WO2016038238A1 - Uso de ésteres derivados de pirazol protón-ionizables y sus correspondientes sales para el tratamiento de la enfermedad de chagas y la leishmaniasis - Google Patents

Uso de ésteres derivados de pirazol protón-ionizables y sus correspondientes sales para el tratamiento de la enfermedad de chagas y la leishmaniasis Download PDF

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WO2016038238A1
WO2016038238A1 PCT/ES2015/070658 ES2015070658W WO2016038238A1 WO 2016038238 A1 WO2016038238 A1 WO 2016038238A1 ES 2015070658 W ES2015070658 W ES 2015070658W WO 2016038238 A1 WO2016038238 A1 WO 2016038238A1
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dicarboxylate
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leishmania
pyrazol
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PCT/ES2015/070658
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Felipe REVIRIEGO PICON
Pilar Navarro Torres
Vicente J. ARAN REDO
Manuel Sanchez Moreno
Clotilde Marin Sanchez
Francisco Olmo Arevalo
Inmaculada RAMIREZ MACIAS
Enrique GARCIA-ESPAÑA MONSONIS
María Teresa ALBELDA GIMENO
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic)
Universidad De Granada
Universitat De Valencia
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of proton-ionizable pyrazole-derived esters in neutral form or in the form of salts (pyrazolates), as medicaments and more particularly for the prevention and / or treatment of diseases of parasitic origin such as the disease of Chagas or leishmaniasis.
  • Chagas disease (American trypanosomiasis) is an infectious tropical disease cataloged in the group of so-called “neglected deseases", which affects thousands of people in Latin America in areas of population with low economic resources, and It therefore represents a serious health problem. It is a parasitic disease, usually chronic, caused by the hemophlagelated protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi).
  • the natural reservoir consists of armadillos, marsupials, rodents, bats and wild primates, as well as certain domestic animals (dogs and cats).
  • Triatoma infestans Triatoma infestans
  • Rhodius prolixus Triatoma dimidiata
  • the disease can also be transmitted by non-vector mechanisms such as transfusion of contaminated blood or organ donation, by ingestion of contaminated food or vertically from an infected mother to the fetus.
  • the acute infection phase is normally asymptomatic, and most patients do not realize that they have been infected; but this acute phase subsequently evolves into a chronic state, which reaches between 30% and 40% of all chagasic patients, in which severe complications are manifested 10-30 years after infection.
  • nifurtimox Nfx, 3-methyl-4- (5-nitrofurfurylidenamino) tetrahydro-4 / - / - 1, 4-thiazine -1, 1-Dioxide, Lampit ® , which has recently been discontinued by Bayer
  • benznidazole Bzn, N-benzyl-2- (2-nitroimidazol-1-yl) acetamide, Rochagan ® from Roche, now manufactured by LAFEPE in Brazil.
  • Chagas disease Another worrying aspect of Chagas disease is the high reactivation capacity of parasitemia in immunosuppressed individuals. It has been proven that cured patients who have subsequently undergone kidney or liver transplantation, diagnosed with AIDS, or treated with anticancer chemotherapy, underwent reactivation of Chagas disease with a very aggressive clinical course leading to meningoencephalitis and / or acute myocarditis. In fact, when patients with chronic chagasic heart disease undergo cardiac transplantation, reactivation of parasitemia occurs and benznidazole treatment only leads to temporary remission, but T. cruzi infection persists [Campos, S.V. et al., J. Hear ⁇ Lung Transp. 2008, 27, 597-602].
  • leishmaniasis Another important disease caused by kinetoplastic protozoan parasites is leishmaniasis, caused by infection with different species of protozoa of the genus Leishmania, which is transmitted through the bite of diptera of the genera Phlebotomus and Lutzomyia.
  • leishmaniasis is endemic in 98 countries, mainly in America, but also in Europe and Asia, with more than 350 million people at risk, more than 2 million new cases each year, and an annual mortality that exceeds 60,000 patients .
  • the World Health Organization has ranked it 9th among the most severe infectious diseases.
  • Leishmaniasis can occur with different clinical manifestations: (I) visceral, which is the most severe of all; (II) the skin, which causes nodules and ulcers that may persist for years; and (III), the mucocutaneous, which causes permanent lesions in the mouth, nose or genital mucosa. Visceral leishmaniasis is the clinical form that takes more lives worldwide. It can be fatal if not treated in time and is characterized by inflammation of the liver and spleen, accompanied by severe abdominal distension, loss of body condition, malnutrition and anemia.
  • Leishmania infantum (L infantum) is considered to be the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in southeastern Europe. It uses dogs as a reservoir and mainly affects children, although co-infection with HIV and the increasing use of chemotherapy for immunosuppression in transplants have led to a considerable increase in the percentage of cases in adults.
  • Leishmania braziliensis (L. braziliensis) that mainly affects the Andean countries, and the Amazon basin, and causes cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.
  • the treatment of leishmaniasis is complicated. There are no effective vaccines and diagnostic tests are not specific due to poor vector control measures [Barrett, MP et al., Curr. Top. Med. Chem.
  • Chemotherapy is the main weapon to combat the clinical manifestations of most forms of leishmaniasis.
  • the medications that have been commonly used so far are sodium stibogluconate (Pentostan ® ) and antimoniato of meglumine (Glucantime ® ). But they are very ineffective and cause a multitude of toxic side effects such as nausea, vomiting, diarrhea, rashes, dizziness, cardiac arrhythmia, hypotension, hepatitis and pancreatitis.
  • the current treatment with Glucantime is based on intramuscular application for a period of 20 to 30 days. However, this drug shows a high toxicity and is also not effective [Palumbo, E., Am. J. Ther. 2009, 16, 178-182].
  • amphotericin B (AmBiosome ® ), which is administered for a maximum of 10 days and has no toxicity, but is extremely expensive ($ 1,500 to $ 2,400 per treatment); miltefosine that is orally administered but the treatment lasts 4 weeks and has restrictions of use for pregnant women and children; Pentamidine and Ketoconazole.
  • Amphotericin B AmBiosome ®
  • miltefosine that is orally administered but the treatment lasts 4 weeks and has restrictions of use for pregnant women and children
  • Pentamidine and Ketoconazole Pentamidine and Ketoconazole.
  • repeated infections or ineffective treatments have caused parasite resistance to these therapies [Singh, N. et al., Indian J. Med. Res. 2006, 123, 41 1- 422]. Therefore, it is necessary to obtain new antileishmanial agents of lower cost, greater effectiveness and with less adverse side effects.
  • FeSOD iron superoxide dismutase
  • prosthetic groups are essential in all enzymatic processes, modifications in the active center of the enzyme, either by dissociation of the metal or by changes in coordination geometry, could be an effective way to deactivate its antioxidant action, and possibly affecting both the growth and survival of the parasite cells.
  • alkylamino derivatives of benzo [g] phthalazine or phthalazine with antiparasitic activity in vitro and / or in vivo against 7 cruzi and Leishmania spp., Showed a potent ability to inhibit the FeSOD of the respective parasites [Sánchez-Moreno, M. et al. , J. Med. Chem. 2012, 55, 9900-9913].
  • macrocyclic and macrobicyclic polyamines containing pyrazole rings which inhibit FeSOD from T. cruzi, showed trypanosomicidal activity in the acute and chronic phases of Chagas disease [Sánchez-Moreno, M. et al., J.
  • the present invention provides the use of low toxicity and low cost compounds, which possess a potent antiparasitic activity against the Kinetoplastea class and in particular against the Trypanosomatidae family, in particular trypanosomicidal activity in Chagas disease, more particularly, in immunodeficiency cases in which reactivation of parasitemia frequently occurs, in addition to activity against leishmaniasis.
  • said compounds are characterized by a potent efficacy to inhibit the enzyme iron superoxide dismutase (FeSOD).
  • FeSOD farnesoid satuticas .
  • compounds of formula (I) and (II) capable of inhibiting the FeSOD of Trypanosoma and Leishmania have been used in the present invention, limiting their antioxidant defense against the host's toxic radicals.
  • a first aspect of the present invention relates to the use of a compound of general formula (I) or (II) (hereafter compounds of the invention):
  • R 2 and R 2 may be the same or different and represent a (C1-C1 0 ) alkyl group;
  • R 3 is selected from hydrogen or a (C1-C1 0 ) alkyl group;
  • X + is a pharmaceutically acceptable monovalent cation
  • the medicament is an antiparasitic agent.
  • Another aspect of the present invention relates to the compounds of general formula (I) or (II), described in the present invention, for use as a medicament.
  • alkyl refers in the present invention to linear or branched aliphatic chains having 1 to 10 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl or ferc-butyl .
  • the alkyl group has 1 to 4 carbon atoms.
  • R 3 is hydrogen
  • R ⁇ i and / or R 2 is an alkyl group (CC 4 ), more preferably R ⁇ and R 2 are the same.
  • X + is an alkali cation, more preferably it is selected from Li + , Na + or K + , even more preferably it is Na + .
  • the compounds of the invention are diethyl 1 / - / - diethyl pyrazol-3,5-dicarboxylate or 3,5-bis (ethoxycarbonyl) pyrazolate, even more preferably the compound is 1 / - / - diethyl pyrazol-3,5-dicarboxylate.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a compound of general formula (I) or (II) as previously described, for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a parasitic disease, which preferably It is based on the inhibition of the parasitic FeSOD enzyme, more preferably for the prevention and / or treatment of diseases caused by a parasite of the Kinetoplastea class, more preferably of the Trypanosomatidae family, more preferably the parasites are of the Trypanosoma or Leishmania genus.
  • Species thereof may be, but are not limited to Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropic or Leishmania chagasi, among others, known to a person skilled in the art.
  • leishmaniasis is a disease caused by a protozoan of the genus Leishmania and transmitted, mainly by diptera known as “sand fly”, sand flies or jejenes. This disease occurs in humans and vertebrate animals, such as marsupials, canids, rodents and primates.
  • Trypanosomiasis are diseases caused in humans or vertebrate animals that are caused by protozoan parasites of the genus Trypanosoma, among them you can find African human trypanosomiasis, also known as sleeping sickness, American trypanosomiasis or Chagas disease or trypanosomiasis in Animals or Nagana
  • trypanosomiasis is Chagas disease, preferably in its acute phase or in its chronic phase, particularly in immunocompromised individuals in which reactivation of parasitemia occurs.
  • compositions comprising at least one compound of general formula (I) or (II) as previously described, together with a pharmaceutically acceptable carrier, optionally said composition may comprise another active ingredient, preferably the active ingredient is an antiparasitic. Furthermore, the use of said composition will be in a therapeutically effective amount.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • pyrazole esters of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts, as well as the pharmaceutical compositions containing them, can be used together with other drugs, or additional active ingredients, preferably antiparasitic, to provide a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to a compound of general formula (I) or (II) or to the pharmaceutical composition that He understands them.
  • an additional active ingredient examples include, but are not limited to: meglumine antimony, sodium stibogluconate, amphotericin B, ketoconazole, miltefosine, paromomycin, pentamidine, allopurinol, itraconazole, gamma interferon, bleomycin, levamisole, mebendazole, metronidazole, chlortronone, metronidazole, metronidazole, chlortronone , minomycin, methyluracil, nifurtimox, diminazene, cyclologuanyl palmoate, emetine, furazolidone, rifampicin, isoniazid, interleukin 2, trimethoprim-sulfamethoxazole, suramine, melarsoprol, eflornithine, chloroquine, quinine, tinva, solvates, fluvazole, tinva, solvate ,
  • another aspect of the present invention relates to a combined preparation for use separately, simultaneously or sequentially comprising at least one compound of general formula (I) or (II) as described above and another active ingredient, preferably an antiparasitic. More preferably the use of that combined preparation for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of a disease caused by a parasite, preferably of the Kinetoplastea class, more preferably of the Trypanosomatidae family, more preferably the parasites are of the Trypanosoma or Leishmania genus.
  • a parasite preferably of the Kinetoplastea class, more preferably of the Trypanosomatidae family, more preferably the parasites are of the Trypanosoma or Leishmania genus.
  • Species thereof may be, but are not limited to Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania tropic or Leishmania chagasi, among others, known to a person skilled in the art.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, due to the characteristics of the compounds, as well as the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • Said therapeutic composition can be prepared in solid form or in suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • a further aspect of the present invention relates to a compound selected from: 3,5-bis (methoxycarbonyl) sodium pyrazolate; Dipropyl 1 / - / - pyrazol-3,5-dicarboxylate; Sodium 3,5-bis (propoxycarbonyl) pyrazolate; and 1 / - / - dibutyl pyrazol-3,5-dicarboxylate.
  • FIG. 1 Evaluation of compounds 3 and 4 on the rate of infection and division of intracellular forms of T. cruzi in culture of infected Vero cells.
  • A % of infection.
  • B number of amastigotes per infected cell.
  • C number of trypomastigotes in the culture medium. The values are results of four independent experiments; the legend indicates the value of the reduction of the corresponding parameter in relation to the control for each of the tested compounds.
  • FIG. 2 - In vitro inhibition (%) of CuZnSOD from human erythrocytes with compounds 3 and 4.
  • B In vitro inhibition (%) of FeSOD from epimastigote forms of T. cruzi with compounds 3 and 4. Concentrations tested : 1-100 ⁇ ; the legend indicates the IC 50 values of the corresponding SOD obtained for each of the compounds tested. IC 50 values for erythrocytes were obtained by mathematical extrapolation.
  • FIG. 3. Evaluation of compounds 3 and 4 on the rate of infection and division of intracellular forms of L infantum in culture of J774.2 macrophages infected with L. infantum.
  • A % of infection.
  • B number of amastigotes per infected cell. Measured at a concentration of IC 2 s; the legend indicates the value of the reduction of the corresponding parameter in relation to the control for each of the tested compounds .
  • FIG. 4. Evaluation of compounds 3 and 4 on the rate of infection and division of intracellular forms of L braziliensis in J774.2 macrophage culture infected with L. braziliensis.
  • A % of infection.
  • B number of amastigotes per infected cell. Measured at a concentration of IC 2 s; the legend indicates the value of the reduction of the corresponding parameter in relation to the control for each of the tested compounds.
  • FIG. 5.- In vitro inhibition (%) of CuZnSOD from human erythrocytes by compounds 3 and 4.
  • B In vitro inhibition (%) of FeSOD from promastigote forms of L. infantum by compounds 3 and 4.
  • C In vitro inhibition (%) of FeSOD forms L. braziliensis promastigote for compounds 3 and 4. Concentrations tested: 1-100 ⁇ ; the legend indicates the IC 50 values of the corresponding SOD obtained for each of the compounds tested. IC 50 values for erythrocytes were obtained by mathematical extrapolation.
  • FIG. 6. Parasitemia in the murine model during the acute phase of Chagas disease. Dose administered: 25 mg / kg; the legend indicates the value of the reduction in the number of trypomastigotes / mL in relation to the control (untreated animals) for each of the compounds tested.
  • FIG. 7 Percentage of reactivation of parasitemia after the administration of an immunosuppressive treatment cycle for both the group of control mice (untreated animals) and those treated.
  • FIG. 8. Total levels of anti-7 Ig-G. cruzi expressed in absorbance units (OD, optical density) for groups of control mice (untreated animals) and treated at different days after infection (p.i.). For the day 120 p.i. The groups were divided into two subgroups: immunosuppressed (IS) and not immunosuppressed.
  • FIG. 9. Result of the PCR amplification for post mortem mouse organs (day 120 p.i.), through the use of specific primers for the parasite superoxide dismutase gene (sod-b).
  • the compounds of the general formula (I) were prepared by esterification of the ⁇ -pyrazol-3,5-dicarboxylic acid with the corresponding alcohol and the compounds of the general formula (II) were prepared by treating the esters (I) with sodium hydroxide.
  • the compounds that share the general formula (I) (compounds 1, 3, 5, 7 and 8) and the general formula (II ) (compounds 2, 4, and 6) are effective in vitro in the treatment of diseases caused by the parasites T. cruzi and Leishmania spp., while maintaining a low level of toxicity (substantially lower than the compounds of reference). In general, all of them selectively inhibit the FeSOD of the parasites T. cruzi and Leishmania spp. in relation to CuZnSOD.
  • T. cruzi type I was used (strain SN3, isolated in Guajira in northern Colombia in humans, 2006) [Téllez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34].
  • the culture of the epimastigote forms of T. cruzi was performed in vitro in sterility in a single phase MTL (Medium Trypanosomes Liquid) culture medium enriched with 10% (v / v) fetal bovine serum (SBF-I) inactivated at 56 ° C for 30 minutes.
  • MTL Medium Trypanosomes Liquid
  • SBF-I fetal bovine serum
  • the inoculum of parasites to start the culture was 5 x 10 4 cells / mL in 5 mL of medium in 25 cm 2 Falcon ® plastic bottles and kept in an oven at 28 ° C. Cultures were performed routinely achieving exponential growth of flagellate until the necessary cell mass was obtained for subsequent studies. For the performance of the trials both epimastigote and trypomastigote and amastigote forms were used.
  • Epimastigote forms of T. cruzi cultured in the manner described above were collected in their exponential phase of growth by centrifugation at 1500 rpm for 10 min. The number of parasites was counted in a hemocytometric chamber of Neubauer and seeded in a 24-well plate at a concentration of 5 x 10 4 parasites / well.
  • the compounds to be tested were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), a solvent that at a final concentration in the test medium of 0.01% (v / v) does not show toxicity or have any effect on the growth of parasites.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the compounds were added to the culture medium at final concentrations of 100, 50, 25, 10 and 1 ⁇ .
  • the effect of each compound on the growth of epimastigote forms, at the different concentrations tested, was evaluated at 72 h, using a hemocytometric chamber of Neubauer and the trypanocidal effect was expressed as IC 50 (concentration required to produce an inhibition of 50%, calculated by analysis of the linear regression of K c at the concentrations tested) [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 970-979].
  • Vero cells were detached from the culture flask where they were attached by trypsinization. For this, the culture medium was removed, then the cell surface was covered with EDTA-trypsin and incubated cold for 5 minutes. After that, the mixture was transferred to a conical bottom flask of 25 ml_ capacity (steriline), centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed and the cells were counted in Neubauer chamber.
  • ml_ capacity steriline
  • Vero cells were resuspended at a concentration of 1 x 10 4 cells / well in RPMI culture medium, cultured in 24-well plates, in each of which a 12 mm round glass cover glass had previously been introduced. For adhesion, the cells were left 24 h at 37 ° C at 5% C0 2 .
  • the cells were adhered, they were infected in vitro with 1 x 10 5 cells / well of trypomastigote forms of T. cruzi [Ram ⁇ rez-Mac ⁇ as, I. et al., Parasite !. Int. 2012, 61, 405-413].
  • the infection was maintained for 24 hours for the parasite to enter the cell.
  • the culture medium was removed and fresh medium was added with the products to be tested, at the concentrations necessary to obtain the IC 50 (100 to 1 ⁇ ).
  • the crystals were removed. Once the crystals were removed, they were placed on a slide. They were fixed with methanol and allowed to dry.
  • DPX Panreac ®
  • DPX a microscopy mounting medium
  • Azur-Eosin-Methylene Blue solution was diluted according to Giemsa DC (Code 251338) with Sórensen buffer (dilution 1: 10), mixed well and covered the preparation leaving Color for 20 minutes. It was washed with distilled water. It was allowed to drain and dry in an upright position. Finally, it was examined with the objective of immersion and the number of intracellular amastigote forms in a total of 200 cells was counted.
  • Vero cells were established from the kidney of an adult African green monkey, keeping the cultures at a density of 1 x 10 4 cells / mL at 37 ° C and 5% C0 2 . The cells were deposited in a sterile and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded and the cells were resuspended in RPMI medium.
  • the cells and the medium present in the wells were split, to which 100 ⁇ of propidium iodide solution (Pl, 100 ⁇ g / mL) (Sigma Chemical Co) was added, incubating at 28 ° C in darkness for about 10 minutes ; subsequently, 100 of fluorescein diacetate (FDA) (Sigma Chemical Co) in solution (100 ng / mL) was added, re-incubating at 28 ° C in the dark for about 10 minutes, and after centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes, the procedure was to wash the precipitate with PBS. Finally, the results were analyzed taking into account that the cells with the intact plasma membrane have a green fluorescence, while the damaged or dead cells have a red fluorescence. The percentage of viability was calculated. The number of dead cells was determined by comparison with the control cultures.
  • Particularly preferred compounds of the present invention for use as an antiparasitic against T. cruzi are the compounds of formula 3 and 4, which have a level of non-specific toxicity against Vero cells much lower than that of benznidazole (Bzn) and even less than the rest of the esters and pyrazolates studied in the present invention.
  • Leishmania species have been maintained in our laboratory for several years by means of cultures at 28 ° C in MTL medium enriched with 10% inactive fetal bovine serum (FCSI) and so that you do not lose your virulence, passes are made In vivo newspapers in Balb / c strain mice [Téllez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34].
  • FCSI inactive fetal bovine serum
  • the culture was centrifuged at 1000 g for 10 minutes in order to concentrate the flagellated forms on a button.
  • the amastigote forms were obtained in vitro after infestation of macrophages of the J774.2 line (ECACC 85011428) according to the method developed by the authors of the present invention [González, P. et al., J. Antimicrob. Agents 2005, 25, 136-141].
  • promastigote forms were started in exponential growth phase, grown at 28 ° C in MTL medium supplemented with 10% FCSI of the two Leishmania strains.
  • the promastigote forms test is performed in a similar way to that described for the epimastigote forms of T. cruzi.
  • Particularly preferred compounds for use as an antiparasitic against Leishmania spp. are those of formula 3, 4 and 7. Specifically, compounds 3 and 4 are much more active against extracellular (promastigote) and intracellular (amastigote) forms of L. infantum and L braziliensis than the reference medicine, Glucantime, and much less toxic on macrophages.
  • Examples 4 are much more active against extracellular (promastigote) and intracellular (amastigote) forms of L. infantum and L braziliensis than the reference medicine, Glucantime, and much less toxic on macrophages.
  • Vero cells were cultured under the same conditions outlined above for 2 days. The cells were then infected in vitro with metacyclic forms of T. cruzi, in 10: 1 ratio. Compounds 3 and 4 (at the IC concentration 2 s) were added immediately after infestation and incubated for 12 h at 37 ° C in 5% C0 2 . Non-phagocytic parasites and products were removed by washing and infected cultures were grown for 10 days in fresh medium, adding fresh medium every 48 hours. The activity of the compounds was determined by the% of infected cells, number of amastigotes per infected cell and number of trypomastigotes in the medium. Treated and untreated cultures were fixed and stained with methanol and Giemsa. The% of infected cells and the average number of amastigotes per infected cell was determined by analysis of 200 Vero cells under a microscope every 48 hours. The number of trypomastigotes in the medium was determined using a Neubauer chamber.
  • FeSOD has been shown to effectively and selectively inhibit epimastigote forms of T. cruzi in relation to the CuZnSOD of human erythrocytes (see FIG. 2).
  • the cells were infected in vitro with promastigote forms of the two Leishmania species, in 10: 1 ratio.
  • Compounds 3 and 4 (at an IC concentration of 2 s) were added immediately after infestation and incubated for 12 ha. 37 ° C at 5% C0 2 .
  • the non-phagocytic parasites and the products were removed by washing and the infected cells were cultured for 10 days in fresh medium, which was added every 48 hours.
  • the activity of the compounds was determined by the% of infected cells and the number of amastigotes per infected cell [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 970-979].
  • Treated and untreated cultures were fixed and stained with methanol and Giemsa.
  • The% of infected cells and the average number of amastigotes per infected cell was determined by the analysis of 200 cells under a microscope every 48 hours.
  • compounds 3 and 4 also effectively reduce the rate of infection and division of intracellular forms relative to control (see FIG. 3 and 4).
  • the values of these tests are results of four independent experiments. Typical glucantime values in these trials were 24% (FIG. 3A), 30% (FIG. 3B), 22% (FIG. 4A) and 37% (FIG. 4B) [Mar ⁇ n, C. et al., Eur J. Med. Chem. 2013, 62, 466-477].
  • the two selected compounds (3 and 4) effectively and selectively inhibit the FeSOD of promastigotes of L. infantum and L. braziliensis in relation to the CuZnSOD of human erythrocytes (see FIG. 5 ).
  • the lots were distributed as follows: a) a lot for the study of the development of the disease [acute phase and chronic phase (Example 10)], positive control group composed of infected animals and without any treatment, and b) a second group of lots: animals infected and treated with different concentrations of the compounds under study (one increase per product and concentration to be tested).
  • Parasitemia number of circulating parasites, was quantified through the blood cell counting chamber. Peripheral blood, obtained by puncture of the maxillary vein, was used in phosphate buffer (PBS). This count was performed every 3 days, for 30 days (end of the acute phase).
  • mice were treated with benznidazole (5 mg / kg of weight / day for 5 days), under the same conditions as described above.
  • Both compounds 3 and 4 showed a high efficacy of parasitemia inhibition in the acute phase (see FIG. 6).
  • mice Once on day 120 (advanced chronic phase) the mice were divided into two subgroups, one that remained under the same conditions and another that underwent immunosuppression treatment (induced by cyclophosphamide monohydrate). This added variable allowed to determine the degree of reactivation of parasitemia and therefore the parasitological cure or not of the specimens (see FIG. 7, 8 and 9).
  • FIG. 7 specifically, the percentage of reactivation of parasitemia is shown, by fresh count of the specimens that were immunosuppressed (both treated and controls); the percentage of reactivation of parasitemia, which in the control is 60%, falls to 5% in the presence of compound 4, and to 24% in the presence of compound 3.
  • FIG. 8 the variations in the concentrations of antibodies against T.

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Abstract

Uso de ésteres derivados de pirazol, preferiblemente derivados protón-ionizables en forma neutra o en forma de sales (pirazolatos), como medicamentosy más particularmentepara la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de origen parasitario tales como la enfermedad de Chagas o la leishmaniasis.

Description

USO DE ESTERES DERIVADOS DE PIRAZOL PROTÓN-ION IZABLES Y SUS CORRESPONDIENTES SALES PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS Y LA LEISHMANIASIS DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere al uso de ésteres derivados de pirazol protón- ionizables en forma neutra o en forma de sales (pirazolatos), como medicamentos y más particularmente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de origen parasitario tales como la enfermedad de Chagas o la leishmaniasis.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) es una enfermedad tropical infecciosa catalogada en el grupo de las denominadas "enfermedades olvidadas" ("neglected deseases"), que afecta en América Latina a millares de personas en áreas de población con bajos recursos económicos, y representa por tanto un grave problema de salud. Se trata de una enfermedad parasitaria, generalmente crónica, causada por el parásito protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). El reservorio natural lo constituyen armadillos, marsupiales, roedores, murciélagos y primates silvestres, además de ciertos animales domésticos (perros y gatos). Se transmite al hombre por triatominos hematófagos tales como Triatoma infestans, Rhodius prolixus o Triatoma dimidiata, que defecan sobre las picaduras que ellos mismos han realizado para alimentarse. La enfermedad puede ser también transmitida por mecanismos no vectoriales tales como transfusión de sangre contaminada o donación de órganos, por ingestión de alimentos contaminados o verticalmente de una madre infectada al feto. Inicialmente, la fase de infección aguda es normalmente asintomática, y la mayor parte de los pacientes no se da cuenta de que han sido infectados; pero esta fase aguda evoluciona posteriormente a un estado crónico, al cual llegan entre el 30% y el 40% de todos los enfermos chagásicos, en el que se manifiestan severas complicaciones a los 10-30 años posteriores a la infección. Suele producirse cardiomiopatía difusa grave, alteraciones del sistema nervioso periférico, dilatación patológica del esófago y colon, megaesófago, y megacolon, respectivamente. Muchos de ellos sufren fallo cardiaco y muerte súbita. Debido al gran incremento de viajes internacionales y a la inmigración, la enfermedad de Chagas se ha extendido, no solo a través de toda América Latina, sino también a Estados Unidos, Canadá, España, Italia y otros países.
Actualmente no hay una terapia adecuada ni una vacuna efectiva. Los dos medicamentos principalmente utilizados para tratar la enfermedad de Chagas son dos heterociclos nitroaromáticos descubiertos hace más de tres décadas: el nifurtimox (Nfx, 3-metil-4-(5-nitrofurfurilidenamino)tetrahidro-4/-/-1 ,4-tiazina-1 , 1 -dióxido, Lampit®, que recientemente se ha dejado de fabricar por Bayer), y el benznidazol (Bzn, N- bencil-2-(2-nitroimidazol-1-il)acetamida, Rochagan® de Roche, ahora fabricado por LAFEPE en Brasil). El uso de dichos medicamentos en la fase aguda es ampliamente aceptado, pero su eficacia en la fase crónica es bastante controvertida, y se calcula que la cura parasitológica en esta fase sólo se obtiene en un 10-20% de los pacientes [Maya, J.D. et al., Comp. Biochem. Physiol. Parí A 2007, 146, 601-620]. Además, causan efectos secundarios severos como pancreatitis y toxicidad cardiaca. El más utilizado en clínica es el benznidazol, a pesar de que en adultos genera un considerable número de efectos secundarios adversos, tales como trastornos digestivos, hematológicos, dermatológicos y neurológicos [Castro, J.A. et al., Hum. Exp. Toxicol. 2006, 25, 471-479].
Otro aspecto preocupante de la enfermedad de Chagas es la alta capacidad de reactivación de la parasitemia en individuos inmunodeprimidos. Se ha comprobado que pacientes curados que han sido sometidos posteriormente a trasplante de riñon o hígado, diagnosticados de sida, o tratados con quimioterapia anticancerosa, sufrieron reactivación de la enfermedad de Chagas con un curso clínico muy agresivo conduciendo a meningoencefalitis y/o miocarditis aguda. De hecho, cuando enfermos con cardiopatía chagásica crónica sufren trasplante cardiaco, se produce reactivación de la parasitemia y el tratamiento con benznidazol solo conduce a remisión temporal, pero la infección por T. cruzi persiste [Campos, S.V. et al., J. Hearí Lung Transp. 2008, 27, 597-602].
Considerando estos hechos, puede concluirse que urge la necesidad de encontrar nuevos medicamentos menos tóxicos para los pacientes y más efectivos en la fase crónica de la enfermedad de Chagas que el benznidazol, utilizado actualmente, y que tengan además la capacidad de reducir la reactivación de la parasitemia en casos de inmunodeficiencia.
Otra importante enfermedad producida por parásitos protozoarios kinetoplástidos es la leishmaniasis, causada por la infección con diferentes especies de protozoos del género Leishmania, que se transmite a través de la picadura de dípteros de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia. Actualmente, la leishmaniasis es endémica en 98 países, principalmente en América, pero también en Europa y Asia, con más de 350 millones de personas en riesgo, más de 2 millones de nuevos casos cada año, y una mortalidad anual que supera los 60.000 pacientes. La Organización Mundial de la Salud la ha clasificado en noveno lugar entre las enfermedades infecciosas más severas.
La leishmaniasis se puede presentar con diferentes manifestaciones clínicas: (I) visceral, que es la más severa de todas; (II) la cutánea, que origina nodulos y úlceras que pueden persistir durante años; y (III), la mucocutánea, que causa lesiones permanentes en la boca, nariz o en la mucosa genital. La leishmaniasis visceral es la forma clínica que se cobra más vidas mundialmente. Puede ser fatal si no se trata a tiempo y se caracteriza por la inflamación del hígado y del bazo, acompañada por distensión abdominal severa, pérdida de condición corporal, desnutrición y anemia.
La Leishmania infantum (L infantum) se considera que es el principal agente etiológico de la leishmaniasis visceral en el sureste de Europa. Utiliza perros como reservorio y afecta principalmente a niños, aunque la coinfección con HIV y el uso creciente de quimioterapia para inmunosupresión en trasplantes han conducido a un aumento considerablemente del porcentaje de casos en adultos. Otra especie significativa es la Leishmania braziliensis (L. braziliensis) que afecta principalmente a los países andinos, y cuenca de la Amazonia, y causa leishmaniasis cutánea y mucocutánea. El tratamiento de la leishmaniasis es complicado. No hay vacunas efectivas y las pruebas diagnósticas no son específicas debido a las deficientes medidas de control del vector [Barrett, M.P. et al., Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2, 471-482]. La quimioterapia es el arma principal para combatir las manifestaciones clínicas de la mayoría de las formas de leishmaniasis. Los medicamentos que se han utilizado comúnmente hasta ahora son el estibogluconato sódico (Pentostan®) y el antimoniato de meglumina (Glucantime®). Pero son muy inefectivos y causan multitud de efectos secundarios tóxicos tales como náuseas, vómitos, diarrea, erupciones cutáneas, vértigos, arritmia cardiaca, hipotensión, hepatitis y pancreatitis. El tratamiento actual con Glucantime, se basa en la aplicación intramuscular durante un plazo de 20 a 30 días. Sin embargo, este fármaco muestra una toxicidad elevada y además no es efectivo [Palumbo, E., Am. J. Ther. 2009, 16, 178-182].
Otros medicamentos utilizados son: anfotericina B (AmBiosome®) que se administra durante un máximo de 10 días y no presenta toxicidad, pero es sumamente caro (1.500 a 2.400 $ por tratamiento); la miltefosina que es de administración oral pero el tratamiento dura 4 semanas y tiene restricciones de uso para gestantes y niños; la pentamidina y el ketoconazol. Por otra parte, las infecciones repetidas o los tratamientos inefectivos han ocasionado resistencia de los parásitos a estas terapias [Singh, N. et al., Indian J. Med. Res. 2006, 123, 41 1- 422]. Por lo tanto, resulta necesario obtener nuevos agentes antileishmaniásicos de menor coste, mayor efectividad y con menores efectos secundarios adversos.
La búsqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y de la leishmaniasis se ha centrado principalmente en su acción potencial sobre componentes esenciales y exclusivos de tripanosomátidos. Entre las enzimas específicas de tripanosomátidos se encuentra la hierro superóxido dismutasa (FeSOD), que juega un papel fundamental en la supervivencia de parásitos tales como 7 cruzi y Leishmania spp., por su capacidad para evadir el daño originado por los radicales tóxicos del hospedador. Como la FeSOD no está presente en humanos puede considerarse una atractiva diana para la búsqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y de la leishmaniasis. Dado que los grupos prostéticos son esenciales en todos los procesos enzimáticos, las modificaciones en el centro activo de la enzima, ya sea por disociación del metal o por cambios en la geometría de coordinación, podrían ser una vía eficaz para desactivar su acción antioxidante, y posiblemente afectar tanto al crecimiento como a la supervivencia de las células del parásito.
Se ha descrito anteriormente que alquilamino derivados de benzo[g]ftalazina o ftalazina con actividad antiparasitaria in vitro y/o in vivo frente a 7 cruzi y Leishmania spp., mostraron una potente capacidad de inhibición de la FeSOD de los respectivos parásitos [Sánchez-Moreno, M. et al. , J. Med. Chem. 2012, 55, 9900-9913]. De forma similar, poliaminas macrocíclicas y macrobicíclicas conteniendo anillos de pirazol, que inhiben la FeSOD de T. cruzi, mostraron actividad tripanosomicida en las fases aguda y crónica de la enfermedad de Chagas [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 4231-4243]. Sin embargo, no se ha descrito hasta el momento la utilización de ésteres acíclicos sencillos derivados de pirazol protón-ionizables y de sus correspondientes sales (pirazolatos), a los que hace referencia esta invención, ni como inhibidores de FeSOD ni como agentes antiparasitarios para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona el uso de unos compuestos de baja toxicidad y bajo coste, que poseen una potente actividad antiparasitaria frente a la clase Kinetoplastea y en concreto frente a la familia Trypanosomatidae, en particular actividad tripanosomicida en la enfermedad de Chagas, más particularmente, en casos de inmunodeficiencia en los que se produce frecuentemente reactivación de la parasitemia, además de actividad frente a la leishmaniasis. En general, dichos compuestos se caracterizan por una potente eficacia para inhibir la enzima hierro superóxido dismutasa (FeSOD). Dado que la supervivencia del parásito está estrechamente vinculada a la capacidad de sus enzimas (FeSOD) de evitar el daño originado por los radicales tóxicos de su hospedador y que, por lo tanto, la FeSOD desempeña un papel relevante como parte de la defensa antioxidante en los parásitos que causan dichas enfermedades, en la presente invención se han utilizado compuestos de fórmula (I) y (II) capaces de inhibir la FeSOD de Trypanosoma y Leishmania, limitando su defensa antioxidante frente a los radicales tóxicos del hospedador.
Como se evidencia en los ejemplos, los compuestos de la invención son estructuralmente diferentes a los fármacos conocidos y presentan una toxicidad mucho menor. Son particularmente significativos los resultados de actividad antiparasitaria y baja toxicidad obtenidos in vivo frente a T. cruzi, en la fase aguda y en la crónica de la enfermedad de Chagas, así como en condiciones de inmunodeficiencia en las que se producen procesos de reactivación de la parasitemia. Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II) (a partir de ahora compuestos de la invención):
Figure imgf000007_0001
(") (I") donde:
y R2, pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo alquilo (C1-C10); R3 se selecciona de entre hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C10); y
X+ es un catión monovalente farmacéuticamente aceptable;
para la elaboración de un medicamento, preferiblemente el medicamento es un agente antiparasitario.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) o (II), descritos en la presente invención, para su uso como medicamento.
El término "alquilo", se refiere en la presente invención, a cadenas alifáticas lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo o ferc-butilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
En una realización preferida los compuestos de la invención R3 es hidrógeno.
En otra realización preferida, R<i y/o R2 es un grupo alquilo (C C4), más preferiblemente R^ y R2 son iguales.
En una realización preferida, X+ es un catión alcalino, más preferiblemente se selecciona de entre Li+, Na+ o K+, aún más preferiblemente es Na+.
En una realización preferida el compuesto de la invención se selecciona de entre:
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo; 3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sódico;
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo;
3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sódico;
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo;
3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sódico;
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de diisopropilo; y
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.
En una realización más preferida, los compuestos de la invención son 1 /-/-pirazol-3,5- dicarboxilato de dietilo o 3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sódico, aún más preferiblemente el compuesto es el 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II) según se han descrito previamente, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad parasitaria, que preferiblemente está basada en la inhibición de la enzima FeSOD parasitaria, más preferiblemente para la prevención y/o el tratamiento enfermedades causadas por un parásito de la clase Kinetoplastea, más preferiblemente de la familia Trypanosomatidae, más preferiblemente los parásitos son del género Trypanosoma o Leishmania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania trópica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.
Las enfermedades parasitarias a tratar podrían ser leishmaniasis o tripanosomiasis. La "leishmaniasis" es una enfermedad causada por un protozoo del género Leishmania y transmitido, principalmente por dípteros conocidos como "sand fly", moscas de la arena o jejenes. Esta enfermedad se produce en humanos y animales vertebrados, como pueden ser marsupiales, cánidos, roedores y primates. Las "tripanosomiasis" son enfermedades producidas en humanos o animales vertebrados que son causadas por parásitos protozoarios del género Trypanosoma, entre ellas se puede encontrar la tripanosomiasis humana africana, también conocida como enfermedad del sueño, la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas o la tripanosomiasis en animales o Nagana. Preferiblemente la tripanosomiasis es la enfermedad de Chagas, preferiblemente en su fase aguda o en su fase crónica, en particular en individuos inmunodeprimidos en los que se produce reactivación de la parasitemia. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) o (II) según se ha descrito previamente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente dicha composición puede comprender otro principio activo, preferiblemente el principio activo es un antiparasitario. Además el uso de dicha composición será en una cantidad terapéuticamente efectiva.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
Los ésteres de pirazol de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen, pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos adicionales, preferiblemente antiparasitarios, para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de un compuesto de fórmula general (I) o (II) o a la composición farmacéutica que los comprende.
Ejemplos de un principio activo adicional incluyen, pero no se limitan a: antimoniato de meglumina, estibogluconato sódico, anfotericina B, ketoconazol, miltefosina, paromomicina, pentamidina, alopurinol, itraconazol, interferón gamma, bleomicina, levamisol, mebendazol, metronidazol, clorpromazina, miconazol, minomicina, metiluracilo, nifurtimox, diminazeno, palmoato de cicloguanilo, emetina, furazolidona, rifampicina, isoniazida, interleucina 2, trimetoprima-sulfametoxazol, suramina, melarsoprol, eflornitina, cloroquina, quinina, fluconazol, tinidazol, así como cualquiera de sus sales, solvatos, esteroisómeros o prodrogas farmacéuticamente aceptables administrados de forma simultánea o secuencial a al menos uno de los compuestos de fórmula (I) o (II) descritos en la presente invención.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una preparación combinada para su uso por separado, simultáneo o secuencial que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) o (II) como se ha descrito anteriormente y otro principio activo, preferiblemente un antiparasitario. Más preferiblemente el uso de esa preparación combinada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por un parásito, preferiblemente de la clase Kinetoplastea, más preferiblemente de la familia Trypanosomatidae, más preferiblemente los parásitos son del género Trypanosoma o Leishmania. Especies de las mismas, pueden ser, pero sin limitarse Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, Leishmania brazilensis, Leishmania donovani, Leishmania trópica o Leishmania chagasi, entre otras, conocidas por un experto en la materia.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, así como la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Dicha composición terapéutica se puede preparar en forma sólida o en suspensión, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un compuesto seleccionado de entre: 3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sódico; 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo; 3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sódico; y 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Evaluación de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infección y división de las formas intracelulares de T. cruzi en cultivo de células Vero infectadas. (A) % de infección. (B) número de amastigotes por célula infectada. (C) número de tripomastigotes en el medio de cultivo. Los valores son resultados de cuatro experimentos independientes; en la leyenda se indica el valor de la reducción del correspondiente parámetro en relación con el control para cada uno de los compuestos testados.
FIG. 2 - (A) Inhibición in vitro (%) de CuZnSOD de eritrocitos humanos con los compuestos 3 y 4. (B) Inhibición in vitro (%) de FeSOD de formas epimastigote de T. cruzi con los compuestos 3 y 4. Concentraciones ensayadas: 1-100 μΜ; en la leyenda se indican los valores de IC50 de la correspondiente SOD obtenidos para cada uno de los compuestos testados. Los valores de IC50 para los eritrocitos se obtuvieron por extrapolación matemática.
FIG. 3.- Evaluación de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infección y división de las formas intracelulares de L infantum en cultivo de macrófagos J774.2 infectados con L. infantum. (A) % de infección. (B) número de amastigotes por célula infectada. Medido a una concentración IC2s; en la leyenda se indica el valor de la reducción del correspondiente parámetro en relación con el control para cada uno de los compuestos testados.
FIG. 4.- Evaluación de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infección y división de las formas intracelulares de L braziliensis en cultivo de macrófagos J774.2 infectados con L. braziliensis. (A) % de infección. (B) número de amastigotes por célula infectada. Medido a una concentración de IC2s; en la leyenda se indica el valor de la reducción del correspondiente parámetro en relación con el control para cada uno de los compuestos testados.
FIG. 5.- (A) Inhibición in vitro (%) de CuZnSOD de eritrocitos humanos por los compuestos 3 y 4. (B) Inhibición in vitro (%) de FeSOD de formas promastigote de L. infantum por los compuestos 3 y 4. (C) Inhibición in vitro (%) de FeSOD de formas promastigote de L. braziliensis por los compuestos 3 y 4. Concentraciones ensayadas: 1-100 μΜ; en la leyenda se indican los valores de IC50 de la correspondiente SOD obtenidos para cada uno de los compuestos testados. Los valores de IC50 para los eritrocitos se obtuvieron por extrapolación matemática.
FIG. 6.- Parasitemia en modelo murino durante la fase aguda de la enfermedad de Chagas. Dosis administrada: 25 mg/kg; en la leyenda se indica el valor de la reducción del número de tripomastigotes/mL en relación con el control (animales sin tratar) para cada uno de los compuestos testados.
FIG. 7 - Porcentaje de reactivación de la parasitemia tras la administración de un ciclo de tratamiento inmunosupresor tanto para el grupo de ratones control (animales sin tratar) como el de tratados. FIG. 8.- Niveles totales de Ig-G anti-7. cruzi expresados en unidades de absorbancia (DO, densidad óptica) para los grupos de ratones control (animales sin tratar) y tratados a diferentes días posinfección (p.i.). Para el día 120 p.i. los grupos fueron divididos en dos subgrupos: inmunosuprimidos (IS) y no inmunosuprimidos. FIG. 9.- Resultado de la amplificación de PCR para los órganos de ratón post mortem (día 120 p.i.), mediante el uso de unos primers específicos para el gen de la superóxido dismutasa del parásito (sod-b). Calles: (M) Marcador de pares de bases, (1) Control positivo de PCR, (2) Control negativo de PCR, (3) Corazón del grupo control de la infección, (4) Corazón del grupo infectado y tratado con el compuesto 4, (5) Corazón del grupo infectado y tratado con el compuesto 3, (6) Corazón del grupo control de la infección inmunosuprimido, (7) Corazón del grupo infectado, tratado con el compuesto 4 e inmunosuprimido, (8) Corazón del grupo infectado, tratado con el compuesto 3 e inmunosuprimido. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos estudios realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la invención
Ejemplo 1 Preparación de los compuestos de fórmula general (I) y (II)
Los compuestos de fórmula general (I) se prepararon por esterificación del ácido Λ - pirazol-3,5-dicarboxílico con el alcohol correspondiente y los compuestos de fórmula general (II) se prepararon por tratamiento de los esteres (I) con hidróxido sódico.
Procedimiento general de síntesis de compuestos de fórmula (I):
cuando y R2 son iguales y se representan como R y R3 es H
Figure imgf000013_0001
(I)
Metodología: A una solución de ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico monohidrato (5,00 g; 28,7 mmol) en 100 mL del alcohol adecuado (ROH) se hizo pasar una corriente de cloruro de hidrógeno gaseoso hasta saturación, manteniendo la agitación durante 24 h. Transcurrido ese tiempo, se eliminó el disolvente a sequedad y se añadió una solución acuosa al 10% de NaC03H hasta alcanzar un pH básico. La mezcla de reacción se extrajo con cloroformo y se secó la fase orgánica con MgS04. La eliminación del disolvente conduce al producto deseado en forma de aceite cromatográficamente puro que solidifica al poco tiempo.
1H-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo (1)
Figure imgf000013_0002
O)
Reactivos: ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico monohidrato, metanol. Rendimiento: 4,86 g (92%) (lit. 86%; Schenck, T.G. et al., Inorg. Chem. 1985, 24, 2334-2337). P. f. 154- 155 °C. Análisis elemental (C7H8N204): Teórico %C 45,66, %H 4,38, %N 15,21 ; Hallado %C 45,77, %H 4,30, %N 15,07. vmáx (KBr)/cm"1 3369 (NH), 1729, 1709 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-cfe) δ: 14,71 (1 H, s), 7,21 (1 H, s), 3,84 (3H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 160,7, 143,3, 135,9, 1 11 ,3, 52,5. EM-FAB (m/z): 185 (MH+).
1 -pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo (3)
Figure imgf000014_0001
(3)
Reactivos: ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico monohidrato, etanol. Rendimiento: 5,48 g (90%). P. f. 54-55 °C (hexano) (lit., p.f. 53-54 °C; Iturrino, L. et al., Eur. J. Med. Chem. 1987, 22, 445-451). Análisis elemental (C9H12N204): Teórico %C 50,94, %H 5,70, %N 13,20; Hallado %C 50,80, %H 5,51 , %N 13,34. vmáx (KBr)/cm"1 3260 (NH), 1730 (CO). 1 H RMN (300 MHz; DMSO-cfe) δ: 14,62 (1 H, s), 7, 18 (1 H, s), 4,31 (4H, c), 1 ,31 (6H, t). 13C RMN (75 MHz; DMSO-cfe) δ: 160,9, 159,0, 143,6, 134,7, 1 10,8, 60,9, 14, 1. EM-FAB (m/z): 213 (MH+). 1 H -pirazol-3, 5-dicarboxilato de dipropilo (5)
Figure imgf000014_0002
(5)
Reactivos: ácido 1 /-/-pirazol-3, 5-dicarboxílico monohidrato, propanol. Rendimiento: 6,35 g (92%). P. f. 53-55 °C. Análisis elemental (Cn H16N204): Teórico %C 54,99, %H 6,71 , %N 1 1 ,66; Hallado %C 54,91 , %H 6,65, %N 11 ,71. vmáx (KBr)/cm"1 3443 (NH), 1732 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-cfe) δ: 14,64 (1 H, s), 7, 17 (1 H, s), 4, 19 (4H, t), 1 ,67 (4H, m), 0,92 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 161 ,2, 158,6, 143,8, 134,7, 1 10,8, 66,3, 21 ,54, 10,2. EM-FAB (m/z): 241 (MH+).
1H-pirazol-3, 5- (7)
Figure imgf000014_0003
Reactivos: ácido 1 /-/-pirazol-3, 5-dicarboxílico monohidrato, isopropanol. Rendimiento: 6,21 g (90%). P. f. 50-52 °C. Análisis elemental (Cn H16N204): Teórico %C 54,99, %H 6,71 , %N 1 1 ,66; Hallado %C 55,07, %H 7,08, %N 11 ,62. vmáx (KBr)/cm"1 3432 (NH), 1724 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-cfe) δ: 14,58 (1 H, s), 7,1 1 (1 H, s), 5,09 (4H, m), 1 ,28 (6H, s), 1 ,26 (6H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 161 ,0, 158,5, 144,4, 135,4, 1 11 ,1 , 69,0, 22,0. EM-FAB (m/z): 241 (MH+).
1 -pirazol-3,5-dicarboxilato de di butilo (8)
Figure imgf000015_0001
(8)
Reactivos: ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico monohidrato, butanol. Rendimiento: 6,78 g (88%). P. f. 46-47 °C. Análisis elemental (C13H20N2O4): Teórico %C 58,19, %H 7,51 , %N 10,44; Hallado %C 58, 17, %H 7,42, %N 10,40. vmáx (KBr)/cm"1 3437 (NH), 1727 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-cfe) δ: 14,66 (1 H, s), 7, 16 (1 H, s), 4,25 (4H, t), 1 ,65 (4H, m), 1 ,37 (4H, m), 0,89 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 160,3, 143,8, 135,4, 1 11 ,2, 64,9, 30,6, 19, 1 , 14,0. EM-ES+ (m/z): 269 (MH+).
Procedimiento general de síntesis de sales sódicas de fórmula (II):
cuando y R2 son iguales y se representan como R
Figure imgf000015_0002
(I) (II)
Metodología: A una solución del éster del ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico (1 ,00 g) en 30 ml_ del alcohol correspondiente (ROH), se añadió lentamente una cantidad equimolecular de hidróxido sódico disuelto en 10 mL del mismo alcohol. La mezcla de reacción se mantuvo con agitación y a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado en cada caso, se concentró el disolvente y se filtró el sólido obtenido.
3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sódico (2)
O O
MeO' "OMe
N-N
Na+
(2)
Reactivos: éster metílico del ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico, metanol. Condiciones de reacción: agitación a temperatura ambiente 48 h. Rendimiento: 1 ,06 g (95%). P. f.: >215 °C (descomp.). Análisis elemental (C7H7N204Na): %C 40,79, %H 3,42, %N 13,59; Hallado %C 40,52, %H 3,55, %N 13,42. vmáx (KBr)/cm"1 1704 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-de) δ: 6,97 (1 H, s), 3,68 (6H, s). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 163,3, 142,5, 1 11 ,0, 50,3. EM-FAB (m/z): 207 (MH+).
3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sódico (4)
Figure imgf000016_0001
Na+
W
Reactivos: éster etílico del ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico, etanol. Condiciones de reacción: agitación a temperatura ambiente 1 h. Rendimiento: 1 ,07 g (97%). P. f.: 213- 214 °C (lit.3, p.f. 212-214 °C) (Reviriego, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16458- 16459. Análisis elemental (CgHu ISbC^Na): %C 46, 15, %H 4,70, %N 1 1 ,96; Hallado %C 46,03, %H 4,68, %N 12, 10. vmáx (KBr)/cm"1 1670 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-cfe) δ: 6,69 (1 H, s), 4, 16 (4H, c), 1 ,25 (6H, t). 13C RMN (125 MHz; DMSO-cfe) δ: 163,6, 142,4, 1 11 , 1 , 58,5, 14,4. EM-FAB (m/z): 235 (MH+).
3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sódico (6)
Figure imgf000016_0002
Na+
(6)
Reactivos: éster propílico del ácido 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxílico, propanol. Condiciones de reacción: agitación a temperatura ambiente 48 h. Rendimiento: 1 ,06 g (97%). P. f.:
>300 °C. Análisis elemental (Cii H15N204Na): %C 50,38, %H 5,77, %N 10,68; Hallado
%C 50,72, %H 5,70, %N 10,43. vmáx (KBr)/cm"1 1724, 1696 (CO). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-de) δ: 6,93 (1 H, s), 4,05 (4H, t), 1 ,64 (4H, m), 0,92 (6H, t). 13C RMN (125 MHz;
DMSO-de) δ: 163,9, 142,5, 1 10,9, 63,9, 21 ,7, 10,3. EM-FAB (m/z): 263 (MH+).
Ensayos de actividad in vitro frente a T. cruzi y Leishmania spp.
Tal y como se demuestra en los Ejemplos 2 (Tabla 1) y 3 (Tablas 2 y 3), los compuestos que comparten la formula general (I) (compuestos 1 , 3, 5, 7 y 8) y la formula general (II) (compuestos 2, 4, y 6) son eficaces in vitro en el tratamiento de enfermedades causadas por los parásitos T. cruzi y Leishmania spp., a la vez que mantienen un nivel de toxicidad bajo (sustancialmente menor que los compuestos de referencia). En general, todos ellos inhiben selectivamente la FeSOD de los parásitos T. cruzi y Leishmania spp. en relación a la CuZnSOD.
Ejemplo 2
Procedimiento de evaluación de la actividad in vitro y toxicidad de los compuestos 1 -8 frente a formas epimastigote (extracelulares) y amastigote (intracelulares) de T. cruzi, toxicidad frente a células Vero e índices de selectividad (IS)
Metodología: Para estos estudios se utilizó T. cruzi tipo I (cepa SN3, aislada en Guajira al norte de Colombia en humanos, 2006) [Téllez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34]. El cultivo de las formas epimastigote de T. cruzi se realizó in vitro en esterilidad en medio de cultivo monofásico MTL (Médium Trypanosomes Liquid) enriquecido con el 10% (v/v) de suero bovino fetal (SBF-I) inactivado a 56 °C durante 30 minutos. El inoculo de parásitos para iniciar el cultivo fue de 5 x 104 células/mL en 5 mL de medio en frascos de plástico Falcon® de 25 cm2 y se mantuvieron en una estufa a 28 °C. Los cultivos se realizaron de manera rutinaria consiguiendo el crecimiento exponencial de los flagelados hasta conseguir la masa celular necesaria para los posteriores estudios. Para la realización de los ensayos se usaron tanto formas epimastigote como tripomastigote y amastigote.
Las formas epimastigote de T. cruzi cultivadas de la forma anteriormente descrita fueron recolectadas en su fase exponencial de crecimiento mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. El número de parásitos fue contado en una cámara hemocitométrica de Neubauer y sembrado en una placa de 24 pocilios a una concentración de 5 x104 parásitos/pocilio.
Los compuestos a ensayar se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO), disolvente que a una concentración final en el medio de ensayo de 0,01 % (v/v) no muestra toxicidad ni tiene ningún efecto sobre el crecimiento de los parásitos. Los compuestos fueron añadidos al medio de cultivo a concentraciones finales de 100, 50, 25, 10 y 1 μΜ. El efecto de cada compuesto sobre el crecimiento de las formas epimastigote, a las diferentes concentraciones ensayadas, se evaluó a las 72 h, usando una cámara hemocitométrica de Neubauer y el efecto tripanocida se expresó como la IC50 (concentración requerida para producir una inhibición del 50%, calculado por el análisis de la regresión lineal de la Kc a las concentraciones ensayadas) [Sánchez- Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011 , 54, 970-979].
Para el estudio del efecto in vitro sobre formas intracelulares de T. cruzi se usó el modelo experimental diseñados por los autores de la presente invención [Ramírez- Macías, I. et al., Parásito!. Int. 2012, 61, 405-413]. Las células Vero se despegaron del frasco de cultivo donde se encontraban adheridas mediante tripsinización. Para ello, se eliminó el medio de cultivo, seguidamente se cubrió la superficie celular con EDTA- tripsina y se incubó en frío durante 5 minutos. Tras ello, se pasó la mezcla a un frasco de fondo cónico de 25 ml_ de capacidad (esterilín), se centrifugó a 800 rpm durante 5 minutos, se retiró el sobrenadante y las células se contaron en cámara de Neubauer. Las células Vero se resuspendieron a una concentración de 1 x 104 células/pocilio en medio de cultivo RPMI, cultivándose en placas de 24 pocilios, en cada uno de los cuales se había introducido previamente un cristal cubreobjetos redondo de 12 mm. Para su adherencia, las células se dejaron 24 h a 37 °C en 5% C02.
Una vez adheridas las células, se infectaron in vitro con 1 x 105 células/pocilio de formas tripomastigote de T. cruzi [Ramírez-Macías, I. et al., Parásito!. Int. 2012, 61, 405-413]. La infección se mantuvo durante 24 horas para que el parásito entrase en la célula. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones necesarias para obtener la IC50 (100 a 1 μΜ). A las 72 horas de la incubación, se procedió a la retirada de los cristales. Una vez sacados los cristales se colocaron en un portaobjetos. Se fijaron con metanol y se dejaron secar. Una vez fijados y secos, se les añadió DPX (Panreac®), medio de montaje para microscopía y se tiñeron con Giemsa; para ello, inmediatamente antes de su empleo y en tubo de ensayo, se diluyó solución Azur-Eosina-Azul de Metileno según Giemsa DC (Código 251338) con tampón Sórensen (dilución 1 :10), se mezcló bien y se cubrió la preparación dejando colorear durante 20 minutos. Se lavó con agua destilada. Se dejó escurrir y secar en posición vertical. Por último se examinó con el objetivo de inmersión y se contó el número de formas amastigote intracelulares en un total de 200 células. Para el estudio de la toxicidad inespecífica frente a células Vero se usó el modelo experimental diseñados por los autores de la presente invención [Marín, C. et al., J. Nat. Prod. 2011 , 74, 744-750]. Las células Vero fueron establecidas a partir del riñon de un mono verde africano adulto, manteniendo los cultivos a una densidad 1 x 104 células/mL a 37 °C y 5% de C02. Las células, se depositaron en un esterilín y se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en medio RPMI. Se depositaron 1 x 104 células/pocilio en placas de titulación de 24 pocilios, se incubaron durante 24 h a 37 °C en atmósfera húmeda enriquecida con 5% C02. Esto se realizó para que se fijasen las células. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo se retiró y se adicionó medio fresco con los productos a ensayar, a las concentraciones de 100, 50, 25, 10 y 1 μΜ. A las 72 horas de la incubación, se procedió a la preparación de las muestras para su lectura en el citómetro de flujo siguiendo un procedimiento descrito previamente. Se partió de las células y el medio presente en los pocilios, a los cuales se adicionó 100 μΙ de solución de ioduro de propidio (Pl, 100 μg/mL) (Sigma Chemical Co), incubándose a 28 °C en oscuridad unos 10 minutos; posteriormente, se añadió 100 de diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma Chemical Co) en solución (100 ng/mL) volviéndose a incubar a 28 °C en oscuridad unos 10 minutos, y previa centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos, se procedió a lavar el precipitado con PBS. Finalmente, se analizaron los resultados teniendo en cuenta que las células con la membrana plasmática intacta tienen una fluorescencia color verde, mientras que las células dañadas o muertas presentan una fluorescencia roja. Se calculó el porcentaje de viabilidad. El número de células muertas se determinó por comparación con los cultivos control.
Tabla 1.- Actividad, toxicidad e índices de selectividad encontrados para los compuestos 1-8 frente a formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentración necesaria para obtener el 50% de inhibición, calculada por análisis de regresión linear del valor Kc a las concentraciones empleadas (1 , 10, 25, 50 y 100 μΜ). "Concentración necesaria para obtener el 50% de inhibición frente a células Vero después de 72 h de cultivo. cíndice de Selectividad = IC50 de las células Vero/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi. Entre paréntesis: número de veces que el IS de los compuestos es superior al IS del fármaco de referencia. IC50 μΜ3 Toxicidad ISC
Formas IC50 Formas
Compuestos Formas Formas
amastigote cel. Vero amastigote epimastigote epimastigote
intracelulares ( b intracelulares
Benznidazol 15,8±1 , 1 23,3±4,6 13,6±0,9 0,9 0,6
1 40,5±6,3 16,9±2,8 186,5±9,3 4,6 (5) 1 1 ,0 (18)
2 27,5±3,2 27, 1 ±1 , 1 139, 1 ±9,3 5,0 (6) 5,1 (9)
3 17,2±2,4 10,8±0,7 385,4±1 1 ,5 22,4 (25) 35,7 (59)
4 16,5±1 ,6 9,3±5,8 404, 1 ±13,3 24,5 (27) 43,4 (72)
5 38,7±7,7 23,6±1 ,4 154,5±12,5 4,0 (4) 6,5 (11)
6 34,5±2,2 34,5±1 ,7 170,2±13,8 4,9 (6) 4,9 (8)
7 31 ,2±3,8 30,9±4,7 179,4±13,1 5,7 (6) 5,8 (10)
8 35,8±4, 1 23,7±3,3 242, 1 ±10,6 6,8 (7) 10,2 (17)
Los compuestos particularmente preferidos de la presente invención para su uso como antiparasitarios frente a T. cruzi son los compuestos de fórmula 3 y 4, los cuales presentan un nivel de toxicidad inespecífica frente a células Vero mucho menor que la del benznidazol (Bzn) e incluso menor que el resto de los ésteres y pirazolatos estudiados en la presente invención.
Ejemplo 3
Procedimiento de evaluación de la actividad in vitro de los compuestos 1 -8 frente a formas promastigote (extracelulares) y amastigote (intracelulares) de L. infantum y L. braziliensis, toxicidad frente a macrófagos e índices de selectividad
Metodología: Para este estudio, se emplearon formas promastigote y amastigote de dos especies del género Leishmania:
- L braziliensis (MHOM/BR/1975/M2904).
- L infantum (MCAN/ES/2001/UCM-10).
Las especies de Leishmania se mantienen en nuestro laboratorio desde hace varios años mediante cultivos a 28 °C en medio MTL enriquecido con un 10% de suero bovino fetal inactivo (FCSI) y para que no pierda su virulencia se realizan pases periódicos in vivo en ratones cepa Balb/c [Téllez-Meneses, J. et al., Acta Trop. 2008, 108, 26-34].
Alcanzada la fase exponencial de desarrollo (106 promastigotes/mL), el cultivo fue centrifugado a 1000 g durante 10 minutos a fin de concentrar en un botón las formas flageladas. Las formas amastigote se obtuvieron in vitro previa infestación de macrófagos de la línea J774.2 (ECACC 85011428) de acuerdo con el método desarrollado por los autores de la presente invención [González, P. et al., J. Antimicrob. Agents 2005, 25, 136-141].
Para los ensayos in vitro de las formas promastigote, se partió de formas promastigote en fase exponencial de crecimiento, cultivadas a 28 °C en medio MTL suplementado con un 10% FCSI de las dos cepas de Leishmania. El ensayo sobre formas promastigote se realiza de forma similar al descrito para el caso de formas epimastigote de T. cruzi.
Para los estudios sobre formas amastigote se procede de forma similar a la descrita para T. cruzi, sólo que en este caso se utilizan macrófagos J774.2 con formas promastigote en fase estacionaria de crecimiento de las dos cepas de Leishmania, según la metodología descrita anteriormente.
A lo largo de todos los experimentos se realizaron estudios encaminados a conocer las diferencias en la sensibilidad de los parásitos frente a fármacos de actividad conocida como el benznidazol en el caso de T. cruzi y Glucantime para las dos cepas de Leishmania, lo que nos permitió comparar su comportamiento con los resultados obtenidos con nuestros productos.
Tabla 2.- Actividad, toxicidad e índices de selectividad encontrados para los compuestos 1-8 frente a formas extracelulares e intracelulares de Leishmania infantum. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentración necesaria para obtener el 50% de inhibición, calculada por análisis de regresión linear del valor Kc a las concentraciones empleadas (1 , 10, 25, 50 y 100 μΜ). "Concentración necesaria para obtener el 50% de inhibición frente a macrófagos J 774.2 después de 72 h de cultivo. cíndice de Selectividad = IC50 de los macrófagos/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de L. infantum. Entre paréntesis: número de veces que el IS de los compuestos es superior al IS del fármaco de referencia
Figure imgf000022_0001
Tabla 3.- Actividad, toxicidad e índices de selectividad encontrados para los compuestos 1 -8 frente a formas extracelulares e intracelulares de Leishmania braziliensis. Resultados de cuatro experimentos independientes. aIC50 = concentración necesaria para obtener el 50% de inhibición, calculada por análisis de regresión linear del valor Kc a las concentraciones empleadas (1 , 10, 25, 50 y 100 μΜ). "Concentración necesaria para obtener el 50 % de inhibición frente a macrófagos J 774.2 después de 72 h de cultivo. cíndice de Selectividad = IC50 de los macrófagos/IC50 de las formas extracelulares e intracelulares de L. braziliensis. Entre paréntesis: número de veces que el IS de los compuestos es superior al IS del fármaco de referencia.
Figure imgf000022_0002
Los compuestos particularmente preferidos para su uso como antiparasitarios frente a Leishmania spp. son los de fórmula 3, 4 y 7. Concretamente, los compuestos 3 y 4 son mucho más activos frente a formas extracelulares (promastigotes) e intracelulares (amastigotes) de L. infantum y L braziliensis que el medicamento de referencia, el Glucantime, y mucho menos tóxicos sobre macrófagos. Ejemplo 4
Procedimiento de evaluación de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infección y el crecimiento de parásitos en medios de cultivo de células Vero infectadas con T. cruzi
Metodología: Las células Vero se cultivaron en las mismas condiciones reseñadas anteriormente durante 2 días. Después las células fueron infectadas in vitro con formas metacíclicas de T. cruzi, en proporción 10: 1. Los compuestos 3 y 4 (a la concentración IC2s) fueron adicionados inmediatamente después de la infestación e incubados por 12 h a 37 °C en 5% C02. Los parásitos no fagocitados y los productos fueron eliminados mediante lavado y los cultivos infectados fueron cultivados durante 10 días en medio fresco, adicionando medio fresco cada 48 horas. La actividad de los compuestos fue determinada por el % de células infectadas, número de amastigotes por célula infectada y número de tripomastigotes en el medio. Cultivos tratados y sin tratar fueron fijados y teñidos con metanol y Giemsa. El % de células infectadas y la media del número de amastigotes por célula infectada se determinó por análisis de 200 células Vero en un microscopio cada 48 horas. El número de tripomastigotes en el medio fue determinado usando una cámara de Neubauer.
En ensayos de crecimiento de parásitos en medios de cultivo de células Vero infectadas con T. cruzi, los compuestos 3 y 4 reducen eficazmente la velocidad de infección, el número de amastigotes por célula infectada, y el número de tripomastigotes en el medio de cultivo en relación al control (ver FIG. 1). Los valores típicos del benznidazol en estos ensayos fueron 23% (FIG. 1A), 13% (FIG. 1 B) y 46% (FIG. 1 C) [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 4231-4243]. Ejemplo 5
Procedimiento de evaluación de la capacidad de los compuestos 3 y 4 para inhibir la FeSOD de epimastigotes de T. cruzi en relación a la CuZnSOD de eritrocitos humanos
Metodología: Los compuestos seleccionados previamente fueron evaluados como inhibidores de la enzima FeSOD exclusiva de protozoos parásitos de la clase Kinetoplastea, y por lo tanto ausente en el hospedador mamífero, a fin de validar esta nueva y atractiva diana para el diseño de nuevos fármacos con actividad antiparasitaria debido a su capacidad para inactivar la acción de la FeSOD del parásito capturando su ión metálico mediante mecanismos competitivos de complejación. Paralelamente se realizaron ensayos de selectividad FeSOD (parásito)/CuZnSOD (humana). La inhibición de los nuevos compuestos sobre la actividad FeSOD/CuZnSOD se cuantificó en un espectrofotómetro a 560 nm según una técnica descrita anteriormente [Beyer, W.F. & Fridovich, I., Anal Biochem. 1987, 161, 559-66], basada en la reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT) por los iones superóxido y que los autores de la presente invención han puesto a punto para el ensayo en tripanosomátidos de modo rutinario [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011 , 54, 970-979; Ramírez-Macías, I. et al., J. Antimicrob. Chemother. 2011 , 66, 913-919].
En estos ensayos se ha demostrado como inhiben eficaz y selectivamente la FeSOD de formas epimastigote de T. cruzi en relación a la CuZnSOD de eritrocitos humanos (ver FIG. 2).
Ejemplo 6
Procedimiento de evaluación del efecto de los compuestos 3 y 4 sobre la velocidad de infección y el crecimiento de parásitos en medios de cultivo de macrófagos infectados con L. infantum y L. braziliensis
Metodología: Macrófagos de la línea J774.2, conservados en laboratorio por criopreservación en nitrógeno líquido y sucesivos pases en cultivo con medio esencial mínimo (MEM) + glutamina + 20% FCSI, fueron depositados en un esterilín y centrifugados a 100 g durante 5 min, el sobrenadante fue descartado y las células resuspendidas en el mismo medio a una concentración final de 1 x 106 células/mL.
Luego, 10 μΙ de la suspensión celular se depositó en cada pocilio de una placa de cultivo de 24 pocilios (cada uno con un cristal cubreobjetos redondo de 10 mm de diámetro) en un volumen total de 500 μΙ, e incubadas por 24 h a 37 °C en atmósfera húmeda enriquecida con 5% C02.
Las células fueron infectadas in vitro con formas promastigote de las dos especies de Leishmania, en proporción 10: 1. Los compuestos 3 y 4 (a una concentración IC2s) fueron adicionados inmediatamente después de la infestación e incubados por 12 h a 37 °C en 5% C02. Los parásitos no fagocitados y los productos fueron eliminados mediante lavado y las células infectadas fueron cultivadas durante 10 días en medio fresco, que se fue adicionando cada 48 horas. La actividad de los compuestos fue determinada por el % de células infectadas y el número de amastigotes por célula infectada [Sánchez-Moreno, M. et al., J. Med. Chem. 2011 , 54, 970-979]. Cultivos tratados y sin tratar fueron fijados y teñido con metanol y Giemsa. El % de células infectadas y la media del número de amastigotes por célula infectada se determinó por el análisis de 200 células en un microscopio cada 48 horas. En ensayos de crecimiento de parásitos en medios de cultivo de macrófagos J774.2 infectados con L infantum y L braziliensis, los compuestos 3 y 4 también reducen eficazmente la velocidad de infección y división de las formas intracelulares en relación al control (ver FIG. 3 y 4). Los valores de estos ensayos son resultados de cuatro experimentos independientes. Los valores típicos del glucantime en estos ensayos fueron 24% (FIG. 3A), 30% (FIG. 3B), 22% (FIG. 4A) y 37% (FIG. 4B) [Marín, C. et al., Eur. J. Med. Chem. 2013, 62, 466-477].
Ejemplo 7
Procedimiento de evaluación de la capacidad de los compuestos 3 y 4 para inhibir la FeSOD de promastigotes de L. infantum y L. braziliensis en relación a la CuZnSOD de eritrocitos humanos.
Metodología: El procedimiento utilizado para evaluar la capacidad de inhibición de la enzima FeSOD de las formas promastigote de L. infantum y L. braziliensis en relación a la CuZnSOD de eritrocitos humanos fue el mismo descrito anteriormente en el caso de 7. cruz i.
Paralelamente a como ocurre en los ensayos de T. cruzi, los dos compuestos seleccionados (3 y 4) inhiben eficaz y selectivamente la FeSOD de promastigotes de L. infantum y L. braziliensis en relación a la CuZnSOD de eritrocitos humanos (ver FIG. 5).
Ejemplo 8
Procedimiento de evaluación de la toxicidad de los compuestos 3 y 4 in vivo
Metodología y resultados: Como modelo se utilizaron ratones albinos de la cepa Balb/c, lote de 5 animales de la misma edad (6-8 semanas) y peso (25-30 g) y de sexo femenino, a los cuales se les administró una dosis inicial de 100 mg/kg de cada compuesto en días alternativos con el objeto de averiguar la dosis letal 50 (DL50). En vista de que tras administrar 500 mg/kg peso no se alcanzaba ningún efecto tóxico aparente ni la muerte de ningún ejemplar, se procedió a administrar dosis de 500 mg/kg de cada compuesto en días alternativos hasta alcanzar los 6 g/kg, donde se decidió cesar el experimento por considerar que estos niveles de administración del compuesto dejaban patente la "no toxicidad" de los mismos. A la semana del cese del tratamiento se realizó un análisis de parámetros bioquímicos de rutina y no se observó ninguna alteración significativa. La única apreciación fuera de la norma era que en los 15-20 minutos inmediatos tras la administración de los compuestos los ratones mostraban cierta hiperactividad tras su traslado a la jaula, que cesaba tras este periodo y no dejaba ninguna secuela o cambio de comportamiento apreciable.
Los ensayos de toxicidad in vivo en modelo murino (ratones albinos de la cepa Balb/c) han dejado patente que a dosis comprendidas entre 500 mg/kg y 6 g/kg, los dos compuestos seleccionados (3 y 4) no producen efectos tóxicos aparentes ni se produce la muerte de ningún animal.
Ejemplo 9
Procedimiento de evaluación in vivo de la actividad de los compuestos 3 y 4 en la fase aguda de la enfermedad de Chagas
Metodología: Como modelo se utilizaron ratones albinos de la cepa Balb/c, lote de 6 animales de la misma edad (6-8 semanas) y peso (25-30 g), y de sexo femenino. Inicialmente se buscó la dosis letal (DL50) de los compuestos seleccionados (como se ha visto en un ejemplo anterior), así como su permanencia y estabilidad en suero. Como inoculo se utilizaron tripomastigotes metacíclicos. A cada animal se le inoculó 5 x 105 tripomastigotes metacíclicos, vía intraperitoneal. Los animales de experimentación fueron tratados bajo las normas y principios de la guía internacional para la investigación biomédica con animales de experimentación y con la autorización del Comité de Bioética de la Universidad de Granada. Los lotes quedaron distribuidos de la siguiente manera: a) un lote para el estudio del desarrollo de la enfermedad [fase aguda y fase crónica (Ejemplo 10)], grupo control positivo compuesto por animales infectados y sin ningún tratamiento, y b) un segundo grupo de lotes: animales infectados y tratados con diferentes concentraciones de los compuestos objeto del estudio (un subióte por producto y concentración a ensayar). La parasitemia, número de parásitos circulantes, se cuantificó a través de la cámara de conteo de células hemáticas. Se utilizó sangre periférica, obtenida por punción de la vena maxilar, en tampón fosfato (PBS). Este conteo se realizó cada 3 días, durante 30 días (fin de la fase aguda). La administración de los productos se realizó al quinto día de la infección y, una vez confirmada la parasitación, se ensayaron diferentes concentraciones de los productos, de acuerdo con los datos de la DL50 y la posología a la dosis establecida para cada producto y durante 5 días. Grupos similares de ratones fueron tratados con benznidazol (5 mg/Kg de peso/día durante 5 días), en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente.
Los dos compuestos 3 y 4 mostraron una gran eficacia de inhibición de la parasitemia en la fase aguda (ver FIG. 6).
Ejemplo 10
Procedimiento de evaluación in vivo de los compuestos 3 y 4 sobre los porcentajes de reactivación de la parasitemia después de inmunosupresión en la fase crónica de la enfermedad de Chagas
Metodología: Tras el día 60, los animales entran en fase crónica; al día 120 del experimento se induce una situación de inmunosupresión con monohidrato de ciclofosfamida según lo descrito [Cencig, S. et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 2011 , 5, e1216]; finalmente tiene lugar el sacrificio de los animales para la extracción de tejidos y órganos que serán sometidos a valoración del efecto de los compuestos a nivel de la parasitemia tras el tratamiento, mediante conteo (fase aguda y crónica), ELISA (comparación fase aguda y crónica) y PCR de tejidos (fase crónica).
Una vez alcanzado el día 120 (fase crónica avanzada) los ratones fueron divididos en dos subgrupos, uno que se mantuvo bajo las mismas condiciones y otro que fue sometido a un tratamiento de inmunosupresión (inducida por monohidrato de ciclofosfamida). Esta variable añadida permitió determinar el grado de reactivación de la parasitemia y por tanto la curación parasitológica o no de los ejemplares (ver FIG. 7, 8 y 9). En la FIG. 7, concretamente, se muestra el porcentaje de reactivación de la parasitemia, por conteo en fresco de los ejemplares que fueron inmunosuprimidos (tanto tratados como controles); el porcentaje de reactivación de la parasitemia, que en el control es del 60%, baja al 5% en presencia del compuesto 4, y al 24% en presencia del compuesto 3. En la FIG. 8 se observan las variaciones en las concentraciones de anticuerpos frente a T. cruzi, señal del estado inmunológico del ratón; en ella se observa como alcanzada la fase crónica en situación normal, tratados o no, se alcanza un equilibrio inmunológico (señal de cronificación de la enfermedad); este estado de equilibrio es roto de modo artificial con la inmunosupresión, de modo que en la situación control se produce un aumento considerable en los niveles de inmunoglobulinas como consecuencia de la presencia del parásito en sangre, mientras que en los tratados con los compuestos 3 y 4 los niveles se mantienen prácticamente constantes, indicadores de una menor parasitemia. Son también especialmente notables los resultados del análisis post mortem que se muestran en la FIG. 9, en la que se comparan resultados de eliminación de la parasitemia en tejidos del corazón de animales no inmunodeprimidos e inmunodeprimidos analizados mediante la técnica PCR. En ausencia de inmunosupresión, tanto por tratamiento con el compuesto 3 como con el 4, no se detecta ninguna banda (señal de la disminución de la parasitemia). Pero en tejidos del corazón procedentes de animales previamente inmunodeprimidos, en el caso de tratamiento con el compuesto 4 no se observa ninguna banda, mientras que en el caso de tratamiento con el compuesto 3 se observa una banda más tenue, señal de una menor parasitemia con respecto al control.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II)
Figure imgf000029_0001
donde:
y R2, pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo alquilo (C Ci0); R3 se selecciona de entre hidrógeno o un grupo alquilo (C Ci0); y
X+ es un catión monovalente farmacéuticamente aceptable;
para la elaboración de un medicamento.
2. Uso según la reivindicación 1 , donde R3 es hidrógeno.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R^ y/o R2 es un grupo alquilo (C C4).
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R^ y R2 son iguales.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde X+ es un catión alcalino.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde X+ se selecciona de entre Li+, Na+ o K+, preferiblemente Na+.
7. Uso según la reivindicación 1 , donde el compuesto se selecciona de entre:
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dimetilo;
3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sódico;
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dietilo;
3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sódico;
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo;
3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sódico; 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de diisopropilo; y
1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.
8. Uso según las reivindicación anterior, donde el compuesto es 1 /-/-pirazol-3,5- dicarboxilato de dietilo o 3,5-bis(etoxicarbonil)pirazolato sódico.
9. Uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II) según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades parasitarias a través de la inhibición de la enzima FeSOD parasitaria.
10. Uso según la reivindicación anterior, donde las enfermedades son enfermedades causadas por un parásito de la clase Kinetoplastea.
1 1. Uso según la reivindicación 10, donde el parásito es de la familia Trypanosomatidae.
12. Uso según la reivindicación 11 , donde los parásitos son de los géneros Leishmania o Trypanosoma.
13. Uso según la reivindicación 12, donde los parásitos son de las especies Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania trópica o Leishmania chagasi.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la enfermedad es tripanosomiasis.
15. Uso según la reivindicación 14, donde la enfermedad es la enfermedad de Chagas.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la enfermedad es la leishmaniasis en humanos o animales.
17. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) o (II) según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica según reivindicación 17, que además comprende al menos otro principio activo antiparasitario.
19. Compuesto seleccionado de entre:
3,5-bis(metoxicarbonil)pirazolato sódico; 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dipropilo; 3,5-bis(propoxicarbonil)pirazolato sódico; y 1 /-/-pirazol-3,5-dicarboxilato de dibutilo.
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