ES2645484T3 - Composición farmacéutica que comprende difenileneiodonio para el tratamiento de enfermedades causadas por los parásitos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae - Google Patents

Abstract

Difenileneiodonio o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por los parásitos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae.

Description

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DESCRIPCION

Composicion farmaceutica que comprende difenileneiodonio para el tratamiento de enfermedades causadas por los parasitos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un nuevo uso de difenileneiodonio (DPI) como sustancia activa contra los parasitos de la familia Trypanosomatidae, en particular contra los parasitos del genero Leishmania y Trypanosoma.

Antecedentes de la invencion

Los parasitos del genero Leishmania amenazan a una poblacion de 98 pafses en 5 continentes [Alvar et al. 2012]. La leishmaniasis, una enfermedad causada por protozoos parasitos Leishmania (incluyendo, por ejemplo. L. aethiopica, L. donovani, L. infantum, L. major, L. mexicana, L. tropica), se produce en zonas intertropicales de America y Africa y se extiende hasta la zona templada de America del Sur, Asia y el sur de Europa. Dependiendo de la parte del cuerpo que se ve afectada por la enfermedad, se distinguen tres tipos de leishmaniasis: cutanea, mucocutanea y visceral. Se supone que 2 millones de personas (1,5 millones de leishmaniasis cutanea, 0,5 millones de leishmaniasis visceral) son recientemente infectadas al ano y 20.000 a 40.000 personas mueren a causa de la enfermedad al ano, mientras que recientemente el numero total de personas afectadas alcanza los 12 millones en todo el mundo [OMS, 2012]. Dado que la notificacion de la enfermedad es obligatoria solo en 32 de los 98 pafses afectados por la leishmaniasis, una gran parte de las personas enfermas no se registra en ningun sitio. La enfermedad amenaza no solo a los residentes de los pafses endemicos, sino tambien a los viajeros [Kobets et al. 2012] y las fuerzas militares ubicadas en esas areas. No existe una vacuna eficaz contra la infeccion y los farmacos en uso poseen muchos efectos secundarios indeseables. Ademas, los parasitos se volvieron resistentes contra estos farmacos en muchas areas [Kobets et al. 2012].

El impacto de la leishmaniasis en la salud de la poblacion fue fuertemente subestimada durante muchos anos. En los ultimos 10 anos, debido a los cambios climatico y ambiental, guerras y otros efectos desconocidos, las areas endemicas se han extendido en gran medida y el numero de casos notificados aumento. En Europa, por ejemplo, la leishmaniasis se restringio con anterioridad en la region del Mediterraneo, pero ahora se ha propagado hasta el norte de Italia y el sur de Alemania, donde se han notificado decenas de casos de personas que no viajaron fuera de dicha area [Kobets et al. 2012], y recientemente se notificaron casos autoctonos de animales infectados en Hungrfa y Suiza. Lo que es alarmante es el hecho de que Phlehotomus, el mosquito que transmite la Leishmania, se extiende en una direccion norte-oriental mas rapido que lo predicho por los modelos existentes.

No todas las personas que resultan infectadas con Leishmania desarrollaran la enfermedad. En la region mediterranea, por ejemplo, se estima que se produce un caso clfnico durante aproximadamente 30-100 infecciones subclfnicas [Pampiglione et al. 1975]. Esta infradeclaracion puede tener enormes consecuencias para los bancos de sangre. La sangre de los donantes que viven en areas endemicas de Grecia fue seropositiva para Leishmania en el 15 % de los casos [Kyriakou et al. 2003], y en el caso de los donantes procedentes de regiones endemicas de Espana (Islas Baleares) en el 11 % [Riera et al. 2008]. Estas infecciones asintomaticas pueden convertirse en formas clfnicas graves en pacientes con un sistema inmunitario comprometido, p. ej., pacientes con SIDA. La co- infeccion con parasitos Leishmania y VIH se esta convirtiendo en un grave problema de salud en numerosos pafses del mundo, debido a que la infeccion por VIH aumenta el riesgo de desarrollar leishmaniasis visceral en 100 a 2.320 veces, y viceversa, la infeccion por Leishmania aumenta el riesgo de aparicion del SIDA [Kobets et al. 2012].

Los perros infectados con Leishmania representan un grave problema en la medicina veterinaria. Los perros infectados suelen presentar sfntomas significativos. No obstante, tanto los perros enfermos como asintomaticos suponen un riesgo para los seres humanos ya que son un reservorio de parasitos, que son transmitidos a los humanos por los insectos. En algunas areas de Brasil, hasta el 24 % de los perros estan infectados con Leishmania [Coura-Vital et al. 2011], mientras que en algunas partes del sur de Europa, la presencia de anticuerpos contra el parasito muestra que hasta el 34 % de los perros fue detectado con la infeccion [Kobets et al. 2012]. En los ultimos anos, se observo en los EE.UU leishmaniasis en perros y gatos domesticos. [Petersen, 2009].

No existe vacuna humana segura y eficaz contra la enfermedad. Del mismo modo, no existe un tratamiento adecuado y sencillo sin efectos secundarios [Kobets et al. 2012]. Los farmacos que se utilizan para tratar la leishmaniasis visceral [Kobets et al. 2012] y que pueden usarse tambien para el tratamiento de la leishmaniasis cutanea y muco-cutanea son: antimoniales pentavalentes, anfotericina B, anfotericina B liposomal, miltefosina y paromomicina. Los agentes quimioterapeuticos mas antiguos explotados para el tratamiento de la leishmaniasis visceral son las sales de antimonio. En la actualidad, derivados de antimonio estibogluconato de sodio (Pentostam) y antimoniato de meglumina (Glucantime) se administran como inyeccion intramuscular o intravenosa. La desventaja de estos farmacos es la baja eficacia clfnica en algunas areas, la emergencia de resistencia del parasito (hasta un 60 % en el estado indio de Bihar), la larga duracion del tratamiento (30 dfas), la toxicidad y el elevado precio. Otros agentes quimioterapeuticos eficaces en el tratamiento de la leishmaniasis son farmacos que se desarrollaron originalmente para el tratamiento de otras enfermedades. Es un medicamento para combatir las infecciones

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fungicas, anfotericina B (AmBisome), un medicamento para tratar el cancer, miltefosina (Impavido), y un antibiotico de amplio espectro, paromomicina. Incluso estos medicamentos no son ideales. Solo la miltefosina puede administrarse per os, pero su eficacia se ve reducida, y en algunos casos la administracion de miltefosina lleva a la muerte de un paciente causada por los efectos secundarios de un farmaco [Sundar et al. 2012]. La anfotericina B y la anfotericina B liposomal requieren infusion intravenosa y la paromomicina se administra por via intramuscular. Asimismo estos medicamentos tienen numerosos efectos secundarios, que son, a excepcion de paromomicina, caros, y solo una unica mutacion es suficiente para que los parasitos se vuelvan resistentes a la miltefosina. La desventaja es tambien la larga duracion del tratamiento [Kobets et al. 2012]. Las desventajas de los farmacos individuales pueden reducirse parcialmente por la terapia de combinacion [van Griensven et al. 2010]. Se describio el exito del tratamiento con una dosis unica de anfotericina B liposomal en la India [Sundar et al. 2010], pero estos resultados prometedores aun deben de confirmarse [Edwards et al. 2011].

Los protozoos parasitos del genero Trypanosoma incluyen T. brucei y T. cruzi, que causan la enfermedad del sueno o la enfermedad de Chagas.

La enfermedad del sueno (tambien conocida como tripanosomiasis africana) es una enfermedad humana causada por el protozoo Trypanosoma brucei y transmitida por una mosca (las moscas) tse-tse. La enfermedad es "endemica" en grandes areas de Africa subsahariana (incluyendo 36 pafses y habitados por cerca de 60 millones de personas). Segun la OMS, en el ano 2009 en Africa se notificaron aproximadamente 30.000 nuevos casos de la enfermedad. La enfermedad existe en dos formas o es causada por dos subespecies: Trypanosoma brucei gambiense en Africa Occidental y Central y Tryparcosoma brucei rhodesiense en Africa Oriental y Meridional, la subespecie enumerada como la segunda es mucho mas agresiva y de accion mas rapida. Para el tratamiento de la enfermedad del sueno, dependiendo de la etapa de la enfermedad, se usan pentamidina, melarsoprol y suramina, sin embargo, estos farmacos presentan una serie de efectos secundarios, pueden causar anemia o dano renal. La prevencion de la enfermedad del sueno es practicamente imposible ya que no existe una vacuna eficaz.

La enfermedad de Chagas (tambien conocida como tripanosomiasis americana) es una enfermedad parasitaria tropical causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, que se transmite a traves de la mordedura de insectos triatomfnicos hematofagos (tambien conocidos como "vinchucas"). El insecto infectado transmite la infeccion solo en el caso de que defeque heces infectadas durante la mordida. No obstante, la transmision puede no ocurrir solo a traves de la mordedura de las vinchucas. La enfermedad puede ser transmitida por la sangre de una persona a otra (por ejemplo, durante una transfusion o trasplante de organos, o durante el embarazo la madre infectada puede infectar a su hijo no nacido). La OMS estima que 7-8 millones de personas estan infectadas con este parasito. El periodo de incubacion es de una a cuatro semanas (en caso de infeccion por transfusion sangufnea, el periodo de incubacion puede extenderse hasta 6 semanas). La enfermedad afecta principalmente al corazon, intestino y cerebro. El tratamiento medico es eficaz solo en la fase inicial de la enfermedad y la vacunacion contra la enfermedad no existe. Los farmacos en uso son Nifurtimox y Benznidazol, su desventaja es una considerable toxicidad, ambos farmacos causan reacciones adversas graves del sistema digestivo y nervioso.

Trypanosoma brucei brucei causa la enfermedad en los animales (p. ej., caballos, camellos, bufalos acuaticos), pero no en los seres humanos.

De todos los datos anteriores, resulta evidente que existe una necesidad de un nuevo farmaco con actividad contra protozoos parasitos de la familia Tripanosomatidae, que no requiera un tratamiento complicado y tenga menos efectos secundarios que los medicamentos usados en la actualidad, y esten disponibles en las areas endemicas.

El difenileneiodonio ([1,1'-bifenil]-2,2'-diiliodonio, DPI) es un compuesto que tiene la siguiente formula:

imagen1

Se ha demostrado en ratas que el sulfato de difenileneiodonio previene el dano hepatico inducido por alcohol [Kono et al. 2001]. El documento WO 20071080598 desvelo una composicion farmaceutica que comprende DPI o sal del mismo para inhibir la proliferacion de neofntima y prevenir la reestenosis. El documento WO 2012/135588 desvelo el uso de cloruro de difenileneiodonio como agente quimioterapeutico en el tratamiento de tumores serosos.

Se notifico previamente que DPI mata el parasito de la malaria Plasmodium falciparum (CI50 = 0,001-0,00006 pM) [Yuan et al. Nat Chem Biol 5:765-771, 2009].

La actividad de DPI contra los parasitos de la familia Tripanosomatidae aun no se conoce.

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Descripcion de la invencion

Los inventores de la presente invencion ensayaron la biblioteca de 2.448 compuestos qufmicos, incluyendo las siguientes colecciones: "Biblioteca de compuestos farmacologicamente activos" (LOPAC1280, Sigma-Aldrich), "Biblioteca qufmica de Prestwick" (Illkirch, Francia) y "Coleccion clfnica de NIH" (NIH, EE.UU.). Los compuestos se identificaron sistematicamente para la inhibicion del crecimiento del parasito Leishmania major. Esta identificacion sistematica primaria dio lugar a la identificacion de difenileneiodonio (DPI) como un inhibidor eficaz.

En otros ensayos, los inventores descubrieron sorprendentemente que DPI ejerce una actividad significativa contra los parasitos de la familia Trypanosomatidae, Leishmania major y Trypanosoma brucei brucei. En los ensayos que se incluyeron en la identificacion sistematica secundaria, y descritos con detalle en los Ejemplos, se demostro que DPI inhibe eficazmente el crecimiento de parasitos del genero Leishmania en forma promastigote (es decir, forma que vive en el insecto vector). Se establecio el valor de CI50 = 0,010 pM, que era significativamente inferior al valor de los farmacos actuales, tales como anfotericina B (CI50 = 0,039 pM). Ademas, DPI tambien es eficaz en matar a parasitos del genero Leishmania en forma amastigote (es decir, forma que se encuentra en los macrofagos), mientras que el valor de DL50 = 0,066 pM descubierto por los inventores tambien es inferior al valor del mejor farmaco actual anfotericina B (DL50 = 0,143 pM).

Ademas, los ensayos in vivo en ratones infectados demostraron que la administracion de DPI condujo a una reduccion significativa en el numero de parasitos en el bazo de ratones infectados.

Los ensayos tambien demostraron que la forma sangufnea del parasito Trypanosoma brucei brucei es matada por el tratamiento con DPI con una alta eficacia, se observo el valor CL50 = 0,85 pM.

Por lo tanto, DPI puede ser util como medicamento para el tratamiento de enfermedades causadas por parasitos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae, preferentemente parasitos del genero Leishmania y Trypanosoma, especfficamente, por ejemplo, enfermedades causadas por Leishmania major o Trypanosoma brucei brucei.

Un aspecto de la presente invencion se refiere a difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por parasitos de la familia Trypanosomatidae. Preferentemente, DPI se puede usar en el tratamiento de una enfermedad que es causada por parasitos del genero Leishmania y Trypanosoma. Mas preferentemente, se usa en el tratamiento de la enfermedad causada por el parasito Leishmania major. En otro aspecto mas preferente, la solicitud se refiere al tratamiento de una enfermedad causada por el parasito Trypanosoma brucei brucei.

Una composicion farmaceutica que comprende un DPI o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo es util para tratar seres humanos o puede usarse en la medicina veterinaria. El tratamiento medico debe entenderse como profilaxis como tratamiento curativo.

En la preparacion farmaceutica, DPI tambien puede estar presente en forma de sales farmaceuticamente aceptables (no toxicas, fisiologicamente aceptables), de naturaleza organica o inorganica. El experto en la materia es capaz de preparar de forma rutinaria sales adecuadas.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden DPI o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como principio activo se pueden formular, por ejemplo, para administracion sistemica, p. ej., administracion enteral, p. ej., oral, p. ej., en forma de comprimidos o capsulas, para administracion rectal, p. ej., en forma de supositorios, para administracion nasal o por inhalacion, p. ej., como pulverizacion o gotas. Las composiciones pueden formularse preferentemente para administracion parenteral, tal como inyeccion (IV, IM, SC), o para la administracion por medio de una infusion o sistema de deposito implantable. Un experto en la materia apreciara que este listado no sea exhaustivo y tal persona es consciente de otros metodos adecuados.

Normalmente, la sustancia activa esta presente en la composicion farmaceutica junto con excipientes, tales como materiales de relleno, disgregantes, diluyentes, disolventes, aglutinantes, agentes emulsionantes, tampones, agentes estabilizantes, conservantes y agentes colorantes. Los excipientes y su uso son bien conocidos por el experto en la materia.

DPI puede comprenderse en composiciones farmaceuticas en combinacion con otra sustancia activa, p. ej., con un compuesto que presenta un efecto sinergico.

Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion comprenden DPI o sal farmaceuticamente aceptable del mismo en una cantidad farmaceuticamente eficaz. El metodo de determinacion de la cantidad farmaceuticamente eficaz es un procedimiento rutinario bien conocido por el experto en la materia.

La determinacion de una dosis de DPI en forma de dosificacion unitaria, p. ej., capsula o concentracion adecuada en solucion, p. ej., solucion para inyeccion o infusion, es un procedimiento rutinario que es conocido por un experto en la materia.

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El conocimiento del experto mencionado anteriormente en relacion con los productos farmaceuticos, formas farmaceuticas, excipientes, etc. se ha resumido en manuales especializados (Gennaro, A.R. et al. Remington: The Science and Practice in Pharmacy. 20. Edicion. Lippincot Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, Kibbe, A. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Pharmaceutical Press, Londres, 2000, Chalabala, M. et al.: Technologie leku (Medicaments Technology), Galen, Praga, 2001) facilmente disponibles para los expertos en la materia y tambien en la Farmacopea Checa (CL 2009), en la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) y/o en la Farmacopea Estadounidense (USP).

Descripcion de la figuras

FIG. 1. Efecto de DPI en Leishmania major en forma promastigote (A), incluyendo cepas resistentes a sales de antimonio (B)

FIG. 2. Efecto de DPI en Leishmania major en forma amastigote (la forma que vive en los macrofagos huesped) FIG. 3. Efecto de DPI in vivo en la reduccion del numero de parasitos en el bazo de ratones infectados FIG. 4. Efecto de DPI en la forma sangufnea del parasito Trypanosoma brucei brucei FIG. 5. Determinacion del efecto de DPI sobre la viabilidad de celulas humanas Ejemplos de la invencion EJEMPLO 1

Identificacion sistematica primaria

DPI se identifico al ensayar la biblioteca de 2.448 compuestos qufmicos que comprende "Biblioteca de compuestos farmacologicamente activos" (LOPAC1280, Sigma-Aldrich), "Biblioteca qufmica de Prestwick" (Illkirch, Francia) y "Coleccion clfnica de NIH" (NIH, EE.UU.). Los compuestos se reformatearon en placas de polipropileno de 384 pocillos (Corning, cat. n.° 3657) a una concentracion final de 1 pM en DMSO y se usaron para identificar sistematicamente la inhibicion del crecimiento del parasito Leishmania major.

La identificacion sistematica primaria resulto en el hallazgo de que DPI es un potente inhibidor del crecimiento de Leishmania major. Por lo tanto, DPI, en forma de cloruro de difenileneiodonio, se ensayo adicionalmente en experimentos in vitro (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° D2926) y en experimentos in vivo (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° D2926 o AG Scientific, San Diego, CA, cat. n.° D-1011), como se describira en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 2

Efecto citostatico de DPI en Leishmania major en forma promastigote (Fig. 1A, 1B)

La actividad antiparasitaria en cultivo de promastigotes (forma de insecto) se midio usando un metodo de microdilucion convencional, determinando la concentracion minima inhibitoria (CMI) de la muestra de ensayo, lo que conduce a la inhibicion del crecimiento del parasito.

Leishmania major LV 561 (MHOM/EL/67/LRC-L137 JERICHO II) se almaceno en el recubrimiento de 10 % de dimetilsulfoxido en nitrogeno liquido como subcultivo 0. Las muestras almacenadas se descongelaron y los parasitos se cultivaron durante 7 dias a 23 °C en un medio bifasico SNB-9 (solucion salina-neopeptona-sangre-9) [Grekov et al. 2011]. La fase solida y el recubrimiento de SNB-9 se prepararon a partir de los siguientes ingredientes: agar BactoTM (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, cat. n.° 214010), neopeptona BactoTM (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, cat. n.° 211681), NaCl y sangre de conejo desfibrinada (Bioveta, a.s., Ivanovice na Hane, Republica Checa). La solucion de recubrimiento se suplemento con 50 mg/ml de gentamicina (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° G1272). Para los ensayos de inhibicion del crecimiento de promastigotes, el subcultivo 2 de L. major se cultivo en un medio de insectos de Schneider (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° S0146) suplementado con 50 pm/ml de gentamicina (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° G1272), 63,7 ug/ml de penicilina G (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° PENK), 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° S6501), 2 % de orina humana y suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° F2442).

Los promastigotes de Leishmania en la fase de crecimiento logaritmico se distribuyeron en placas negras de 384 pocillos (Corning, Nueva York, NY, cat. n.° 3571) a una concentracion de 15.000 parasitos/pl/pocillo usando un instrumento Multidrop Combi (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Inmediatamente despues, DPI (1 nM-500 nM) o anfotericina B (20 nM-10 mM) se anadieron usando "pitool" conectado a una estacion de trabajo automatizada JANUS® (PerkinElmer Inc., Waltham, MA) y se incubaron durante 48 horas. La capacidad metabolica del parasito se midio despues de 2,5 horas de incubacion usando el reactivo CellTiter-Blue® (Promega Corporation, Madison, WI, cat. n.° G8082) usando un lector EnVision Multilabel (PerkinElmer Inc., Waltham, MA). Los datos se analizaron

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mediante regresion no lineal (log (inhibidor) vs. respuesta - pendiente variable). La preparacion de los graficos y el calculo de CI50 se realizaron usando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, EE.UU.). El valor de CI50 se calculo por el metodo de regresion no lineal como la concentracion de DPI en la que el numero de promastigotes viables se redujo en un 50 % (valores dados a continuacion en la Tabla 1).

El efecto de DPI contra promastigotes de Leishmania major, determinado como se ha descrito anteriormente, se ilustra en la FIG. 1A y 1B (incluyendo cepas resistentes a las sales de antimonio). Las figuras muestran el porcentaje de promastigotes de L. major que viven en cultivos a los que se anadieron DPI o anfotericina B en comparacion con el cultivo de control (tomado como 100 %).

Efecto citotoxico de DPI en Leishmania major en forma amastigote (FIG. 2)

Los precursores de macrofagos se aislaron de la medula osea y se incubaron durante 7 dfas a 37 °C y CO2 al 5 % en DMEM suplementado con sobrenadante de celulas L929 (20 por ciento en volumen) que contienen FECG. Tras la diferenciacion, los macrofagos se infectaron con L. major que expresa E-GFP en la fase estacionaria de crecimiento en una relacion de 1:10. A continuacion, los macrofagos se incubaron en DMEM suplementado con el sobrenadante de celulas L929 (20 % de volumen) que contienen FECG a 37 °C y CO2 al 5 %. Despues de 24 horas, el medio que contiene los parasitos extracelulares se desecho y las placas se lavaron 3 veces con medio SSEH (solucion salina equilibrada de Hanks, Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° H9269). En la etapa final, SSEH se reemplazo con DMEM suplementado y las muestras se incubaron durante otras 24 horas para poder transformar los promastigotes en amastigotes. A continuacion, se anadieron las sustancias de ensayo en concentraciones de 7,8 nM a 2 nM. Despues de 48 horas de co-incubacion con las sustancias, los macrofagos se tineron con 1 pg/ml de laser de colorante estiril-751 (LDP-751) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, el medio se aspiro, los macrofagos se lavaron lejos de la placa con TFS frfo que contiene glucosa 10 mM (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° G5400) y EDTA 3 mM (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° 3365).

Las muestras se analizaron en un citometro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) usando el software CellQuest Pro (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Detectores usados: dispersion directa (FSC) (dispersion frontal), dispersion lateral (SSC) (dispersion hacia los lados), FL1 (emision a 530 ± 15 nm) detector para GFP, FL3 (emision >670 nm - "filtro de paso largo") detector para LDS-751. Los resultados se midieron para 10.000 macrofagos en el primer experimento y para 20.000 macrofagos en el segundo experimento. Las celulas muertas negativas para LDS-751 se excluyeron del analisis. Los resultados se procesaron usando una regresion no lineal (log (inhibidor) vs. respuesta - pendiente variable).

Los resultados del ensayo anterior se muestran graficamente en la FIG. 2.

Para comprobar los resultados anteriores obtenidos por citometrfa de flujo (CMF), se prepararon frotis celulares a partir de suspensiones celulares de macrofagos peritoneales tratados con DPI a concentraciones de 2,7 nM, 24,7 nM, 0,222 pM y 2,0 pM. Los frotis se tineron con Giemsa (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° 11700) y se analizaron mediante microscopfa de fluorescencia Leica6000DM (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) a un aumento de 400x. Se determino el numero total de parasitos en 500 macrofagos. Los resultados se procesaron usando regresion no lineal ("disminucion exponencial monofasica").

Los valores de DL50 tanto para la citometrfa de flujo como de los frotis celulares se calcularon como la concentracion a la que el numero de macrofagos infectados disminuyo en un 50 %. Se crearon los graficos y el valor de DL50 se calculo usando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, EE.UU.). Los valores de CI50 y DL50 se muestran en la Tabla 1.

TABLA. 1. Valores de DL50 y CI50 determinados a partir de los resultados de ensayos que se muestran en la FIG. _______________________1A, 1B y 2B. Amf B = anfotericina B______________________

DPI Amf B

L. major, en forma promastigote (CI50, pM)

0,010 0,039

L. major, resistente a sales de antimonio, en forma promastigote (CI50, pm)

0,015 0,043

L. major, en forma amastigote intracelular (DL50, pM)

0,066 0,143

Los ensayos mostraron que el DPI es eficaz en la inhibicion del crecimiento de parasitos del genero Leishmania en forma promastigote (una forma que vive en los vectores de insectos). El valor de CI50 = 0,010 pM es significativamente inferior al valor de los farmacos actuales, tales como anfotericina B (CI50 = 0,039 pM).

Ademas, se demostro que el DPI es eficaz en matar a los parasitos del genero Leishmania en forma amastigote (forma que se encuentra en los macrofagos). El valor de DL50 = 0,066 pM descubierto para DPI es significativamente inferior al valor de anfotericina B (DL50 = 0,143 pM).

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EJEMPLO3

Efecto de DPI in vivo (FIG. 3)

Ratones hembra BALB/c (8-11 semanas de vida) se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos experimentales de 8-9 animales: 1) control no infectado; 2) control no tratado infectado; 3) administracion de 2,5 mg/kg/dfa (MKD) de anfotericina B; 4) administracion de 0,5 MKD de DPI. Los promastigotes de L. major (10 X 106) del subcultivo 2 de 7 dfas en 50 pl de solucion salina esteril (TFS) se inocularon por via subcutanea en la rafz de la cola del raton. Los ratones de control no infectado se inocularon con solucion salina esteril. La aplicacion del farmaco convencional (anfotericina B) y la sustancia de ensayo (DPI) comenzo la segunda semana despues de la infeccion cuando la mayorfa de los ratones habfan desarrollado una hinchazon en el sitio de la inyeccion parasitaria. Durante los siguientes 28 dfas, el grupo 3 se trato diariamente por inyeccion intraperitoneal de farmaco convencional anfotericina B, y el grupo 4 mediante la inyeccion de DPI en 20 % de DMSO en TFS, y los grupos 1 y 2 en un volumen identico de 20 % de DMSO en TFS. El tamano de la lesion de la piel se midio semanalmente mediante un calibrador. Los ratones se sacrificaron a las 6 semanas despues de la infeccion y se extrajo el bazo para su analisis. El numero de parasitos en el bazo se determino usando PCR-ELISA de acuerdo con el procedimiento descrito en Kobets et al. Nature Protocols, 5 (6): 1074-1080, 2010. Brevemente, se aislo el ADN total usando procedimientos convencionales (
http://www.mrcgene.com/tri.htm) de reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, EE.UU.). Para la amplificacion por PCR, los cebadores fueron: cebador F marcado con digoxigenina 5'-ATT TTA CAC CAA CCC CCA GTT-3' y cebador R biotinilado 5'-GTG GGG GAG GGG CGT TCT-3' (VBC Genomics Biosciences Research, Austria) que orientan selectivamente 120 pb de la region conservada de ADN en el minicfrculo de cinetoplasto de Leishmania. Cada reaccion se realizo usando 50 ng de ADN aislado. 20 ng de ADN de L. major se uso como control positivo y el amplificado sirvio como el patron de concentracion mas elevado. La amplificacion por PCR se realizo con 30 ciclos. Un numero de parasitos se determino mediante analisis del producto de PCR usando un protocolo ELISA modificado (Pharmingen, San Diego, EE.UU.). La concentracion de ADN de Leishmania se evaluo mediante el lector ELISA Tecan y el programa KIM-E (Schoeller Pharma, Praga, Republica Checa), en el que la curva de calibrado se evaluo mediante el analisis de regresion lineal por mfnimos cuadrados.

El efecto de DPI in vivo en la reduccion de parasitos de L. major en el bazo de ratones infectados se muestra en la FIG. 3.

En el ensayo in vivo que se ha descrito anteriormente, se demostro que la administracion de DPI resulto en una reduccion estadfsticamente significativa en el numero de parasitos en el bazo de los ratones infectados, en un nivel comparable al observado para un grupo tratado con el farmaco convencional de anfotericina B.

EJEMPLO 4

Efecto de DPI en la forma de torrente sangufneo del parasito Trypanosoma brucei brucei (FIG. 4)

Trypanosoma brucei brucei AnTarl fue un regalo de Jan van den Abbeele, Instituto de Medicina Tropical "Principe Leopold", Amberes, Belgica. Los parasitos se almacenaron en nitrogeno lfquido y antes del experimento se descongelaron y se usaron para infectar ratones por inoculacion intraperitoneal. Seis a siete dfas despues de la infeccion, los ratones infectados fueron sacrificados por dislocacion cervical, la sangre se extrajo de la cavidad del pecho despues de la rotura de la aorta y se mezclo en una relacion de 1:5 con HMI-11 (medio modificado de Iscove (Sigma, St. Louis, MO, cat. n.° I6529,) suplementado con L-cistefna 1,5 mM, 2-mercaptoetanol 0,2 mM, piruvato de sodio 1 mM, timidina 0,16 mM, 100 pg/ml de estreptomicina, 63,7 pg/ml de penicilina G y SFB inactivado por calor al 20 %) [Hiru Hiru & 1989]. La suspension se centrifugo a 200 g durante 5 minutos a 4 °C y se recogio el sobrenadante. Se determino el numero de formas de torrente sangufneo de T. brucei brucei en el sobrenadante por recuento en una camara de Burker. El cultivo se diluyo en HMI-11 a una densidad de 4x106 parasitos/ml, y los parasitos se cultivaron durante 3 horas a 37 °C, CO2 al 5 % en placas de cultivo de 48 pocillos (Costar, cat. n.° 3548), 0,5 ml/pocillo. Las placas se cubrieron luego con parafilm para evitar el intercambio de gases y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Los parasitos sobrevivieron otras 24 horas a aproximadamente la misma densidad y entonces podrfan usarse para ensayar los efectos antiparasitarios de DPI.

Para determinar los efectos antiparasitarios de DPI, los parasitos se cultivaron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Al comienzo del cultivo se anadio DPI a los cultivos de ensayo dando lugar a diferentes concentraciones molares (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 y 9 pm). Los cultivos paralelos se ensayaron con las mismas concentraciones de pentamidina (sal de potasio de pentamidina), que sirvio como la sustancia de referencia (es un medicamento que se usa habitualmente), y los cultivos sin adicion de sustancias activas como control. Dos experimentos independientes se llevaron a cabo y en cada uno de ellos se llevaron a cabo cultivos individuales por duplicado. El numero de parasitos vivos (celulas moviles) en cultivos individuales se contaron despues de 24 h de cultivo en la camara de Burker.

El efecto de DPI en la forma de torrente sangufneo del parasito Trypanosoma brucei brucei se ilustra graficamente en la FIG. 4. Para DPI, se observo el valor de CL50 = 0,85 pM, que es superior a un valor de la sustancia de referencia pentamidina (CL50 = 0,14 pM). Sin embargo, es interesante que DPI actue tanto sobre Leishmania como

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Trypanosoma. Esto indica el hecho de que el DPI puede actuar sobre un mecanismo comun de estos parasitos. El valor de CL50 se designo como la concentracion que provoca una reduccion de parasitos vivos en un 50 % en comparacion con el control negativo. Los valores de CL50 se determinaron usando la curva logaritmo de tres parametros (inhibidor) vs. respuesta en GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, EE.UU.). Esta curva se selecciono como adecuada para la adaptacion de los datos medidos. La curva se ajusto a los datos por analisis de mfnimos cuadrados.

EJEMPLO5

Determinacion de la citotoxicidad de DPI para las celulas humanas (FIG. 5)

Las celulas humanas CCD 841 (celulas epiteliales intestinales) y MRC5 (fibroblastos de pulmon fetal) en medio de crecimiento apropiado se distribuyeron en placas negras de 384 pocillos (Corning, cat. n.° 3571) a una densidad de 15.000 celulas/25pl/pocillo usando un Multidrop Combi (Thermo Scientific). Despues de 48 horas de incubacion a 37 °C y CO2 al 5 %, la viabilidad celular se determino usando un ensayo comercial que representa el ensayo de viabilidad celular CellTiter Blue (Promega, cat. n.° G8082). La citotoxicidad se determino despues de 4 horas a 37 °C y CO2 al 5 % usando un ensayo comercial que representa un ensayo de membrana homogeneo CytoTox-ONE (Promega, cat. n.° G7892). La intensidad de fluorescencia se midio por el detector (lector) EnVision (Perkin Elmer) y se analizaron los datos medidos usando el software Prism5 (GraphPad Software, Inc.).

La viabilidad de las celulas como dependiente de la concentracion de DPI se muestra en la FIG 5. Las concentraciones de DPI, en las que se produce una actividad antiparasitaria significativa, es decir, en el intervalo de 9,8 nM-1,25 M (veanse los ejemplos 1 y 2), no mostro efecto negativo alguno sobre la viabilidad de celulas humanas CCD 841 y MRC5. Por ende, las concentraciones de DPI eficaces anti-parasitariamente no son citotoxicas para las celulas humanas.

Referencias

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10

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Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por los parasitos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae.

   5
2. 2. Difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por los parasitos pertenecientes al genero Leishmania.
3. 3. Difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades 10 causadas por el parasito Leishmania major.
4. 4. Difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por los parasitos pertenecientes al genero Trypanosoma.

   15 5. Difenileneiodonio o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades

   causadas por el parasito Trypanosoma brucei brucei.