ES2614131B2 - Derivados de 5-NITROINDAZOL y su uso como agentes antiprotozoarios - Google Patents

Abstract

Derivados de 5-nitroindazol y su uso como agentes antiprotozoarios.#La presente invención se refiere a dos familias de derivados de 5-nitroindazol que poseen propiedades antiparasitarias y a su empleo para la fabricación de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de infecciones causadas por protozoos patógenos de las familias Trypanosomatidae y Trichomonadidae, tales como la enfermedad de Chagas, la leishmaniosis y la tricomonosis.

Description

DERIVADOS DE 5-NITROINDAZOL y SU USO COMO AGENTES ANTIPROTOZOARIOS

Sector de la Técnica La presente invención se refiere a dos familias de compuestos derivados de 5nítroindazol, a su procedimiento de preparación y a su uso para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de infecciones, particularmente las provocadas por protozoos de las familias Trypanosomatidae y Trichomonadidae. La invención, por tanto, se engloba dentro del sector farmacéutico.

Estado de la técnica Los protozoos son los agentes etiológicos de varias de las principales enfennedades parasitarias.'Muchas de estas infecciones se concentran en las zonas más pobres del planeta y se consideran "enfermedades tropicales desatendidas". Los tratamientos farmacológicos existentes para muchas de estas protozoosis están lejos de ser satisfactorios y el desarrollo de una vacuna es un objetivo todavía inalcanzado. Las terapias existentes en la actualidad no son adecuadas debido esencialmente a varios factores, tales como los índices terapéuticos bajos que conducen a altas toxicidades y efectos secundarios inaceptables, la aparición de parásitos resistentes, la dificultad de cwnplimiento del tratamiento debido a protocolos complejos, los altos precios que están fuera del alcance de los pacientes en los países afectados, etc.

La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana), ocasionada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi (fam. Trypanosomatidae), es una antropozoonosis transmitida principalmente a través de las heces contaminadas de chinches hematófagas. Se estima que en todo el mundo hay unos 7 millones de personas infectadas y alrededor de 25 millones más en riesgo de contraer la enfermedad, que provoca más de 7.000 muertes anuales, principalmente en 21 países latinoamericanos donde es endémica (WHO, lnvesting fa overcome the global impact 01 Neglected Tropical Diseases. Third WHO reporl on Neglected Tropical Diseases, 2015). Sin embargo, la existencia de otras rutas de transmisión alternativas a la vectorial (transfusión de sangre contaminada, trasplante de órganos infectados o por vía congénita), junto con las migraciones internacionales producidas en las últimas décadas, han hecho de la enfennedad de Chagas una patología emergente en diversos países desarrollados; en España, se estima que puede haber unas 85.000 personas infectadas, principalmente de origen boliviano (Schmunis, G.A. y Yadon, Z.E.~ Acta Trop. 2010,115,14-21).

La enfennedad de Chagas presenta una fase aguda inicial de entre 1-2 meses de duración, generalmente asintomática o leve y Con parasitemia detectable. Tras una fase indeterminada, entre el 30-40% de los pacientes evolucionan hacia una fase crónica que se manifiesta 10-30 años después de la infección. Esta se caracteriza por la presencia de lesiones cardiacas y digestivas irreversibles, que surgen como consecuencia de lesiones inflamatorias (Rassi Jr., A. et al., Lance! 2010, 375, 13881402) producidas por la persistencia del parásito junto con reacciones de carácter auto inmune (Mari n-Neto, J.A. et al., Circulation 2007, 115, 1109-1123).

Actualmente no se dispone de vacuna ni tratamiento completamente eficaz para la enfermedad de Chagas. Los dos únicos fármacos hasta hoy disponibles, los rutroheterociclos nifurtimox y benznidazol, se desarrollaron hace más de cuarenta años (Coura, J.R. et al., Mem. 1nst. Oswaldo Cruz 2009, 104, 549-554). Ambos son bastante efectivos en la fase aguda, pero su eficacia en la fase crónica es muy limitada. Por otra parte, la aparición de cepas de T cruzi resistentes a estos fármacos ha dado lugar a variaciones en su eficacia ligadas a la zona geográfica. Además, ambos compuestos presentan efectos secundarios de carácter severo, pero el benznidazol es mejor tolerado por los pacientes y generalmente se considera el tratamiento de elección para la enfennedad de Chagas (Urbina, J.A., Acta Trop. 2010, 1/5, 55-68; Rassi Jr., A. et al., Lancet2010, 375, 1388-1402).

En los últimos años se han descrito muchos compuestos con actividad antichagásica, así como diferentes dianas moleculares potenciales del parásito (Guedes, P.M.M. et al., Expert Rev. Anti-InJect. Ther. 2011, 9, 609-620; Urbina, J.A., Acta Trop. 2010, 1/5, 55-68; Cerecetto, H. y Gonzá1ez, M., Pharmaceuticals 2010, 3, 810-838; Sánchez-Sancho, F. el al., Curro Med Chem. 2010, 17,423-452; Soeiro, M.N.C. y de Castro S.L., Expert Opino Ther. Targets 2009, 13, 105-121).

Especial interés han despertado los azoles antifúngicos inhibidores de la síntesis de esteroles, pero estudios clínicos recientes han resultado muy decepcionantes, mostrando que estos compuestos son bastante menos efectivos que el benznidazol, al menos como quimioterapia única (Chatelain, E., J Biomo/. Screen. 2015,20,22-35).

Todos estos hechos ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y, por otra parte, se ha señalado recientemente que los derivados nitroheterocíclicos siguen representando la única alternativa real en la lucha antichagásica (Moraes, c.s. et al., Sci. Rep. 2014, 4,4703; DOJ:10.1038/srep04703).

Se ha descrito también la actividad antichagásica de diversos 5-nitroindazoles con estructuras y patrones de sustitución completamente diferentes de los que poseen los compuestos incluídos en esta invención: l-alquiJindazol-3-oles (Arán, V.J. el al., Bioorg. Med e hem. 2005,13, 3197-3207; Boiani, L. et al., Eur. J Med. e hem. 2009, 44, 1034-1040), 3-alcoxiindazoles (Montero-Torres_ A. et al., Bioorg. Med ehem. 2005, 13, 6264-6275), 3-alcoxi-l-alquilindazoles (Arán, V.J. et al., Bioorg. Med. ehem. 2005, J3, 3197-3207; Boiani, L. et al., Eur. J Med. ehem. 2009, 44, \0341040; Rodríguez, J. et al., Eur. J Med. ehem. 2009, 44, 1545-1553; Rodríguez, J. et al., Bioorg. Med. ehem. 2009, 17,8 186-8196; Vega, M.C. et al., Eur. J Med. ehem.

2012, 58,214-227; Muro, B. et al., Eur. J Med. e hem. 2014, 74, 124-134), indazolin3-onas 1,2-condensadas (Díaz-Urrutia, c.A. el al., Spectrochim. Acta A 2012, 95, 670678) Y 1,1 '-hidrocarbilenbis(3-alcoxi-y 3-hidroxiindazoles) (Aguilera-Venegas, S. et al., Int. J Electrochem. Sci. 2012, 7, 5837-5863).

También se conoce la actividad frente a Trypanosoma brucei rhodesiense, agente etiológico de la enfermedad del sueño africana, de diversos derivados de 5nitroindazol: l-alquil-y l-arilindazol-3-oles, 2-alquilindazolin-3-onas, 3alcoxiindazoles, 3-alcoxi-l-alquilindazoles, indazolin-3-onas 1,2-condensadas, y 1,1'hidrocarbilenbis(3-alcoxiindazoles) (Arán, V.J. el al., Bioorg. Med. Chem. Lea. 2012, 22, 4506-4516), asi como las propiedades leishmanicidas de algunos 3-a1coxi-lalquilindazoles (Boiani, L. et al., Eur. J. Med. ehem. 2009,44, 1034-1040; Marin, C. et al., Acta Trop. 2015, 148, 170-178) que habian mostrado previaruente actividad frente a T. cruzi.

En la presente invención se proponen 5-nitroindazolin-3-onas 1,2-disustituidas como agentes antichagásicos.

En este contexto, se ha descrito en los últimos años la síntesis y propiedades antichagásicas de algunas indazolinonas relacionadas (Montero-Torres, A. el al., Bioorg. Med ehem. 2005, 13, 6264-6275; Vega, M.C. et al., Eur. J. Med ehem. 2012,58,214-227; Mura, F. et al., J. Spectrosc. Dyn. 2013,3, articulo 8; FonsecaBerzal, C. et al., Parasitol. Res. 2014, 113, 1049-1056), asi COmO la escasa actividad anti-T cruzi de los 3-alcoxi-2-alquilindazoles isómeros (Vega, M.C. el al., Eur. J. Med ehem. 2012, 58, 214-227; Mura, F. et al., J. Spectrosc. Dyn. 2013, 3, 8; Fonseca-Berzal, C. et al., Parasitol. Res. 2014, 113, 1049-1056).

También se conoce la actividad frente a T. brucei rhodesiense (Arán, V.J. el al., Bioorg. Med. ehem. Letl. 2012,22, 4506-4516) de algunas 5-nitroindazolinonas 1,2disustituidas, así COmo sus propiedades antiinflamatorias (Marrero-Ponce, Y. et al., Eur. J. Med. ehem. 2011, 46, 5736-5753).

Las indazolin-3-onas 1,2-disustituidas previamente publicadas presentan en posición l grupos alquilo simples (metilo, propilo, isopropilo, butilo y pentilo) o bencilo. En la presente invención se muestra cómo estos grupos pueden ser sustituidos por grupos alquilo complejos, conteniendo insaturaciones o di versas funcionalidades variadas (halógeno, carboxilo, éster, éter, alcohol, amida, etc.) o por grupos aciJo O sulfonilo, pudiéndose obtener compuestos más acti vos y menos tóxicos que los previamente conocidos además de aumentar la solubilidad en agua de los compuestos mediante la introducción de grupos polares pudiendo presentar, así, un comportamiento farmacocinético más apropriado.

Por otra parte, Tríchomonas vaginalis (fam. Trichomonadidae) es el agente causal de la tricomonosis, una infección de transmisión sexual (ITS) responsable de más del 50% de todas las ITS curables del mundo. Según los últimos datos estimados por la Organización Mundial de la Salud y publicados en 2012, se producen más de 276 millones de infecciones cada año (WHO, Global incidence and preva/ence 01seJecled curable sexually Iransmitted diseases -2008, 2012).

Este protozoo es transmitido únicamente mediante contacto sexuaL Se caracteriza por mostrar un amplio rango de manifestaciones clínicas que pueden ocasionar casos graves de inflamación de conductos genitourinarios acompaftados de una leucorrea característica, eritema, prurito, disuria, infertilidad o la formación de pequeñas lesiones denominadas "colpitis macularis" en el cuello uterino, En el hombre, esta infección puede derivar en una uretritis no gonocócica y la alteración de la viabilidad y movilidad espermática (Swygard, H. et al., Sexo Transm. Infeel. 2004,80, 91-95; Lewis, D.A., Medicine (Ba/limore) 2010, 38, 291-293). Sin embargo, los estudios epidemiológicos revelan que al menos la mitad de las mujeres así como el 80% de los varones infectados no presentan síntomas, convirtiéndose en portadores asintomáticos y potenciales transmisores de esta infección.

La tricomonosis urogenital humana se ha asociado a distintas complicaciones como problemas durante la gestación o neonatos con bajo peso, partos prematuros, etc.

(Cotch, M.F. et aL, Sexo Transm. Dis. 1997, 24, 353-360). Asimismo, esta ITS

también aumenta el riesgo de desarrollo de neoplasia cervical (Viikki, M. et al., Acta

Oneo/. 2000, 39, 71-75) Y de próstata (Sutcliffe, S. et al., Caneer Epidemio/.

Biomarkers Prevo 2006, 15, 939-945), así como una mayor predisposición a la coinfección con otras ITS de origen bacteriano, vírico, etc. (Schwehke, J.R. y Burgess,

D., Clin. Mícrobio/. Rev. 2004, /7, 794-803; Cherpes, T.L. et aL, Sexo Transm. Dis. 2006, 33, 747-752; Allsworth, l.E. el al., Sexo Transm. Dis. 2009, 36, 738-744; McClelland, R.S. et aL, J Infeet. Dis. 2007, 195, 698-702).

La tricomonosis se trdta preferentemente con el nitroheterociclo metronidazol, introducido en el mercado hacia 1960. Actualmente, el metronidazol y el tinidazol, ambos de la misma familia de 5-nitroimidazoles, son los dos únicos medicamentos aceptados por la Food and Drug Administration (FDA) para tratar esta ITS (Crowell,

A.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 4 7, 1407-1409). Sin embargo, no existen alternativas eficaces para aquellos pacientes que desarrollen efectos secundarios, que muestren hipersensibilidad o en los que su uso esté contraindicado. Por otra parte, se estima que aproximadamente el 5% de los casos diagnosticados de tricomonosis son causados por un aislado resistente a nitroimidazoles (Vázquez, F. el al., Enferm. Infecc. Microbio/. Clin. 2001,19,114-124).

Por todo ello, es necesaria la búsqueda de alternativas fannacológicas para el tratamiento de esta enfermedad. En la presente invención se proponen 3-a1coxi-2alq uil-2H-indazo les.

Se ha estudiado la actividad tricomonicida de ciertas indazolin-3-onas 1,2disustituidas (Ibáñez Escribano, A. et aL, Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2012, 107,637643), así como la de diversos derivados de 5-nitroindazol con estructuras y patrones de sustitución completamente diferentes de los que poseen los compuestos objeto de esta invención: l-alquilindazol-3-o1es (Marrero-Ponce, Y. et al., Curro Drug Discov. Techno/. 2005,2,245-265; Marrero-Ponce, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 6502-6524), 2-alquilindazol-3-onas, 3-alcoxiindazoles, indazol-3-onas 1,2condensadas y 1,1 '-hidrocarbilenbis(3-hidroxiindazoles) (Marrero-Ponce, Y. et al., Curro Drug Discov. Techno/. 2005,2, 245-265), Y 3-alcoxi-I-alquilindazoles (Arán,

V.J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2005, 13. 3197-3207). Pero la actividad frente a T vaginalis de los 3-alcoxi-2-alquilindazoles, objeto de esta invención, no se encuentra descrita en la literatura.

Descripción detallada de la invención

Derivados de 5-nitroindazol y su uso COmO agentes antriprotozoarios.

La presente invención se refiere a dos grupos de compuestos derivados de 5nitroindazol, fácilmente asequibles, que poseen actividad biológica frente a determinados protozoos patógenos,

5 Un primer aspecto de la invención se refiere a dos diferentes tipos de compuestos, de fórmulas generales (1) y (11). Los compuestos de tipo (1) son 5-nitroindazolin-3-onas 1,2-disustituidas y presentan, en general, actividad frente a Trypanosoma cruz;, mientras que los de tipo (11) son 3-alcoxi-2-alquil-2H-indazoles que presentan actividad frente a Trichomonas vaginalis.

Fórmula (1) Fórmula (11)

donde R puede ser:

15 -un grupo alquenilo o alquinilo de 2-6 átomos de carbono y con el enlace múltiple en las diversas posiciones posibles; se excluye especificamente la l-alil-2-bencil-5nitroindazolinona [compuesto tipo (1)] descrita como intermedio sintético en una

patente [Qin, D. et al. (GSK), W020l2l62l29 Al].

20 -un grupo polimetilénico de longitud variable [(CH2)n, n = 1-6] con sustituyentes terminales de tipo Br, OH, eOOR (R ~ H o alquilo de 1-5 carbonos), eONR'R' (R' y/o R' ~ H o alquilo de 1-5 carbonos), eN u OR (R ~ grupos alquilo o acilo de 1-5 carbonos).

25 -un grupo alcoxicarbonilo con el grupo alcoxilo de 1-5 átomos de carbono.

-

un grupo acilo alifático (de 1 a 5 átomos de carbono) u aromático (benzoilo o benzoilo o benzoilos diferentemente sustituidos en las posiciones 2, 3 o 4 con grupos

tales como F, el, Br, OH, OR, NH" NO, o eN).

-

un grupo sulfonilo alifático o aromático,

y X puede ser cualquier sustituyente de los que pueden encontrarse habitualmente en las posiciones 2, 3 o 4 de un grupo bencilo, tales como grupos alquilo sencillos o ramificados de 1-5 átomos de carbono, grupos trifluorometilo (CF3), átomos de

halógeno (F, CI, B), grupos hidroxilo o alcoxilo (OH y OR; R ~ alquilo), grupos

arnino primario, secundario o terciario (NH2, NHR, NR2; R = alquilo), nitro (N01) o

ciano (CN).

En compuestos de tipo (1), cuando R = CH2COOH, se excluyen específicamente derivados con dos átomos de halógeno en el sustituyente bencilico que han sido

estudiados como inhibidores de .Idosa reductas. (Malamas, M.S. y Millen, 1., J Med ehem. 1991,34,1492-1 503).

En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto [Fórmula (I)] que se selecciona de la lista siguiente:

2-Bencil-5-nitro-I-prop.rgil-1 ,2-dihidro-3H-ind.zol-3-on. (2) 2-Bencil-I-(2-bromoetil)-5-nitro-I,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (3) 2-Bencil-l-(3-bromopropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona (4)

2-Bencil-l -(metoxicarbonil)metil-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (S) 2-Bencil-I -cianometil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (6)

2-Bencil-I-[2-(metoxicarbonil)etil]-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-ind.zol-3-ona (7) 2-Bencil-I-[3-( etoxicarbonil)propil]-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (8) 2-Bencil-I-(2 -hidroxietil)-5-nitro-l,2 -dihidro-3H-indazol-3-ona (9) 2 -Bencil-I-(3 -hidroxipropil)-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (10) 2-Bencil-l-(2-metoxietil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-on. (11) 2-Bencil-I-etoxicarbonil-5-nitro-I,2-dihidro-3H-indazol-3-on. (12) 2-Bcncil-I-bcnciloxicarbonil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (13) l-Acetil-2-bencil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (14) 2-Bencil-l-benzoil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3 H-indazol-3-on. (15)

2-Bencil-5-nitro-l-tosil-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (16)

2-Bencil-5-nitro-l-vini1-1 ,2-dihidro-3H-i ndazol-3-ona (24) 2-Bencil-l-(2-carboxietil)-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (25) 2-Bencil-l-(3-carboxipropil)-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (26) 2-Bencil-l-(3-carbarnoilpropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (27) 2-Bencil-l-[3-(metilcarbarnoil)propil]-5-nitro-l ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona (28) 2-Bencil-I-[3-( dimetilcarbamoil)propil]-5-nitro-l ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona (29) 2-Bencil-l-(3 -etoxipropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (30) 1-(2-Acetoxietil)-2-bencil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (31)

o sus solvatos o pro fármacos.

En otra realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto [Fónnula (11») que se selecciona de la lista siguiente:

2-Bencil-3-(2-bromoetoxi)-5-nitro-2H-indazol (17) 2-Bencil-3-(3 -bromopropoxi)-5-nitro-2H-indazol (18) 2-Bencil-3 -( metoxi carbonil)metoxi -5-nitro-2H-ind azo 1 (19) 2 -Benci 1-3 -[2 -( metoxicarbonil )etoxi]-5 -ni tro-2H-indazol (20) 2-Bencil-3-(2-hidroxietoxi)-5-nitro-2H-indazol (21) 2 -Bencil-3 -(3 -hidroxi propoxi)-5-nitro-2H-indazol (22) 2-Benci 1-3-(2 -meto xiet oxi)-5-nitro-2H-indazo 1(23)

o sus solvatos o profármacos.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de un compuesto de fónnula general (1) o (H); como consecuencia del carácter tautómero de la 5-nitroindazolin-3-ona (1), algunos de estos compuestos se obtienen a la vez al hacer reaccionar el producto de partida bajo condiciones diversas con agentes alquilantes, acilantes o sulfonilantes apropiados. tal como se muestra en el Esquema 1. A partir de la forma tautómera la (forma "indazolin-3-ona") se obtienen los compuestos de fónnula general (1). mientras que la forma tautómera lb (fonna "3

hidroxi-2H-indazol) conduce a los compuestos de fórmula general (10-Las condiciones concretas para cada reacción dependen de los reactivos alquilantes, acilantes o sulfonilantes concretos, tal como se describe en los ejemplos I a-f.

Esquema 1. Ruta sintética para la preparación de los compuestos 2-16 [tipo (1)] y 1723 [tipo (11)] a partir de la 2-bencil-5-nitroindazolinona Ia,b.

Un cuarto aspecto está relacionado con la preparación de otros compuestos de fónnuJa

10 general (1) por transformación química de las cadenas en posición 1 de los productos anteriores resultantes de la alquilación, utilizando procedimientos variados (deshidrohalogenación, hidrólisis O aminólisis de ésteres, eterificación de haluros de alquilo o acilación de alcoholes), tal como se muestra en el Esquema 2.

o O'N'OJ O,N~

I N-Sn • I N-Sn'" ~' '" N' R' R' 3,4,7,8,9, 26 24-31

Compuesto R' Compuesto R'

3 ICH,),Sr 24 CH=CH,

7 [CH,),COOMe -25 [CH,I,COOH

8 [CH,hCOOEt 26 [CH,hCOOH

-

8 [CH,hCOOEt 27 [CH,hCONH,

-

8 [CH,hCOOEt 28 [CH,hCONHMe

-

26 [CH,hCOOH 29 [CH,hCONMe,

-

4 [CH,hSr 30 [CH,hOEt 9 [CH,I,OH 31 [CH, I,OAc

Esquema 2_ Rutas sintéticas para la preparación de los compuestos 24-31 [tipo (11)] a partir de los compuestos 3 , 4, 7-9 Y 26 [tipo (11)]. 5

Un quinto aspecto de esta invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula

general (1) o (11) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de

enfermedades causadas por protozoos patógenos de las familias Trypanosomatidae

(Trypanosoma, Leishmania) y Trichomonadidae (Trichomonas), preferiblemente

10 tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) y tricomonosis, causadas por los parásitos T. cruz; y T. vaginalis, respectivamente.

Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprenda un compuesto de fórmula general (1) o (11) y, al menos, un excipiente

15 fannacéuticamente aceptable (adyuvantes o vehículos farnlacéuticos aceptables); opcionalmente dicha composición puede contener también otros principios activos.

Modo de realización de la invención La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.

5 EJEMPLO 1. Preparación de los compuestos 2-16 (tipo (1)( y 17-23 (tipo (11)( a partir de la 2-bencil-S-nitroindazoJinona 1. Los compuestos recogidos en la Tabla 1 se obtuvieron mediante la alquilación, alcoxicarbonilación, acilación o sulfonilación de la 2-bencil-S-nitroindazolin-3-ona 1 con los reactivos requeridos, que se mencionan en cada caso concreto.

10 Tabla l. Compuestos preparados y estudiados.

O'N'(r,)R

O'N'Gd

I N-Sn N-Sn

' :::::.... --N'

'" N,

R

2-16,24-31 17-23

Compuesto R Compuesto R

2 CH,C=CH 14 Ac 3,17 [CH,],Sr 15 Sz 4, 18 [CH,hSr 16 Ts 5, 19 CH2COOMe 24 CH=CH2

6 CH2CN 25 [CH,I,COOH 7, 20 [CH,I,COOMe 26 [CH,hCOOH 8 [CH,hCOOEI 27 [CH,bCONH, 9, 21 [CH,I,OH 28 [CH,hCONHMe 10, 22 [CH,hOH 29 [CH,hCONMe,

11,23 [CH,I,OMe 30 [CH,hOEI 12 COOEI 31 [CH,I,OAc 13 COOSn

Las reacciones de alquilación conducen por lo general a mezclas de las 15 correspondientes indazolin-3-onas 1,2-disustituidas [2-11; compuestos tipo (1)) y de

los 3-alcoxi-2-alquil-2H-indazoles [17-23; compuestos tipo (11)]; estos últimos compuestos son generalmente productos minoritarios de reacción que en algunos casos no fueron aislados (Vega, M.e. et al., Eur. 1. Med. ehem. 2012, 58,214-227). Muchas de las reacciones de alquilación se llevaron a cabo en K2C03/DMF a 100 oc. Sin embargo, la reacción de propargilación que conduce al compuesto 2 dio mejores resultados utilizando K2C03 en acetona a reflujo, y la alquilación del compuesto 1 con bromoacetato de metilo o bromoacetonitrilo para conducir a los compuestos 5/19 y 6, respectivamente, se llevó a cabo utilizando bicarbonato sódico en acelona a 35 oc. Por olra parte, durante la alquilación del compuesto 1 a los derivados 7/20 con 3bromopropionato de metilo en DMF a 100 oc se observó intensa deshidrogenación de este último a acrilato de metilo; mejores resultados se obtuvieron llevando a cabo la reacción con K2C03 en tolueno/agua utilizando catálisis de transferencia de fase; sin embargo, también se obtuvieron notables cantidades del correspondiente ácido 25, procedente de la hidrólisis del resto éster del compuesto 7 en las condiciones bá"icas utilizadas.

Por otra parte, el tratamiento del compuesto 1 con los cloroformiatos de alquilo requeridos o con los correspondientes cloruros de acilo o sulfonilo en piridina proporcionó las I-alcoxicarbonil (12, 13), I-benzoil (15) o I-tosilindazolinona (16) deseadas. El l-acetil derivado 14 fue obtenido por tratamiento de 1 con anhídrido acético en piridina. De acuerdo con algunos resultados publicados con anterioridad, en estos procesos sólo pudieron ser aislados los correspondientes derivados 1,2disustituidos (Baiocchi, L. et al., Synthesis 1978, 633-648).

Ejemplo 10_ Preparación de los 3-(etoxicarbonil)propil (8), 2-hidroxietil (9/21), 3hidroxipropil (10/22) y 2-metoxietil (11/23) derivados. Una mezcla agitada de la 2bencilindazolinona de partida 1 (1,00 g, 3,71 mmol), el bromuro requerido (4,00 mmol) y K2CO, (0,55 g, 4,00 mmol) en DMF (20 mL) se calentó a 100 oC hasta la finalización de la reacción [CCF; 12 h (para 11/23); 12 h seguidas de 1-3 adiciones de cantidades adicionales del bromuro requerido (0,3 mmol) y, eventualmente, si es necesario, base (0,3 mmol) cada 6 h (para 8,9/21 Y 10/22)]. La mezcla se evaporó a sequedad y, después de la adición de agua (200 mL), se extrajo con CHCh (3 x 50

rnL). La fase clorofórmica concentrada se aplicó a una columna de cromatografia que

se eluyó con mezclas de c1orofonno/acetona (50: 1 a 25: 1) (para 8 y 11/23) o con las

mismas mezclas (10:1 a 5:1) y a continuación cloroformo/metanol (50: 1 a 25: 1) (para 9/21 y 10/22). En todos los casos, los 3-alcoxi-2-bencil-2H-indazoles (21-23) eluyeron en primer lugar, seguidos por las correspondientes 2-bencilindazolinonas l-sustituidas

(8-11).

2-Bencil-l-[3-(etoxicarbonil)propilj-5-nitro-l, 2-dihidro-3H-indazol-3-ona (8).

Rendimiento: 1,00 g (70%). Aceite que solidifica con el tiempo; pf 51-53 oC. 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: /j 8,52 (d, J ~ 2,1 Hz, IH, 4-H), 8,38 (dd, J ~ 9,0, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,62 (d, J ~ 9,0 Hz, 1H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,19 (s, 2H, CH, Bn), 4,06 (t, J ~ 7,2 Hz, 2H, 1 '-H), 3,99 (c, J ~ 7,0 Hz, CH, Et), 2,21 (t, J ~ 7,2 Hz, 2H, 3'-H), 1,53 (m, 2H, 2'-H), 1,13 (t, J ~ 7,0 Hz, CH,); 13c RMN [75 MHz, (CD,)2S0]: /j 172,00 (C-4'), 160,88 (C-3), 148,56 (C-7a), 141,32 (C-5), 136,1 1 (C-I Bn), 128,70 (C-3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 127,26 (C-2, -6 Bn), 127,19 (C-6), 120,54 (C-4), 115,62 (C-3a), 111,88 (C-7), 59,99 (CH, Et), 45,86 (C-I'), 44,70 (CH, Bn), 30,11 (C-3'), 21 ,40 (C-2'), 14,00 (CH,); EM (ES+): miz (%) 789 (29) ([2M+Nat), 767 (64) ([2M+Ht), 406 (37) ([M+Nat), 384 (100) ([M+Hn Anál. calc. para C,oH2IN,O, (383,40): C 62,65; H 5,52; N 10,96. Encontrado: C 62,50; H 5,72; N 11,17.

2-Benci1-J-(2-hidroxi el i1)-5-nilro-J,2-di hidro-3H-indazo 1-3-ona (9). Rendimiento:

0,91 g (78%). pf 137-139 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,hSO]: /j 8,49 (d, J ~ 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,3 1 (dd, J~9,3, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,60 (d, J~ 9,3 Hz, 1H, 7-H), 7,29 (m, 3H) y 7,20 (m, 2H)(H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, CH, Bn), 4,73 (t, J ~ 5, 1 Hz, 1H, OH), 4,12 (t, J ~ 4,9 Hz, 2H, I'-H), 3,45 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,),SO]: /j 160,88 (C-3), 149,23 (C-7a), 140,66 (C-5), 136,15 (C-I Bn), 128,72 (C3, -5 Bn), 127,78 (C-4 Bn), 127,20 (C-2, -6 Bn), 126,43 (C-6), 120,29 (C-4), 114,65 (C-3a), 112,42 (C-7), 58,39 (C-2'), 49,17 (C-I '), 44,78 (CH, Bn); EM (lE): miz (%) 313 (100) (~), 282 (11), 236 (6), 192 (11), 177 (9), 162 (5),146 (8), 131 (11), 103 (7). Anál. calco para CI6H"N,O, (313,31): C 61,34; H 4,83; N 13,41. Encontrado: C 61,57; H 4,69; N 13,68.

2 -Bencil-I-(3 -hidroxipropil)-5-nitro-l, 2-dihidro-3H-indazol-3-ona (JO). Rendimiento: 0,58 g (48%). Pf 141-143 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SOl: iJ 8,52 (d, J ~ 2,4 Hz, IH, 4-H), 8,36 (dd, J~ 9,3, 2,4 Hz, IH, 6-H), 7,62 (d, J~ 9,3 Hz, 1H, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,18 (s, 2H, CH, Bn), 4,58 (t, J ~ 4,8 Hz, IH, OH), 4,09 (t, J~ 7,0 Hz, 2H, 1 '-H), 3,23 (m, 2H, 3'-H), 1,45 (m, 2H, 2'-H); 13C RMN [75 MHz, (CD,)2S0]: iJ 160,88 (C-3), 148,64 (C-7a), 141,19 (C-5), 136,12 (C-1 Bn), 128,71 (C3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 127,24 (C-2, -6 Bn), 127,05 (C-6), 120,47 (C-4), 115,46 (C-3a), 111,97 (C-7), 57,50 (C-3'), 44,77 (CH, Bn), 44,08 (C-1 '),29,26 (C-2'); EM (ES+): miz (%) 350 (40) ([M+Nan, 328 (lOO) ([M+Hn. Aná!. calc. para C17H 17N,04 (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,19; H 5,57; N 13,09.

2-Bencil-l-(2-metoxietil)-5-nilro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (J J). Rendimiento:

0,78 g (64%). Pf 116-118 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: iJ 8,50 (d, J~ 2,1 Hz, IH, 4-H), 8,32 (dd, J~ 9,3, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,62 (d, J~ 9,3 Hz, IH, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,18 (s, 2H, CH, Bn), 4,23 (t, J~ 5,0 Hz, 2H, 1 '-H), 3,35 (t, J~ 5,0 Hz, 2H, 2'-H), 2,98 (s, 3H, CH,); \3c RMN [75 MHz, (CD,)2S0]: iJ 161,10 (C-3), 149,54 (C-7a), 141 ,05 (C-S), 136,13 (C-I Bn), 128,76 (C-3, -5 Bn), 127,86 (C4 Bn), 127,27 (C-2, -6 Bn), 126,73 (C-6), 120,35 (C-4), 114,92 (C-3a), 112,45 (C-7), 68,92 (C-2 '), 58,15 (CH,), 47,67 (C-1 '),44,94 (CH, Bn); EM (lE): miz (%) 327 (lOO) (M+), 282 (21), 250 (4), 236 (4), 206 (2), 177 (9), 131 (7), 103 (4). Aná!. calco para C17H17N,04 (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,57; H 5,37; N 12,57.

2-Bencil-3-(2-hidroxietoxi)-5-nitro-2H-indazol (21). Rendimiento: 0,21 g (18%). Pf 167-169 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)2S0]: iJ 8,90 (d, J~ 2,1 Hz, 1H, 4H), 7,91 (dd, J ~ 9,6, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,53 (d, J ~ 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,31 (m, SH, H aromát. Bn), 5,50 (s, 2H, CH, Bn), 5,16 (t, J~ 5,5 Hz, OH), 4,72 (t, J~ 4,5 Hz, 2H, I'-H), 3,81 (m, 2H, 2'-H); \3C RMN [75 MHz, (CD,),SO]: !J 149,99 (C-3), 146,92 (C7a), 140,19 (C-5), 135,93 (C-I Bn), 128,61 (C-3, -5 Bn), 128,01 (C-2, -6 Bn), 127,88 (C-4 Bn), 120,86 (C-4), 119,91 (C-6), 118,03 (C-7), 105,33 (C-3a), 76,43 (C-I '), 59,77 (C-2'), 51,49 (CH, Bn); EM (lE): miz (%) 313 (100) (M+), 269 (58), 252 (14),

222 (7),19\ (41), \64 (7), 149 (4), 103 (\4). Aná!. calc. para CI6H"N,O, (313,31): C 61,34; H 4,83; N 13,41. Encontrado: C 61,49; H 5,97; N 13,55.

2-Bencil-J-(J-hidroxipropoxi)-5-nitro-2H-indazol (22). Rendimiento: 0,12 g (10%). Pf 122-124 ·C (2-PrOH). lH RMN [300 MHz, (CD,),SO): Ó 8,89 (d, J= 2,1 Hz, IH, 4-H), 7,90 (dd, J= 9,6, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,53 (d,J= 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,32 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,44 (s, 2H, CH, Bn), 4,80 (t, J = 6,1 Hz, 2H, l ' -H), 4,68 (t, J = 5,2 Hz, IH, OH), 3,60 (m, 2H, 3'-H), 1,97 (m, 2H, 2'-H); DC RMN [75 MHz, (CD,),SO): ó 149,82 (C-3), 146,84 (C-7a), 140,14 (C-5), 135,81 (C-I Bn), 128,64 (C-3, -5 Bn), 127,90 (C-4 Bn), \27,82 (C-2, -6 Bn), 121,00 (C-4), 119,90 (C-6), 118,02 (C-7), 104,94 (C-3a), 71,16 (C-I'), 56,75 (C-3'), 51,64 (CH, Bn), 32,36 (C-2'); EM (ES+): miz ('lo) 350 (27) ([M+Nar), 328 (100) ([M+Hr). Aná!. calc. para C17HI7N,O, (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,09; H 5,52; N 13,09.

2-Bencil-J-(2-metoxietoxi)-5-nilro-2H-indazol (23). Rendimiento: 0,39 g (32%). Pf 109-111 ·C (2-PrOH). 1H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: ó 8,88 (d, J = 2,1 Hz, 1 H, 4H), 7,90 (dd, J= 9,6, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,53 (d, J= 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,30 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,45 (s, 2H, CH, Bn), 4,82 (m, 2H, I'-H), 3,74 (m, 2H, 2'-H), 3,32 (s, 3H, CH,); DC RMN [75 MHz, (CD,),SO): Ó 149,70 (C-3), 146,89 (C-7a), 140,28 (C5), 135,82 (C-I Bn), 128,62 (C-3, -5 Bn), 127,91 (C-2, -4, -6 Bn), 120,75 (C-4), 119,92 (C-6), 118,07 (C-7), 105,36 (C-3a), 73,70 (C-I'), 70,38 (C-2'), 58,22 (CH,), 51,61 (CH, Bn); EM (lE): miz ('lo) 327 (100) (M'), 269 (7), 252 (4), 222 (5), 191 (4), 164 (7), 149 (4), 103 (13). Aoá!. cale. para C17HI7N,O, (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,50; H 4,97; N 12,63.

Ejemplo lb. Preparación del propargil derivado Z. Una mezcla agitada de la 2bencilindazolinona 1 (1 ,00 g, 3,71 mmol), bromuro de propargilo (80% en peso en

tolueno) (4,00 mmol) y K, CO, (0,55 g, 4,00 mmol) en acetona (50 mL) se refluyó durante 12 h. La mezcla se evaporó a sequedad y, después de la adición de agua (200

rnl), se extrajo con CHCb (3 x 50 ml). La fase c1orofónnica concentrada se aplicó a una columna de cromatografia que se eluy6 con mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 30: 1) para proporcionar el compuesto 2.

2-Bencil-5-nitro-l-propargil-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (2). Rendimiento: 0,62 g (54%). Pf 163-165'C (EtOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,}2S0J: o8,52 (d, J~ 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,47 (dd, J~ 9,0, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,80 (d, J~ 9,0 Hz, IH, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromA!. Bn), 5,12 (s, 2H, CH, Bn), 4,96 (d, J ~ 2,1 Hz,2H, 1 '-H), 3,16 (t, J ~ 2,1 Hz, IH, 3'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,),SOJ: (j 161,48 (C-3), 151,61 (C-7a), 143,11 (C-5), 136,09 (C-I Bn), 128,56 (C-3, -5 Bn), 127,75 (C-4 Bn), 127,60 (C-6 y C-2, -6 Bn), 119,89 (C-4), 118,77 (C-3a), 114,02 (C-7), 76,58 (C-2'), 75,95 (C-3'), 44,69 (CH, Bn), 38,52 (C-I '); EM (lE): miz (%) 307 (100) (M+), 268 (13),249 (5), 230 (3), 203 (4), 128 (5), liS (4), 103 (11). Anál. cale. para CI7H"N,O, (307.30): C 66,44; H 4,26; N 13,67. Encontrado: C 66,58; H 4,47; N 13,59.

Ejemplo le, Preparación de los 2-bromoetil (3/17) y 3-bromopropil (4/18) derivados. Una mezcla agitada de la 2-bencilindazolinona de partida 1 (2,00 g, 7,43 mmol), el a,ro-dibromoalcano requerido (40,00 mmol) y K,CO, (1 ,10 g, 8,00 mmol) en DMF

(50 rnL) se calentó a 100 (le durante 3 h. La mezcla se evaporó a sequedad y, después

de la adición de agua (200 mL), se extrajo con CHCb (3 x 50 mL). La fase orgánica se

secó (MgS04), se concentró y se aplicó a una columna de cromatografia que se eluyó

con mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 25: 1).

A partir de 1,2-dibromoetano se obtuvieron, en este orden de eluci6n, el indazol 2,3

disustituido 17, ell-vinilindaw l24 [70 mg (3%)J y la indazolinona 1,2-disustituida 3.

Análogamente, a partir de 1,3-dibromopropano, se obtuvieron el correspondiente indazol2,3-disustituido 18 y la indazolinona l ,2-disustituida 4.

2-Bencil-]-(2-bromoet U)-5-nitro-] ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (3). Rendimiento: 1,20 g (43%). Pf 172-174 'C (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SOJ: (j 8,52 (d, J~ 2,4 Hz, IH, 4-H), 8,37 (dd, J~ 9,0,2,4 Hz, IH, 6-H), 7,75 (d, J~ 9,0 Hz, IH, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromAt. Bn), 5,19 (s, 2H, CH, Bn), 4,53 (t, J~ 6,3 Hz, 2H, I '-H), 3,51 (t, J~ 6,3 Hz, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,}zSOJ: 0161,39 (e-3), 149,28 (e7a), 141,46 (C-5), 135,95 (C-I Bn), 128,75 (C-3, -S Bn), 127,87 (e-4 Bn), 127,26 (C2, -6 Bn), 127,02 (C-6), 120,36 (C-4), 115,43 (C-3a), 112,59 (C-7), 47,67 (C-I '), 45,23 (CH, Bn), 29,17 (C-2'); EM (lE): miz (%) 377 (99) ([M+2¡+), 375 (lOO) (M+),

,.

361 (5),359 (5), 347 (7),345 (7), 256 (9),254 (9), 192 (8), 177 (9), 164 (9), 145 (8), 131 (17), 103 (36). Anál. cale. para C"H14BrN,O, (376,20): C 51,08; H 3,75; N 11,17. Encontrado: C 50,90; H 3,69; N 11,46.

2-Bencil-l-(J-bromopropil}-5-nilro-l, 2-dihidro-JH-indozol-J -ano (4). Rendimiento: 0,90 g (31 %). PC 111-113 'c (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)2S0]: óS,52 (d, J ~ 2,5 Hz, 1H, 4-H), 8,39 (dd, J~ 9,1, 2,5 Hz, IH, 6-H), 7,65 (d, J~ 9,1 Hz, 1H, 7-H), 7,28 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,18 (s, 2H, CH, Bn), 4,1 4 (t, J~ 7,3 Hz, 2H, I '-H), 3,36 (t, J ~ 6,6 Hz, 2H, 3'-H), 1,80 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,hSO]: J 160,98 (C-3), 148,73 (C-7a), 141,52 (C-5), 136,01 (C-I Bn), 128,72 (C-3, -5 Bn), 127,84 (C-4 Bo), 127,27 (C-6 y C-2, -6 Bo), 120,48 (C-4), 115,87 (C-3a), 112,02 (C7),45,52 (C-I'), 44,89 (CH, Bn), 30,81 (C-3'), 29,19 (C-2'); EM (lE): miz (%) 391

(98) ([M+2t), 389 (100) ([M+]), 361 (4),359 (4),345 (6), 314 (6), 312 (6), 282 (7), 192 (27), 149 (23), 146 (21), 131 (25), 103 (26). Anál. cale. para CI7HI6BrN,O, (390,23): C 52,32; H 4,13; N 10.77. Encontrado: C 52,58; H 4,17; N 10,73.

2-Bencil-J-(2-bromoeloxi}-5-nilro-2H-indozof (17). Rendimiento: 0,84 g (30'10). PC 140-142 'c (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)2S0]: J 8,88 (d, J~ 2,1 Hz, IH, 4H), 7,91 (dd, J~ 9,6, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,56 (d, J~ 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,32 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,50 (s, 2H, CH, Bn), 5,05 (m, 2H, I '-H), 3,93 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,hSO]: J 148,91 (C-3), 146,86 (C-7a), 140,46 (C-5), 135,65 (C-I Bn), 128,63 (C-3, -5 Bn), 128,03 (C-2, -6 Bn), 127,97 (C-4 Bn), 120,50 (C-4), 119,97 (C6), 118,16 (C-7), 105,33 (C-3a), 73,84 (C-I '), 51,80 (CH, Bn), 31,41 (C-2'); EM (lE): miz (%) 377 (60) ([M+2tJ, 375 (61) (W), 268 (31), 252 (58), 222 (10), 199 (65), 197 (67), 191 (47), 164 (14), 149 (7), 117 (51), 109 (97), 107 (100). Anál. cale. para CI6H14BrN,O, (376,20): C 51 ,08 ; H 3,75; N 11 ,17. Encontrado: C 50,91 ; H 3,70; N 11,47.

2-Bencif-J-(3-bromopropaxi)-5-nilro-2H-indozol (18). Rendimiento: 0,84 g (29%). PC 124-126 'c (2-PrOH). 'H RMNR [300 MHz, (CDJhSO]: o8,88 (d, J~ 2,4 Hz, IH, 4H), 7,90 (dd, J ~ 9,6, 2,4 Hz, IH, 6-H), 7,54 (d, J ~ 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,31 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,47 (s, 2H, CH, Bn), 4,82 (t, J ~ 5,8 Hz, 2H, I '-H), 3,66 (t, J ~ 6,6 Hz, 2H, 3'-H), 2,35 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,):¡SO]: ,j 149,37 (C-3), 146,81 (C-7a), 140,28 (C-5), 135,82 (C-I Bn), 128,63 (C-3, -5 Bn), 127,88 (CA Bn), 127,74 (C-2, -6 Bn), 120,76 (C-4), 119,91 (C-6), 118,09 (C-7), 104,92 (C-3a), 71,75 (C-I '), 51,76 (CH, Bn), 32,02 (C-2'), 30,51 (C-3'); EM (lE): miz (%) 391 (99) ([M+2t), 389 (100) (M'), 280 (7), 269 (98), 252 (43), 222 (12), 191 (38), 164 (14), 123 (48), 121 (50), 103 (27). Aná!. cale. para CI7H"BrN,O, (390,23): C 52,32; H 4,13; N 10.77. Encontrado: C 52,51 ; H 4,36; N 10,57.

Ejemplo ld. Preparación de los (metoxicarbonil)metil derivados 5/ /9 y del cianometil

derivado 6. Una mezcla agitada de la 2-bencilindazolinona 1 (1 ,00 g, 3,71 mmol),

bromoacetato de metilo o bromoacetonitrilo (4,5 mmo!) y NaHCO) (0,42 g, 5,00 rnmol) en acetona (30 rnL) se calentó a 35 oC durante 5 días. La mezcla se evaporó a

sequedad y, después de la adición de agua (50 mL), el sólido precipitado se recogió por filtración. Para los compuestos 5/19, el sólido filtrado se lavó con acetona (2 x 5 mL) proporcionando el compuesto 5 puro (1,03 g). El filtrado se concentró a

sequedad, se disolvió en cloroformo y comatografió en lUla columna que se eluyó con cloroformo y una mezcla de cloroformo/acetona (50:1) para dar, siguiendo este orden

de elución, el compuesto 19 [0,04 g (3%)] Y luego una cantidad adicional del compuesto 5 [rendimiento total: 1,18 g (93%)].

Para el compuesto 6, el sólido filtrado se cromatografió directamente con mezclas de c1orofonno/acetona (50: 1 a 30: 1) para proporcionar el l-cianometil derivado puro

[0,84 g (73%)].

2-Bencil-l-(metoxicarbonil)metil-5-nitro-l. 2-dihidro-3H-indazol-3-ona (5). Los

cristales (2-PrOH) de este compuesto reblandecen a 150-170 oC; a continuación el producto vuelve a solidificar mostrando un pfposterior a 195-197 oc. IH R1vfN [300

MHz, (CD,), SO]: B8,54 (d, J ~ 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,40 (dd, J~ 9,3, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,67 (d, J~ 9,3 Hz, IH, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,15 (s, 2H, CH, Bn), 5,09 (s, 2H, I'-H), 3,41 (s, m, CH,); DC RMN [75 MHz, (CD,),SO]: B 167,27 (C-2'), 160,83 (C-3), 150,13 (C-7a), 141,79 (C-5), 135,94 (C-I Bn), 128,55 (C-3, -5 Bn), 127,72 (C-4 Bn), 127,45 (C-2, -6 Bn), 127,30 (C-6), 120,10 (C-4), 116,30 (C-3a), 112,00 (C-7), 52,00 (CH,), 47,77 (C-l'), 44,87 (CH, Bn); EM (ES+): miz (%) 705 (23) ([2M+Nat), 683 (25) ([2M+HtJ, 364 (34) ([M+NatJ, 342 (100) ([M+H¡+). Aná!.

calc. para CI7H"NJO, (341,32): C 59,82; H 4,43; N 12,31. Encontrado: C 60,11; H

4,71; N 12,59.

2-Bencil-I-cianomelil-5-nitro-I,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (6). Pf 146-148 oC (2PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CDJPSO): B8,57 (m, 2H, 4-, 6-H), 7,89 (d, J ~ 9,9 Hz, 1H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,43 (s, 2H, I'-H), 5,17 (s, 2H, CH, Bn); IJC RMN [75 MHz, (CDJJ,SO]: B 161,86 (C-3), 151,58 (C-7a), 144,08 (C-S), 135,71 (C-I Bn), 128,66 (C-3, -s Bn), 128,48 (C-6), 127,92 (C-4 Bn), 127,66 (C-2, -6 Bn), 120.14 (C-4), 119,1 5 (C-3a), 114,23 (C-7), 114.04 (C-2'), 45.13 (CH, Bn), 38.00 (C-!'); EM (lE): miz (%) 308 (87) (M'), 281 (100),264 (3), 251 (4),234 (4), 231 (S), 175 (14), 149 (6),131 (S), 129 (5),103 (19). Anál. cale. para C " HI2N40J (308,29): C 62,33; H 3,92; N 18,17. Encontrado: C 62,45; H 3,72; N 18,01.

2-Bencil-3-(metoxicarbonil)metoxi-5-nitro-2H-indazol (19). Pf94-96 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CDJJ,SO]: B 8,83 (d, J ~ 2,2 Hz, 1H, 4-H), 7,91 (dd, J ~ 9,6, 2,2 Hz, IH, 6-H), 7,57 (d, J~ 9,6 Hz, IH, 7-H), 7,33 (m, SH, H aromat. Bn), 5,54 (s, 2H, CH, Bn), 5,49 (s, 2H, I '-H), 3,74 (s, 3H, CHJ); IJC NMR [75 MHz, (CDJJ,SO]: o 168,38 (C-2 '), 148,71 (C-3), 146,80 (C-7a), 140,56 (C-S), 135,63 (C-1 Bn), 128,58 (C-3, -S Bn), 127,87 (C-2, -4, -6 Bn), 120,15 (C-4), 119,88 (C-6), 118,20 CC-7), 105,15 (C-3a), 69,52 (C-I '), 52,22 (CHJ), 51 ,84 (CH, Bn); EM (lE): miz (%) 341

(100) (M'), 325 (1), 282 (2), 268 (I6), 252 (2), 236 (2), 222 (2), 191 (2), 164 (2), 103 (3). Aná!. calc. para CI7H"NJO, (341 ,32): C 59,82; H 4,43; N 12,31. Encontrado: C 59,53; H 4,67; N 12,57.

Ejemplo le. Preparación de los 2-(metoxicarbonil)etil derivados 7/20 y del 2carboxietil derivado 25. Una solución agitada de la 2-bencilindazolinona 1 (1,00 g,

3,71 mmo1), K,COJ (1,38 g, 10,00 mmol) y bromuro de benciltributilarnonio (0,10 g) en una mezcla de agua (20 mL) y tolueno (20 mL) se calentó a 100 oC durante 30 min

y, a continuación, se añadió 3-bromopropionato de metilo (0,84 g, 5,03 mmol). Cantidades adicionales de 3-bromopropionato de metilo (ca. 10 x 0,25 g) y, eventualmente, si fuera necesario, K2COJ para mantener el pH básico, se fueron

añadiendo durante 2 días cada 5-10 h. La mezcla de reacción se dejó alcanzar la temperatura ambiente y luego se separó la fase de tolueno, se secó (MgS04) y se evaporó a sequedad. El residuo obtenido se sometió a cromatografia en una columna usando mezclas de cloroformo/acetona (50:1 a 10:1) para dar, siguiendo este orden de elución, el compuesto 20 [0,15 g (11 %)J Yluego el compuesto 7 [0,56 g (42%)].

La fase acuosa restante se acidificó con HCI acuoso cone. (pH 1) Y el sólido precipitado se recogió por filtración, se secó y se aplicó a una columna de cromatografía que se eluyó primero con cloroformo/metanol (50: 1 a 10: 1) Y luego con clorofonno/metanol (10:1) conteniendo ácido acético (0,5%), para obtener, en este orden de elución, la indazolinona de partida 1 recuperada [0,07 g (7%)] Y después el ácido 2S [0,33 g (26%)J .

2-Bencil-I-[2-(metoxicarbonil)etilj-5-nitro-l, 2-djhidro-3H-jndazol-3-ona (7). Pf 127129 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)2S0J: /j 8,50 (d, J ~ 2,1 Hz, lH, 4-H), 8,37 (dd, J~ 9,0, 2,1 Hz, lH, 6-H), 7,68 (d, J~ 9,0 Hz, IH, 7-H), 7,25 (m, SH, H aromá!. Bn ), 5,16 (s, 2H, CH, Bn), 4,32 (t, J = 6,5 Hz, 2H, l'-H), 3,43 (s, 3H, CH,), 2,36 (t, J~ 6,5 Hz, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,)2S0J: ¡; 170,82 (C-3'), 161,31 (C-3), 149,04 (C-7a), 141 ,68 (C-5), 136,02 (C-I Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,82 (C4 Bn), 127,28 (C-2, -6 Bn), 127,17 (C-6), 120,29 (C-4), 116,25 (C-3a), 112,62 (C-7), 51,48 (CH,), 44,94 (CH2 Bn), 42,98 (C-l'), 30,30 (C-2'); EM (lE): miz (%) 355 (100) (M'), 282 (5), 278 (5), 177 (5), 131 (8), 103 (8). Anál. cale. para C"HI7N,O, (355,34): C 60,84; H 4,82; N 11,83. Encontrado: C 60,77; H 4,91; N 11,57.

2-Bencil-3-[2-(metoxicarbonil)etoxi}-5-nilro-2H-indazol (10). Pf 130-132 oC (2PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)2S0]: ¡; 8,90 (d, J~2,1 Hz, lH, 4-H), 7,91 (dd, J= 9,6,2,1 Hz, lH, 6-H), 7,55 (d, J~9,6 Hz, lH, 7-H), 7,30 (m, 5H, H aromA!. Bn), 5,42 (s, 2H, CH2 Bn), 4,90 (t, J= 5,7 Hz, 2H, I'-H), 3,64 (s, 3H, CH,), 2,95 (t, J= 5,7 Hz, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,)2S0J: ¡; 170,83 (C-3'), 149,22 (C-3), 146,85 (C-7a), 140,42 (C-5), 135,69 (C-l Bn), 128,61 (C-3, -5 Bn), 127,90 (C-2, -4, -6 Bn), 120.51 (C-4), 119,95 (C-6), 118,14 (C-7), 105,34 (C-3a), 70.18 (C-l '), 51.68 (CH, Bn, CH,),

34.10 (C-2'); EM (lE): miz (%) 355 (22) (M' ), 324 (3), 91 (lOO). Aná!. cale. para

e"HI7N,o, (355,34): e 60,84; H 4,82; N 11,83. Encontrado: e 60,99; H 5,1 1; N 11 ,53.

2-Bencil-l-(2-carboxietil)-5-nilro-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (25). Pf 224-226 oc (ElOHlH,O). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO): ¡¡ 12,39 (s, IH, COOH), 8,50 (d, J~ 2,1 Hz, lH, 4-H), 8,37 (dd, J~ 9,3, 2,1 Hz, lH, 6-H), 7,69 (d, J ~ 9,3 Hz, lH, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,17 (s, 2H, CH, Bn), 4,27 (1, J ~ 6.9 Hz, 2H, I'-H), 2,26 (1,J~ 6,9 Hz, 2H, 2'-H); "C RMN [75 MHz, (CD,),SO]: ¡¡ 171 ,87 (C-3'), 161 ,27 (C3), 149,01 (e-7a), 141,64 (e-5), 136,05 (C-I Bn), 128,73 (C-3, -5 Bn), 127,83 (e-4 Bn), 127,29 (C-2, -6 Bn), 127,14 (C-6), 120,29 (C-4), 116,22 (C-3a), 112,68 (C-7), 44,96 (CH, Bn), 43,07 (C-I'), 30,48 (e-2'); EM (ES'): miz (%) 705 (51) ([2M+NarJ, 683 (35) ([2M+Ht), 364 (65) ([M+NarJ, 342 (100) ([M+HtJ. Aná!. calc. para CI7HIlNJO, (341,32): C 59,82; H 4,43; N 12,3 1. Encontrado: C 59,60; H 4,66; N 12,60.

Ejemplo lf. A/coxicarbonilación, acilación y sulJonilación de la 2-bencU-5nitroindazolin-3-ona 1: preparación de alcoxicarbonil (12, 13), aci/ (14, 15) Y tosil

(16) derivados. A una solución agitada de la 2-bencilindazolin-3-ona 1 (1,00 g; 3,71 mmol) en piridina (15 rnL), se añadieron lentamente el clorofonniato de alquilo requerido (4,00 mmol) (para 12, 13), anhídrido acético (2,0 mL, exceso) (para 14) o el correspondiente cloruro de ácido (3 ,90 rnmol) (para 15, 16). La mezcla de reacción se calentó a 100 oC durante 3 h (para 14), o se agitó a temperatura ambiente durante 1 h

(para 12, 13, 15 Y16), Y después se vertió en agua (100 mL). El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con Hel acuoso al 2% (50 mL) y con agua abundante, y se secó al aire.

2-Bencil-l-etoxicarbonil-5-nitro-l, 2-dihidro-3H-indazo/-3-ona (12). Rendimiento:

1,20 g (95%). Pf 135-137 oC (EtOH). 'H RMN [300 MHz, (eD,)JSO]: ¡¡ 8,56 (d, J~ 2,2 Hz, IH, 4-H), 8,52 (dd, J~ 9,0, 2,2 Hz, lH, 6-H), 8,00 (d, J~ 9,0 Hz, 1H, 7-H), 7,26 (m, 311) y 7,11 (m, 211) (11 aromát. Bn), 5,33 (s, 2H, CH, Bo), 4,39 (e, J ~ 7,0 Hz, 2H, eH, Et), 1,30 (t, J ~ 7,0 Hz, 3H, CH,); "c RMN [75 MHz, (eD,)JSO): ¡¡ 162,58 (e-3), 149,48 (COO), 145,57 (e-7a), 144,18 (e-5), 135,33 (e-I Bo), 128,88 (C -6), 128,66 (C-3, -5 Bn), 127,96 (C-4 Bn), 127,41 (C-2, -6 Bn), 119.63 (C-4), 118,19 (C-3a), 116,35 (C-7), 64,75 (CH, Et), 49,98 (CH, Bn), 13.83 (CH,); EM (ES+): miz (%) 705 (39) ([2M+Nat), 683 (75) ([2M+Ht), 364 (15) ([M+NaJ'), 342

(100) (M+Ht). Aná!. calco para C17H"N,O, (341,32): C 59,82; H 4,43; N 12,31. Encontrado: C 60,04; H 4,17; N 12,19.

2·Bencil-J-benciloxicarbon il-5 -nitro-1, 2 -dihidro-3 H -indazol-3-ana (13).

Rendimiento: 1,45 g (97%). Pf 143-145 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,J,SO): S 8,56 (d, J~ 2,1 Hz, lH, 4-H), 8,51 (dd, J~ 8,9, 2,1 Hz, lH, 6-H), 7,99 (d, J~ 8,9 Hz, lH, 7-H), 7,42 (m, 6H), 7,21 (m, 2H) y 7,00 (m, 2H) (H aromá!. 0-y NBn), 5,44 (s, 2H, CH, OBn ), 5,30 (s, 2H, CH, NBn); DC RMN [75 MHz, (CD,),SOj: S 162,66 (C-3), 149,44 (COO), 145,56 (C-7a), 144,27 (C-5), 135,05, 134,47 (C-l, y 0-y NBn), 128,95 (C-6), 128,81, 128,78, 128,64 (2 señales superpuestas), 128,01, 127,49 (0-YNBn, y C-2, -3, -4, -5, -6),119.70 (C-4), 118,29 (C-3a), 116,30 (C-7), 69,67 (OCH,), 49,95 (NCH,); EM (ES+): miz (%) 829 (68) ([2M+Nal'), 807 (36) ([2M+Hl'), 426 (22) ([M+Nat), 404 (lOO) ([M+Hl'). Aná!. calco para C"H17N,O, (403,39): C 65,50; H 4,25; N 10,42. Encontrado: C 65,59; H 4,06; N 10,16.

I-Acetil-2-bencil-5-nitro-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (U ). Rendimiento: 1,03 g (89%). Pf 165-167 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,J,SO): S 8,56 (d, J ~ 2,1 Hz, lH, 4-H), 8,50 (dd, J~ 9,3, 2,1 Hz, lH, 6-H), 8,30 (d, J~ 9,3 Hz, lH, 7-H), 7,25 (m, 3H) y 7,11 (m, 2H) (H aromá!. Bn), 5,33 (s, 2H, CH,), 2,57 (s, 3H, CH, ); DC RMN [75 MHz, (CD,hSOj: S 168,37 (CO Ac), 164.05 (C-3), 145,89 (C-7a), 144,11 (C-5), 135,12 (C-l Bn), 128,92 (C-6), 128,67 (C-3, -5 Bn), 128,02 (C-4 Bn), 127,57 (C-2, -6 Bn), 119.69 (C-4), 118,52 (C-3a), 116,18 (C-7), 51,14 (CH,), 24.98 (CH,); EM (ES+): miz (%) 645 (44) ([2M+Nat), 623 (3) ([2M+Hl'), 334 (62) ([M+Nan, 312 (100) ([M+Ht). Aná!. calco para CI6HIlN,O, (311,29): C 61,73; H 4,21; N 13,50. Encontrado: C 61,50; H 4,47; N 13,59.

2-Bencil-I-benzoil-5-nitro-J ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (15). Rendimiento: 1,36 g

(98%). Pf 164-166 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,J,SO): ¡; 8,59 (d, J ~ 2,4

Hz, IH, 4-H), 8,28 (dd, J~9,3, 2,4 Hz, IH, 6-H), 7,76 (dd, J ~ 7,6, 7,6 Hz, IH, 4-H

Bz), 7,57 (dd, J~ 7,6, 7,6 Hz, 2H, 3-, 5-H Bz), 7,41 (d, J~ 7,6 Hz, 2H, 2-, 6-H Bz),

7,27 (m, 3H) y 7,08 (m, 2H) (H aromát. Bn), 6,48 (d, J ~ 9,3 Hz, lH, 7-H), 5,27 (s,

2H, CH,); 13c RMN [75 MHz, (CD,),SO]: S 164,76 (CO Bz), 162.18 (C-3), 145,08

5

(C-7a), 144,03 (C-5), 134 ,84 (C-l Bn), 134,18 (C-4 Bz), 132,62 (C-I Bz), 129,51 (C

3, -5 Bz), 129.15 (C-2, -6 Bz), 128,84 (C-3, -5 Bn), 128,53 (C-4 Bn), 128,29 (C-6),

127,72 (C-2, -6 Bn), 120.11 (C-4), 11 7,85 (C-3a), 114,09 (C-7), 48,84 (CH,); EM

(ES'): miz (%) 769 (72) ([2M+NaJ'), 747 (44) ([2M+Hl'), 396 (26) ([M+NaJ'), 374

(lOO) ([M+H]'). Aná!. calco para C21H"N,04 (373,36): C 67,56; H 4,05; N 11 ,25.

lO

Encontrado: C 67,40; H 4,27; N 10,97.

2-Bencil-5-nitro-J-losil-J,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (16). Rendimiento: 1,54 g

(98%). Pf 162-164 oC (I-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: S 8,58 (dd, J ~ 9,0,

2,1 Hz, lH, 6-H), 8,40 (d, J~2,1 Hz, IR, 4-H), 8,14 (d, J~ 9,0 Hz, lH, 7-H), 7,44 (d ,

15

J~ 8,4 Hz, 2H), 7,29 (m, 5H) y 7,20 (m, 2H) (H aromát. Bn y Ts), 5,34 (s, 2H, CH,),

2,28 (s, 3H, CH,); "c RMN [75 MHz, (CD3)2S0]: S 163,57 (C-3), 147,75 (C-7a),

147,23 (C-4 Ts), 146,29 (C-5), 135,11 (C-I Bn), 130,04 (C-3, -5 Ts), 129,36 (C-6),

128,69 (C-3, -5 Bn), 128.60 (C-2, -6 Ts), 128,20 (C-2, -6 Bn), 128,12 (C-4 Bn),

126,74 (C-l Ts), 121 ,33 (C-3a), 119,91 (C-4), 119,08 (C-7), 50,19 (CH,), 2I.ll

20

(CH,); EM (lE): miz (%) 423 (4) (M'), 268 (41), 155 (4), 91 (lOO). Aná!. calco para

C21Hl7N,O,S (423.44): C 59,57; H 4,05; N 9.92. Encontrado: C 59,50; H 4,17; N

10,09

EJEMPLO 2. Preparación de los compuestos 24-31 (tipo (1)] a partir de los

25

compuestos 3,4, 7-9 Y 26 (tipo (1)(,

Los compuestos 24-31 se obtuvieron (Esquema 2) a partir de algunas de las

indazolinonas 1,2-disustituidas incluidas en el Esquema 1, siguiendo diferentes

procedimientos. Así, el l-vinil derivado 24 se preparó a partir del 2-brornoetil

derivado 3 a través de una reacción de deshidrohalogenación. El derivado de ácido

30

propiónico 25 se obtuvo, junto con el éster 7, en la alquilación de la inrlazolinona 1

con 3-bromopropionato de metilo según el procedimiento del Ejemplo le, por

hidrólisis parcial del éster inicialmente formado en el medio básico de reacción; dado

su origen, el compuesto 2S se describe en el Ejemplo 1. El derivado de ácido butírico

26 se obtuvo por hidrólisis (LiOH) del correspondiente éster 8. La butiramida 27 y la

N-meti lbuti ramida 28 se obtuvieron por tratamiento del éster etílico 8 con amoniaco o

metilamina, respectivamente; la N,N-dimetilbutiramida 29 se preparó a partir del

5

cloruro del ácido 26 (SOel,) y dimetilamina. El 3-etoxipropi l derivado 30 se aisló de

un intento de preparación del 3-hidroxipropil derivado 10 a partir del bromuro 4 y

NaOH en etanol/agua. Por último, el 2-acetoxietil derivado 31 se preparó por

aceti lación (AC20) del correspondiente 2-hidroxietil derivado 9.

ID

Ejemplo 2a. Preparación del vinil derivado 24. Una solución de la 1-(2

bromoetil)indazolinona 3 (0,56 g, 1,49 mmol) y piperidina (0,35 g, 4, I I mmol) en

etanol (20 mL) se calentó a reflujo durante 48 h. La so lución se evaporó a sequedad y,

después de la adición de HCI acuoso al 2% (50 mL), se extrajo con cloroformo (3 x 50

mL). La fase orgánica se secó (MgS04) y se evaporó a sequedad para proporcionar el

15

compuesto deseado; res ultados similares se obtuvieron usando metilamina (33% p/p

en solución etanólica).

El compuesto 24 también se obtuvo como un subproducto en la alquilación de la 2

bencilindazolinona 1 con 1,2-dibromoetano (véase más arriba, Ejemplo lc).

20

2-Benci/-5-nilro-I-vini/-I,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (24). Rendimiento: 0,41 g

(93%). Pf 11 6-118 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD3),SO]: 8 8,53 (d, J ~ 3,0

Hz, IH, 4-H), 8,40 (dd, J~ 9,3, 3,0 Hz, IH, 6-H), 7,71 (d, J~ 9,3 Hz, IH, 7-H), 7,26

(m, 3H) y 7,15 (m, 2H) (H aromát. Bn), 7,08 (dd, J ~ 14,7, 9,0 Hz, IH, I'-H), 5,25

(dd, J~ 14,7, 1,4 Hz, IH, 2'-H"aa,), 5,20 (s, 2H, CH, Bn), 5,10 (dd, J~ 9,0,1,4 Hz,

25

IH,2'-H",); 13C RMN [75 MHz, (CD3)zSO]: 8 162,05 (C-3), 146,73 (C-7a), 142,10

(C-5), 135,48 (C-I Bn), 129,93 (C-I'), 128,66 (e-3, -5 Bn), 128,07 (C-6), 127,90 (CA

Bn), 127,38 (e-2, -6 Bn), 120.43 (C-4), 11 5,46 (e-3a), 11 2,13 (e-7), 104,68 (e-2'),

47,00 (CH, Bn); EM (lE): miz (%) 295 (100) (M+), 280 (2), 265 (2), 218 (2), 158 (3),

145 (3), 116 (7), 104 (9). Aná!. calc. para C16H13N303 (295,29): e 65,08; H 4,44; N

30

14,23 . Encontrado: e 65,30; H 4,46; N 14,07.

Ejemplo lb. Preparación del ácido 4-(indazol-l-il)bulÍrico 26. Una mezcla del éster

etilico 8 (0,50 g, 1,30 mmol) y LiOH (0,16 g, 6,68 rnmol) en THFIH,O (1: 1, 20 mL)

se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. A continuación, el THF se evaporó y la solución acuosa se acidificó con HCI acuoso cone. (pH 1). El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con Hel acuoso (1%; 3 x 3 rnL) y se secó al aire.

2-Bencil-l-(3-carboxipropil)-5-nitro-l, 2-dihidro-3H -indazol-J-ona (26).

Rendimiento: 0,42 g (91%). Pf 202-204 oC (EtOHIH,O). 'H RMN [300 MHz, (CD3)2S0]: 8 12,20 (s, IH, COOH), 8,52 (d, J= 2,4 Hz, IH, 4-H), 8,37 (dd, J~ 9,3, 2,4 Hz, IH, 6-H), 7,62 (d, J= 9,3 Hz, 1H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, CH, Bn), 4,05 (t, J ~ 7.5 Hz, 2H, I'-H), 2,15 (t, J= 7,2 Hz, 2H, 3'-H), 1,50 (m, 2H,2'-H); 13C RMN [75 MHz, (CD3)2S0]: 8 173,61 (C-4'), 160,81 (C-3), 148,53 (C7a), 141,31 (C-5), 136,13 (C-I Bn), 128,72 (C-3, -5 Bn), 127,83 (C-4 Bn), 127,27 (C2, -6 Bn), 127,17 (C-6), 120,55 (C-4), 115,62 (C-3a), 111,89 (C-7), 45,95 (C-I'), 44,66 (CH, Bn), 30,15 (C-3'), 21,40 (C-2'); EM (ES+): miz (%) 378 (20) ([M+Nan 356 (100) ([M+Ht). Anál. cale. para C"HI7N30, (355,34): C 60,84; H 4,82; N 11,83. Encontrado: C 60,59; H 4,97; N 11,68.

Ejemplo 2e. Preparación de la amida 27 y de la N-metilamida 28. Para obtener el compuesto 27, una mezcla de éster etílico 8 (0,50 g, 1,30 mmol) y una solución saturada de amoníaco en metanol (15 ml) se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 días. Tras eliminar el disolvente y el amoníaco, con objeto de eliminar algunos subproductos, el residuo se cromatografió en una columna que se eluyó con una mezcla de c1orofonno/metanol (25: 1) para proporcionar el producto requerido.

Para obtener el compuesto 28, una mezcla de éster etílico 8 (0,50 g, 1,30 mmol) y

metilamina 8 M en etanol (20 mL) se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 24 h. la mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando la amida deseada.

2-Benci1-1 -(3-carbamoiIpro pi/)-5-nil ro-1,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (27).

Rendimiento: 0,45 g (98%). Aceite que solidifica tras trituración con 2-PrOH; pf 106

108 oc. 'H RMN [300 MHz, (CD)2S0]: 8 8,52 (d, J ~ 2,1 Hz, 1 H, 4-H), 8,36 (dd, J = 9,0,2,1 Hz, IH, 6-H), 7,62 (d, J= 9,0 Hz, IH, 7-H), 7,25 (m, 6H, H aromá!. Bn y

NHA), 6,79 (s ancho, 1H, NHs), 5,21 (s, 2H, CH, Bo), 4,03 (t, J~ 7,3 Hz, 2H, l'-H), 1,98 (t, J~ 7,1 Hz, 2H, 3'-H), l ,sl (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,),SO]: ¡; 173,16 (C-4'), 160,73 (C-3), 148,40 (C-7a), 141,20 (C-5), 136,16 (C-I Bo), 128,72 (C3, -5 Bo), 127,82 (C-4 Bo), 127,25 (C-2, -6 Bo), 127,09 (C-6), 120,54 (C-4), 115,49 (C-3a), 111,87 (C-7), 46,18 (C-I'), 44,61 (CH, Bn), 31,04 (C-3'), 21,77 (C-2'); EM (ES' ): miz (%) 731 (15) ([2M+Na]'), 709 (40) ([2M+Hn, 377 (12) ([M+Nan, 355

(100) ([M+H]' ). Aoál. cale. para CI8H"N404 (354,36): C 61,01; H 5,12; N 15,81. Encootrado: C 61 ,30; H 4,92; N 15,57.

2-Bencil-l-[3 -(melilcarbamoj/)propil}-5-nUro-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona (28).

Reodimieoto: 0,45 g (94%). Pf 159-161 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: ¡; 8,52 (d, J~ 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,36 (dd, J~ 9,3, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,67 (e aocho, J~ 4,5 Hz, IH, NH), 7,61 (d, J~ 9,3 Hz, IH, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, CH, Bo), 4.03 (t, J ~ 7,4 Hz, 2H, I'-H), 2,52 (d, J ~ 4,5 Hz, 3H, CH,), 1,97 (t, J ~ 7,2 Hz, 2H, 3'-H), 1,53 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,), SO]: ¡; 171,32 (C-4'), 160,77 (C-3), 148,45 (C-7a), 141,19 (C-5), 136,15 (C-I Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 127,24 (C-2, -6 Bn), 127,07 (C-6), 120,53 (C-4), 115,47 (C-3a), 111.87 (C-7), 46.16 (C-I'), 44.63 (CH, Bn), 31.27 (C-3'), 25.40 (CH,), 22.01 (C-2'); EM (ES' ): miz (%) 759 (17) ([2M+NaJ'), 737 (53) ([2M+H]'), 391 (22) ([M+NaJ), 369 (100) ([M+Hn Anál. calc. para C19H,oN404 (368,39): C 61 ,95 ; H 5,47; N 15,21. Encontrado: C 61 ,75; H 5,77; N 15,50.

Ejemplo 2d. Preparación de la N,N-dimetilamida 29. Una suspensión del ácido 26

(0,53 g, 1,49 mmol) y SOC!, (1 ,00 mL) eo CHCb (30 mL) se calentó a reflujo durante

1 h. Después de la evaporación del disolvente y del exceso de SOCh. se añadió al residuo aceitoso una solución de clorhidrato de dimetilamina (1,63 g, 19,99 rnmol) y K2C0 3 (2,80 g, 20,26 rnmol) en agua (20 mL). La mezcla se agitó vigorosamente durante 12 h Y después el producto precipitado 29 se recogió por filtración, se lavó con agua (3 x 5 rnL) y se secó al aire.

2-Bencil-l-[3-(dimelilcarbamoil)propi l} -5-n Uro-l ,2-dihi dro-3H-indazol-3-ono (29). Rendimiento: 0,5 1 g (90%). Pf 144-146 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz,

'8

(CD, )zSO]: B 8,52 (d, J~ 2,1 Hz, IH, 4-H), 8,37 (dd, J~ 9,0, 2,1 Hz, IH, 6-H), 7,60 (d, J~ 9,0 Hz, 1H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromA!. Bn), 5,23 (s, 2H, CH, Bn), 4,04 (t, J ~ 7,5 Hz, 2H, I'-H), 2,80 (s, 3H, CH, Irans), 2,78 (s, 3H, CH, cis), 2, 19 (t, J ~ 6,6 Hz, 2H, 3'-H), 1,51 (m, 2H, 2'-H); "c RMN [75 MHz, (CD,)zSO]: S 170,80 (C-4'), 160,69 (C-3), 148,39 (C-7a), 141,19 (C-5), 136,20 (C-I Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,79 (C4 Bn), 127,26 (C-2, -6 Bn), 127,04 (C-6), 120,53 (C-4), 115,51 (C-3a), 111.79 (C-7),

46.19 (C-I'), 44.57 (CH, Bn), 36.39 (CH, Irans), 34.79 (CH, eis), 28.61 (C-3'). 21.47 (C-2'); EM (lE): miz (%) 382 (41) (M+), 337 (32), 310 (10), 291 (19), 282 (23), 268 (25), 246 (64), 232 (9), 2 18 (49), 192 (19), 172 (21), 128 (47), 114 (100), 106 (27). Anál. cale. para C,oH" N.O. (382,41): C 62,82; H 5,80; N 14,65. Encontrado: C 62,99; H 5,96; N 14,51.

Ejemplo 2e. Preparación del 3-eroxipropil derivado 30. A una solución del 1-(3~

bromopropil) derivado 4 (0,59 g, 1,51 mmol) en etanol (100 mL), se añadió NaOH

(0,40 g, exceso) en agua (20 rnL), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. A continuación, se evaporó el etanol y la solución básica se extrajo con CHCb (3 x 50 rnL). La fase orgánica se secó (MgS04), se concentró y se cromatografió en columna con mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 25: 1) para proporcionar el éter

30.

2-Bencil-l-(3 -etoxipropi/)-5-nilro-J, 2-dihidro-3H-indazo/-3-ona (30j. Rendimiento:

0,38 g (71 %). Pf93-95 'c (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,)zSO]: S 8,51 (d, J~ 2, 1 Hz, IH, 4-H), 8,36 (dd, J ~ 9,0, 2,1 Hz, I H, 6-H), 7,61 (d, J ~ 9,0 Hz, 1H, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromA!. Bn), 5,17 (s, 2H, CH, Bn), 4,09 (t, J~ 6,8 Hz, 2H, I'-H), 3,17 (e, J~ 7,1 Hz, CH, Et), 3,09 (t, J~ 6,0 Hz, 2H, 3'-H), 1,56 (m, 2H, 2'-H), 1,02 (t, J~ 7,1 Hz, 3H, CH,); "c RMN [75 MHz, (CD,),SO]: S 160,94 (C-3), 148,64 (C-7a), 141,11 (C-5), 136,11 (C-I Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,80 (C-4 Bn), 127,21 (C-2,-6 Bn), 126,93 (C-6), 120,44 (CA), 115,34 (C-3a), 111,88 (C-7), 66.16 (C-3'), 65.19 (CH, Et), 44.87 (CH, Bn), 44.09 (C-I'), 26.56 (C-2'), 14.90 (CH,); EM (lE): miz (%) 355 (100) (M+), 282 (3), 278 (4), 268 (4), 220 (4), 192 (13), 146 (7),131 (4), 106 (4), 103 (4). Anál. cale. para C19H21N,04 (355,39): C 64,21; H 5,96; N 11,82. Encontrado: C 63,92; H 5,77; N 11,98.

Ejemplo Jf. Preparación del 2-aceloxielil derivado 31. Una suspensión del 1-(2hidroxietil) derivado 9 (0,47 g, 1,50 mmol) en anhídrido acético (5 mL) se calentó a

100 oC durante 2 h. La reacción se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con 2

PrOH (2 mL); el compuesto insoluble se recogió por filtración, se lavó con 2-PrOH (2

x 2 rnL) Yse secó al aire.

1-(2-Aceloxietil)-2-bencil-5 -nilro-l, 2-dihidro-3H-indazol-3 -ona (31). Rendimiento: 0,47 g (88%). Pf 168-170 oC (2-PrOH). 'H RMN [300 MHz, (CD,),SO]: ¡; 8,51 (d, J= 2,4 Hz, IH, 4-H), 8,38 (dd, J= 9,0, 2,4 Hz, IH, 6-H), 7,66 (d, J= 9,0 Hz, 1H,7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,19 (s, 2H, CH, Bn), 4,36 (t, J = 4,8 Hz, 2H, I'-H), 4,07 (t, J= 4,8 Hz, 2H, 2'-H), 1,57 (s, 3H, CH,); "c RMN [75 MHz, (CD,),SO]: ¡; 169,53 (CO Ac), 161.19 (C-3), 149,90 (C-7a), 141,32 (C-5), 136,04 (C-I Bn), 128,73 (C-3,5 Bn), 127,86 (C-4 Bn), 127,32 (C-2, -6 Bn), 126,84 (C-6), 120,33 (C-4), 115,51 (C3a), 112,48 (C-7), 60,22 (C-2'), 45,95 (C-I'), 44,81 (CH, Bn), 20.08 (CH,); EM (lE): miz (%) 355 (100) (M+), 325 (2), 295 (5),282 (6), 204 (6), 177 (9), l31 (10), 103 (7). Anál. calc. para C"H17N,O, (355,34): C 60,84; H 4,82; N 11,83. Encontrado: C 60,60; H 5,03; N 11,57.

EJEMPLO 3. Estudio in vitro de la actividad de los derivados de indazol sobre epimastigotes de Trypanosoma cruz;. Los ensayos de actividad frente T. cruzi se llevan a cabo de acuerdo con un protocolo secuencial de cribado farmacológico in vitro en el que, en primer lugar. se realizan ensayos simultáneos de actividad frente a epimastigotes (forma extracelular) y

citotoxicidad inespecífica en fibroblastos L929 (células hospedadoras de los

amastigotes, fonna intracelular del parásito). Los epimastigotes son formas extracelulares presentes sólo en los insectos vectores (triatominos), pero dado que son fácilmente cultivables in vitro en el laboratorio, se usan para los cribados iniciales de actividad antichagásica. Aquellos compuestos que resultan con una selectividad en epimastigotes igual o superior a la del benznidazol, son seleccionados para un posterior ensayo de actividad sobre amastigotes (Fonseca-Berzal, C. et al., Bioorg. Med Chem. Leu. 2013, 23, 4851-4856). Los amastigotes son parásitos intracelulares

de las células de mamífero afectadas, por lo que los resultados obtenidos sobre ellos

son mucho más significativos desde el punto de vista de la enfermedad de Chagas en

humanos.

5

Para evaluar la actividad in vitro en epimastigotes. se utilizaron cultivos axénicos de

r cruzi, cepa el clon B5 transfectada de manera estable con el gen de la ~

galactosidasa (lacZ) de Escherichia coli (Buckner, F. el al., Antimicrob. Agenls

Chemolher. 1996, 40, 2592-2597). Esta cepa presenta un comportamiento biológico

similar al de la cepa el parental que la hace idónea para el cribado farmacológico in

lO

vilro (Le-Senne, A. et al., Mem. Insl. Oswaldo Cruz 2002, 97, 1101-1105). La

expresión de la enzima p-galactosidasa por el parásito da lugar a la reducción del

sustrato cromogénico rojo de clorofenol p-D-galactopiranosido (CPRG) a rojo de

fenol. Dicha reacción colorimétrica es directamente proporcional al número de

parásitos vivos, lo quc permite estimar los porcentajes de actividad de los compuestos

15

mediante espectrofotometria.

Los cultivos de epimastigotes se manti enen a 28 oC en medio LIT suplementado al

10% (v/v) con suero bovino fetal inactivado (56 oC, 30 min.), penicilina (100 VI/ml)

y estreptomicina ( 100 ¡.tg/rnL), realizando subcultivos semanalmente para mantenerlos

20

continuamente en fase de crecimiento exponencial.

De acuerdo con el protocolo estandarizado por Vega, M. C. et al. (Parasito/. Res.

2005, 95. 296-298), posteriormente modificado por Fonseca-Berzal, C. et al. (Bioorg.

Med. Chem. Lell. 2013, 23, 485 1-4856), los cultivos en rase de crecimiento

25

exponencial se distribuyeron en placas de 96 poci llos a razón de 250.000

epimastigoteslmL en volúmenes de 200 ~Upocillo y se incubaron junto con los

compuestos a ensayar durante 72 h a 28 oC. Todos los compuestos se disolvieron en

sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se añadieron extemporáneamente a los respectivos

medios de cultivo en concentraciones finales de 256-0, 125 ¡.tM. l a concentración final

30

de DMSO en los cultivos nunca superó el 0,2% (v/v), no presentando a esta

concentración efecto tóxico para células y parásitos. En cada placa se ensayó cada

concentración por triplicado y se incluyeron controles de crecimiento, blancos de

medio y de compuesto, así como un control interno con benznidazol, fármaco de referencia. Una vez transcurridas las 72 h, se procedió a revelar el ensayo mediante la adición de 50 JiLlpocillo de una solución de CPRG en 0,9% Tritón X-lOO (concentración final 200 ~M, pH 7.4) Y posterior incubación de las placas durante 3 h a 37 oC. Finalmente, se determinó la absorbancia a 595 run en un espectrofotómetro de placas (ELx808 ELISA reader, Biotek Instruments Inc.) y se estimaron los porcentajes de actividad mediante comparación del valor medio obtenido en los pocillos tratados con el valor medio de absorbancia que presenta el control de crecimiento.

Para cada compuesto, se estimó la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento de los epimastigotes (CIso epimastigotes) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de actividad en epimastigotes). Los resultados de actividad se expresan como la media de la Clso en epimastigotes ± desviación estándar (SD), a partir de los valores obtenidos en tres experimentos realizados de manera independiente (n = 3). Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que los 3-a1coxi-2-benciJindazoles [compuestos de la serie (11)] presentan escasa actividad, mientras que muchas de las indazolinonas 1,2-disustituidas [compuestos de la serie (1)] presentan actividades, expresadas como CIso, muy superiores a la del benznidazol, fármaco de referencia (el" ~ 22,73 ~M). Destacan las indazolinonas conteniendo en posición 1 grupos alquilo sustituidos tales como 2-bromoetilo (3), 3-bromopropilo (4), 2-hidroxietilo (9), 3-hidroxipropilo (10) o grupos aJquenilo como vinilo (24), con valores de CIso= 1,582,90 ~M. Los derivados con una cadena lateraJ de ácido carboxílico (25, 26) así como los compuestos acilados en posición 1 (14, 15), al contrario, no presentan actividad.

EJEMPLO 4. Estudio ill vi/ro de la citotoxicidad ¡nespecífica de los derivados de indazol frente a fibroblastos murinos L929 y determinación de los índices de selectividad (lS). Con el fin de descartar cualquier efecto tóxico de los compuestos sobre células de mamífero, así como para determinar la selectividad de los mismos hacia T. cruzi, se evaluó su citotoxicidad ¡nespecífica en fibroblastos L929.

Tabla 2. Actividad in vi/ro frente a fannas extracelulares (epimastigotes) e intracelulares (amastigotes) de T cruz; y citotoxicidad ¡nespecífica en fibroblastos murinos L929, expresadas como Clsoy CLso. respectivamente.

Compuesto

Choepimastigotes (~M) eL" L929 (~M) IS' e~imasti Bptes Clso amastigotes (~M) IS' amastigotes

2

10,79 ± 4,80 195,27± 9,70 18,10 3,02 ± 0,55 64,66

3

2, 13 ±o,n > 256 > 120, 19 1, 14 ±O, 14 > 224,5 6

4

2,90 ± 0,37 25 ,19 ±3, 16 8,69 -•

5

26,17± 11 ,31 128,89 ± 10,32 4,92

6

11 ,66 ± 2, 13 >256 > 21,95 3,50 ± 0,83 > 73, 14

7

9,19 ± 1,20 > 256 > 27,86 2,93 ± 1,68 > 87,37

8

11,14±0,59 78,07± 8,02 7,0 1

9

1,5 8 ± 0,06 > 256 > 162,02 0,22 ± 0,06 > 1.163,64

10

1,68 ± 0,36 > 256 > 152,38 0,25 ± 0,12 > 1.024,00

11

6,56 ± 0,87 > 256 > 39,02 2,29 ± 0,79 > 111 ,79

12

49,01 ± 14, 58 122,03 ± 15,98 2,49

13

43,59 ± 5,4 1 86,06 ± 13,66 1,97

14

>25 6 > 256 NO'

15

>256 145,5 2 ± 6, 10 < 0,57

16

28,76 ± 2,67 > 256 > 8,90

17

> 256 > 256 NO

18

39,04 ± 13,42 59,04 ± 4,61 1,5 1

19

144,7 1 ± 9,30 > 256 > 1,77

20

> 256 > 256 NO

21

> 256 > 256 NO

22

64,9 1 ± 8,34 > 256 > 3,94

23

> 256 > 256 NO

24

2,75 ± 0,09 160,46 ± 14,89 58,3 5 0,47± 0, 10 34 1,40

25

> 256 > 256 NO

26

> 256 > 256 NO

27

30,9 8 ± 3,94 > 256 > 8,26

28

13,29 ± 0,92 > 256 > 19,26 1,50 ± 0,23 > 170,67

29

3,86 ± 0,37 > 256 > 66,32 0,5 4 ± 0,04 > 474,07

30

6,57± 0,27 170,4 1 ± 9,94 25,94 3,3 1 ± 0,52 51,48

31

5,43 ± 1,89 > 256 > 47, 14 0,25± 0, 14 > 1.024

Benznidazol

22,73± 3,33 > 256 > 11 ,26 0,68± 0,08 > 376,47

aíndices de selectividad para epimastigotes (1$ = CL50 L929/Clso epimastigotes). bíndices de selectividad para amastigotes (lS ::::I CL~o L929/Clsoamastigotes), eNo determinado. dNo evaluado en amastigotes por no alcanzar en epimastigotes el mínimo de selectividad establecido por el fármaco de referencia (lSCOfnpueRO< ISBc~).

Los cultivos de L929 se mantienen a 37 oc y 5% COz en frascos de 75 cm2 de superficie, utilizando medio MEM sin rojo de fenol, suplementado al 10% (v/v) con suero bovino fetal ¡nactivado (56 oC, 30 min.), penicilina (100 UUmL) y estreptomicina (I 00 ~g/mL).

La citotoxicidad en fibroblastos L929 se detenninó mediante fluorimetría en presencia del sustrato resazurina, indicador redox que al mismo tiempo sufre un cambio de color y emite fluorescencia en presencia de células metabólicamente act ivas (AlamarBlue® Assay, U.S. Patent No. 5,501,959).

Para la realización del ensayo, las células L929 se despegaron del frasco de cultivo mediante tripsinización. Para ello, tras retirar el medio de cultivo, se adicionó al frasco una solución de EDTA-tripsina y se incubó durante 5 min a 37 oC y 5% C02, Esta mezcla se centrifugó 5 min a 1.500 rpm, se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio MEM a una concentración de 15x104 L929/mL, que se distribuyó en placas de 96 pocillos colocando 100 fJUpocillo, Tras incubar las placas 3 ha 37 oC y 5% C02 para favorecer la adhesión de las células, se descartó el medio de cultivo y se añadieron 200 ~Upocillo de los compuestos a ensayar diluidos en MEM fresco.

Las placas se incubaron durante 48 h a 37 oC y 5% C02. Cada concentración se evaluó por triplicado y se incluyeron controles de crecimiento, blancos de medio y de compuesto, así como un control interno con benznidazol en cada placa. Finalmente, se añadieron 20 ~Llpocillo de una solución de resazurina en 1 % PBS (2 mM, pH 7) Y se incubaron las placas durante 3 h a 37 oC y 5% C02' La intensidad de fluorescencia se determinó a 535 nm (excitación) y 590 nm (emisión) en un espectrofluorímetro de placas (Infinite 200, Tecan), El porcentaje de citotoxicidad se calculó mediante comparación de la señal de fluorescencia emitida por las células tratadas con respecto

a la emitida por las células sin tratar (Fonseca-Berzal, C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lell. 2013,23,4851-4856).

Para cada compuesto se estimó la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular (CLso L929) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de citotoxicidad en fibroblastos). Los resultados de actividad se expresan como la media de la CLso ± SD, a partir de los valores obtenidos en tres experimentos independientes (n = 3). Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que la mayor parte de los compuestos activos frente a epimastigotes (3, 9, 10 Y 24) presentan mucha menor toxicidad que el benznidazol frente a fibroblastos, por lo que sus IS para epimastigotes son muy superiores a los del fármaco de referencia.

EJEMPLO S. Estudio in vi/ro de la actividad de los derivados de indazol sobre amastigotes de Trypallosoma cruz';. De la misma manera que las pruebas de actividad en epimastigotes, estos ensayos se realizaron sobre la cepa CL-B5 transfectada con el gen de la p-galactosidasa (lacZ) de Escherichia coli y se detenninó la actividad de los compuestos mediante reducción del sustrato CPRO (Buckner, F. et al., Antimicreb. Agen/s Cheme/her. 1996, 40, 25922597).

Para evaluar la actividad in vi/ro en amastigotes, forma parasitaria clínicamente relevante en la enfermedad de Chagas, se obtuvieron tripomastigotes derivados de cultivo celular (TDC) mediante la infección de cultivos de células L929 con epimastigotes en fase estacionaria de crecimiento. Los cultivos se incubaron junto con las formas infectivas durante 24 h a 33 oC y 5% C02 para favorecer la invasión celular. Transcurrido este tiempo, aquellos parásitos que no habían infectado a las células se retiraron mediante lavado de los cultivos con PBS. Tras adicionar medio MEM fresco, los cultivos infectados se incubaron en similares condiciones de temperatura y humedad durante 7 días, momento en el cual se obtuvieron TDC en el sohrenadante.

Las pruebas se realizaron en placas de cultivo celular de 48 pocillos (Fonseca-Berzal,

C. et al., Parasi/ol. Res. 2014, 113, 1049-1 056). Tras despegar las células L929 de sus frascos de cultivo celular mediante tripsi nización, se distribuyeron por cada pocillo

10.000 L929 en 120 ~L de MEM y se incubaron las placas 2 h a 37 'C y 5% C02. Una

5 vez adheridas las células, éstas se infectaron con TDC en proporción 1:6 (célula: parásito) y se incubaron durante 24 h a 33 oC y 5% C02. A continuación, se retiró el medio de cultivo, se realizaron lavados con PBS para eliminar los TDe que no penetraron en las células y se añadieron diluciones de los compuestos a ensayar en MEM fresco en un volumen final de 450 JlUpocillo. Las placas se incubaron durante

10 7 días a 33 oC y 5% C02 y en elJas se evaluó cada concentración por triplicado, incluyéndose controles de infección, crecimiento celular, blancos de medio y de compuesto, así como un control interno con benznidazol. Una vez finalizado el tiempo de incubación con los compuestos, se procedió a revelar el ensayo mediante la adición de 50 J-lUpocillo de una solución de CPRG t:n 3% Tritón X-lOO (concentración final

15 400 ~M, pH 7.4) Y posterior incubación de las placas durante 3 ha 37 'C. Finalmente, se detenninó la absorbancia a 595 nm en un espectrofluorimetro de placas (lnfinite 200, Tecan). Los porcentajes de actividad se estimaron mediante comparación del valor medio de absorbancia obtenido en los pocillos tratados, con respecto a la absorbancia media que presentan los controles de infección. La absorbancia

20 correspondiente a los controles de crecimiento celular (sólo células L929) fue restada en los grupos experimental y de control de infección.

Para cada compuesto se estimó la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento de los amastigotes (Cho amastigotes) a partir de la correspondiente curva 25 dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de actividad en amastigotes). Los resultados de actividad se expresan como la media de la CIso para amastigotes ± SD, a partir de los valores encontrados en tres experimentos independientes (n = 3). Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que varias indazoJinonas 1,2-disustituidas [compuestos de la serie (1)] son también superiores al

30 benznida201 (CI" ~ 0,68 ~M; IS > 376,47) en cuanto a actividad e índice de selectividad frente a amastigotes, destacando los productos 9, 10, 29 Y 31 (CI" ~ 0,22-0,54 ~M; IS > 474,07-> 1.163,64).

EJEMPLO 6. Estudio in vitro de la actividad de los derivados de indazol sobre trofozoitos de Tr;c¡'omonas vagina/is. La búsqueda de nuevos agentes tricomonicidas sigue un modelo secuencial de cribado basando en varias fases que, a modo de filtro, permiten pasar al siguiente nivel de estudio s6lo aquellos productos que muestran determinados valores significativos de actividad (lbáñez-Escribano, A. et al., J. Microbio/. Melhods 2014, 105, 162-167).

En primer lugar, los derivados de indazol son evaluados frente al aislado de T. vaginalis JHJIA4, de la colección de la American Type Culture Collection (ATCC), sensible al fármaco de referencia metronidazol. Este aislado se mantiene en cultivo en medio TYM (tripticasa, extracto de levadura, maltosa), suplementado con L-cisteína, ácido ascórbico y un 10% de suero bovino fetal descomplementado. Los cultivos del parásito se mantienen en estufa a 37 oC y 5% C02, realizándose pases cada 48 h. El cribado in vitro se lleva a cabo evaluando el porcentaje de crecimiento de un cultivo controlado tras 24 h en contacto con concentraciones crecientes del compuesto a evaluar. Para determinar la concentración inhibitoria 50 (Clso), se prepara una solución stock de los compuestos en sulfóxido de dimetilo (DMSO), y se ensayan en un rango de seis concentraciones distintas en diluciones dobles seriadas sucesivas, partiendo de una concentración máxima de 300 ~M.

En primer lugar se preparan los cultivos en tubos de vidrio con 100.000 trofozoitos/rnL en un volumen final de 2 mL. Tras 5 h de incubación en estufa, se añaden 4 ~L de los compuestos disueltos en DMSO (volumen final del disolvente < 0,2%). Tras 24 h de incubación a 37 oC y 5% CO" se reparten 200 ~L de cada cultivo en placas estériles de fondo plano de 96 pocillos (Nunc). A continuación se retira el medio de cultivo tras centrifugar las placas a 2.000 rpm durante 5 min y se resuspenden los trofozoitos en el mismo volumen de tampón fosfato estéril suplementado con O, I % de glucosa. Finalmente, se revela la prueba añadiendo 20 IlL de una solución stock de resazurina 3 mM a cada pocillo. Este sustrato es un colorante redox capaz de ser reducido a resorufina por células viables. La resorufina, a diferencia de la resazurina, emite fluorescencia pudiéndose determinar el porcentaje

de viabilidad celular mediante lectura fluorimétrica. Tras una hora de incubación a 37 oC la intensidad de fluorescencia es detenninada en un fluorírnetro INFINITE (!.excitación 535 nm y A.emisión 590 nm), siguiendo el protocolo previamente descrito por el grupo de investigación (lbáñez Escribano, A. el al., Mem. 1ns/. Oswaldo Cruz 2012, 107, 637-643). En todos los ensayos se incluye un control de metronidazol 25 ~M y tres controles de crecimiento a los que se les añade el mismo volumen de disolvente (DMSO). Los resultados se calculan a partir de la media obtenida de al menos dos experimentos independientes. Todos los compuestos son evaluados por triplicado en cada ensayo, obteniéndose una DS por debajo del 10%.

Los compuestos que muestran una actividad relevante frente al aislado parasitario se sometieron también a evaluación frente al cultivo de T vaginalis metronidazolresistente IR 78. El procedimiento de cribado in vi/ro es idéntico al descrito para el aislado JH31A4.

Los resultados obtenidos para el aislado de T vaginalis JH31 A4 sensible a metronidazol se recogen en la Tabla 3, donde se muestran los valores de concentración que producen una inhibición del 50% del crecimiento del parásito (Clso). Los compuestos que pasaron el primer filtro de evaluación en T vaginalis, presentando valores de Clso < 50 IlM, fueron las indazolinonas 1,2-disustituidas

[compuestos tipo (1)] 9 Y 29, Y los 3-alcoxi-2-alquilindazoles [compuestos tipo (11)] 18,20,21 Y 22. Cabe destacar los compuestos de tipo (11) 21 Y 22 [3-(2-hidroxietoxi)y 3-(3-hidroxipropoxi)indazoles], que presentaron una actividad relevante frente al parásito con valores de Clso de 9,82 y 7,25 JlM, respectivamente. El derivado 22 mostró la actividad antiparasitaria más elevada logrando una inhibición de crecimiento de más del 90% a la máxima concentración evaluada, siendo superior a la actividad mostrada a la misma concentración por el metronidazol, fármaco de referencia. El resto de moléculas ensayadas resultaron poco activas o incluso no mostraron ningún efecto sobre el crecimiento de los parásito, no pudiéndose calcular en estos casos sus valores de Clso.

La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos frente al aislado de T vaginalis resistente a metronidazol IR 78. El valor de CIso correspondiente al compuesto 22 es muy similar al obtenido con el aislado sensible a metronidazol, lo que pone en evidencia la falta de resistencia cruzada entre este compuesto y el fármaco de referencia. De este modo, el compuesto 22 puede considerarse un buen prototipo para el desarrollo de fánnacos utilizables en los casos de resistencia a los 5-nitroimidazoles, para los cuales no existe un medicamento alternativo aceptado por los organismos de salud internacional.

EJEMPLO 7. Estudio in vitro de la citotoxicidad inespecífica de los derivados de ¡ndazol frente a células Vero y determinación de los índices de selectividad (18). En este estudio se analizan sólo aquellas moléculas que han mostrado una actividad significativa in vi/ro frente a T vagina/is (CIso < 50 ~M).

Este ensayo se lleva a cabo sobre la línea celular Yero CCL-81 (ATCC); las células son mantenidas en botes de cultivo celular horizontal, en medio RPMI-1460 (SigmaAldrich) suplementado con 10% de suero bovino fetal y solución de antibióticos. Las células se despegan empleando una solución estéril de EDTA-tripsina. A continuación se hace un recuento hemocitométrico con azul Tripán, añadiéndose a placas estériles de 96 pocillos una concentración de 50.000 célulasll 00 ~UpociJlo. Se mantienen las placas en estufa a 37 oC y 5% C02 para favorecer la adhesión de las células al plástico. Tras la incubación se afiaden los compuestos a las mismas concentraciones que fueron ensayadas frente a T vaginalis. Tras mantener en contacto las células con los compuestos durante 24 h, se procede al revelado de la prueba afiadiendo 20 ¡.tL del colorante resazurina preparado a una concentración stock de I mM en solución PBS estéril. Las lecturas fluorimétricas se llevan a cabo tras 3 horas de incubación con el sustrato redox. Al igual que en los ensayos in vi/ro frente a T vaginalis, los resultados se calculan a partir de la media obtenida tras la realización de al menos dos experimentos independientes. Cada concentración se evalúa por triplicado obteniéndose una DS por debajo del 10%, existiendo además un control de crecimiento al que se le asume un 0% de actividad citotóxica inespecífica.

Los resultados obtenidos en este estudio se recogen en la Tablas 3 y 4, donde se muestran los valores necesarios para inhibir un 50% del crecimiento de las células Vero (Ceso). Igualmente, se han estimado los Índices de selectividad (IS) que detenninan la toxicidad selectiva de la molécula a partir de la relación entre la cesoy

5 la Cl". Los seis compuestos ensayados (9, 18, 20, 21, 22 Y 29) mostraron una

actividad citotóxica ¡nespecifica baja, con porcentajes de inhibición del crecimiento de células Vero < 20% a 300 J.1M Yunos valores del IS entre 6,0 y > 41,4. Nuevamente hay que destacan los compuestos de tipo (11) 21 Y 22, que mostraron porcentajes de citotoxicidad (%C) a la máxima concentración ensayada (300 J..LM) muy bajas (%Cn =

10 14,7 ± 4,3; %C.. ~ 14,5 ± 3,2).

Tabla 3. Actividad in vi/ro frente a T. vagiflalis JH31A4 y citotoxicidad ¡nespecífica frente a células Vero, expresadas como Cho y CC~o respectivamente.

Compuesto

O so (~M) CCso (~M) 15 Compuesto Cho (~M) 15

2

260,97 16 151,47

3

347,74 17 64,75

4

80,21 18 18,57 538,85 29,0

5

534,57 20 43,02 > 300 > 7,0

6

ND 21 9,82 > 300 > 30,5

7

375,54 22 7,25 > 300 > 41,4

8

192,42 23 107,45

9

17,94 >300 > 16,7 24 258,43

10

128,44 25 ND

11

284,62 27 104, 13

12

418,86 28 182,01

\3

588,88 29 48,94 > 300 >6,1

14

212,91 30 362,18

15

197,42 31 265,63

Metronidazol 1,43 > 600 > 100

NO: No determinado por ausencia de actividad antiparasitaria

Tabla 4. Actividad in vitro frente a T. vaginalis IR 78 Y citotoxicidad ¡nespecífica frente a células Vera, expresadas como CI50 y CCso. respectivamente.

ES 2 61413 1 Al

Compuesto

el" (~M) ee,,(~) IS

18

39,12 538,85 13,8

21

49,82 > 300 > 6,0

22

9,11 > 300 > 32,9

Metronidazol

5,78 > 600 > 100

En el caso del aislado de T. vaginalis resistente a metronidazol, los valores del IS están comprendidos entre> 6,0 Y > 32,9, presentando una vez más el compuesto 22 el máximo valor, por lo que resulta prometedor como una alternativa al fármaco de referencia.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   l. Compuestos derivados de 5-nitroindazol de fórmulas generales (1) y (11),

   O,N~

   lJlt/0

   R V~x

   Fórmula (I) Fórmula (U)

   5 donde R puede ser: -un grupo alquenilo O alquinilo de 2-6 átomos de carbono y con el enlace múltiple en cualquiera de las posiciones posibles. Se excluye específicamente la l-alil-2bencil-5-nitroindazolinona [compuesto tipo (1)].

   10 -un grupo polimetilénico de longitud variable [(CH2)n, n = 1-6] con sustituyentes terminales de tipo Br, OH, COOR (R = H o alquilo de 1-5 átomos de carbono), eONR'R' (R' y/o R' ~ H o alquilo de 1-5 átomos de carbono), eN, OR (R ~ grupos alquilo o acilo de 1-5 átomos de carbono). -un grupo etoxicarbonilo o benciloxicarbonilo.

   15 -un grupo acile alifático (de 1 a 5 átomos de carbono tales como fOlll1ilo, acetilo o propionilo) u aromático (benzoilo o benzoilos diferentemente sustituidos en las posiciones 2, 3 o 4 con grupos tales como F, CI, Br, OH, OR, NH2, N02 o CN). -un grupo sulfonilo alifático o aromático [metanosulfonilo o p-toluenosulfonilo (tosilo)].

   20 y donde X puede ser cualquier sustituyente en las posiciones 2, 3 o 4 de un grupo bencilo, seleccionado entre un grupo alquilo sencillo o ramificado de 1-5 átomos de carbono, tritluorometilo (eF,), F, el, Br, grupos hidroxilo (OH), a1coxilo (OR; R ~ alquilo), grupos amino (NH,. NR,), nitro (NO,) o ciano (eN). En compuestos de

   25 tipo (1), cuando R = CH2COOH, se excluyen específicamente derivados con dos átomos de halógeno en el sustituyente bencílico.

   o sus solvatos o profánnacos.
2. 2. Un compuesto de fórmula general (1) según la reivindicación 1, seleccionado de la lista siguiente: 2-Bencil-5-nitro-l-propargil-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona 2-Bencil-l-(2-brornoetil)-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-00a

   2-Bencil-I-(3-bromopropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l-(metoxicarbonil)metil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-¡ndazol-3-00a

   2-Bencil-l-cianornetil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-00a

   2-Bencil-I-[2-( metoxicarbonil)etil]-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona 2-Bencil-I-[3-( etoxicarbonil)propil]-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona 2-Bencil-I-(2-hidroxietil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l-(3 -hidroxipropil)-S-nitro-l ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l-(2-metoxietil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l-etoxicarbonil-5-nitro-l ,2-dihidro-3 H-indazol-3-00a

   2-Bencil-l-benciloxicarbonil-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   I-Acetil-2-benci1-5-nitro-1 ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l-benzoil-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-5-nitro-l-tosil-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-5-nitro-l-vinil-l,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-I-(2-carboxietil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-i ndazol-3-ona 2-Bencil-I-(3-carboxipropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-l -(3 -carbamoilpropil)-5-nitro-I ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona 2-Bencil-l-[3-(metilcarbamoil)propil ]-5-nitro-I,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona

   2-Bencil-I-[3-( dimetilcarbamoil)propil]-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   2-Bencil-I-(3-etoxipropil)-5-nitro-1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   1-(2-Acetoxietil)-2-bencil-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona

   o sus solvatos o pro fármacos.
3. 3. Un compuesto de fórmula general (11) según la reivindicación 1, seleccionado de la

   lista siguiente: 2-Bencil-3 -(2-bromoetoxi)-5-nitro-2H-indazo l 2-Bencil-3 -(3 -bromopropoxi)-5-nitro-2 H-indazo1

   2-Benci1-3 -( metoxicarboni 1 )meto xi -S-ni tro-2H-indazo 1 2-Benci1-3-[2-(metox i carboni I)etoxi]-5-nitro-2H-i ndazo 1 2-Senci 1-3 -(2 -hidroxi etox i)-S-nitro-2H-indazol 2-Benci 1-3-(3-hidro x i propoxi)-5-nitro-2H-indazo1

   5 2-Benci1-3-(2-metoxietoxi)-5-nitro-2H-indazol

   o sus solvatos o profármacos.
4. 4. Procedimiento para la preparación de los compuestos de fónnula general (1) y (11)

   10 por tratamiento de la S-nitroindazolinona con agentes alquilan tes, aJcoxicarbonilantes, acilantes y sulfonilantes, según se recoge en el Esquema l .

   20 Esquema 1
5. 5. Procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula general (1) por modificación química de la cadena lateral de los compuestos de fórmula general (1) incluidos en la reivindicación 1, según se recoge en el Esquema 2,

   o

   02Nvj

   _____O_2N~N_Bn

   I N-Sn

   '" ~' ~N'

   R' R'

   Esquema 2
6. 6. Uso de los compuestos de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades causadas por protozoos

   patógenos de las familias Trypanosomatidae (Trypanosoma, Leishmania) y Trichomonadidae (Trichomonas).

7. 7.

   Una composición farmacéutica que incluya cualquiera de los compuestos definidos en las reivindicaciones 1-3 Y. al menos, un excipiente fannacéuticamente aceptable.

8. 8.

   Una composición farmacéutica, según reivindicación 7. que, opcionalmente, puede contener también otros principios activos.