ES2563242T3 - Vacuna oral - Google Patents

Abstract

Una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana, en la forma de una formulación de cápsula, que comprende: una membrana de la cápsula y un microorganismo transformado que expresa una proteína de antígeno de flagelina, en el que la membrana de la cápsula es resistente a los ácidos, y el microorganismo transformado se encapsula con la membrana de la cápsula.

Description

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Vacuna oral

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una vacuna oral util para prevenir y tratar una enfermedad infecciosa bacteriana, y un metodo para producir la misma.

Antecedentes de la tecnica

La fiebre tifoidea es una de las enfermedades infecciosas causadas por Salmonella enterica var. Typhi, que es un tipo de bacteria de la salmonela; infeccion causada por la ingestion de agua potable contaminada, comida, o similares. La fiebre tifoidea es comun en todo el mundo, en particular, en las zonas de Asia, Oriente Medio, Europa del Este, Africa y America Central y del Sur. Cada ano, 16 millones de personas estan afectadas por la fiebre tifoidea, y 0,6 millones de personas mueren de esta enfermedad. La mayorfa de los muertos son ninos en los pafses en desarrollo. Actualmente, una bacteria de salmonela atenuada (Ty2la) o similar se administra por via oral en forma de vacuna contra la fiebre tifoidea causada por la bacteria de salmonela, pero no se puede administrar a los bebes de 5 anos o menos, debido a sus efectos secundarios, como diarrea o vomitos. Una vez que una persona se ve afectada por la fiebre tifoidea, un anticuerpo contra la fiebre tifoidea se desarrolla dentro del cuerpo, y la inmunidad se adquiere, pero este efecto no dura mucho tiempo.

El colera es una de las enfermedades infecciosas causadas por Vibrio cbolerae O1 o O139. El colera es prevalente en todo el mundo, en particular, en Asia, Oriente Medio y Africa. Epidemias de colera clasicas han ocurrido repetidamente y varios millones de personas han muerto de esta enfermedad debido a su fuerte patogenicidad (tasa de mortalidad 20%). Actualmente, la gente se inoculan contra esta enfermedad, pero el efecto de tal inoculacion es relativamente bajo y se dice que es aproximadamente del 50%.

La disenterfa bacteriana (shigelosis) es una enfermedad infecciosa bacteriana ampliamente distribuida en todo el mundo, y que se nota sobretodo en pafses con falta de higiene. Disenterfa bacteriana es causada por las bacterias intestinales que pertenecen al genero Shigella, que incluye cuatro grupos que consisten en Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei, en orden de patogenicidad.

Como se describio anteriormente, hay diversas enfermedades infecciosas bacterianas, y es evidente que las vacunas eficaces contra enfermedades infecciosas bacterianas son necesarias. En particular, las vacunas para la prevencion de enfermedades infecciosas de transmision entre humanos son necesarias. Actualmente, por ejemplo, algunas vacunas contra varias especies de salmonella son comercialmente disponibles. Estas vacunas son a veces eficaces, pero tienen desventajas graves. Estas vacunas normalmente inducen anticuerpos causados por la infeccion con la bacteria silvestre, y una carga excesiva se coloca en los sujetos.

Con el fin de resolver este problema, un estudio se centro en el flagelo de las bacterias tambien se ha llevado a cabo. Un flagelo es una estructura larga que sobresale de la superficie celular de las bacterias, y juega un papel importante cuando las celulas muevan e invadan una celula huesped. El flagelo se compone de una protefna conocida como flagelina. Esta protefna flagelina ha sido conocida por inducir un alto nivel de anticuerpos. La flagelina de protefna antigenica de Salmonella typhimurium se describe por M. McClelland M. et al. en Nature, vol. 413, p. 852 (2001). La flagelina de protefna antigenica de Vibrio cholerae se describe por Heiderberg et al. en Nature, vol. 406, p. 477 (2000). Ademas, la flagelina de protefna antigenica de Shigella dysenteriae se describe por Tominaga A. et al. en Genes Genet. Syst., Vol. 76, p. 111 (2001). Sin embargo, una vacuna eficaz para el uso de este tipo de anticuerpo contra flagelo no se ha proporcionado aun.

Descripcion de la invencion

Es un objeto de la presente invencion el de proporcionar medios para utilizar, como vacuna, una protefna de flagelina derivada de una bacteria que provoca una enfermedad infecciosa, debido a que la enfermedad infecciosa no es causadoa por la protefna de flagelina solo.

La presente invencion proporciona una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana, en la forma de una formulacion de capsula, que comprende:

una membrana de la capsula y

un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina,

donde la membrana de la capsula es resistente a los acidos, y el microorganismo transformado se encapsula con la membrana de la capsula.

La presente invencion tambien proporciona un primer metodo para producir una vacuna oral frente a una

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enfermedad infecciosa bacteriana, que comprende las etapas de:

la preparacion de un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno fde lagelina; y la envoltura del microorganismo transformado en una membrana de la capsula resistente a los acidos, produciendo de este modo una formulacion de capsula resistente a los acidos.

La presente invencion proporciona ademas un segundo metodo para producir una vacuna oral frente a una enfermedad infecciosa bacteriana, que comprende las etapas de:

la preparacion de un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina; la envoltura del microorganismo transformado en una membrana de la capsula, produciendo de este modo una formulacion de capsula; y

la proporcion de la membrana de la capsula de la formulacion en capsulas producidas con resistencia a los acidos.

En una realizacion, la protefna de antfgeno de flagelina que se expresa en la celula del microorganismo.

En otra realizacion, la protefna de antfgeno de flagelina se secreta de la celula del microorganismo.

En una realizacion, el microorganismo es al menos uno seleccionado de microorganismos pertenecientes al grupo que consta del genero Bilidobacterium, el genero Lactobacillus, al genero Lactococcus, el genero Pediococcus, el genero Streptococcus, del genero Enterococcus, el genero Leuconostoc, el genero Tetragenococcus, el genero Oenococcus, y el genero Weissella.

En una realizacion, la vacuna oral es una vacuna contra la fiebre tifoidea, el colera, o disenterfa.

En una realizacion, la formulacion en capsulas es una formulacion de capsula transparente, una formulacion de capsula blanda, o una formulacion de capsula dura.

De acuerdo con la presente invencion, un microorganismo transformado que expresa una protefna antigenica de flagelina esta contenida en una formulacion de capsula resistente a los acidos. Por lo tanto, el microorganismo transformado esta protegido de acido gastrico con el fin de permitir que sea efectivamente entregado en el intestino con vida. La formulacion se desintegra en el intestino para liberar el microorganismo transformado, que produce la protefna antigenica de flagelina. La flagelina en sf no es infecciosa, sin embargo, un anticuerpo se produce en el cuerpo. En particular, el microorganismo transformado se puede preparar a partir de bacterias intestinales, comunmente conocidas como bacterias buenas, tales como las bifidobacterias o bacterias del acido lactico, que es viable en el intestino. En consecuencia, la protefna flagelina se produce en el intestino, y la protefna de flagelina producida, se considera entonces como un antfgeno para inducir la produccion de anticuerpos en el cuerpo. Por lo tanto, la enfermedad infecciosa se puede prevenir.

Por consiguiente, la presente invencion puede proporcionar un metodo para la prevencion y el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas con una pequena carga de anticuerpo.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es una vista esquematica que muestra la estructura del plasmido pBLES 100.

La FIG. 2 es una vista esquematica que muestra la estructura de pBLES-FliC preparado como un vector de expresion flagelina.

La FIG. 3 es una vista esquematica en seccion transversal que muestra la configuracion de una formulacion de capsula transparente de tres capas que contienen un microorganismo transformado de flagelina.

El mejor modo de llevar a cabo la invencion

Una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana de acuerdo con la presente invencion en la forma de una formulacion de capsula. En este documento, una capsula contiene contenido del mismo se conoce como una "formulacion de capsula". La formulacion de capsula segun la presente invencion incluye una membrana de la capsula y un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina, en la que la membrana de la capsula es resistente a los acidos. La formulacion de capsula incluye una membrana de la capsula resistente a los acidos y un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina que puede tener cualquier configuracion y cualquier forma, siempre y cuando esta formulacion capsula tenga una membrana de la capsula resistente a los acidos y contiene un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina como el contenido de la capsula, sin excluir la formulacion que incluye ademas un elemento constituyente adicional. En consecuencia, el microorganismo transformado que expresa la protefna de antfgeno de flagelina se encapsula en o envuelve la membrana de la capsula resistente al acido (es decir, contenida dentro de la capsula formada por la membrana resistente a los acidos). En este documento, esta formulacion de capsula tambien se conoce como una "formulacion de capsula resistente al acido".

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En lo sucesivo, la adquisicion de un gen para la flagelina (gen de flagelina), la preparacion de un vector para expresar la flagelina (vector de expresion flagelina), la preparacion de un microorganismo transformado que expresa la flagelina, y la produccion de una formulacion de capsula resistente a los acidos que contiene el microorganismo transformado para la preparacion de una vacuna oral, y una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana se describira secuencialmente en las secciones siguientes.

1. Adquisicion de Gen de Flagelina

Un gen que codifica la flagelina esta disponible basado en secuencias genicas conocidas. Un gen que codifica la flagelina puede ser adquirido, por ejemplo, mediante la realizacion de la amplificacion a traves de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN genomico o ADNc preparados a partir de bacterias patogenas infecciosas (por ejemplo, bacterias que causan salmonella, colera o disenterfa) como una plantilla con un par de cebadores preparados sobre la base de la informacion de la secuencia del gen estructural de la flagelina de la bacteria.

Un gen que codifica la flagelina de fiebre tifoidea esta disponible basado en la secuencia del gen estructural de flagelina de S. typhimurium descrito por M. McClelland et al., en Nature, vol. 413, p. 852 (2001). Por ejemplo, el gen puede ser adquirido mediante la realizacion de la amplificacion a traves de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN o ADNc cromosomicos de S. typhimurium como una plantilla con las secuencias de SEQ ID NOs: 1 y 2 como un par de cebadores.

Un gen que codifica la flagelina de colera esta disponible basado en el gen estructural de flagelina de Vibrio cholerae descrito por Heiderberg et al., en Nature, vol. 406, p. 477 (2.000). Por ejemplo, el gen puede ser adquirido por la realizacion de la amplificacion a traves de PCR que usa la cromosoma ADN o ADNc de V. cholerae como una plantilla con las secuencias de SEQ ID NOs: 3 y 4 como un par de cebadores.

Un gen que codifica la flagelina de disenterfa esta disponible sobre la base del gen estructural de flagelina de Shigella dysenteriae descrito por Tominaga A. et al., en Genes Genet. Syst., vol. 76, p. 111 (2001). Por ejemplo, el gen puede ser adquirirse mediante la realizacion de la amplificacion a traves de PCR, utilizando el cromosoma de ADN o ADNc de S. dysenteriae como una plantilla, con las secuencias de SEQ ID NOs: 5 y 6 en la lista de secuencias como un par de cebadores.

2. Preparacion de vector de expresion de flagelina

El gen de flagelina preparado como en el apartado 1 anterior se incorpora en un plasmido para preparar un vector de expresion. No hay limitacion particular el plasmido usado para preparar un vector de expresion, mientras que un plasmido pueda efectuar la expresion en bacterias intestinales. Un plasmido derivado de un microorganismo perteneciente al genero Bifidobacterium (por ejemplo, pTB4, pTB6, pTB10, pBL67 o pBL78), un plasmido derivado de un microorganismo perteneciente al genero Streptococcus (por ejemplo, el plasmido pC194), y similares se utilizan. Ademas, estos plasmidos se pueden complejar con un plasmido de Escherichia coli (vease la Publicacion de Patente japonesa abierta N°. 5-130876, por ejemplo).

En vista de la expresion estable y la facilidad de la preparacion de ADN para la preparacion de una cepa transformada, un plasmido complejo de un plasmido de Bifidobacterium longum (B. longum) con un plasmido de Escherichia coli es preferible entre los plasmidos descritos anteriormente.

En vista de seleccion para una cepa transformada, el vector de expresion tiene preferiblemente un marcador seleccionable tal como resistencia a antibioticos, auxotrofia, o similares.

El vector de expresion tiene preferiblemente una secuencia de control para expresar o ventajosamente expresar la flagelina. Los ejemplos de la secuencia de control incluyen secuencias promotoras, secuencias lfderes, secuencias de propeptido, secuencias potenciadoras, secuencias de senal, secuencias de terminacion, y similares. No hay ninguna limitacion particular sobre el origen de la secuencia de control, siempre y cuando se efectue la expresion en bacterias intestinales. No hay ninguna limitacion particular en la secuencia del promotor, siempre que efectue la expresion en bacterias intestinales.

No hay ninguna limitacion particular en una secuencia promotor, siempre que efectue la expresion de la bacteria intestinal. En vista de expresion eficiente, una secuencia promotor de una protefna similar a histona (HU) (en adelante, puede ser denominado como un "promotor HU") de B. longum se usa preferentemente. Por ejemplo, un gen promotor HU puede obtenerse mediante la amplificacion y la recuperacion de la secuencia de las posiciones de nucleotido 1 al 192 en los genes HU de SEQ ID N°s: 9 y 10 (Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (3), 598 a 603 (2002)), utilizando el cromosoma de ADN o ADNc de B. longum como una plantilla con las secuencias de SEQ ID 7 y 8 N0S en la lista de secuencias como un par de cebadores. Para facilitar la incorporacion en un plasmido, un sitio de enzima de restriccion apropiada se puede incluir en una secuencia de cebador (HindIII para SEQ ID N°: 7, NcoI para

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SEQ ID N°: 8).

Ademas, en vista de la mejora de la eficiencia de expresion, una secuencia del terminador esta preferiblemente incluida. Como la secuencia de terminador, la secuencia terminadora del gen HU se utiliza preferentemente, que corresponde a una secuencia de bases en las posiciones 475 a 600 de SEQ ID N°: 9.

Ademas de lo anterior, una secuencia lfder, una secuencia de propeptido, una secuencia potenciadora, una secuencia senal, y similares pueden estar dispuestos segun sea necesario. Por ejemplo, es preferible contener una secuencia lfder y una secuencia senal para la secrecion de modo que la flagelina puede ser secretada fuera de la celula del microorganismo.

De esta manera, las secuencias de control, tales como una secuencia promotora y una secuencia terminadora, y un gen marcador seleccionable estan incorporados en el plasmido segun sea necesario, para preparar un vector de clonacion. Por ejemplo, un enlazador que tiene un sitio de multiclonacion se dispone preferentemente aguas abajo del promotor del vector de clonacion. Al utilizar tal enlazador, un gen (ADN) que codifica la flagelina se incorpora aguas abajo del promotor de modo que la flagelina se puede expresar en marco.

Los ejemplos del plasmido para un vector de clonacion incluyen pBLES100, pBLEM100, y similares. FIG. 1 muestra una vista esquematica de la estructura de pBLES 100. El plasmido pBLES100 incluye el vector Escherichia coli derivado de pBR322, fragmento de Pstl-EcoRI y fragmento de Pstl-Hindlll (en total 4,4 kbp; parte de la lfnea en la FIG. 1), fragmento Pstl-Pstl de vector de B. longum derivado de pTB6 (3,6 kbp:. porcion de banda negra en la FIG. 1), y una region que codifica espectinomicina adeniltransferasa derivada de Enterococcus faecalis (SpR) (1,1 kbp: flecha dibujada en FIG. 1).

Por ejemplo, un plasmido pBLES100 se prepara como sigue. pTB6, que es un plasmido derivado de B. longum, se escindio con Pstl, y se inserto en el sitio Pstl de Escherichia coli de vector de clonacion pBR322 (fabricado por Takara Bio Inc.). Ademas, una region de fragmento de Hindlll-EcoRI que codifica SpR de Enterococcus faecalis se inserta en el sitio EcoRI-Hindlll de pBR322.

Los fragmentos adquiridos para secuencia promotora y el gen de flagelina HTJ (en adelante, puede ser referido como un "gen F1iC") se incorporan en el marco en este plasmido pBLES 100 para preparar un vector que expresa la flagelina. Mas especfficamente, el fragmento del gen de flagelina que se prepara mediante la amplificacion por PCR se realiza utilizando el ADN cromosomico de S. typhimurium como una plantilla con la secuencia de la SEQ ID N°: 1, que tiene el sitio de escision Ncol y la secuencia de la SEQ ID NO: 2 que tiene el sitio de escision BamHI como un par de cebadores, y el fragmento amplificado se escinde con Ncol y Bamlll. El fragmento promotor de HU se prepara por que la amplificacion PCR se realiza utilizando el ADN cromosomico de B. longum como una plantilla con un cebador de la SEQ ID NO: 7 que tiene el sitio Hindlll y un cebador de SEQ ID NO: 8 que tiene el sitio Ncol como un par de cebadores, y el fragmento amplificado se escinde con Hindlll y Ncol. Estos fragmentos se ligaron a pBLES100 escindido con Hindlll y BamHl. Por lo tanto, se obtiene un vector de expresion de flagelina pBLES-F1iC en el que el gen de flagelina de salmonela ("flagelina" en la FIG. 2) se incorpora aguas abajo del gen promotor HU ("hupP" en la FIG. 2). FIG. 2 muestra este vector de expresion pBLES-F1iC. El vector de expresion de flagelina asf obtenida se utiliza para la transformacion de las bacterias intestinales.

Para la expresion secretora fuera de la celula del microorganismo, un vector se puede usar que se realiza mediante la incorporacion de fragmentos para el gen de secrecion del peptido senal y para el gen de flagelina (gen F1iC) en marco en el plasmido pBLES100. Mas especfficamente, el fragmento del gen de flagelina que se prepara mediante la amplificacion por PCR se realiza usando ADN cromosomico de S. typhimurium como una plantilla con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que tiene el sitio de escision Ncol y la secuencia de la SEQ ID NO: 2 que tiene el sitio de escision BamHI como un par de cebadores, y el fragmento amplificado se escinde con Ncol y BamHI. El fragmento de gen del peptido senal de secrecion se prepara por que la amplificacion por PCR se realiza usando ADN cromosomico de B. bifidum como una plantilla con un cebador de SEQ ED 15 NO: 11 que tiene el sitio Hindlll y un cebador de SEQ ID NO: 12 que tiene el sitio Ncol como un par de cebadores, y el fragmento amplificado se escinde con Hindlll y Ncol. Estos fragmentos se combinan con pBLES 100 escindido con BamHI y Hindlll. Por lo tanto, un vector de expresion secretora de flagelina pBLESSP-FliC se obtiene en el que el gen de flagelina de salmonela se incorpora aguas abajo del fragmento de gen del peptido senal de secrecion. El vector de expresion de flagelina asf obtenida se utiliza para la transformacion de las bacterias intestinales.

3. Preparacion de microorganismo transformado de expresion de flagelina

No hay ninguna limitacion particular en el microorganismo huesped en el que la flagelina se expresa, siempre y cuando la bacteria es viable en el intestino grueso y el intestino delgado de seres humanos o animales (bacteria intestinal). Cuando la bacteria huesped crece en el intestino, se expresa la flagelina. La flagelina expresada ejerce la antigenicidad, por el cual se induce un anticuerpo. Cualquier bacteria viable en el intestino (es decir, las bacterias intestinales), comunmente llamados bacterias buenas, tales como bifidobacterias o bacterias del acido lactico pueden utilizarse favorablemente.

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Los ejemplos preferibles del microorganismo incluyen microorganismos pertenecientes al genero Bifidobacterium, el genero Lactobacillus, el genero Lactococcus, el genero Pediococcus, el genero Streptococcus, el genero Enterococcus, el genero Leuconostoc, el genero Tetragenococcus, el genero Oenococcus, y el genero Weisseilla (tambien denominados colectivamente como "bacterias del acido lactico").

Los ejemplos de los microorganismos que pertenecen al genero Bifidobacterium (tambien referidos colectivamente como "bifidobacteria") incluyen Bifidobacterium adolescents, B. angulatum, B. animalis subsp. animalis, B. animalis subsp. lactis, B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. globosum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. parvulorum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum subsp. globosum, B. pseudolongum subsp. pseudolongum, B. puilorum, B. ruminale, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii B. subtile, B. suis, B. thermacidophilum, y B. thermophilum.

De estos, Bifidobacterium adolescents, B. animalis subsp. animalis, B. animalis subsp. lactis, B. bifidum, B. breve, B. lactis, B. longum, y B. pseudolongum. subsp pseudolongum se utilizan preferentemente.

Los ejemplos de los microorganismos que pertenecen al genero Lactobacillus incluyen Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. animalis, L. brevis, L. brevis subsp. gravesensis, L. L. buchneri, L. bulgaricus, L. casei, L. casei subsp. casei, L. casei subsp. plantarum, L. casei subsp. tolerans, L. cellobiosus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. divergens, L. fermentum, L. fructosus, L. gasseri L. hilgardii L. kefir, L. leichmannii L. paracasei, L. paracasei subsp. paracasei, L. pentosus, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L., L. sakei, L. sakei subsp. sakei, L. sanfrancisco, L. vaccinostrcus, Lactobacillus sp.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Lactococcus incluyen Lactococcus garvieae, L. lactis, L. lactis subsp. hordniae, L. lactis subsp. lactis, L. piantarum, y L. raffinolactis.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Pediococcus incluyen Pediococcus pentosaceus y P. acidilactici.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Streptococcus incluyen Streptococcus bovis, S. cremoris, S. faecalis, S. lactis, S. pyogenes y S. thermophilus.

Ejemplos de los microorganismos pertenecientes al genero Enterococcus incluyen Enterococcus casseliflavus y E. faecalis.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Leuconostoc incluyen Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, L. mesenteroides subsp. mesenteroides y L. mesenteroides subsp. dextranicum.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Tetragenococcus incluyen Tetragenococcus halophilus y T muriaticus.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Oenococcus incluyen Oenococcus oeni.

Ejemplos de microorganismos pertenecientes al genero Weissella incluyen Weissella viridescens.

No hay ninguna limitacion particular sobre el metodo para introducir un vector de expresion de flagelina en bacterias intestinales, y metodos comunmente utilizados por los expertos en la tecnica pueden utilizarse. Ejemplos de los mismos incluyen metodos de electroporacion; Fosfato de calcio; lipofeccion; el uso de iones de calcio; protoplasto; y similares. La electroporacion se usa preferiblemente. La electroporacion se puede realizar en 0,5 a 20 kV / cm y 0,5 psec a 10 mseg, mas preferiblemente de 2 a 10 kV / cm y 50 psec a 5 mseg.

Una cepa transformada se selecciona con un marcador seleccionable contenido en el vector de expresion de flagelina. Un medio para el cultivo de la cepa transformada puede ser cualquier medio adecuado para el microorganismo huesped. Ejemplos del medio incluyen el medio de agar de hfgado en la sangre (BL), de medio de agar de Man-Rogosa-Sharpe (MRS), medio de agar de medio anaerobio Gifu (GAM), medio de agar de la mejora de GAM (TGAM), un medio de agar Briggs y medio de agar de peptona de glucosa de levadura (YGP). Para la presion de seleccion, los antibioticos pueden anadirse al medio, o los aminoacidos pueden ser de suprimir o anadir al medio, dependiendo del marcador seleccionable.

La expresion de flagelina en un microorganismo transformado puede ser confirmado, por ejemplo, usando la transferencia de Western. La expresion de flagelina puede ser confirmado por que: En primer lugar, el microorganismo transformado se lisaron, por ejemplo, usando un tensioactivo no ionico,mincluyendo ester de sorbitan polioxietileno (Tween (marca registrada) 20, 40, 60, 65, 80, 85), y ester de sorbitan (Span (marca registrada) 20, 40, 60, 65, 80, 85), y similares; despues se diluyo con tampon fosfato, tampon de citrato, tampon de borato, tampon de tris(hidroximetil)aminometano (Ts)-hidroclorida, o similares; luego se sometio a electroforesis con gel de

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dodecilsulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE), tris-glicina-gel de poliacrilamida, o similares; despues se transfirio a la membrana de nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVF) de la membrana, o similares; y luego se hace reaccionar con un anticuerpo (inmunoglobulina G (IgG)) contra flagelina, y reaccionar adicionalmente con un anticuerpo secundario con un marcador fluorescente. Para la expresion secretora de flagelina por un microorganismo transformado, que puede ser confirmado con posterioridad a la seleccion para la cepa transformada, un sobrenadante se obtiene a traves de la separacion centrffuga y sometidos a Western Blot como descrito arriba.

El microorganismo transformado en que la expresion de flagelina se ha confirmado se puede cultivar, se recupero, y se utilizo directamente para la produccion de una formulacion, utilizando cualquier metodo comunmente utilizado por aquellos expertos en la tecnica. Alternativamente, el microorganismo transformado puede utilizarse en una forma seca. El microorganismo transformado puede ser secado por el tratamiento en el que se realiza un tratamiento a baja temperatura, tales como liofilizacion o secado a baja temperatura, de modo que el microorganismo puede crecer cuando se expone a condiciones de crecimiento tales como los de un medio intestinalo o un medio.

4. La produccion de una formulacion de capsula resistente a los acidos que contiene el microorganismo transformado.

Con el fin de permitir que el microorganismo transformado que expresa una protefna de flagelina para actuar como una vacuna oral, el microorganismo transformado tiene que pasar a traves del estomago, alcanzar el intestino, y crecer en el. Sin embargo, bacterias intestinales ingeridas mayoritariamente por via oral, tales como bacterias del acido lactico, mueren debido a pH en el estomago significativamente bajo, el pH de 1 a 3. Por lo general, se dice que la relacion de las bacterias intestinales que alcanzan el intestino manteniendo al mismo tiempo su capacidad para proliferar es un 10000° o menos de la cantidad de bacterias administradas. En consecuencia, con el fin de utilizar el microorganismo transformado segun la presente invencion, es necesario evitar que el microorganismo transformado se vea afectado por el acido gastrico de modo que el microorganismo transformado puede alcanzar el intestino humano vivo y crecer en el intestino para expresar flagelina.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona una formulacion en capsula que el microorganismo transformado se encapsula con o envuelto en una membrana de la capsula resistente a los acidos, en la otra palabra, el farmaceutico esta en forma de una formulacion de capsula en la que el microorganismo transformado esta contenido dentro de una capsula que tiene una membrana resistente a los acidos. No hay ninguna limitacion particular sobre la configuracion, la forma, o similares de la formulacion de la capsula, siempre y cuando la membrana es resistente al acido gastrico. Especfficamente, la configuracion es deseable que evita que el acido gastrico penetre en la capsula y en contacto con el microorganismo transformado. La membrana de la capsula puede ser una membrana insoluble a un pH de 4 o inferior, preferiblemente a un pH de 1 a 3. No hay ninguna limitacion particular sobre el metodo para la encapsulacion.

Formulacion de capsula sin costuras

La capsula para proporcionar con resistencia al acido gastrico puede estar preferiblemente en la forma de una capsula sin costuras. En este documento, la "capsula sin costuras" se refiere a un tipo de capsula blanda en la que los contenidos se envuelve en una membrana sin costuras. La capsula sin costuras puede tener una estructura de multiples capas que consta de dos o mas capas, y preferiblemente tiene una estructura de multiples capas que consta de tres o mas capas. Tfpicamente, una capa mas interna puede contener los contenidos (siendo el microorganismo transformado en el caso de la presente invencion), y una capa externa (o la capa mas externa) puede actuar como membrana. Especfficamente, el microorganismo transformado se encapsula con la membrana.

En lo sucesivo, la preparacion de una formulacion de capsula transparente de tres capas se describira. FIG. 3 es una vista esquematica en una vista de seccion transversal de una formulacion de capsula transparente de tres capas. Esta estructura de tres capas consiste en una capa mas interna, una capa intermedia que cubre la capa interna, y una capa externa que cubre la capa intermedia.

La capa mas interna incluye el microorganismo transformado y un disolvente no acuoso o componente solido para suspender o mezclar el microorganismo transformado (en lo sucesivo, componente que se conoce como una "sustancia capa mas interna"). No hay ninguna limitacion particular sobre la sustancia capa mas interna. Ejemplos de los mismos incluyen diversas grasas y aceites, acidos grasos, esteres de acidos grasos de azucares, hidrocarburos alifaticos, hidrocarburos aromaticos, eteres lineales, esteres de acidos grasos superiores, alcoholes superiores, y terpenos. Ejemplos especfficos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, aceite de soja, aceite de sesamo, aceite de palma, aceite de almendra de palma, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de coco, aceite de colza, manteca de cacao, sebo de vaca, manteca de cerdo, caballos de aceite, aceite de ballena, la grasa y los aceites de estas grasas naturales y los aceites tienen un punto de fusion de 40 ° C o menos, margarina, manteca hidrogenada, esteres de glicerina de acidos grasos, esteres de acidos grasos de sacarosa, aceites de alcanfor, el aceite de menta, a-pinene, D-limoneno, y similares. Estas sustancias de capa mas interna se pueden utilizar solas o en una combinacion de dos o mas.

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Un material utilizado para la capa intermedia es, entre las sustancias de capa mas interna enumeradas anteriormente, un material que tiene un punto de fusion de 20 ° C a 50 ° C y diferente de la sustancia de capa mas interna, mas preferiblemente un material que se encuentra en estado solido a temperatura ambiente. Como, en los ejemplos expuestos a continuacion, aceite de palmiste de hidrogenado que tiene un punto de fusion de 34 ° C y el aceite de almendra de palma hidrogenado que tiene un punto de fusion de 43 ° C se utilizan como la sustancia de capa mas interna y el material de capa interior, respectivamente, las mismas especies de grasa y aceites se pueden utilizar como la sustancia de capa mas interna y el material de capa interior, que se sometio a hidrogenacion a fin de tener diferentes puntos de fusion. Esta capa intermedia puede actuar como la prevencion de la permeacion de agua y oxfgeno y la prevencion de contacto con acido gastrico. El material a ser seleccionado puede ser determinado en consideracion de la duracion del almacenamiento de la capsula y similares.

Un material utilizado para la capa exterior (siendo la capa mas externa en el caso de una estructura que tiene tres o mas capas) puede ser una mezcla de una protefna y un alcohol polihfdrico soluble en agua; una mezcla de una protefna, un alcohol polivalente soluble en agua, y un polisacarido; una mezcla de un polisacarido y un alcohol polivalente soluble en agua; o similar. Los ejemplos de la protefna incluyen gelatina y colageno. Ejemplos del alcohol polivalente soluble en agua incluyen sorbitol, manitol, glicerina, propilenglicol, y polietilenglicol. Ejemplos de polisacarido incluyen agar, goma de gelano, goma de xantano, goma de algarroba, pectina, alginato, carragenina, goma arabe, dextrina, dextrina modificado, almidon, almidon modificado, pululano, pectina, y la sal de carboximetilcelulosa. En el caso en que se utiliza pectina, alginato, goma de gelano, o carragenina, una sal de metal alcalino o una sal de metal alcalino-terreo se pueden anadir segun sea apropiado.

La formulacion de capsula transparente de tres capas se prepara utilizando cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica, tales como el metodo de goteo utilizando una boquilla triple descrito en la patente japonesa n° 1398836. En este metodo de goteo, la sustancia de capa mas interna combina con el microorganismo transformado (por ejemplo, se seco por congelacion las celulas del microorganismo), que es preferiblemente una suspension del microorganismo transformado (preferiblemente, las celulas liofilizadas de microorganismo) en un material disolvente hidrofobo que es no fluido a de 20 a 50 ° C, desde la boquilla mas interna de la boquilla triple concentrica, un material formador de capa intermedia (por ejemplo, un lfquido obtenido por la fusion de un material en la forma de un solido a temperatura ambiente) de la boquilla intermedia y una solucion de un material que forma la capa exterior (membrana) de la boquilla mas externa se expulsan de forma simultanea, y se dejo caer en un lfquido portador (por ejemplo, aceite de mafz, aceite de colza, o similares), que fluye bajo enfriamiento, formando asf una capsula "sin costuras" de tres capas en el microorganismo transformado esta contenido en la capa mas interna. En consecuencia, el microorganismo transformado se encapsula con o envuelto en la membrana sin costuras.

La capsula formada de este modo se seca a continuacion. Por ejemplo, el secado se realiza por la ventilacion a temperatura ambiente. Tfpicamente, la capsula se seca, por ejemplo, en el aire a 5 ° C a 30 ° C. El tiempo de secado es preferiblemente de 2 a 12 horas. Como se describe en la Publicacion de Patente Japonesa abierta N° 07-069867, una capsula que se ha secado ordinariamente como se describe anteriormente puede ser sometido ademas, preferiblemente, al vacfo o liofilizacion al vacfo. El grado de vacfo se puede mantener en 0,5 a 0,02 torr. La capsula puede ser congelado y se seco a -20 ° C o inferior en el caso de secado por congelacion al vacfo. No hay ninguna limitacion particular sobre el tiempo de secado al vacfo o secado por congelacion al vacfo, pero es tfpicamente de 5 a 60 horas, preferiblemente de 24 a 48 horas. Si el tiempo es mas corto que 5 horas, el secado es insuficiente y el agua presente en la capsula puede afectar negativamente el contenido.

En el caso de una capsula obtenida usando el metodo descrito en la Publicacion de Patente Japonesa Abierta N° 07069867, el agua se elimina suficientemente de la capsula mediante secado por congelacion al vacfo, y, por tanto, el valor Aw puede ser de 0,20 o menos, y la conductividad de calor puede ser 0,16 kcallmh ° C o menos. Por secado al vacfo o secado por congelacion al vacfo, la cantidad de agua se reduce, naturalmente, mientras que la capsula esta suficientemente seca y se vuelve porosa. Por lo tanto, la conductividad termica es significativamente menor que en el caso en que se realiza simplemente por secado ordinario.

El valor Aw no se refiere a un contenido absoluto de agua presente en la muestra, pero a un valor determinado por el estado en el que el agua esta presente, es decir, los grados de libertad para el agua en la muestra. El valor Aw es un indicador que indica el agua que puede afectar directamente a la reaccion qufmica o el crecimiento de microorganismos, y se mide utilizando un metodo de medicion de la actividad de resistencia electrica de agua (por ejemplo, contador Aw WA-360, Shibaura Electronics Co., Ltd.). La conductividad termica se mide usando el metodo de Fitch o similar. El valor Aw es preferiblemente 0,20 o menos, y la conductividad termica es preferiblemente de 0,02 a 0,08 kcal/mh°C.

Con el fin de proporcionar a la membrana de la capsula de la formulacion de capsula transparente con resistencia a los acidos, se forma una capa externa resistente a los acidos o se trata la membrana (la capa mas externa) de la capsula transparente preparada de modo que sea resistente a los acidos.

Los ejemplos del metodo para la formacion de una capa externa resistente a los acidos incluyen la adicion de la pectina, alginato, goma arabe, o similares en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, preferiblemente de 0,1 a 10% en peso a la gelatina, agar, carragenano, o similares, que tiene una capacidad de gelificacion.

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Ejemplos del metodo para proporcionar la membrana (la capa mas externa) de la capsula sin costuras preparado con resistentencia a los acidos incluyen la reticulacion de la capa exterior (la capa mas externa) de la capsula transparente y revestimiento de la superficie de la capsula sin costura, que puede realizarse solo o en combinacion.

Para la reticulacion de la capa externa que contiene una protefna, la capsula transparente se prepara primero, y luego se lava suficientemente con agua y, a continuacion, se anade la capsula transparente lavado con agua a una solucion acuosa que contiene un agente de reticulacion. Por lo tanto, la superficie de la capa externa se somete a un tratamiento de reticulacion. Como agente de reticulacion, se pueden usar agentes de reticulacion conocidos convencionalmente. Ejemplos de agentes de reticulacion incluyen formaldehfdo, acetaldehfdo, propionaldehfdo, glioxal, glutaraldehfdo, cinamaldehfdo, vanilil aldehfdo, acetona, cetona de metil etil, oxido de etileno, oxido de propileno, el alumbre de potasio, y el alumbre de amonio. Tfpicamente, la capa exterior es tratada mediante la adicion de 1 parte en peso de la capsula sin costuras a 50 a 100 partes en peso de solucion acuosa que contiene 0,1 a 2 w/v%, preferiblemente de 0,5 a 2 w/v%, de un agente de reticulacion, y agitando la mezcla durante 10 a 300 segundos. Aquf, la cantidad de agente de reticulacion usado y el perfodo de tiempo para la accion variara dependiendo del tipo del agente de reticulacion. Despues de que la superficie de la membrana externa se someta al tratamiento de reticulacion, la membrana externa se lava suficientemente con agua para eliminar la solucion acuosa que contiene el agente de reticulacion, y el agua en la capa exterior se seca.

Para la reticulacion de la capa externa que contiene protefnas, la reticulacion se puede realizar a traves de tratamiento enzimatico con transglutaminasa. En este caso, la capa exterior es tratada mediante la adicion de 1 parte en peso de capsula transparente producida a 50 a 100 partes en peso de solucion acuosa que contiene 0,1 a 10 w / v%, preferiblemente de 0,5 a 2 w / v%, de enzima, y se agita la mezcla durante 1 a 300 minutos. El resultado se lava con agua y se seca como se ha descrito anteriormente.

Para el recubrimiento, despues de que la capsula transparente humedo producida se haya secado, la capsula transparente esta convencionalmente recubierta con goma laca, etilcelulosa, ropilmetilcelulosa hidroxipo, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, celulosa TC-5, acetato de vinil-vinilpirrolidona copolfmero, zefna, cera de etileno, o similares como el material de base, y aceite de ricino, aceite de colza, ftalato de dibutilo, polietilenglicol, glicerina, acido estearico, ester de acido graso, pairnitato de sorbitan, estearato de polioxietileno, monoglicerido acetilado, o similares como el plastificante.

La membrana de la capsula puede estar provista ademas de entericidad. De este modo, la capsula esta protegida de una solucion acida y similares (tal como el acido gastrico) en el estomago, y se desintegra en el intestino de manera que el microorganismo transformado se libera desde el interior de la capsula para efectuar suficientemente la produccion de antfgeno en el intestino. La membrana de la capsula puede estar provista de entericidad mediante la produccion de una capsula enterica como se practica comunmente por los expertos en la tecnica. Una mezcla de gelatina y pectina se puede utilizar como material de la capa exterior de la capsula sin costura para convertir la membrana en enterica. La capa externa resistente a los acidos esta provista ademas de entericidad mediante la preparacion mediante la adicion de pectina, alginato, goma arabe, o similares en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, preferiblemente de 0,1 a 10% en peso a la gelatina, agar, carragenina, o similares, que tiene una capacidad de gelificacion.

La formulacion de la capsula transparente puede estar en la forma de una esfera debida al metodo de produccion. El tamano medio de las partfculas de la capsula sin costura es de 0,3 a 10 mm, preferiblemente de 1,5 a 8,0 mm.

La formulacion de la capsula transparente obtenida de esta manera se puede almacenar durante seis meses o mas mientras se mantiene la actividad del microorganismo transformado a temperatura ambiente. Si la formulacion se almacena a 10°C o menos, el almacenamiento extendido durante un ano o mas es posible.

Formulacion de capsula blanda

Como en el caso de la formulacion en capsulas sin costura, una formulacion de capsula blanda puede ser la encapsulacion de una suspension del microorganismo transformado en un disolvente no acuoso (como el contenido de la capsula) con una lamina de membrana. El material de la lamina de membrana es como se ha mencionado para la capa exterior de la capsula sin costuras.

Una formulacion de capsula blanda se puede preparar usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, como se describe en la patente japonesa n° 2999535. Por ejemplo, usando una matriz rotativa, mientras que los contenidos se inyectan, y se llenan, la lamina de membrana se calienta a traves de la matriz, con el fin de envolver y encapsular los contenidos. Para la accion de liberar el microorganismo transformado en el intestino, un aceite, que es una agente liberador, se elimina de la capsula blanda resultante a traves de un lavado con un disolvente polar (por ejemplo, metanol, etanol, propanol o isopropanol). Posteriormente, la capsula puede hacerse resistente a los acidos mediante la realizacion de un tratamiento de reticulacion y el tratamiento de recubrimiento en combinacion, o la realizacion de uno cualquiera de los tratamientos, como en el caso de la capsula sin costuras.

La lamina de membrana resistente a los acidos puede prepararse tambien sobre la base de cualquiera de los

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metodos conocidos tales como mediante la adicion de pectina, alginato, goma arabe, o similares en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, preferiblemente de 0,1 a 10% en peso a la gelatina, agar, carragenano, o similar, que tiene una capacidad gelificante. Alternativamente, la lamina de membrana se puede hacer resistente a los acidos, al realizar el tratamiento de reticulacion y el tratamiento de recubrimiento en combinacion, o la realizacion de uno cualquiera de los tratamientos. La lamina de membrana resistente a los acidos asf obtenido puede ser utilizado para producir una formulacion de capsula blanda en la que el microorganismo transformado se encapsula con la membrana resistente a los acidos. Por ejemplo, a partir de la lamina obtenida de membrana resistente a los acidos se obtiene la forma de una capsula, los contenidos se introducen en la capsula, y luego una costura de la capsula se funde y se unen con el fin de envolver los contenidos, utilizando tecnicas conocidas.

La formulacion de capsula blanda puede estar en la forma de una esfera, una elipse, o un rectangulo. La capsula blanda tiene preferiblemente un eje mayor de 3 a 16 mm y un eje menor de 2 a 10 mm, y mas preferiblemente tiene un eje mayor de 5 a 7 mm y un eje menor de 2 a 3 mm.

La formulacion de capsula blanda obtenida de esta manera se puede almacenar durante seis meses o mas mientras se mantiene la actividad del microorganismo transformado a temperatura ambiente. Si la formulacion se almacena a 10 ° C o menos, un almacenamiento prolongado por un ano o mas es posible.

Formulacion de capsula dura

Una formulacion de capsula dura puede producirse al moldear una membrana de la capsula en un cuerpo y una tapa de antemano, llenando el cuerpo de la capsula con el contenido, y la combinacion de la resultante con la tapa de la capsula.

Ejemplos del material de la membrana de la formulacion de capsula dura incluyen gelatina, celulosa, pululano, carragenano, y derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa. La capsula dura se puede moldear usando cualquiera de los metodos comunmente utilizados por los expertos en la tecnica. La capsula moldeada puede consistir en capsulas disponibles comercialmente. El contenido puede abarcarse y envolverse en la membrana.

Los contenidos pueden ser una mezcla obtenida por mezclado suficiente del microorganismo transformado con un vehfculo (por ejemplo, anhfdrido silfcico, silicato de aluminio sintetico, lactosa, almidon de mafz, o celulosa cristalina), o polvos que contienen polvos secos del microorganismo transformado.

Despues de que los contenidos se almacenen en la capsula, la membrana de la capsula puede estar recubierta. Para este recubrimiento, los materiales y los metodos que se han mencionado para la capa exterior de la capsula sin costuras pueden aplicarse para proporcionar la membrana con resistencia a los acidos y preferiblemente desintegratividad en el intestino (entericidad). Este recubrimiento tambien permite que la membrana de la capsula pueda sellarse a fin de encapsular el contenido.

La lamina de membrana resistente a los acidos tambien puede prepararse en base a cualquiera de los metodos conocidos, tales como a traves de la adicion de pectina, alginato, goma arabe, o similares en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, preferiblemente de 0,1 a 10% en peso a la gelatina, agar , carragenano, o similar, que tiene una capacidad de gelificacion. Alternativamente, la lamina de membrana se puede hacer resistente a los acidos, al realizar el tratamiento de reticulacion y el tratamiento de recubrimiento en combinacion, o la realizacion de uno cualquiera de los tratamientos. La lamina de membrana resistente a los acidos obtenida de este modo puede ser utilizada para producir una formulacion de capsula dura en la que el microorganismo transformado esta encapsulado por la membrana resistente a los acidos. Por ejemplo, a partir de la lamina obtenida de membrana resistente a los acidos se obtiene la forma de una capsula dura, los contenidos se introducen en la capsula dura formada, y luego una costura de la capsula se funde y se une con el fin de envolver los contenidos, utilizando una tecnica conocida.

La formulacion capsula dura asf obtenida puede almacenarse durante seis meses o mas, mientras que se mantenga la actividad del microorganismo transformado a temperatura ambiente. Si la formulacion se almacena a 10 ° C o menos, el almacenamiento extendido durante un ano o mas es posible.

5. Vacuna Oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana

Despues de la administracion oral, la formulacion de capsula resistente a los acidos (la formulacion en capsulas sin costura, la formulacion en capsula blanda, y la formulacion en capsula dura) obtenida como se explica en la Seccion 4 que se describe anteriormente pasa a traves del estomago, teniendo un pH de 1 a 3, alcanza el intestino y, a continuacion, se desintegra en el intestino. El microorganismo transformado se libera a traves de la desintegracion de la formulacion, crece, produce, y preferiblemente segrega flagelina fuera de la celula del microorganismo en un entorno intestinal. La flagelina entonces es reconocido como un antfgeno para producir un anticuerpo. Por consiguiente, la formulacion de capsula resistente al acido puede ser una vacuna oral eficaz contra un microorganismo que tiene la flagelina.

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Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invencion se describira a modo de ejemplos, pero la presente invencion no se limita a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Preparacion de la formulacion de la capsula resistente a los acidos que contiene antfgeno de fiebre tifoidea que produce bifidobacteria

A. La amplificacion del gen de flagelina S. Typhimurium a traves de PCR.

S. typhimurium ATCC 14028 se cultivo en el medio LB (fabricado por Invitrogen) a 37 ° C durante 12 horas. Despues de finalizado el cultivo, el ADN genomico fue extrafdo convencionalmente a partir de S. typhimurium. El ADN genomico extrafdo se amplifico usando un kit para la reaccion de PCR (fabricado por Applied Biosystems) con polimerasa de ADN Ampli Taq (0,5 unidades) de acuerdo con la instruccion. Como par de cebadores, se utilizaron los siguientes: SEQ ID NO: 1 (hacia delante): 5'-CATGCCATGGATGGCACAGTCATTAATACA-3' (CCATGG en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision Ncol), y SEQ ID No: 2 (inversa): 5'- CGCGGATCCTTAACGCAGTAAAGAGAGGAC-3' (GATCCT en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision BamHI). El PCR se realizo usando 40 pL de lfquido de reaccion que contiene 125 ng de plantilla de ADN, 0,5 pmol de cada cebador, 2,5 unidades de Pfu de polimerasa ADN, 4 pL de x10 de solucion de tampon para el la polimerasa de ADN Pfu, y 200 pmol de cada dNTP, bajo 30 ciclos a 94 ° C durante 1 minuto, a 55 ° C durante 1 minuto, y a 72 ° C durante 1 minuto, y luego a 72 ° C durante 10 minutos. Despues de la finalizacion de la PCR, el producto resultante se escindio con NcoI y BamHI. Por lo tanto, el fragmento de gen de flagelina se preparo.

B. La amplificacion del promotor HU a traves de PCR

B. La cepa longum ATCC 15703 fue cultivada en medio MRS (fabricado por Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) a 37 ° C durante 12 horas. Despues de finalizado el cultivo, el ADN genomico fue extrafdo convencionalmente a partir de B. longum. El PCR se realizo como se describio en la Seccion A anterior. Como par de cebadores, se utilizaron los siguientes: SEQ ID No: 7 (hacia delante): 5'-CGCCAAGCTTTGGGCGCGGCGGCCATGAAG-3' (AAGCTT en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision HindIII), y SEQ ID NO: 8 (inversa): 5'- CGCGCCATGGAAAGCATCCTTCTTGGGTCA-3' (CCATGG en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision NcoI). Despues de la finalizacion del PCR, el producto resultante se escindio con HindIII y NcoI. De este modo, el fragmento para el gen promotor HU se preparo.

C. Preparacion del vector de expresion

El plasmido pBLES100 se escindio con BamHI y Hindili, y se combino con y se ligo al fragmento de gen de flagelina de salmonela preparado en la Seccion A como se describe anteriormente y el fragmento de gen promotor HU preparado en la Seccion B descrita anteriormente. Asf, se obtuvo un vector de expresion pBLES-F1iC.

D. Introduccion del vector de expresion en B. Animalis

B. animalis ATCC 27536 se inoculo en el medio MRS, y se cultivo hasta la fase de crecimiento semilogarftmica manteniendose en pie a 37 ° C durante 12 horas bajo la atmosfera de nitrogeno que contiene 10% de carbono dioxido. El cultivo resultante se centrifugo, y se recogieron las celulas del microorganismo y se lavo tres veces con PBS (obtenido diluyendo 8 g de cloruro sodico, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de hidrogeno fosfato disodico, y 0,24 g de dihidrogeno fosfato de potasio con 1 L de agua destilada, y ajustando el pH a 7,4). A continuacion, se anadio PBS a 5x108 celulas / mL con el fin de obtener una suspension de B. animalis. Entonces, 5 pL (1 pg de ADN / 5 pL) de pBLES-F1iC preparado en la Seccion C descrito anteriormente se anadio a 50 pL de esta suspension, y el resultante se coloca en una cubeta de electroporacion 0,2 cm de anchura y se trato en las condiciones de 5 ps, 1.000 V para la transformacion.

El cultivo se realiza en un espectinomicina (50 pg / ml) que contienen medio de agar BL (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd) a 37 ° C bajo la atmosfera de nitrogeno que contiene dioxido de carbono 10%. Asf, se obtuvo B. animalis transformado.

E. Western Blotting

Se exprese o no el B. animalis transformado una protefna de flagelina se confirmo como sigue. B Animalis se diluyo con un tampon de fosfato (pH 6,8) que contiene 1 w / v% de Tween (marca registrada) 80 y una solucion de tampon A (126 clorhidrato mM Tris, 20 w / v% de glicerina, 4 w / v% de dodecilsulfato de sodio, 1,0 w / v% 2-mercaptoetanol, 0,05 w / v% azul de bromofenol, pH 6,8). Entonces, 5 pg del resultante se sometio a electroforesis (gel de glicina de poliacrilamida-tris), y despues se sometio a electrotransferencia para transferir protefnas resueltas a una membrana de nitrocelulosa, y luego se sometio a ELISA con IgG1 (fabricado por ViroStat) especffico para flagelina comun a especies de Salmonella y de anticuerpo secundario de peroxidasa de rabano picante de etiqueta (HRP) (1: 500). Por lo tanto, se confirmo la expresion de flagelina.

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F. Preparacion de polvo de microorganismo liofilizado del microorganismo transformado

En primer lugar, 2 bucles de platino de las transformadas B. animalis se inocularon en 1 L de medio MRS (fabricado por Nippon Becto Dickinson Company, Ltd.) que contiene 50 pM de espectinomicina, y se cultivaron a 37 ° C durante 18 horas con la inyeccion de gas de nitrogeno que contiene el dioxido de carbono 10%. El pH se ajusto a 5,5 con 10M de solucion acuosa de hidroxido de sodio por un ajustador de pH automatico para evitar la disminucion del pH durante el cultivo. Despues del cultivo, durante 15 horas, las celulas se diluyeron apropiadamente con un diluyente anaerobico, aplicado al medio de agar de BL que contiene 50 pm de espectinomicina y se contaron para el numero de celulas viables de las colonias. Aquf, el diluyente anaerobico se obtuvo por disolucion de 6,0 g de fosfato de hidrogeno disodico, 4,5 g de fosfato de dihidrogeno de potasio, 0,5 g de monohidroquiorida L-cistefna, 0,5 g de Tween (marca registrada) 80, y 1,0 g de agar en 1 L de agua destilada y esterilizando a vapor el resultante a 121 ° C durante 15 minutos.

Despues del cultivo, las celulas se recogieron por separacion centrffuga (15.000 xg, 20 minutos), y a las celulas, se anadieron 120 g de agua destilada, 12 g de citrato de sodio y 8 g de malato de sodio para obtener una suspension de las celulas. Despues, se anadieron 8 g de Avicel FD-101 (fabricado por Asahi Kasei Corporation) a esta suspension, y el resultante se agito suficientemente, se congelo, y despues se seco en un vacfo. Posteriormente, se anadio dextrina en una. cantidad dos veces mas que los polvos obtenidos. Por lo tanto, los polvos de celulas de microorganismos liofilizados se obtuvieron.

G. Preparacion de formulacion de capsulas acido-resistentes

Como se describe a continuacion, la formulacion en capsulas sin costuras resistente a los acidos que contiene celulas de microorganismo transformado se preparo usando un aparato de produccion de capsula provista de una boquilla triple coaxial.

En primer lugar, se fundio 400 g de aceite endurecido (aceite de almendra de palma hidrogenado que tiene un punto de fusion de 34 ° C) y 100 g de los polvos de celulas de microorganismos liofilizados obtenidos en la seccion F que se ha descrito anteriormente despues se disperso en el mismo. Como se describe a continuacion, la formulacion en capsulas sin costuras resistente a los acidos que contiene las celulas microorganismo transformado se preparo usando un aparato de produccion de capsula provista de una boquilla coaxial triple. En primer lugar, se fundio 400 g de aceite endurecido (aceite de almendra de palma hidrogenado que tiene un punto de fusion de 34 ° C) y 100 g de los polvos de celulas de microorganismos liofilizados obtenidos en la seccion F se ha descrito anteriormente despues se dispersa en el mismo. Esta dispersion de la boquilla mas interna de la boquilla triple concentrica, un aceite endurecido fundido (aceite de almendra de hidrogenado de palma de tener un punto de fusion de 43 ° C) de la boquilla intermedia situada en el lado exterior de la boquilla mas interna, y una solucion de gelatina (obtenida disolviendo 600 g de gelatina, 300 g de glicerina y 100 g de pectina en 4 kg de agua purificada) de la boquilla mas externa expulsada simultaneamente, y goteo en aceite de colza, que fluye bajo enfriamiento a 15 ° C, formando de ese modo una formulacion en la que las celulas de microorganismos transformadas se encapsula en una capsula transparente de tres capas con un diametro de 2,5 mm. Esta formulacion de capsulas se seco por la ventilacion a 20 ° C durante 10 horas, y luego se seco en vacfo a temperatura ambiente. Por lo tanto, el valor de la actividad del agua Aw se redujo a 0,20 o menos y la conductividad de calor se redujo a 0,16 kmal/mh ° C o menos en la capsula.

H. Preparacion de formulacion de capsula blanda resistente a los acidos

En primer lugar, 50 g de polvos de celulas de microorganismos liofilizados obtenidos en Seccion F descritos anteriormente se suspendieron en 300 g de aceite de colza para preparar un contenido de fluido de una capsula blanda. Despues, se anadieron 400 g de gelatina y 100 g de glicerina a 200 g de agua destilada, se agito a 60 ° C, y se disolvio, y el resultante se conforma en una hoja, obteniendo de ese modo una membrana de gelatina, que se uso como la membrana de la capsula blanda. Las membranas de gelatina se envfan a un espacio entre un par de troqueles de cilfndrica giratoria, y el contenido de fluido fue expulsado a un espacio entre las membranas de gelatina por una bomba que se mueve en relacion con los troqueles, formando con ello la encapsulacion.

A continuacion, se colocaron 400 g de los encapsulados en un granulador de rodadura, y una solucion obtenida disolviendo 10 g de goma laca y 1 g de aceite de ricino en 400 g de licor mezclado de metanol-acetato de etilo (1:1, v/v) se pulverizo sobre toda la superficie de las capsulas blandas a un espesor de la membrana de recubrimiento de 0,3 mm. De este modo, se obtuvo que 400 g de formulaciones de capsula blanda que tiene un eje mayor de 4 mm y un eje menor de 3 mm, encapsulando las celulas de microorganismo transformado, y que tiene un revestimiento resistente a los acidos.

I. Preparacion de formulacion capsula dura acido-resistentes

Los polvos de celulas de microorganismos liofilizados obtenidos en la Seccion F descritos anteriormente se utilizan como el contenido de una capsula dura. Para la membrana de la capsula dura, una capsula comercialmente disponible de N° 5 como se definio en la Farmacopea Japonesa se utilizo. Los contenidos se llenaron con el cuerpo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de la capsula, y se combinan con la tapa de la capsula, formando asf la encapsulacion.

A continuacion, se colocaron 100 g de los encapsulados en un granulador de rodadura, y una solucion obtenida disolviendo 10 g de goma laca y 1 g de aceite de ricino en 400 g de acetato de licor mezclado de metanol-acetato (1 1, v / v) era pulveriza sobre toda la superficie de las capsulas duras a un revestimiento de espesor de la membrana de 0,3 mm. Por lo tanto, 100 g de formulaciones de capsula dura que encapsulan los microorganismos de celulas transformadas y que tienen un revestimiento resistente a los acidos.

Ejemplo 2: Preparacion de la formulacion de la capsula resistente al acido que contiene bacterias productoras de antfgeno de colera de acido lactico

V. cholerae ATCC 11628, que produce un antfgeno del colera, se cultivo en un medio LB a 37 ° C durante 12 horas. Despues de la complecion del cultivo, el ADN genomico fue convencionalmente extrafdo a partir de V cholerae. El PCR se realizo como en el Ejemplo 1, utilizando el ADN genomico extrafdo como una plantilla con las secuencias de SEQ ID NO: 3 (hacia adelante) y SEQ. ID NO: 4 (inversa) como un par de cebadores. El fragmento amplificado resultante se recupero y se escindio con Ncol y BamHI. Por lo tanto, el fragmento de gen de flagelina de colera se preparo. Los pBLES-FliC preparo en el Ejemplo 1 se digirio con Ncol y BamHI, y un fragmento grande se recupero. Este fragmento y el fragmento de gen de flagelina de colera se ligaron entre sf. De este modo, se obtuvo una colera que expresa el antfgeno de expresion de vector pBLES-Vc.

El vector de expresion de flagelina de colera pBLESVc obtenido se uso para transformar Lb. plantarum ATCC BAA- 793 a preparar un Lb. plantarum que produce el antfgeno de colera. La expresion del antfgeno del colera se confirmo por ELISA usando la respuesta de anticuerpos de antfgeno tal como se explica en la Seccion E del Ejemplo 1.

El Lb. Plantarum en que se utilizo la expresion de la protefna de flagelina de colera se confirmo para preparar un polvo de celula de microorganismo liofilizado como en la seccion F del Ejemplo 1, y una formulacion de capsula sin costuras y una formulacion de capsula blanda y una formulacion de capsula dura, cada una de las cuales contiene los polvos de celulas de microorganismos liofilizados, se prepararon, respectivamente, como en las secciones G, H, I y del Ejemplo 1. Las membranas de la formulacion de capsula transparente resultante, la formulacion de capsula blanda y formulacion de capsula dura eran resistentes a los acidos.

Ejemplo 3: Preparacion de la formulacion de la capsula resistente a los acidos que contienen antfgeno de disenterfa que produce bifidobacterias.

S. dysenteriae ATCC 29026, que produce un antfgeno de la disenterfa, se cultivo en medio LB a 37 ° C durante 12 horas. Despues de finalizado el cultivo, el ADN genomico fue convencionalmente extrafdo a partir de S. dysenteriae. El PCR se realizo como en el Ejemplo 1, utilizando el ADN genomico extrafdo como una plantilla con las secuencias de SEQ ID No: 5 (hacia adelante) y SEQ ID NO: 6 (inversa) como un par de cebadores. El fragmento amplificado resultante se recupero y se escindio con NcoI y BamHI. Por lo tanto, el fragmento de gen de flagelina de disenterfa se preparo. Los pBLES-F1iC preparados en el Ejemplo 1 se digirio con NcoI y BamHI, y un fragmento grande se recupero. Este fragmento y el fragmento de gen de flagelina de disenterfa se ligaron entre sf. De este modo, se obtuvo un vector pBLES-Sd de expression de antfgeno de disenterfa.

El vector de expresion de disenterfa de flagelina pBLES-Sd obtenido se uso para transformar B. longum ATCC 15697 para preparar un antfgeno de disenterfa que produce B. longum. La expresion del antfgeno de disenterfa se confirmo por ELISA, usando la respuesta de anticuerpos de antfgeno tal como se explica en la Seccion E del Ejemplo 1.

B. longum en el que la expresion de la protefna de flagelina de disenterfa se confirmo que se uso para preparar los polvos de celulas de microorganismos liofilizados como en la seccion F del Ejemplo 1, y una formulacion de capsula sin costuras, una formulacion de capsula blanda, y una formulacion de capsula dura, cada uno de los cuales contiene los polvos de celulas de microorganismos liofilizados, se prepararon, respectivamente, como en las secciones G, H, I y del Ejemplo 1. Las membranas de la formulacion de capsula sin costuras obtenida, formulacion de capsula blanda, y la formulacion de capsula dura eran resistentes de los acidos.

Ejemplo Comparativo 1

Una formulacion de capsula sin costuras se preparo como en el Ejemplo 1, salvo que la solucion de gelatina para la membrana de la seccion G del Ejemplo 1 se cambio a un material obtenido mediante la disolucion de 600 g de gelatina, 300 g de glicerina y 100 g de sorbitol en 4 kg de agua purificada. La membrana de la farmaceutica obtenida no era resistente a los acidos.

Ejemplo Comparativo 2

Una formulacion de capsula blanda se preparo como en el Ejemplo 1, salvo que el recubrimiento de la seccion H del Ejemplo 1 no se llevo a cabo en la preparacion de la capsula blanda. La membrana de la farmaceutica obtenida no

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10

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30

35

40

45

50

era resistente a los acidos.

Ejemplo Comparativo 3

Una formulacion de capsulas duras se preparo como en el Ejemplo 1, salvo que el recubrimiento de la Seccion I del Ejemplo 1 no se realizo en la preparacion de la capsula dura. La membrana de la farmaceutica obtenida no era resistente a los acidos.

Ejemplos Comparativos 4 a 6

En Ejemplos Comparativos 4 a 6, una formulacion de capsula sin costuras, una formulacion de capsula blanda, y una formulacion de capsula dura se prepararon, respectivamente, como se explica en los Ejemplos Comparativos 1 a 3, salvo que el microorganismo fue cambiado al microorganismo transformado de expresion de colera de flagelina como se explica en el Ejemplo 2. Las membranas de la formulacion de capsula sin costuras obtenida, formulacion de capsula blanda, y la formulacion de capsulas duras no eran resistentes a los acidos.

Ejemplos Comparativos 7 a 9

En los Ejemplos Comparativos 7 a 9, una formulacion de capsula sin costura, una formulacion de capsula blanda, y una formulacion de capsula dura se prepararon, respectivamente, como se explica en los Ejemplos Comparativos 1 a 3, excepto que el microorganismo se cambio a bacilo de la disenterfa de flagelina la que expresan microorganismo transformado preparado como se explico en el Ejemplo 3. Las membranas de la formulacion de capsulas sin costuras obtenida, formulacion de capsula blanda, y la formulacion de capsulas duras no eran resistentes a los acidos.

Ejemplo 4: El examen para la induccion de anticuerpos, resultando de la administracion de microorganismo transformado de fiebre tifoidea de protefna de flagelina (Recombinante B. animalis)

En primer lugar, ratones hembras BALB/c de 8 a 12 semanas de edad (proporcionado por Charles River Laboratories Japan, Inc.) se adquirieron durante una semana con una dieta estandar. Los ratones se dividieron en nueve grupos (de 5 a 7 ratones por grupo). Durante tres grupos, la formulacion de capsula sin costura, la formulacion de capsula blanda, y la formulacion capsula dura, que se prepararon en el Ejemplo 1, se administro por via oral por separado, cada uno de los cuales contenfa el microorganismo transformado de expresion de fiebre tifoidea de flagelina. Para otros tres grupos, la formulacion de capsulas sin costuras no resistentes a los acidos, la formulacion de capsulas blandas, y la formulacion de capsulas duras, que se prepararon en los Ejemplos Comparativos 1 a 3, respectivamente, se administra por via oral por separado, cada uno de los cuales contenfa el microorganismo transformado que expresa de fiebre tifoidea de flagelina. Para otro tres grupos, el microorganismo transformado de expresion de flagelina (recombinante B. animalis) celulas vivas, celulas vivas de huesped B. animalis, y un tampon de fosfato por separado, como controles. Estas formulaciones de capsula, celulas vivas, y similares se ingiere una vez al dfa durante tres semanas.

Despues de tres semanas, las cantidades de IgA en suero y heces se midieron como sigue. PBS que contiene antfgeno de la flagelina se anadio a una placa de 96 pocillos (Nunc Immunoplate Maxisorb F96, fabricado por Nalge Nunc Internacional K.K.), y se mantuvo a 4°C durante 16 horas para revestimiento de la superficie de la placa. Posteriormente, el PBS que contiene 1 w / v% de albumina de suero de bovino fue utilizada para el bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar tres veces con PBS, se anadio un anticuerpo secundario (IgA, IgG, IgM anti-raton derivado de cabra (fabricado por Santa Cruz Biotechnology, inc) y se incubo a temperatura ambiente durante tres horas. Despues de lavar con pBs tres veces, se anadio un anticuerpo terciario (isotiocianato de fluorescefna (FITC) marcado con IgG de anti-cabra derivado de conejo (fabricado por QED Bioscience, Inc.), y se incubaron a temperatura ambiente durante tres horas. La fluorescencia se midio usando FluoroscanII (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.). La Tabla 1 muestra los valores de fluorescencia resultantes.

Tabla 1

Muestra de administracion

Numero de BALB/c Dosis diaria 107 cfu/dfa IgA en heces (OD+Std. Error) IgA en suero (OD+Std. Error)

Ejemplo 1: capsula sin costuras

7 2,5 0,16+0,012 0,40+0,145

Ejemplo 1: capsula blanda

7 3,2 0,15+0,013 0,38+0,151

Ejemplo 1: capsula dura

7 3 0,14+0,014 0,37+0,120

Ejemplo comparativo 1: capsula sin costuras

5 2,5 0,05+0,011 0,16+0,038

Ejemplo comparativo 2: capsula blanda

5 3,2 0,06+0,010 0,16+0,041

Ejemplo comparativo 3: capsula dura

5 3 0,06+0,010 0,13+0,028

Celulas vivas de microorganismo transformado

5 2,5 0,04+0,012 0,11+0,041

Celulas vivas de microorganismo de huesped

5 12 0,02+0,008 0,10+0,038

Tampon de fosfato

5 - 0,02+0,006 0,14+0,032

Se observo que, en los casos de la capsula sin costuras resistente a los acidos, formulaciones de capsula blanda y de capsulas duras preparadas en el Ejemplo 1, independientemente de la forma de la formulacion de capsula resistente a los acidos, las cantidades de IgA eran mas grandes tanto en heces como en la sangre y el efecto de 5 inducir un anticuerpo fue mayor, en comparacion con los casos de las formulaciones de capsulas no resistentes a los acidos de los Ejemplos Comparativos 1 a 3 o de las celulas vivas.

Ejemplo 5: Examen para la induccion de anticuerpos resultantes de microorganismos transformados de administracion de colera de flagelina

10

La formulacion de capsulas sin costuras, la formulacion de capsula blanda, y la formulacion capsula dura, que se prepararon en el Ejemplo 2, y las formulaciones de capsulas de los Ejemplos Comparativos 4 a 6 se examinaron para la induccion de anticuerpos como en el Ejemplo 4, cada uno de los cuales contenfa el microorganismo transformado de colera de flagelina que expresan celulas (recombinante Lb. plantarum).

15

Ademas, las celulas vivas del microorganismo transformado que expresa la colera de flagelina, alberga celulas vivas de Lb. plantarum, y un tampon de fosfato que se utilizo para las administraciones de control. Tabla 2 muestra los resultados.

20

Tabla 2

Muestra de administracion

Numero de BALB/c Dosis diaria 107 cfu/dfa IgA en heces (OD+Std. Error) IgA en suero (OD+Std. Error)

Ejemplo 2: capsula sin costuras

7 2,8 0,15+0,012 0,42+0,133

Ejemplo 2: capsula blanda

7 3,3 0,13+0,013 0,41+0,142

Ejemplo 2: capsula dura

7 3,2 0,13+0,014 0,39+0,140

Ejemplo comparativo 4: capsula sin costuras

5 2,8 0,05+0,011 0,13+0,038

Ejemplo comparativo

5 3,3 0,06+0,010 0,12+0,052

5: capsula blanda

Ejemplo comparativo 6: capsula dura

5 3,2 0,06+0,010 0,11+0,028

Celulas vivas de microorganismo transformado

5 2,8 0,03+0,012 0,12+0,032

Celulas vivas de microorganismo de huesped

5 8,3 0,02+0,008 0,10+0,022

Tampon de fosfato

5 - 0,02+0,006 0,15+0,033

Se observo que, en los casos de la capsula sin costuras resistentes a los acidos, formulaciones de capsula blanda y de capsula dura preparadas en el Ejemplo 2, independientemente de la forma de la formulacion de capsula resistente a los acidos, las cantidades de IgA eran mas grandes tanto en heces como en sangre y el efecto de 5 inducir un anticuerpo fue mayor, en comparacion con los casos de las formulaciones de capsulas no resistentes a los acidos de los Ejemplos Comparativos 4 a 6 o de las celulas vivas.

Ejemplo 6: Examen para la induccion de anticuerpos resultantes de los 10 Administracion de disenterfa Flagelina- Expresando microorganismo transformado

10

La formulacion sin fisuras capsula, la formulacion de capsula blanda, y la formulacion en capsulas duras, que se prepararon en el Ejemplo 3, y las formulaciones de capsulas de los Ejemplos Comparativos 7 a 9 se examinaron para la induccion de anticuerpos como en el Ejemplo 4, cada uno de los cuales contenfa celulas de microorganismo transformado que expresa el bacilo de disenterfa de flagelina (recombinante B. longum).

15

Ademas, las celulas vivas de microorganismos transformados que expresa disenterfa de flagelina, las celulas vivas huesped B. longum, y un tampon de fosfato se utilizo para las administraciones de control. Tabla 3 muestra los resultados.

20

Tabla 3

Muestra de administracion

Numero de BALB/c Dosis diaria 107 cfu/dfa IgA en heces (OD+Std. Error) IgA en suero (OD+Std. Error)

Ejemplo 3: capsula sin costuras

7 3,2 0,13+0,012 0,38+0,142

Ejemplo 3: capsula blanda

7 3,9 0,12+0,013 0,37+0,153

Ejemplo 3: capsula dura

7 4 0,13+0,014 0,39+0,131

Ejemplo comparativo 7: capsula sin costuras

5 3,2 0,06+0,011 0,11+0,038

Ejemplo comparativo 8: capsula blanda

5 3,9 0,05+0,010 0,12+0,051

Ejemplo comparativo 9: capsula dura

5 4 0,06+0,010 0,11+0,028

Celulas vivas de microorganismo transformado

5 3,2 0,02+0,012 0,11+0,038

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Celulas vivas de microorganismo de huesped

5 10,1 0,03+0,008 0,13+0,036

Tampon de fosfato

5 - 0,03+0,006 0,14+0,031

Se observo que, en los casos de la capsula resistente a los acidos sin costuras, formulaciones de capsula blanda y de capsulas dura preparadas en el Ejemplo 3, independientemente de la forma de la formulacion de capsula resistente a los acidos, las cantidades de IgA eran mas grandes tanto en heces como en sangre y el efecto de inducir un anticuerpo fue mayor, en comparacion con los casos de las formulaciones de capsulas no resistentes a los acidos de los Ejemplos Comparativos 7 a 9 o de las celulas vivas.

Ejemplo 7: Preparacion de la formulacion de la capsula resistente a los acidos que contiene bifidobacterias que secretan antfgeno de fiebre tifoidea fuera de la celula del microorganismo

A. La amplificacion del gen de Flagelina S. Typhimurium mediante PCR

El fragmento de gen de flagelina S. typhimurium se preparo como en la Seccion A del Ejemplo 1.

B. La amplificacion de ADN del peptido senal de secrecion a traves de PCR

B. bifidum ATCC 29521 fue cultivado en medio MRS (fabricado por Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) a 37 ° C durante 12 horas. Despues de finalizado el cultivo, el ADN genomico (Access#AJ224435) de B. bifidum se extrae convencionalmente. El PCR se realizo como en la Seccion A del Ejemplo 1, usando el ADN genomico de B. bifidum como una plantilla con par de cebadores de SEQ ID NO: 11 (hacia delante): 5'CGGCAAGCTTTATGGGGGATACAGGATTGGCGAT-3' (AAGCTT en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision de Hindlll) y SEQ ID NO: 12 (atras): 5'-GCGCCCATGGAAATCGGGTGGCGTCCTCGACCG-3'(CCATGG en las posiciones 5 a 10 es el sitio de escision Ncol). Despues de la finalizacion de la PCR, el producto resultante se escindio con Ncol y Hindlll. Por lo tanto, el fragmento de gen del peptido senal de secrecion se preparo.

C. Preparacion del vector de expresion de tipo secrecion

El plasmido pBLES100 se escindio con BamHl y Hindlll y se combina con y se ligo al fragmento del gen de flagelina obtenido en la seccion A que se ha descrito anteriormente y el fragmento de gen del peptido senal de secrecion obtenido en la Seccion B descrita anteriormente. De este modo, se obtuvo un vector pBLES-SP-FliC de expresion del tipo de secrecion.

D. lntroduccion de vector de expresion de tipo de secrecion en B. breve

La transformacion se realizo como en la Seccion D del Ejemplo 1, salvo que el pBLES-SP-F1iC obtenido en la Seccion C descrito anteriormente se utilizo como vector de expresion, y B. breve ATCC 15700 se utilizo como el microorganismo a ser transformado. Por lo tanto, B. breve transformado se obtuvo.

E. La confirmacion de la secrecion

El B. breve transformado obtenido en la seccion D descrito anteriormente se cultivo en medio de caldo MRS que contiene marmol a 37 ° C durante 12 horas, y posteriormente, se centrifugo a 4 ° C y 12.000 rpm, y se obtuvo el sobrenadante. El sobrenadante se sometio a Western Blotting como en la Seccion E del Ejemplo 1. Se confirmo que una protefna de flagelina fue secretada fuera de las celulas de B. breve transformado.

F. Preparacion de un microorganismo en polvo liofilizado del microorganismo transformado

El B. breve confirmado para la secrecion de flagelina de fiebre tifoidea se confirmo que fue utilizado para preparar polvos de celulas de microorganismos liofilizados como en la seccion F del Ejemplo 1.

G. La preparacion de formulacion de capsulas sin costuras resistentes a los acidos, formulacion de capsula blanda y formulacion de capsula dura.

Con los polvos de microorganismos liofilizados obtenidos como se explica en la Seccion F descritos anteriormente, una formulacion de capsula sin costuras, una formulacion de capsula blanda, y una formulacion de capsula dura se prepararon como en las secciones G, H y l del Ejemplo 1, respectivamente. Las membranas de la formulacion de capsula sin costuras obtenida, formulacion de capsula blanda, y la formulacion de capsula dura resistentes a los acidos.

5

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15

20

25

Ejemplos Comparativos 10 a 12

En los Ejemplos Comparativos 10 a 12, una formulacion de capsula sin costuras, una formulacion de capsula blanda, y una formulacion de capsula dura se prepararon, respectivamente, como en los Ejemplos Comparativos 1 a 3, excepto que el microorganismo se cambio al microorganismo transformado de expresion de la fiebre tifoidea de secrecion de flagelina preparado como en el Ejemplo 7. Las membranas de la formulacion de capsulas sin costuras obtenida, la formulacion de capsula blanda y de formulacion de capsula dura no eran resistentes a los acidos.

Ejemplo 8

La formulacion de capsulas sin costuras, la formulacion de capsulas blandas y la formulacion de capsulas duras, que se obtuvieron en el Ejemplo 7, y las formulaciones de capsulas de los Ejemplos Comparativos 10 al 12 fueron examinadas para la induccion de anticuerpos como en el Ejemplo 4, cada una de las cuales contenfa las celulas de microorganismo transformado de fiebre tifoidea secretor de flagelina (recombinante B. breve).

Por otra parte, las celulas vivas de expresion de microorganismo transformado de fiebre tifoidea de secrecion de flagelina (recombinante B. breve), celulas vivas de B. breve de huesped, y un tampon de fosfato se utilizo para el control de administraciones. La tabla 4 muestra los resultados.

Tabla 4

Muestra de administracion

Numero de BALB/c Dosis diaria 107 cfu/dfa IgA en heces (OD+Std. Error) IgA en suero (OD+Std. Error)

Ejemplo 7: capsula sin costuras

7 3,5 0,18+0,015 0,44+0,155

Ejemplo 7: capsula blanda

7 4,1 0,16+0,013 0,42+0,148

Ejemplo 7: capsula dura

7 3,6 0,20+0,014 0,38+0,140

Ejemplo comparativo 10: capsula sin costuras

5 3,5 0,05+0,012 0,12+0,033

Ejemplo comparativo 11: capsula blanda

5 4,1 0,04+0,011 0,11+0,046

Ejemplo comparativo 12: capsula dura

5 3,6 0,06+0,013 0,14+0,034

Celulas vivas de microorganismo transformado

5 3,4 0,05+0,011 0,13+0,036

Celulas vivas de microorganismo de huesped

5 10,5 0,03+0,009 0,12+0,039

Tampon de fosfato

5 - 0,02+0,007 0,13+0,040

Se observo que, en los casos de la capsula sin costuras resistente a los acidos, formulaciones de capsula blanda y de capsula dura que contienen el microorganismo transformado que expresa la fiebre tifoidea de secrecion de flagelina preparado en el Ejemplo 7, independientemente de la forma de formulacion de capsula resistente a los acidos, las cantidades de IgA eran mas grandes tanto en heces como en sangre y el efecto de inducir un anticuerpo fue mayor, en comparacion con los casos de las formulaciones de capsulas no resistentes a los acidos de los Ejemplos Comparativos 10 a 12 o de las celulas vivas.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana, en la forma de una formulacion de capsula, que comprende:

   una membrana de la capsula y

   un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina,

   en el que la membrana de la capsula es resistente a los acidos, y el microorganismo transformado se encapsula con la membrana de la capsula.
2. 2. La vacuna oral de la reivindicacion 1, en la que la protefna de antfgeno de flagelina se expresa en la celula del microorganismo.
3. 3. La vacuna oral de la reivindicacion 1, en la que la protefna de antfgeno de flagelina se secreta fuera de la celula del microorganismo.
4. 4. La vacuna oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el microorganismo es al menos uno seleccionado a partir de microorganismos pertenecientes al grupo que consta del genero Bifidobacterium, el genero Lactobacillus, el genero Lactococcus, el genero Pediococcus, el genero Streptococcus, el genero Enterococcus, el genero Leuconostoc, el genero Tetragenococcus, el genero Oenococcus, y el genero Weissella.
5. 5. La vacuna oral segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la vacuna oral es una vacuna contra la fiebre tifoidea, el colera, o la disenterfa.
6. 6. La vacuna oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la formulacion de la capsula es una formulacion de capsula sin costuras, una formulacion de capsula blanda, o una formulacion de capsula dura.
7. 7. Un metodo para producir una vacuna oral contra una enfermedad infecciosa bacteriana, que comprende las etapas de la preparacion de un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de ; y que envuelve el microorganismo transformado en una membrana de la capsula resistente a los acidos, produciendo de este modo una formulacion de capsula resistente a los acidos
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el microorganismo transformado secreta la protefna de antfgeno de flagelina en la celula del microorganismo.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el microorganismo transformado secreta la protefna de antfgeno de flagelina fuera de la celula del microorganismo.
10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el microorganismo es al menos uno seleccionado a partir de microorganismos pertenecientes al grupo que consta del genero Bifidobacterium, el genero Lactobacillus, al genero Lactococcus, el genero Pediococcus, el genero Streptococcus, el genero Enterococcus, el genero Leuconostoc, el genero Tetragenococcus, el genero Oenococcus , y el genero Weissella.
11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la vacuna oral es una vacuna contra la fiebre tifoidea, el colera, o disenterfa.
12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la formulacion de capsulas es una formulacion de capsula sin costura, una formulacion de capsula blanda, o una formulacion de capsula dura.
13. 13. Un metodo para producir una vacuna oral frente a una enfermedad infecciosa bacteriana, que comprende las etapas de:

    preparar un microorganismo transformado que expresa una protefna de antfgeno de flagelina;

    envolver el microorganismo transformado en una membrana de capsula, produciendo de este modo una

    formulacion de capsula; y

    proporcionar la membrana de capsula de la formulacion en capsulas producida con resistencia a los acidos.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que el microorganismo transformado expresa la protefna de antfgeno de flagelina en la celula del microorganismo.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 13, en el que el microorganismo transformado secreta la protefna de antfgeno de flagelina fuera de la celula del microorganismo.
16. 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el microorganismo es al menos uno seleccionado a partir de microorganismos pertenecientes al grupo que consta del genero Bifidobacterlum, el genero Lactobacillus, al genero Lactococcus, el genero Pediococcus, el genero Streptococcus, el genero Enterococcus, el genero Leuconostoc, el genero Tetragenococcus, el genero Oenococcus, y el genero Weissella.
17. 17. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la vacuna oral es una vacuna contra la fiebre tifoidea, el colera, o disenterfa.

    5 18. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la formulacion de capsulas es una

    formulacion de capsula sin costura, una formulacion de capsula blanda, o una formulacion de capsula dura.

    10