50 y 100 μΜ). b Frente a Macrófagos J774.2 después de 72 h de cultivo.
Tabla 2.- índice de Selectividad (IS) encontrados para los compuestos escuaramídicos estudiados sobre formas extracelulares e intracelulares de Leishmania spp.
Algunos compuestos escuaramídicos se han evaluado frente a formas extracelulares e intracelulares de Leishmania spp (L infantum y L. braziliensis), obteniéndose los
índices IC50 como indicadores de la actividad de los compuestos frente al protozoo, los índices de toxicidad IC50 frente a macrofagos y el índice de selectividad obtenido como IS= IC50 frente a macrofagos /IC50 frente formas extracelulares e intracelulares de los parásitos. En este estudio los valores obtenidos se comparan con los correspondientes a la droga referencia, Glucatime, utilizada comúnmente en el tratamiento de la leishmania.
El análisis de los resultados obtenidos indica que en general los compuestos estudiados son activos frente a las formas intracelulares y extracelulares del parásito utilizadas con valores de IC50 hasta cuatro veces superiores a los valores obtenidos para el compuesto referencia. Además en este caso se han obtenido valores de IC50 frente a macrofagos entre 10 y 25 veces superiores al del compuesto referencia, lo cual indica que los nuevos compuestos presentan una baja toxicidad frente a los macrofagos, lo cual constituye una ventaja a la hora de su uso como agentes terapéuticos. Por lo tanto y a partir de dichos valores se han obtenido índices de selectividad con valores entre 20 y 50 para un grupo de los compuestos estudiados.
CULTIVO PARASITOLÓGICO (paraTrypanosoma cruzi)
Se utilizó Trypanosoma cruzi cepa tipo I (IRHOD/CO/2008/SN3) (Tellez- Meneses y col, Acta Trop 2008; 108:26-34) cuyo origen geográfico es Guajira (Colombia) y su origen biológico fíhodniusprolixus en las formas de desarrollo: epimastigotas, tripomastigotas y amastigotas. El cultivo de las formas epimastigotas de T. cruzi se realizó in vitro en esterilidad en medio de cultivo monofásico MTL (Médium Trypanosomes Liquid, Ruiz-Pérez y col., 1986) enriquecido con el 10% (v/v) de Suero Bovino Fetal (SBF-I) inactivado a 56eC/ 30 minutos. El inoculo de parásitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 células/ml en 5 mi de medio en frascos de plástico Falcon® de 25 cm2 y se mantuvieron en una estufa a 28eC. Los cultivos se realizaron de manera rutinaria consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios. (Téllez-Meneses J,y col. Acta Trop 2008; 108:26-34).
CULTIVOS CELULARES Y ENSAYO DE CITOTOXICIDAD.
Las células Vero fueron establecidas desde el riñon de un mono Verde Africano adulto, manteniendo los cultivos a una densidad 1 x 104 células/cm2 a 37eC y 5% de C02. El procedimiento para trabajar con las células en cultivo fue tripsinizar las células adheridas mediante lavado con PBS y añadiendo la cantidad suficiente de tripsina/EDTA (200ml de PBS + 0,1 g de EDTA y 200 mi de PBS + 0,5 g de tripsina. Se mezclan las dos soluciones. pH= 7,2-7,4 y se filtra). Se incubaron durante 5-10 minutos las células. Se decantaron las células y se centrifugaron durante 5 minutos a 800 rpm. Se resuspendieron las células en un medio de cultivo nuevo. Como medio de cultivo se utilizó RPMI suplementado con un 10 % de suero bovino fetal inactivado (SBF-I). (Sánchez-Moreno M, y col. J AntimicrobChemother 2012;67:387-397). Las células Vero, se depositaron en un esterlín y se centrifugaron a 800 rpm durante 10 min, el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en medio RPMI. Se depositaron 1 x104 células/ml en cada pocilio de una placa de titulación de 24 pocilios, se incubaron durante 24 h a 37eC en atmósfera húmeda enriquecida con 5% C02. Esto se realizó para que se fijasen las células. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25 y 10 μΜ. A las 72 horas de la incubación, se procedió a la preparación de las muestras para su lectura en el citómetro de flujo. El método seguido es el descrito por Marín C, y col. J Nat Prod. 201 1 Apr 25;74(4):744-50, partiendo de las células y el medio presente en los pocilios, a las cuales se le adicionó 100 μΙ de solución de ioduro de propidio (Pl, 100 μg/ml) (Sigma Chemical Co), incubándose a 28eC en oscuridad unos 10 minutos, posteriormente, se añadió 100 μΙ de diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma Chemical Co) en solución (100ng/ml) volviéndose a incubar a 28eC en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedió a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se analizaron los resultados teniendo en cuenta que las células con la membrana plasmática intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las células dañadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculó el porcentaje de viabilidad. El número de células muertas se determinó por comparación con los cultivos controles. (Marín C, y col. J Nat Prod 201 1 ; 74:744-750).
ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VÍTRO: FORMAS EXTRACELULARES. Transformación de formas epimastigotas a formas trypomastigotasmetacíclicas
La metaciclogénesis fue inducida a un cultivo de 5 días (fase estacionaria), tras ser centrifugado a 7000 g durante 10 min a 10eC. Los parásitos fueron incubados 2h a 28eC a una densidad de 5 x 108 parásitos/ml en medio TAU (190 mMNaCI, 17 mMKCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, 8 mMphosphate buffer, pH 6.0). Después, los parásitos se incubaban a la dilución 1 :100 durante 96h a 28eC en medio TAU3AAG (TAU suplementado con 10 mM L-prolina, 50 mM L-glutamato sódico, 2 mM L-aspartato sódicoyI O mM D-glucosa) en frascos de cultivo de 25 mi en posición horizontal impidiendo que supere 1 cm de profundidad del medio. (Cardoso J, y col. Mem Inst Oswaldo Cruz 2010; 5:1026-32).
Formas epimastigotas
Las formas epimastigotas de T. cruzi cultivadas de la forma anteriormente descrita fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. El número de parásitos fue contado en una cámara hemocitométrica de Neubauer y sembrados en una placa de 24 pocilios a razón de una concentración de 5x104 parásitos/ml en cada pocilio.
Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO a una concentración de 0,01 % (v/v) concentración a la cual este disolvente no es tóxico ni tiene ningún efecto sobre el crecimiento de los parásitos. Los compuestos fueron añadidos al medio de cultivo a una concentración final de: 100, 50, 25, 10 y 1 μΜ. El efecto de cada compuesto sobre el crecimiento de las formas epimastigotas, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluó a las 72 h, usando una cámara hemocitométrica de Neubauer y el efecto tripanocida se expresó como la IC50 (concentración requerida para dar una inhibición del 50%, calculado por el análisis de la regresión lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) (Sánchez-Moreno M, y col.. J Med Chem. 201 1 ; 54:970- 9).
Formas Trypomastigotas
La actividad (porcentaje de reducción de parásitos) es comparado con el control después de realizar la metodología descrita por (Júnior CO, y col. BiomedPharmacother 2010; 64:624-6) con algunas modificaciones realizadas en el laboratorio. El ensayo se lleva a cabo usando sangre infectada de ratón Balb/c que ha sido obtenida durante los días de máxima parasitemia (día 7 aprox. post infección). La sangre infectada fue diluida con sangre no infectada para obtener una concentración de 1 -4 x 106 trypomastigotas/ml, entonces se diluía 1 :2 con RPMI 1640 medium- GIBCO. Soluciones stock de los compuestos a ensayar se preparan al mismo tiempo
en DMSO. Una muestra de sangre infectada y la droga se añaden a una placa de 96 pocilios hasta un volumen final de 200 μΙ y a las concentraciones de compuesto de 1 , 10, 25, 50 y 100 mM, a fin de calcular la IC50 para cada uno y posteriormente las placas se incubaron a 4 eC durante 24 h. Los experimentos se repitieron tres veces. Cada muestra se examinó microscópicamente (OLYMPUS CX41 ) para el recuento de parásitos utilizando la cámara de Neubauer.
ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VÍTRO: FORMAS INTRACELULARES.
Ensayo de amastigotas
Las células Vero se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridos mediante tripsinización. Para ello, se eliminó el medio de cultivo, seguidamente se cubrió la superficie celular con EDTA-tripsina y se incubó en frío durante 5 minutos según la metodología expuesta anteriormente. Tras ello, se pasó a un frasco de fondo cónico de 25 mi de capacidad (Steriling) para centrifugarlos a 800 rpm durante 5 minutos, retirándose el sobrenadante y se cuentan en cámara de Neubauer. Resuspendiendo las células a una concentración de 1 x104 células/ml en medio RPMI para las células Vero, cultivándose en placas de 24 pocilios, en las que previamente se había introducido un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm en cada pocilio. Para su adherencia, se dejaron crecer las células 24 h a 37eC en 5% C02.
Una vez adheridas las células, se infectaron "in vitro" las células Vero con 5x104 células/ml de formas tripomastigotas de T. cruzi, obtenidos según la metodología citada anteriormente. La infección se mantiene durante 24 horas para que el parásito entre a la célula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para sacar la IC50 (100, 50, 25, 10 y 1 μΜ). A las 72 horas de la incubación, se procedió a la retirada de los cristales.
Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les añadió DPX (Panreac®), medio de montaje para microscopía. Se tiñeron con Giemsa, para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyó 0,2 mi de Azur-Eosina-Azul de Metileno solución según Giemsa DC (Código 251338) con 2 mi de tampón Sórensen (dilución 1 :10), se mezcló bien y se cubrió la preparación dejando colorear durante 20 minutos. Se lavó con agua destilada. Se dejó escurrir y secar en posición vertical. Por último se
examinó con el objetivo de inmersión y se contó el número de amastigotas intracelulares en un total de 200 células.
Los datos obtenidos en los ensayos anteriores se resumen en la Tabla 3. Tabla 3.- Actividad in vitro, toxicidad e índice de selectividad de los compuestos escuaramídicos evaluados en formas extracelulares e intracelulares de Trypanosoma cruzi.
IC50 (MMf Toxicidad ISC
IC50 Epimastigote Amastigote
Compuesto Epimastigote Amastigote Cel. Vero intracelular intracelular (MM)b
Benznidazol 15,9±1,1 23,3±4,6 13,6±0,9 0,8 0,6
(9) 96,9±4,2 34,7±1,3 337,5±18,5 3,5 (4) 9,7(16)
(8) 21 ,1±3,8 6,0±0,4 147,8±8,4 13,3 (17) 24,6(41)
(7) 17,5±7,0 14,3±6,4 260,2±11,3 14,9 (19) 18,25 (30)
(10) 49,8±2,7 22,4±1,7 90,1±6,2 1,8(2) 3,4 (6)
(13) 44,9±3,0 26,3±1,5 151,4±7,4 3,4 (4) 5,7(10)
(11) 107,2±6,3 38,5±5,7 57,6±6,8 0,5(1) 1,5(2)
(12) 60,8±1,4 39,2±2,0 74,2±3,2 1,2(1) 1,9 (3)
(14) 35,7±1,1 23,8±2,5 54,8±3,4 1,5(2) 2,3 (4)
(15) 45,5±2,7 23,4±0,7 25,3±1,6 0,6(1) 1,1 (2)
(16) 17,3±2,0 66,9±1,2 21 ,6±3,1 1,2 (2) 0,3(1)
(2) 11,4±0,4 14,5±0,4 453,1 ±22,6 39,8 (50) 31,2 (52)
(17) 15,9±0,3 10,1 ±1 ,0 12,9±1,2 0,8(1) 1,3 (2)
(18) 50,8±4,1 44,0±1,9 228,3±12,5 4,5 (6) 5,2 (9)
(19) 26,3±2,0 18,4±0,8 21,5±1,2 0,8(1) 1,2 (2)
(20) 89,1 ±4,5 72,6±5,3 36,6±3,0 0,4 (0) 0,5 (0)
(21) 20,4±3,0 17,4±0,3 28,6±0,7 1,4 (2) 1,6(3)
(22) 18,5±1,1 17,1±0,4 300,7±22,7 16,2 (20) 17,5(29)
(23) 96,2±7,2 46,0±2,6 11,4±0,5 0,1 (1) 0,2(1)
(24) 118,9±7,8 43,9±2,7 73,1±5,3 0,6(1) 1,7(3)
Los resultados representan la media obtenida en cuatro experimentos separados. a. IC50 = concentración requerida para dar el 50% de inhibición, calculada por análisis de regresión lineal a partir de los valores Kc en las concentraciones utilizadas (1 , 10, 25, 50 and 100 μΜ).13 Frente a células Vero después de 72 h de incubación."3 índice de selectividad =IC50 Células Vero/IC50formas extracelulares e intracelulares del parásito. Entre paréntesis: número de veces que el compuesto excede el índice de selectividad de la droga referencia (para formas extracelulares e intracelulares del Trypanosoma cruzi). Tablas 4 y 5 - Actividad ¡n Vitro, Toxicidad e índice de Selectividad encontrados para los compuestos 3 a 6 en formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi.
Tabla 4
Tabla 5
aIC50 = la concentración requerida para obtener el 50% de inhibición, calculada por regresión linear del análisis de los valores Kc a las concentraciones empleadas (1 , 10, 25, 50 and 100 μΜ).
"Sobre células Vero después de 72 h de cultivo.
cíndice de Selectividad=IC50 Células Vero/IC50 formas extracelulares e intracelulares parasitarias. Entre paréntesis: número de veces que el compuesto supera al índice IS de la droga de referencia.
Estos valores se han comparado con los valores obtenidos para el Benznidazol ya que se trata del fármaco comúnmente utilizado para el tratamiento de esta enfermedad. Los resultados obtenidos indican que en general los compuestos escuaramídicos son menos tóxicos que el Benznidazol frente a células Vero con valores de IC50 entre 10 y 30 veces superiores que el IC50 del compuesto referencia. En algunos casos como el compuesto (8), (7) o (2) su actividad es mucho mayor que el compuesto referencia ya que presentan valores de IC50 menores tanto en formas extracelulares como intracelulares. De acuerdo con estos resultados estos compuestos tienen índices de efectividad elevados con valores de índices de selectividad comprendidos entre 20 y 50. Todo ello indica que dichos compuestos presentan una actividad adecuada para su uso como agentes anti T. cruzi. Ensayos In vivo de la actividad tripanocida
Los ensayos in vivo se realizaron para la determinación de los siguientes aspectos:
- determinación del efecto de los compuestos usados en los niveles de parasitemia después del tratamiento, calculando la actividad parasitaria en una cámara de Neubaues como marcador de la fase aguda,
- medida de la reactivación de la parasitemia después de la inmunosupresión como marcador de la fase crónica,
- realización de ensayos ELISA para determinar la respuesta inmunológica y comparar los niveles de IgG en las fases aguda y crónica,
- detección de la presencia del parásito mediante PCR en órganos y
- estudio del nivel de daño en el tejido cardiaco mediante estudios histopatológicos.
Grupos de tres ratones hembra BALB/c de entre 6-8 semanas de edad y peso 20-25 g, se mantuvieron bajo condiciones estándar. Se infectaron mediante vía intraperitoneal con 1 x 105 formas sanguíneas de T. cruzi. Los animales se dividieron en los siguientes grupos:
(I) Grupo 1 : no infectado (no infectado y no tratado)
(II) Grupo 2: no tratado ( infectado con T. cruzi ero no tratado)
(III) Grupo 3: tratado (infectado y tratado con 1 mg/kg peso/día durante 5 días consecutivos, 5-10 días después de la infección, mediante vía intraperitoneal, con los compuestos probados y benzinidazol).
Una muestra sanguínea (5 μί) se extrajo de la vena mandibular de cada ratón tratado y se diluyó a concentración 1 : 100 con PBS. El número de formas trypomastigote de T. cruzi se registró cada 2 días desde los 5 a 60 días post-infección utilizando una cámara de Neubauer. El número de parásitos se expresa como parásitos/mL.
Los anticuerpos frente al Trypanosoma cruzi presentes en el suero circulatorio, en los días 40 y 120 post-infección se evaluaron cuantitativamente mediante ensayos ELISA (enzyme-linked immunoassay). El suero se obtuvo a partir de la sangre por centrifugación y se diluyó a concentración 1 :80 en PBS. El antígeno se compone de una isoforma excretada de enzima Fe-SOD de epimastigotes T. cruzi. Los resultados obtenidos se expresan como la relación entre la absorción de cada muestra a 490 nm respecto al valor máximo estimado. El valor máximo estimado se calcula como la media de los valores obtenidos en los controles negativos (no tratados) más tres veces la desviación estándar.
Después del día 150 post-infección, los grupos de ratones tratados cuyos niveles de parasitemia hubieron decrecido de forma significativa se sometieron a tres ciclos de inmunosupresión con monohidrato de ciclofosfamida. El experimento finalizó con la sangría completa de los ratones y la extracción de los órganos objetivo, corazón e hígado. La sangre recogida se usó para el control del tanto por ciento de reactivación de los niveles de parasitemia y para la determinación de la concentración de Ig-G en el suero mediante ensayos ELISA como se ha indicado anteriormente y con el objetivo de conocer el perfil del cambio en el nivel de antígenos asociado a la presencia del parásito en sangre. Finalmente, tras la extracción de los corazones e hígados, estos se cortaron longitudinalmente. Una de las mitades se utilizó para obtener el DNA total y después se llevó a cabo una PCR para un fragmento en el gen SOD del T. cruzi de acuerdo a un par de cebadores diseñados TciSOD_d: ATG GTC TTC AGC ATT CCT
CC (SEQ NO: 1 , TciSOD_r: GTT GAT CTC GTC GGC AAC TT (SEQ NO: 2) que permite la detección del DNA del T. cruzi en diferentes muestras biológicas. La otra mitad del órgano, en el caso del hígado, se utilizó para llevar acabo análisis histopatológicos, por lo que se lavó en PBS frío (0e C) y se fijó en una disolución tampón con un 10% de formalina. Los tejidos se deshidrataron y fueron embebidos en parafina. Se cortaron secciones de 4-5 μηι de grosor y se tiñeron con Tricomo, siguiendo el protocolo de Masson. Los portaobjedos con muestras se marcaron para un análisis ciego. Los exámenes histológicos se realizaron utilizando un microscopio óptico convencional. Cada muestra se visualizó a menos en 30 campos diferentes (aumentos totales: x 40, x 100, x 200 y x 400) Las alteraciones histológicas recibieron una puntuación de 0 (-) a 5 (+++++), donde 0 representa la ausencia de alteraciones y 5 representa las alteraciones más severas.
Como definición de cura, se consideran curados aquellos animales inoculados con T. cruzi y tratados cuya parasitemia no se repite después de los ciclos de inmunosupresión y cuyas secciones histológicas no presentan nidos amastigote u otra forma de parásitos.
Estos experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación de la Comisión de Ética de la Universidad de Granada.
Los resultados in vivo durante la fase aguda de la infección muestran que el compuesto 2 fue el que redujo en mayor porcentaje la parasitemia (67%) (Figura 1 ). Los estudios de la fase crónica muestra que el compuesto 2 solamente se reactiva en un porcentaje mínimo (3,1 %, Figura 2) tras la inmunosupresión, en comparación con el control donde se reactiva prácticamente el 100%, este resultado se confirma con el mantenimiento de los niveles de IgG (Figura 2). Mediante los estudios de PCR se demuestra la prácticamente curación, tanto en ratones tratados con el producto 2 y no inmunodeprimidos como los tratados e inmunodeprimidos.
Claims
1 . Uso de un compuesto de fórmula general (I):
(
donde:
Ri se selecciona de entre -NRaRb o -ORc, donde: Ra se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); Rb se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido, -(CH2)x-NR1 'R1 " o -(CH2)x-C02Ri"'; x tiene un valor de 0 a 5 y R , R/' y R " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5); Rc se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5);
R2 se selecciona de la lista que comprende arilo, opcionalmente sustituido; heterociclo, opcionalmente sustituido; aralquilo (C1-C5), opcionalmente sustituido; alquilo (CrC20); -(CH2)X-NR2 'R2 "; o -(CH2)y-R4, donde y tiene un valor de 0 a 5, x tiene un valor de 0 a 5 y R2 'y R2 " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5);
R3 se selecciona de entre hidrógeno y alquilo (CrC5); y
R4 es el grupo de fórmula (II):
(II)
donde: X se selecciona de la lista que comprende -NR4 '-, -CH- y arilo, opcionalmente sustituido; y donde R4 ' se selecciona de entre hidrógeno y alquilo
(CrCs),
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades parasitarias.
2. Uso según la reivindicación anterior, donde Ra es hidrógeno o metilo.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde Rb es fenilo.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde Rb es el grupo. -(CH2)X- NRi 'Ri " y Ri ', Ri " y x está definido en la reivindicación 1 .
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4, donde R y R/' se seleccionan de manera independiente entre alquilo (CrC4).
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4 ó 5, donde R y R/' son metilo o butilo.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4 a 6, donde x es 2 ó 3.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4, donde Rb es -NH2.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Rb es el grupo -(CH2)X- C02Ri " ', x tiene el valor de 1 , 2 ó 3 y R/" es hidrógeno.
10. Uso según la reivindicación 1 , donde Ri es -OH.
1 1 . Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3 es hidrógeno o metilo.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R2 es un grupo piperidina, opcionalmente sustituido.
13. Uso según la reivindicación anterior, donde la piperidina está sustituida por un grupo bencilo.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 donde R2 es un grupo fenilo, opcionalmente sustituido.
15. Uso según la reivindicación anterior, donde el grupo fenilo está sustituido por al menos un grupo seleccionado de la lista que comprende hidroxilo, éster o grupo - (CH2)X-NR'R", donde x tiene un valor de 0 a 5 y R'y R" se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo (CrC5).
16. Uso según la reivindicación anterior, donde el grupo fenilo esta sustituido por un éster, hidroxilo, -NH2, -CH2-NH2, o -N(CH3)2.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , donde R2 es un grupo alquilo (C4-C15).
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , donde R2 es bencilo, opcionalmente sustituido.
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , donde R2 es -(CH2)y-R4 y el compuesto es de fórmula (III):
20. Uso según la reivindicación anterior, donde X es un fenilo, opcionalmente sustituido.
21 . Uso según la reivindicación 19, donde X es el grupo -CH-.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , donde y es 1 .
23. Uso según la reivindicación 19 donde X es -NR4 '-, donde R4 ' está definido en la reivindicación 1 .
24. Uso según la reivindicación anterior, donde R4 ' es metilo.
25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde y es 3.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, donde R3 es hidrógeno.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, donde Ri es -NRaRb, Ra es metilo y Rb es el grupo -(CH2)x-NR1 'R1 ", donde R/ y R/' son metilo y x es 2 o 3.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los compuestos están en forma de sales de halógeno.
29. Uso según la reivindicación 1 , donde el compuesto se selecciona de lista:
- 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona 3-(butilamino)-4-(1 -metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
3-((1 -benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona
- ioduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N trimetiletan amonio
benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)
- ioduro de 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N-
- trimetiletanamonio;
ioduro de 2-((2-(bencilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio;
- ácido 2-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)acético;
- ácido 3-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)propanoico;
- ácido 4-((2-(butilamino)-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino)butanoico;
3-((4-(dimetilamino)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1 ,2-diona
3- idroxi-4-((2-hidroxifenil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona;
3-((4-(aminometil)fenil)amino)-4-hidroxiciclobut-3-en-1 ,2-diona;
- 4,4'-(((metilazanediil)bis(propano-3,1 -diil))bis(azanediil))bis(3-((3-
- (dimetilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona);
- ioduro de 3,3'-(((((metilazanediil)bis(propano-3, 1 -diil))bis(azanediil))bis(3,4- dioxociclobut-1 -en-2,1 -diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetilpropan-1 -amonio);
- 4,4'-(propano-1 ,3-diilbis(azanediil))bis(3-((3-dimetilamino)propil)amino)ciclobut- 3-en-1 ,2-diona); y
- ioduro de 2,2'-((((1 ,3-fenilenebis(metilene))bis(azanediil))bis(3,4-dioxociclobut- 1 -en-2,1 -diil))bis(azanediil))bis(N,N,N-trimetiletanamonio).
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad parasitaria es una enfermedad parasitaria protozoaria.
31 . Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los parásitos pertenecen a la familia Trypanosomatidae, preferiblemente del género Leishmania o Trypanosoma, más particularmente la especie Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmaniainfantum o Leishmaniabrazilensis.
32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad es leishmaniasis o tripanosomiasis.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las enfermedades son leishmaniosis o enfermedad de Chagas.
34.
35. Un compuesto de fórmula general (IV):
(IV)
donde:
Ri es un grupo -NRaRb, donde: Ra es un alquilo CrC3; y Rb es el grupo -(CH2)X- NR R ', donde x tiene un valor de 0 a 5 y R y R/' se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5);
R2 se selecciona de un grupo alquilo (C1-C20) o un grupo -(CH2)x-NR2'R2" ; x tiene un valor de 0 a 5 y R2 'y R2 " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC5); y
R3 se selecciona de entre hidrógeno o un alquilo (CrC5);
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
36. Compuesto según la reivindicación anterior, donde Ra es un metilo.
37. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 ó 35, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NR1 'R1 ", x tiene un valor de 1 a 5 y R/y R/' se seleccionan de manera independiente un alquilo (CrC3).
38. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NR1 'R1 ", x tiene un valor de 1 a 5 y R/y R/' son metilo.
39. Compuesto según la reivindicación anterior, donde x es 3.
40. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 ó 35, donde Rb es el grupo -(CH2)x-NRi 'Ri "; x es 0 y Ri 'y Ri " son hidrógeno.
41 . Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, donde R2 es un alquilo (C4-Ci2).
42. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, donde R2 es un grupo -(CH2)X-NR2 'R2 "; x tiene un valor de 1 a 5 y R2 'y R2 " se seleccionan de manera independiente entre hidrógeno y alquilo (CrC3).
43. Compuesto según la reivindicación anterior, donde x es 3 y R2 'y R2 "son metilo.
44. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, donde R3 es hidrógeno o metilo.
45. Compuesto según la reivindicación 34, seleccionado de la lista:
- 3-(butilamino)-4-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2- diona;
3-(butilamino)-4-(1 -metilhidrazinil)ciclobut-3-en-1 ,2-diona;
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(octilamino)ciclobut-3-en-1 ,2- diona;
- 3-((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)-4-(dodecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2- diona; y
- 3,4-bis((3-(dimetilamino)propil)(metil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona.
46. Compuesto seleccionado de la lista:
- 3-((1 -benzilpiperidin-4-il)amino)-4-(fenilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona;
- 3-(butilamino)-4-((3-(dibutilamino)propil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona;
- 3-(butilamino)-4-((2-(dimetilamino)etil)amino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona;
- 3-((2-(dimetilamino)etil)amino)-4-(pentadecilamino)ciclobut-3-en-1 ,2-diona; loduro de 2-((3,4-dioxo-2-(pentadecilamino)ciclobut-1 -en-1 -il)amino)-N,N,N- trimetiletanamonio; y
Benzoato de etil 4-((2-hidroxi-3,4-dioxociclobut-1 -en-1 -il)amino).
47. Procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula (IV) según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 44, que comprende hacer reaccionar un éster de monoescuaramida de fórmula general (V) con una amina de fórmula general (VI):
donde: Et es etilo y Ra, Rb, R2 y R3 se han descrito en las reivindicaciones 34 a 44.
48. Composición farmacéutica que comprende un compuesto descrito según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 45, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
49. Uso del compuesto descrito según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 45, para la elaboración de un medicamento.
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