ES2565216T3 - Métodos de generación de proteínas marcadas endógenamente - Google Patents

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Abstract

Un método de marcaje de al menos una proteína endógena, comprendiendo el método: a) introducir en una célula de mamífero (i) al menos una endonucleasa de dirección o ácido nucleico que codifique una endonucleasa de dirección, uniéndose la endonucleasa de dirección a un sitio diana y siendo capaz de escindir un sitio de escisión en una secuencia cromosómica que codifica la proteína endógena, y (ii) al menos un polinucleótido donante que comprende una secuencia de marcaje, la secuencia de marcaje estando flanqueada por una secuencia dirección cadena arriba y una secuencia dirección cadena abajo, la secuencia cadena arriba y la secuencia cadena abajo compartiendo una identidad de secuencia sustancial con cualquier lado del sitio de escisión de la secuencia cromosómica; y b) mantener la célula en condiciones que reparan la rotura de doble cadena introducida en el sitio de escisión por la endonucleasa de dirección mediante un proceso de homología dirigida, de modo que la secuencia de marcaje del polinucleótido donante se integra en fase en la secuencia cromosómica codificante de la proteína endógena de modo que se produce una proteína endógena marcada;~ en el que la proteína endógena se selecciona entre actina, tubulina, lamina, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y proteína del grupo de alta movilidad A (HMGA).

Description

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TUBA1A, TUBA1B, TUBA1C, TUBA3C, TUBA3D, TUBA3E, TUBA4A y TUBA8; una proteína β-tubulina codificada por los genes TUBB, TUBB1, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4, TUBB4Q y TUBB6; una proteína γtubulina codificada por los genes TUBG1, TUBG2, TUBGCP2, TUBGCP3, TUBGCP4, TUBGCP5 y TUBGCP6; una proteína δ-tubulina codificada por el gen TUBD1, o una proteína de ε-tubulina codificada por el gen TUBE1. En una
5 realización ilustrativa, la tubulina endógena puede ser la proteína de la isoforma de la α-tubulina 1B humana codificada por el gen TUBA1B en el cromosoma humano número 12 (número de acceso NM_006082).
[0061] En otra realización, la proteína endógena puede ser una proteína actina. En alguna realización, la proteína actina puede ser una proteína actina humana tal como α-actina codificada por el gen ACTA1, la proteína β-actina
10 codificada por el gen ACTB, o la proteína γ-actina codificada por el gen ACTG1. En una realización ilustrativa, la proteína endógena puede ser la proteína β-actina humana codificada por el gen ACTB en el cromosoma 7 humano (número de acceso NM_001101).
[0062] En otra realización más, la proteína endógena puede ser una proteína lamina. En ciertas realizaciones, la
15 proteína lamina puede ser una proteína lamina humana, tal como laminas B1 y B2, expresadas por los genes LMNB1 y LMNB2, o proteínas Lamina A y C, las variantes de corte y empalme del gen LMNA. En una realización ilustrativa, la proteína endógena puede ser la proteína Lamina B1 humana codificada por el gen LMNB1 en el cromosoma 5 humano (número de acceso NM_005573).
20 [0063] En otra realización más, la proteína endógena puede ser el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (proteína HER2) que está codificado por el gen ERBB2. HER2 es un receptor tirosina quinasa unido a la superficie de la membrana celular y participa en las vías de transducción de señales que conducen al crecimiento y a la diferenciación celular. La amplificación del gen ERBB2 o la sobreexpresión de su producto proteico se asocia con el cáncer de mama, el cáncer de ovario y el cáncer de estómago. La proteína HER2 endógena puede ser la
25 proteína HER2 humana (UniProtKB/Swiss-Prot, número de acceso: P04626).
[0064] En una realización alternativa, la proteína endógena puede ser HMGA. HMGA se refiere al grupo de alta movilidad de las proteínas cromosómicas que regulan la expresión génica mediante el cambio de la configuración del ADN a través de la unión a regiones ricas en AT. Se encuentran entre el grupo más grande y mejor caracterizado 30 de proteínas nucleares no histonas. El gen HMGA1 regula una gran variedad de procesos biológicos normales, incluyendo el crecimiento, la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. Para este gen, se han encontrado al menos siete variantes de transcripción que codifican dos isoformas diferentes. En algunas realizaciones, la proteína endógena puede ser una proteína HMGA humana. Los ejemplos no limitantes de proteínas HMGA humanas que se pueden usar en la invención incluyen la isoforma a y la isoforma b de HMGA, expresadas por el gen HMGA1
35 (número de acceso NM_145899).
[0065] En realizaciones adicionales, la proteína endógena puede ser una proteína que aparece en la TABLA A.
Tabla A: Otras proteínas marcadas endógenamente
Símbolo del gen
Nombre de la proteína Símbolo de la proteína N.º de acceso de la proteína
1
HiF1a factor inducible por la hipoxia-1 HIF1 Q16665
2
VEGF (A, B, C) factor de crecimiento endotelial vascular (A, B, C) VEGFA, VEFGB, VEGFC P15692, P49765, P49767
3
GLUT1 (SLC2A1) familia de vehículos de solutos 2 (transportador facilitado de la glucosa) GTR1 P11166
4
LDHA lactato deshidrogenasa A LDHA P00338
5
IL-1 (A, B) Interleucina 1 (alfa, beta) IL1A, IL1B P01538, P01584
6
IL-8 Interleucina 8 IL8 P10145
7
Cox-2 (PTGS2) prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 PTGS2 P35354
8
CCND1 Ciclina D1 CCND1 P24385
9
CDKN1B (p27) inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina 1B CDKN1B P46527
10
CREB1 proteína de unión al elemento sensible a cAMP 1 CREB1 P16220
11
Bcl2 CLL/linfoma 2 de linfocitos B BCL2 P10415
12
MDM2 proteína de unión a p53 MDM2 Q00987
Tabla A: Otras proteínas marcadas endógenamente
Símbolo del gen
Nombre de la proteína Símbolo de la proteína N.º de acceso de la proteína
13
p70S6K (RPS6KB1) proteína quinasa S6 ribosomal, 70 kDa, polipéptido 1 RPS6KB1 P23443
14
FKHR (FOXO1) Forkhead box O1 FOXO1 Q12778
15
β-catenina (Ctnnb1) catenina (proteína asociada a la cadherina), beta 1 CTNNB1 P35222
16
MMP7 metalopeptidasa de la matriz 7 (matrilisina, uterina) MMP7 P09237
17
Vim Vimentina VIM P08670
18
BIRC5 5 que contiene la repetición IAP de baculovirus (variante 3 alfa de la survivina) BIRC5 O15392
19
CCND2 Ciclina D2 CCND2 P30279
20
BCLXL (BCL2L1) BCL2 de tipo 1 BCL2L1 Q07817
21
p21 (CIP1,CDKN1A) inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina 1A (p21, Cip1) CDKN1A P38936
22
STAT1 transductor de señales y activador de la transcripción 1 STAT1 P42224
23
STAT2 transductor de señales y activador de la transcripción 2 STAT2 P52630
24
STAT3 transductor de señales y activador de la transcripción 3 STAT3 P40763
25
STAT4 (SLEB11) transductor de señales y activador de la transcripción 4 STAT4 Q14765
26
EGFR (ERBB1) receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR P00533
27
SOCS1 supresor de la señalización de las citocinas 1 SOCS1 O15524
28
SOCS2 supresor de la señalización de las citocinas 2 SOCS2 O14508
29
SOCS3 supresor de la señalización de las citocinas 3 SOCS3 O14543
30
Viperina (RSAD2, ciq5) 2 que contiene el dominio de la S-adenosil metionina radical (Viperina) RSAD2 Q8WXG1
31
GLUT4 (SLC2A4) familia de vehículos de solutos 2 (transportador facilitado de la glucosa), miembro 4 GTR4 P14672
32
COL1A1 colágeno, tipo I, alfa 1 COL1A1 P02452
33
PPARG receptor gamma activado por el factor proliferador de peroxisomas PPARG P37231
34
SMAD3 miembro 3 de la familia SMAD SMAD3 P84022
35
SMAD4 miembro 4 de la familia SMAD SMAD4 Q13485
36
JNK (MAPK8) proteína quinasa activada por mitógeno 8 MAPK8 P45983
37
TP53 proteína tumoral p53 TP53 P04637
38
NF-kB (NFKB1, p50) factor nuclear 1 potenciador de las cadenas ligeras kappa de los linfocitos B NFKB1 P19838
39
Notch1 Notch1 NOTC1 P46531
40
ATF-2 factor de transcripción activador 2 ATF2 P15336
41
c-JUN (Jun) proto-oncogén Jun JUN P05412
42
AKT1 homólogo del oncogén viral de timoma murino v-akt AKT1 P31749
43
p38α (MAPK14) proteína quinasa activada por mitógeno 14 MK14 Q16539
44
p38β (MAPK11) proteína quinasa activada por mitógeno 11 MK11 Q15759
45
p38γ (MAPK12) proteína quinasa activada por mitógeno 12 MK12 P53778
46
ERK (MAPK1) proteína quinasa activada por mitógeno 1 MK01 P28482
47
AhR receptor de hidrocarburo de arilo AHR P35869
48
PXR subfamilia de receptores nucleares 1, grupo I, miembro 2 NR1L2 O75469
49
CAR subfamilia de receptores nucleares 1, grupo I miembro 3 NR1L3 Q14994
Tabla A: Otras proteínas marcadas endógenamente
Símbolo del gen
Nombre de la proteína Símbolo de la proteína N.º de acceso de la proteína
50
CYP1A2 citocromo P450, familia 1, subfamilia A, polipéptido 2 CP1A2 P05177
51
CYP3A4 citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 4 CP3A4 P08684
52
CYP2B6 citocromo P450, familia 2, subfamilia B, polipéptido 6 CP2B6 P20813
53
Nrf2 factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2 NF2L2 Q16236
54
Hmox1 hemo oxigenasa (desciclado) 1 HMOX1 P09601
55
GSTA2 glutationa S-transferasa alfa 2 GSTA2 P09210
56
Prdx1 peroxiredoxina 1 PRDX1 Q06830
57
Keap1 proteína 1 asociada con ECH de tipo kelch KEAP1 Q14145
58
Grp78 receptor 78 acoplado a la proteína G GPR78 Q96P69
59
ATF4 factor de transcripción activador 4 (elemento potenciador sensible a tax B67) ATF4 P18848
60
ATF6 factor de transcripción activador 6 ATF6 P18850
61
XBP1 proteína 1 de unión a la caja X XBP1 P17861
62
Gadd45a detención del crecimiento e inducible de daño del ADN, alfa GADD45A P24522
63
p21 subunidad de 21 kDa de la ribonucleasa P/MRP RPP21 Q9H633
64
Bax proteína X asociada con BCL2 BAX Q07812
65
RAD51c homólogo 3 de la proteína RAD51 de reparación del ADN RA51C O43502
66
BTG2 miembro 2 de la familia de BTG BTG2 P78543
67
OATP1B1 familia de transportadores de aniones orgánicos en vehículos de solutos, miembro 1B1 OATP2 Q9Y6L6
68
OATP1B3 familia de transportadores de aniones orgánicos en vehículos de solutos, miembro 1B3 OATP8 Q9NPD5
69
OAT1 familia 22 de vehículos de solutos (transportador de aniones orgánicos), miembro 6 OAT1 Q4U2R8
70
OAT3 familia 22 de vehículos de solutos (transportador de aniones orgánicos), miembro 8 OAT3 Q8TCC7
71
OCT2 familia 22 de vehículos de solutos (transportador de cationes orgánicos), miembro 2 OCT2 O15244
72
BSEP casete de unión a ATP, subfamilia B (MDR/TAP), miembro 11 BSEP O95342
73
MATE1 familia 47 de vehículos de solutos, miembro 1 MATE1 Q96FL8
74
BCRP proteína de resistencia al cáncer de mama BCRP Q9UNQ0
75
ABCB1 proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos MDR1 P08183
76
ABCC2 miembro 2 de la subfamilia C de casetes de unión al ATP MRP2 Q92887
77
Pdk1 proteína quinasa 1 dependiente del fosfoinosítido 3 PDK1 O15530
78
HSF-1 proteína de factor de choque térmico 1 HSF1 Q00613
79
HSP90 (AA1, AB1) proteína de choque térmico HSP 90 (-alfa, -beta) HSP90 P07900 P08238
80
HSPA1A/1B proteína de choque térmico 1A/1B de 70 kDa HSP70 P08107
81
HSPB1 proteína de choque térmico beta-1 Hsp27 P04792
82
p65 Factor de transcripción p65 TP65 Q04206
83
IL2 Interleucina-2 IL-2 P60568
84
NOS2 Óxido nítrico sintasa, inducible iNOS P35228
Tabla A: Otras proteínas marcadas endógenamente
Símbolo del gen
Nombre de la proteína Símbolo de la proteína N.º de acceso de la proteína
85
iCAM (1,2,3,4,5) Molécula de adhesión intercelular (1,2,3,4,5) iCAM (1,2,3,4,5) P05362, P13598, P32942, Q14773, Q9UMF0
86
JUN Factor de transcripción AP-1 AP1 P05412
87
Fbx15 proteína 15 de caja F sola FBX15 Q8NCQ5
88
TUBB3 Cadena beta-3 de la tubulina TUBB3 Q13509
89
UCHL1 Isozima L1 de la hidrolasa carboxilo-terminal de ubiquitina UCHL1 P09936
90
SERPIN1
91
SV2A glicoproteína de vesícula sináptica 2A SV2A Q7L0J3
92
GRIA2 receptor de glutamato, ionotrópico, AMPA2 GRIA2 P42262
93
MAP2 proteína 2 asociada a los microtúbulos MAP2 P11137
94
GFAP proteína ácida fibrilar glial GFAP P14136
95
PEA15 fosfoproteína enriquecida en astrocitos 15 PEA15 Q15121
96
PLP proteína proteolipídica 1 PLP P60
97
GALC galactosilceramidasa GALC P54803
98
MBP proteína básica de la mielina MBP P02686
99
CNP 2',3'-nucleótido cíclico-3'-fosfodiesterasa CNP P09543
100
Olig2 factor de transcripción de oligodendrocitos 2 Olig2 Q13516
101
NES Nestina Nestin Q48681
102
Sox2 Factor de transcripción SOX-2 SOX2 P48431
103
FoxGIB Proteína de la caja Foxhead G1 FOXG1B P55316
104
Pax6 Proteína Pax-6 PAX6 P26367
105
TH Tirosina 3-monooxigenasa TH P07101
106
CLDN6 Claudina-6 CLDN6 P56747
107
GATA4 Factor de transcripción GATA-4 GATA4 P43694
108
PDX1 Proteína de homeocaja de páncreas/duodeno 1 PDX-1 P52945
109
Krt20 Queratina, citoesqueleto 20 de tipo I KRT20 P35900
110
KLF4 Factor 4 de tipo Krueppel KLF4 O43474
111
Sox17 Factor de transcripción SOX-17 Sox17 Q9H6I2
112
FoxA2 Factor nuclear de hepatocitos 3-beta FOXA2 Q9Y261
113
CXCR4 receptor de quimioquina C-X-C de tipo 4 CXCR4 P61073
114
HNF4A Factor nuclear de hepatocitos 4-alfa HNF4 P41235
115
DPP4 Dipeptidil peptidasa 4 DPP4 P27487
116
AFM Afamina ALB2 P43652
117
KRT19 Queratina, citoesqueleto 19 de tipo I KRT19 P08727
118
KRT18 Queratina, citoesqueleto 18 de tipo I KRT18 P05783
119
CYP7A1 Colesterol 7-alfa-monooxigenasa CYP7A1 P22680
120
CYP3A4 Citocromo P450 3A4 CYP3A4 P08684
121
Cyp2B6 Citocromo P450 2B6 CYP2B6 P20813
122
PCK1 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, citosólica [GTP] PCK1 P35558
123
PCK2 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa [GTP], mitocondrial PCK2 Q16822
124
TAT Tirosina aminotransferasa TAT P17735
125
TD02 Triptófano 2,3-dioxigenasa TDO P48775
126
GalC Galactocerebrosidasa GALC P54803
127
Mafa Factor de transcripción MafA MAFA Q8NHW3
128
NEUROG3 Neurogenina-3 NGN-3 Q9Y4Z2
Tabla A: Otras proteínas marcadas endógenamente
Símbolo del gen
Nombre de la proteína Símbolo de la proteína N.º de acceso de la proteína
129
RUNX1 Factor de transcripción relacionado con Runt 1 RUNX1 Q01196
130
myb (c-myb) Activador de la transcripción Myb c-Myb P10242
131
VAV1 Proto-oncogén vav VAV1 P15498
132
GATA1 Factor de transcripción eritroide GATA1 P15976
133
LCLAT1 Lisocardiolipina aciltransferasa 1 LCLAT1 Q6UWP7
134
CD34 Antígeno de células progenitoras hematopoyéticas CD34 CD34 P28906
135
PTPRC Proteína asociada al receptor de la proteína tirosina fosfatasa de tipo C CD45 Q14761
136
MNX1 Proteína 1 de la homeocaja de las neuronas motoras y del páncreas HOXHB9 P50219
137
CD34
138
ICA1 autoantígeno 1 de las células de los islotes ICAp69 Q05084
139
MYEF-2 Factor de expresión de la mielina 2 MYEF-2 Q9P2K5
140
ChAT colina O-acetiltransferasa ChAT P28329
141
ISLET (ISL1) Proteína potenciadora del gen de la insulina ISL-1 ISLET P61371
142
NKX2-5 Factor de transcripción de NK2 relacionado, locus 5 NKX2-5 P52952
143
EHMT1 (Brachyury) histona-lisina N-metiltransferasa eucromática 1 EHMT1 Q9H9B1
144
MyH6 miosina, cadena pesada 6, músculo cardiaco, alfa MYH6 P13533
145
TNNT2 troponina T de tipo 2 (cardiaca) TNNT2 P45379
146
Mixl1 Proteína de la homeocaja MIXL1 MIXL Q9H2W2
147
MLC2a Cadena ligera reguladora de la miosina 2, isoforma atrial MLC-2a Q01449
148
MLC2v Cadena ligera reguladora de la miosina 2, isoforma del músculo ventricular/cardiaco MLC-2v P10916
149
HCN4 Canal 4 abierto por nucleótidos cíclicos activados por la hiperpolarización del potasio/sodio HCN4 Q9Y3Q4
150
Hey1 Vellosa/potenciadora de la división relacionada con la proteína 1 del motivo YRPW CHF-2 Q9Y5J3
151
Hey2 Vellosa/potenciadora de la división relacionada con la proteína 2 del motivo YRPW CHF-1 Q9UBP5
152
Mesp1 Proteína del mesodermo posterior 1 Mesp1 Q9BRJ9
153
GRE (elemento de respuesta a glucocorticoides)
1-46 genes relacionados con las vías de señalización celular 47-86 genes relacionados con la ADEM/toxicidad 89-152 genes relacionados con la medicina regenerativa/células madre
(b) secuencia de marcaje
[0066] El término “marcador” se refiere, en el presente documento, a una proteína que se fusiona con la proteína
5 endógena para crear las proteínas endógenas marcadas. La secuencia de marcaje se fusiona en fase con la secuencia de codificación de la proteína endógena, de manera que se genera una proteína de fusión. La expresión “en fase” significa que el marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia cromosómica que codifica la proteína se mantiene tras la inserción de la secuencia de marcaje. Las inserciones en fase se producen cuando el número de nucleótidos insertados es divisible entre tres, lo que se puede lograr mediante la adición de un enlazador de
10 cualquier número de nucleótidos a la secuencia que codifica la proteína de marcaje según el caso. La proteína endógena se puede marcar en cualquier lugar dentro de la secuencia polipeptídica de la proteína, siempre que la función de la proteína endógena no se vea afectada. En general, el marcaje se realiza en el extremo N-o C-terminal de la proteína. La proteína endógena se puede marcar, por ejemplo, en el extremo N-terminal de la proteína. Como
alternativa, la proteína endógena se puede marcar en el extremo C-terminal de la proteína.
[0067] Una secuencia de marcaje puede ser cualquier secuencia peptídica codificada por una secuencia de ácido nucleico. La secuencia de marcaje puede codificar una variedad de marcadores, incluyendo, pero sin limitación, 5 epítopos marcadores, marcadores de afinidad, indicadores o combinaciones de los mismos.
[0068] El marcador puede ser, por ejemplo, un epítopo marcador. El epítopo marcador puede comprender una secuencia de aminoácidos aleatoria o una secuencia de aminoácidos conocida. Una secuencia de aminoácidos conocida puede tener, por ejemplo, anticuerpos generados contra ella, o puede no haber anticuerpos conocidos generados contra la secuencia. El epítopo marcador puede ser una epítopo marcador de anticuerpo para el que haya anticuerpos comerciales disponibles. Los ejemplos no limitantes de epítopos marcadores de anticuerpos adecuados son myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, proteína de unión a la maltosa, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, BCCP y calmodulina.
15 [0069] Un marcador ilustrativo puede ser un indicador. Los indicadores adecuados son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de indicadores incluyen marcadores de afinidad, indicadores visuales o indicadores marcadores seleccionables. Los ejemplos no limitantes de marcadores de afinidad incluyen la proteína de unión a la quitina (CBP), la tiorredoxina (TRX), poli(NANP), el marcador de purificación por afinidad en tándem (TAP) y la glutatión-S-transferasa (GST). Los indicadores visuales suelen dar lugar a una señal visual, tal como un cambio de color en la célula, o la fluorescencia o luminiscencia de la célula. Por ejemplo, el indicador LacZ, que codifica βgalactosidasa, volverá azul una célula en presencia de un sustrato adecuado, tal como X-gal. Otros ejemplos no limitantes de indicadores visuales incluyen una proteína fluorescente, luciferasa, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, beta-lactamasa, peroxidasa de rábano picante y variantes de las mismas. Además, se puede usar la luciferasa. Los indicadores marcadores seleccionables normalmente confieren un rasgo seleccionable a la célula, tal
25 como resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a los antibióticos).
[0070] Un marcador ilustrativo es un indicador visual de proteína fluorescente. Los ejemplos no limitantes de indicadores visuales de proteína fluorescente incluyen proteínas verdes fluorescentes (por ejemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), proteínas amarillas fluorescentes (por ejemplo, YFP, EYFP, citrina, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), proteínas azules fluorescentes (por ejemplo, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), proteínas azul verdosas fluorescentes (por ejemplo, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), proteínas rojas fluorescentes (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) y proteínas naranjas
35 fluorescentes (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) o cualquier otra proteína fluorescente adecuada. Son marcadores ilustrativos una proteína verde fluorescente o una proteína roja fluorescente.
[0071] Los ejemplos no limitantes también incluyen permutaciones circulares de proteínas verdes fluorescentes, en las que las partes amino y carboxilo se intercambian y se vuelven a unir con un espaciador corto que conecta los extremos originales, sin que dejen de ser fluorescentes. Estas permutaciones circulares de proteína fluorescente tienen alterados los valores de pKa y las orientaciones del cromóforo. Además, ciertos lugares dentro de algunas proteínas fluorescentes toleran la inserción de proteínas enteras, y los cambios de configuración en la inserción pueden tener efectos profundos en la fluorescencia, tal como el aumento o el cambio de color. Por ejemplo, las
45 inserciones de calmodulina o un dominio de dedos de cinc en el lugar de Tyr-145 de una mutante amarilla (EYFP, proteína amarilla fluorescente mejorada) de GFP dan lugar a proteínas indicadoras cuya fluorescencia se puede mejorar varias veces tras la unión del metal. El injerto de calmodulina en una proteína amarilla fluorescente mejorada puede controlar el Ca2+ citosólico en células de mamífero individuales.
[0072] La proteína endógena se puede fusionar, por ejemplo, con el marcador a través de un enlace peptídico. La secuencia del enlazador peptídico se selecciona basándose en contribuciones estructurales y conformacionales conocidas de segmentos peptídicos para permitir el plegamiento apropiado y evitar un posible impedimento estérico de la proteína que se vaya a marcar y del polipéptido marcador. Los enlazadores peptídicos se usan comúnmente y se conocen en la técnica, y pueden ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 aminoácidos de longitud.
55 [0073] La proteína endógena también se puede marcar con más de un marcador. Por ejemplo, una proteína endógena se puede marcar con al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve marcadores. Se puede expresar más de un marcador como un solo polipéptido fusionado a una proteína endógena de interés. Más de un marcador fusionado a una proteína endógena se puede expresar como un solo polipéptido que se escinde en los polipéptidos marcadores individuales después de la traducción. A modo de ejemplo no limitante, los péptidos 2A de los picornavirus insertados entre polipéptidos marcadores o entre el polipéptido marcador y la proteína endógena pueden dar lugar a la “escisión” junto con la traducción de una marcador, y conducir a la expresión de múltiples proteínas a niveles equimolares.
65 [0074] En una realización ilustrativa, la célula expresa una proteína endógena que está marcada con una proteína
fluorescente. En otra realización ilustrativa, la célula expresa dos proteínas endógenas marcadas por fluorescencia. En otra realización ilustrativa más, la célula expresa tres proteínas endógenas marcadas por fluorescencia. En una realización adicional, la célula expresa cuatro o más proteínas endógenas marcadas.
5 (c) Tipo de célula
[0075] En general, la célula será una célula eucariota. Las células adecuadas incluyen hongos o levaduras, tales como Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae; células de insectos, tales como células SF9 de Spodoptera frugiperda o células S2 de Drosophila melanogaster; células vegetales; y células animales, tales como células de ratón, rata, hámster, primate no humano o ser humano. Las células ilustrativas son de mamífero. Las células de mamífero pueden ser células primarias. En general, se puede usar cualquier célula primaria que sea sensible a las roturas de doble cadena. Las células pueden ser de una variedad de tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, mioblastos, linfocitos T o B, macrófagos, células epiteliales, etcétera.
15 [0076] La célula de mamífero puede ser una célula de línea celular de mamífero. La línea celular puede ser cualquier línea celular establecida o una línea celular primaria. La línea celular puede ser adherente o no adherente,
o la línea celular se puede cultivar en condiciones que potencien el crecimiento adherente, no adherente u organotípico usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), línea CVI de riñón de mono transformada por SV40 (COS7); línea de riñón embrionario humano 293; células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (TM4); células de riñón de mono (CVI-76); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma de cuello uterino (HeLa); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humanas (W138); células de hígado humanas (Hep G2); células de tumor de mama de ratón (MMT); células de hepatoma de rata (HTC); células HIH/3T3, la línea 25 celular de osteosarcoma humana U2-OS, la línea celular A549 humana, la línea celular K562 humana, la línea celular HEK293 humana, la línea celular HEK293T humana y células TRI. Para una extensa lista de líneas celulares de mamíferos, los expertos en la materia pueden consultar el catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®, Mamassas, VA). En general, las células pueden ser de una variedad de tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, mioblastos, linfocitos T o B, macrófagos, células epiteliales, etcétera. Una línea celular ilustrativa de acuerdo con la presente divulgación es la línea celular de osteosarcoma U2OS humana. Otras líneas celulares humanas ilustrativas alternativas son la línea celular A549, la línea celular K562, la línea celular HEK293 y la línea celular HEK293T. Otra línea celular humana ilustrativa es la MCF10a, una línea celular de cáncer epitelial de mama. Otra línea celular humana ilustrativa es la SKOV3, una línea de células epiteliales. Otras líneas celulares ilustrativas alternativas incluyen células iPS, que son células madre pluripotentes inducidas generadas a partir de fibroblastos u
35 otros tipos de células.
[0077] En otras realizaciones más, la célula puede ser una célula madre. Las células madre adecuadas incluyen, sin limitación, células madre embrionarias, células madre de tipo ES, células madre fetales, células madre adultas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre multipotentes, células madre oligopotentes y células madre unipotentes.
[0078] En realizaciones adicionales, la célula puede ser un embrión monocelular. El embrión puede ser un vertebrado o un invertebrado. Los vertebrados adecuados incluyen mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Los ejemplos de mamíferos adecuados incluyen, sin limitación, roedores, animales de compañía, animales de granja y
45 no primates. Los ejemplos no limitantes de roedores incluyen ratones, ratas, hámsteres, jerbos y cobayas. Los animales de compañía adecuados incluyen, pero sin limitación, gatos, perros, conejos, erizos y hurones. Los ejemplos no limitantes de animales de granja incluyen caballos, cabras, ovejas, cerdos, vacas, llamas y alpacas. Los no primates adecuados incluyen, pero sin limitación, monos capuchinos, chimpancés, lemures, macacos, monos tití, tamarinos, monos araña, monos ardilla y monos verdes. Los ejemplos de aves no limitantes incluyen pollos, pavos, patos y gansos. Como alternativa, el animal puede ser un invertebrado tal como un insecto, un nematodo, y similares. Los ejemplos no limitantes de insectos incluyen Drosophila y mosquitos.
II. Método de marcaje de proteína/s endógenas/s
55 [0079] Otro aspecto de la presente divulgación engloba un método de marcaje de al menos una proteína endógena en una célula. El método comprende el uso de una endonucleasa de dirección para mediar en la integración de una secuencia de marcaje en fase con una secuencia codificante endógena. Más concretamente, el método comprende introducir en una célula al menos una nucleasa de dedos de cinc o ácido nucleico que codifique una nucleasa de dedos de cinc y al menos un polinucleótido donante. El polinucleótido donante comprende una secuencia de marcaje que se va a integrar en fase en la secuencia cromosómica endógena, una secuencia cadena arriba y una secuencia cadena abajo flanqueando la secuencia de marcaje, en el que las secuencias cadena arriba y cadena abajo comparten una identidad de secuencia sustancial con cualquiera de los lados del sitio de escisión de la secuencia cromosómica endógena que codifica la proteína. A continuación, se mantienen las células en condiciones que permitan la reparación de una rotura de doble cadena introducida en el sitio de escisión por la
65 nucleasa de dedos de cinc mediante un proceso de homología dirigida, de manera que la secuencia de marcaje del
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(v) Ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc
[0098] La nucleasa de dedos de cinc se puede introducir en la célula como un ácido nucleico que codifique la nucleasa de dedos de cinc. El ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc puede ser ADN o ARN. En
5 una realización, el ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc puede ser ADN. Por ejemplo, puede introducirse ADN de plásmido que comprenda una secuencia de codificación de nucleasa de dedos de cinc en la célula. En otra realización, el ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc puede ser ARN o ARNm. Cuando el ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc es ARNm, la molécula de ARNm puede estar protegida terminalmente en 5’. Del mismo modo, cuando el ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc es ARNm, la molécula de ARNm puede estar poliadenilada. Por lo tanto, un ácido nucleico de acuerdo con el método puede ser una molécula de ARNm protegida terminalmente y poliadenilada, que codifique una nucleasa de dedos de cinc. Los métodos de protección terminal y de poliadenilación de ARNm son conocidos en la técnica.
(b) Polinucleótido donante
15 [0099] El método de integración de la secuencia de marcaje en fase en una secuencia cromosómica diana comprende además introducir en la célula al menos un polinucleótido donante que comprenda la secuencia de marcaje. Un polinucleótido donante no solo comprende la secuencia de marcaje, como se detalla anteriormente en el apartado (l)(b), sino que también comprende una secuencia cadena arriba y una secuencia cadena abajo. Las secuencias cadena arriba y cadena abajo flanquean la secuencia de marcaje en el polinucleótido donante. Además, las secuencias cadena arriba y cadena abajo comparten identidad de secuencia sustancial con cualquiera de los lados del sitio de integración de la secuencia cromosómica endógena.
[0100] Las secuencias cadena arriba y cadena abajo del polinucleótido donante se seleccionan para potenciar la
25 recombinación entre la secuencia cromosómica diana y el polinucleótido donante. La secuencia cadena arriba, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia cromosómica cadena arriba del sitio de integración diana. Del mismo modo, la secuencia cadena abajo se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia cromosómica cadena abajo del sitio de integración diana. Las secuencias cadena arriba y cadena abajo del polinucleótido donante pueden tener aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia cromosómica diana. En otras realizaciones, las secuencias cadena arriba y cadena abajo del polinucleótido donante pueden tener aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia cromosómica diana. En una realización ilustrativa, las secuencias cadena arriba y cadena abajo del polinucleótido donante pueden tener aproximadamente el 99 % o 100 % de identidad de
35 secuencia con la secuencia cromosómica diana.
[0101] Una secuencia cadena arriba o cadena abajo puede comprender de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 2.500 pb. En una realización, una secuencia cadena arriba o cadena abajo puede comprender aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800 , 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400 o 2.500 pb. Una secuencia cadena arriba o cadena abajo ilustrativa puede comprender de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 2.000 pb, de aproximadamente 600 pb a aproximadamente 1.000 pb, o más particularmente, de aproximadamente 700 pb a aproximadamente 1.000 pb.
[0102] Por lo general, el polinucleótido donante será ADN. El polinucleótido donante puede ser un plásmido de
45 ADN, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un vector viral, un trozo lineal de ADN, un fragmento de PCR, un ácido nucleico desnudo o un ácido nucleico complejado con un vehículo de administración tal como un liposoma o poloxámero. En una realización, el polinucleótido donante que comprende la secuencia de marcaje puede ser un plásmido de ADN. En otra realización, el polinucleótido donante que comprende la secuencia de marcaje puede ser un BAC.
[0103] Un experto en la materia sería capaz de construir un polinucleótido donante como se describe en el presente documento usando técnicas recombinantes convencionales bien conocidas (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 y Ausubel et al., 1996).
55 (c) Administración a la célula
[0104] El método comprende la introducción de la endonucleasa de dirección o el ácido nucleico que codifica la endonucleasa de dirección y el polinucleótido donante en una célula. Las células adecuadas se detallan anteriormente en el apartado (l)(c).
[0105] Los métodos de administración adecuados incluyen microinyección, electroporación, sonoporación, biolística, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección catiónica, transfección de liposomas, transfección de dendrímeros, transfección de choque térmico, transfección de nucleofección, magnetofección, lipofección, impalefección, transfección óptica, captación mejorada con agente patentado de ácidos nucleicos y administración a 65 través de liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En una realización, las moléculas se
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un número correspondiente de polinucleótidos donantes. Cada polinucleótido donante comprendería una secuencia de ácido nucleico que se fuera a integrar y una secuencia de cadena arriba y cadena abajo homóloga al sitio cromosómico de integración como se ha detallado anteriormente. El número de endonucleasas de dirección y polinucleótidos donantes correspondientes inyectados en una célula pueden ser dos, tres, cuatro, cinco o más de
5 cinco.
III. Kit de marcaje de la proteína endógena
[0113] La presente divulgación también engloba un kit para el seguimiento de la ubicación de al menos una proteína endógena en una célula. El kit comprende una célula que tiene al menos una secuencia de marcaje integrada en fase en una secuencia cromosómica que codifica una proteína endógena, de modo que la célula expresa al menos una proteína endógena marcada. La célula puede ser una célula de mamífero. Preferentemente, la célula es una célula humana. La célula humana puede ser una célula de una línea celular seleccionada entre una célula U2OS humana, una MCF10A humana, una SKOV3 humana o una iPS humana. La proteína endógena
15 marcada se puede seleccionar entre tubulina, actina, lamina, HER2 y HMGA. Como alternativa, el kit puede expresar al menos una proteína endógena marcada seleccionada entre las enumeradas en la Tabla A. En realizaciones preferidas, el marcador de la proteína endógena puede ser una proteína fluorescente seleccionada entre una proteína verde fluorescente, una proteína azul fluorescente, una proteína azul-verdosa fluorescente, una proteína amarilla fluorescente, una proteína naranja fluorescente y una proteína roja fluorescente. Los marcadores ilustrativos son la proteína verde fluorescente y la proteína roja fluorescente.
Definiciones
[0114] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente
25 documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención: Singleton et al., “Dictionary of Microbiology and Molecular Biology” (2ª ed. 1994); “The Cambridge Dictionary of Science and Technology” (Walker ed., 1988); “The Glossary of Genetics”, 5ª Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, “The Harper Collins Dictionary of Biology” (1991). Como se usan en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a no ser que se especifique lo contrario.
[0115] Cuando se introducen elementos de la presente divulgación o de las realizaciones preferidas de la misma, los artículos "un/a", "el/la" y "dicho/a" pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Los términos "que
35 comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivos, y significan que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos enumerados.
[0116] Un "gen", como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ADN (incluyendo exones e intrones) que codifica un producto génico, así como a todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, sean o no dichas secuencias reguladoras adyacentes a secuencias de codificación y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero sin limitarse necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción tales como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada a ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos del límite, orígenes de replicación, sitios de unión a la matriz y regiones de control de locus.
45 [0117] Una "proteína heteróloga" es una proteína que no es natural (es decir, foránea) para la célula u organismo de interés.
[0118] Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en una configuración lineal o circular, y en forma bien monocatenaria o bicatenaria. Para los fines de la presente divulgación, estos términos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que estén modificados en la base, azúcar y/o restos fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un determinado nucleótido tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es
55 decir, un análogo de A se emparejará con T.
[0119] Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos.
[0120] El término "recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. A los efectos de la presente divulgación, "recombinación homóloga" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio, que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de las roturas de la doble cadena en las células. Este proceso requiere la similitud de secuencia entre los dos polinucleótidos, usa una molécula "donante" o de "intercambio" para la reparación con mole de una molécula "diana" (es decir, la que 65 experimentó la rotura de doble cadena), y se conoce indistintamente como "conversión génica sin cruzamiento" o
"conversión génica de extensión corta", ya que conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin quedar ligados a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección del desapareamiento de ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o "la hibridación de cadenas dependiente de la síntesis", en la que el donante se usa para volver a sintetizar la información genética que formará
5 parte de la diana y/o los procesos relacionados. Dicha recombinación homóloga especializada a menudo produce la alteración de la secuencia de la molécula diana de modo que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpore al polinucleótido diana.
[0121] La expresión "identidad de secuencia" se refiere al grado en el que dos secuencias de nucleótidos son invariables, es decir, las dos secuencias tienen el mismo nucleótido en la misma posición. En general, la identidad de secuencia se expresa como un porcentaje. Dos secuencias de nucleótidos que son idénticas en secuencia y longitud tienen un 100 % de identidad de secuencia.
[0122] Como se usan en el presente documento, las expresiones "sitio diana" o "secuencia diana" se refieren a
15 una secuencia de ácido nucleico que define una parte de una secuencia cromosómica que se va a editar y para la que una nucleasa de dedos de cinc está diseñada para reconocer y unirse, siempre que existan las condiciones suficientes para la unión.
[0123] Las técnicas para determinar la identidad de las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos son conocidas en la materia. Por lo general, dichas técnicas incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Las secuencias genómicas también se pueden determinar y comparar de esta forma. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido
o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Dos o más
25 secuencias (polinucleótido o aminoácido) se pueden comparar determinando su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. El algoritmo de homología local de Smith y Waterman proporciona un alineamiento aproximado para secuencias de ácido nucleico, “Advances in Applied Mathematics” 2: 482-489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, “Atlas of Protein Sequences and Structure”, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Genetics Computer Group (Madison, Wis.) proporciona una implementación ilustrativa de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia en la aplicación de la utilidad "BestFit". En la técnica, se conocen en
35 general otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden usar usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = convencional; filtro = ninguno; cadena = ambas; punto de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la página Web del GenBank. Con respecto a las secuencias descritas en el presente documento, el intervalo de grados deseados de identidad de secuencia es del aproximadamente 80 % al 100 % y cualquier valor entero entre ellos. Por lo general, los porcentajes de identidad entre las secuencias son del al menos 70 a 75 %, preferentemente 80-82 %, más preferentemente 85-90 %, incluso más preferentemente del 92 %, aún más
45 preferentemente del 95 %, y lo más preferentemente del 98 % de identidad de secuencia.
[0124] Como alternativa, el grado de similitud de secuencia entre polinucleótidos se puede determinar mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que permitan la formación de dúplex estables entre regiones que compartan un grado de identidad de secuencia, seguida de la digestión con nucleasa/s específica/s de una sola cadena, y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos ácidos nucleicos o dos secuencias de polipéptidos son sustancialmente similares entre sí cuando las secuencias presentan al menos aproximadamente 70 %-75 %, preferentemente 80 %-82 %, más preferentemente 85 %-90 %, incluso más preferentemente 92 %, aún más preferentemente 95 %, y lo más preferentemente 98 % de identidad de secuencia en una longitud definida de las moléculas, según lo determinado usando los métodos anteriores. Como se usa en el presente documento,
55 sustancialmente similares también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con una secuencia de ADN o polipéptido especificada. Las secuencias de ADN que son sustancialmente similares se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, según lo definido para ese sistema en particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas pertenece al alcance de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; “Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach”, editores B. D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D. C.; IRL Press).
[0125] La hibridación selectiva de dos fragmentos de ácido nucleico se puede determinar de la siguiente manera. El grado de identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficacia y a la fuerza de las hibridaciones entre dichas moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos 65 parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica a una molécula diana. La inhibición de la
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extremo C-terminal de MAPRE3 (par 31/32; Fig. 23 y Tabla 3). En este par, una ZFN se diseñó para que se uniera a la secuencia 5’ TTCCTCTCTCTCCCAC 3' (SEQ ID NO: 11), y la otra ZNF se diseñó para que se uniera a la secuencia 5' AGGAAGGATTCGCAC 3' (SEQ ID NO: 12) que comprendía el locus MAPRE3.
Tabla 3
Par de ZFN
Total Parental Banda uno Banda dos % eficiencia
26/27
0 Ninguna banda detectada por densitometría
29/30
0 Ninguna banda detectada por densitometría
31/32
3.448 2.728 579 141 21 % Banda más pequeña detectada fácilmente
Banda de 317 pb apenas detectada
33/35
0 Ninguna banda detectada por densitometría
Tabla 4
Par de ZFN
Total Parental Banda uno Banda dos % eficiencia
12/13-L
5.476 5.172 304 0 Ninguna banda detectada por densitometría
14/16-L
4.093 3.463 377 253 015 % Ninguna banda detectada por densitometría
50/51-L
4.722 3.512 726 484 26 % Banda más pequeña detectada fácilmente, banda de 317 pb apenas detectada
59/60-L
5.726 4.022 983 721 30 % Ninguna banda detectada por densitometría
[0141] Se produjo un plásmido donante que comprendía secuencias del locus MAPRE3 de cadena arriba y cadena abajo que flanqueaban un polinucleótido codificante de GFP (Fig. 21). Se transfectaron el plásmido donante y el par 31/32 de ARN codificante de ZFN a las células, y la PCR de unión demostró una posible inserción de la GFP
10 marcadora en el locus MAPRE3 (Fig. 24). Sin embargo, el análisis FACS demostró que no se detectó señal fluorescente y, por lo tanto, que la integración dirigida no tuvo éxito (Fig. 25).
Ejemplo 4. Marcaje de la proteína β-actina endógena
15 [0142] Se marcó la proteína β-actina endógena con GFP usando recombinación homóloga inducida por ZFN. En resumen, se usaron ZFN para introducir una rotura de doble cadena en la región cromosómica codificante de la βactina codificada por el locus ACTB. La rotura de doble cadena induce la recombinación homóloga con un polinucleótido donante que comprende la secuencia codificante de GFP flanqueada por secuencias de ácido nucleico homólogas a la región cromosómica del locus ACTB, y que da lugar a la integración de la región codificante
20 de GFP en el cromosoma. El polinucleótido donante (Fig. 28) se construyó para que tuviera integrada la GFP marcadora en fase con la secuencia codificante de la β-actina (Fig. 26, "v.2") para producir una proteína marcada con GFP en el extremo N-terminal (Fig. 26D). La proteína β-actina marcada con GFP se expresó bajo el control del promotor de la actina endógeno.
25 [0143] Se diseñó un par de ZFN para la integración dirigida de un marcador en el sitio diana ACTB, como se ha detallado anteriormente. Para el par de ZFN usado para marcar la proteína β-actina, una ZFN se diseñó para que se uniera a la secuencia 5' GTCGTCGACAACGGCTCC 3' (SEQ ID NO: 13), y la otra ZFN se diseñó para que se uniera a la secuencia 5' TGCAAGGCCGGCTTCGCGG 3' (SEQ ID NO: 14) (Fig. 26A). Tras la unión, el par de ZFN introduce una rotura de doble cadena en la secuencia cromosómica GGCATG entre los sitios de reconocimiento
30 (Fig. 26A y 26B) para inducir la recombinación homóloga. A continuación, se produjo ARNm poliadenilado, protegido terminalmente, codificante del par de ZFN, usando técnicas de biología molecular conocidas.
[0144] Se determinó la frecuencia de la generación de roturas de doble cadena del par de ZFN dirigido en combinaciones de células tratadas ZFN, usando el ensayo de nucleasa Cel-1 (Fig. 27). Dicho ensayo detecta los 35 alelos del locus diana que se desvían del tipo silvestre como resultado de la reparación imperfecta mediada por la unión de extremos no homólogos (NHEJ) de las roturas de doble cadena de ADN inducidas por ZFN. La amplificación por PCR de la región diana de una combinación de células tratadas con ZFN genera una mezcla de amplicones de tipo silvestre y mutantes. La fusión y la rehibridación de esta mezcla da lugar a la formación de desapareamientos entre los heterodúplex de los alelos de tipo silvestre y mutantes. Una "burbuja" de ADN formada
40 en el sitio del desapareamiento es escindida por la nucleasa Cel-1 Surveyor, y los productos de la escisión se pueden resolver mediante electroforesis en gel. La intensidad relativa de los productos de escisión en comparación con la banda parental es una medida del nivel de escisión de Cel-1 del heterodúplex. Esto, a su vez, refleja la frecuencia de la escisión mediada por ZFN del locus diana endógeno que posteriormente sufre la reparación imperfecta por parte de NHEJ.
45 [0145] Se construyó un plásmido (Fig. 28) como un polinucleótido donante para la integración dirigida de una GFP marcadora en el locus ACTB de la línea celular humana. El plásmido comprendía la secuencia codificante de GFP
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