ES2562702T3 - Microorganismos probióticos aislados de leche de burra - Google Patents

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Abstract

Bacteria láctica probiótica, particularmente aislada a partir de leche de burra, y seleccionada a partir del grupo que consiste en cepas depositadas bajo el número de acceso DSM 22098, DSM 22099, DSM 22100, DSM 22102, DSM 22101, DSM 23558, DSM 23559 y DSM 23560 con DSMZ.

Description

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DESCRIPCION
Microorganismos probioticos aislados de leche de burra.
Campo tecnico
La invencion se refiere al campo de microorganismos conocidos como probioticos y su uso en la industria alimentaria, en alimentacion humana o animal. En particular, la invencion se refiere a probioticos aislados particularmente a partir de leche de burra cruda.
Antecedentes de la invencion
Los microorganismos probioticos, o simplemente probioticos, se pueden definir como microorganismos que, cuando se administran en dosis adecuadas, es probable que confieran un beneficio en terminos de salud o nutricion. Pertenecen a la categorfa de los llamados alimentos funcionales.
Los probioticos son conocidos en productos lacteos, tal como productos comercializados bajo las marcas Actimel® o Activia® de DANONE, marca Yakult® de Yakult Honsha o bajo la marca LC1® de NESTLE. Estas bacterias pertenecen a diferentes generos y especies de bacteria acido lactica, por ejemplo Bifidus spp. Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus o Lactobacillus johnsonii.
Se acepta generalmente que los probioticos proporcionan un beneficio de salud o nutricional por la influencia que tienen sobre el equilibrio de la flora intestinal, aunque el mecanismo preciso por el que actuan los probioticos no siempre se conoce.
En los ultimos anos, el interes en leche de burra ha aumentado considerablemente, debido principalmente a su composicion, de modo que se puede considerar una alternativa valida para nutricion infantil a las leches en polvo, leche de soja u otras formulas. En realidad la leche de burra se ve muy cercana a la leche humana debido a su composicion en acidos grasos poliinsaturados, su relacion calcio/fosforo y su contenido en protefnas. Ademas, la leche de burra es rica en lisozima, una glicosidasa capaz de hidrolizar los polisacaridos de la pared celular microbiana. Muchos cientfficos tienen pruebas de la importancia nutricional y para la salud de la lisozima. El alto contenido en lactosa tiene un efecto positivo sobre la absorcion intestinal del calcio y es responsable de la palatabilidad. Incluso despues de los primeros meses de vida, la leche de burra puede mejorar la mineralizacion del hueso y constituye un importante aporte nutritivo en ninos con alergia severa a la protefna de leche de vaca mediada por IgE, teniendo asf un papel en la formacion de un sistema inmune eficaz. En la edad mas adulta, la leche de burra puede ejercer efectos positivos frente a diferentes patologfas cardiovasculares y en dietas hipocolesterolemicas.
Ademas la publicacion de C. Chiavari et al. “Use of donkey's milk for a fermented beverage with lactobacilli”, LAIT, val 85, 1 de octubre de 2005 (2005-10-01) paginas 481-490, describe algunas bacterias acido lacticas aisladas de leche de burra.
Compendio de la invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar bacterias lacticas probioticas nuevas.
En este punto, una realizacion de la invencion propone bacterias lacticas probioticas, aisladas especialmente de leche de burra y seleccionada a partir del grupo que consiste en cepas depositadas bajo los terminos del Tratado de Budapest y “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSMZ, Braunschweig, Alemania) el 8 de diciembre, 2008, bajo numero de acceso DSM 22098, DSM 22099, DSM 22100, DSM 22102, DSM 22101, y el 26 de abril, 2010, bajo el numero de acceso DSM 23558, DSM 23559 y DSM 23560. Las cepas depositadas bajo DSM 22102, DSM 22101, DSM 23558, DSM 23559, y DSM 23560 define una nueva especie llamada de aquf en adelante Lactobacillus asini.
Otra realizacion de la invencion propone una composicion que comprende uno o una pluralidad de especies o cepas de bacteria lactica probiotica de la invencion como se menciono anteriormente. Dicha composicion podrfa ser una composicion alimentaria o una composicion de bebida, para alimentacion humana o animal.
Una realizacion mas de la invencion proporciona un proceso para fabricar una composicion alimentaria o una composicion de bebida. Dicho proceso puede comprender las etapas de:
- inocular un producto alimentario con bacteria lactica probiotica de la invencion como se describio anteriormente,
- colocar el producto alimentario inoculado bajo condiciones favorables para el metabolismo de dicha bacteria lactica probiotica,
- fermentar dicho producto alimentario hasta que se alcance una poblacion de al menos [106] CFU/ml en el producto alimentario.
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En otra realizacion, el proceso de fabricacion de una composicion alimentaria o una composicion de bebida contiene al menos las etapas de:
- fermentar bacteria lactica probiotica como se describio anteriormente hasta que se alcance una poblacion de al menos [106] CFU/ml,
- proteger dicha bacteria lactica probiotica, por ejemplo por envolvimiento,
- mezclar un producto alimentario con dicha bacteria lactica probiotica protegida.
La fermentacion se para cuando se alcanza la fase estacionaria de fermentacion, preferentemente en aproximadamente 24 horas de haber colocado dicha bacteria lactica probiotica bajo condiciones favorables para su metabolismo.
Otra realizacion de la invencion propone el uso de bacteria lactica probiotica en la preparacion de una composicion para tratar un trastorno asociado con la colonizacion de las membranas mucosas por microorganismos patogenos. Las membranas mucosas incluyen, pero no son limitantes, la mucosa de intestino, la mucosa de estomago. Por ejemplo, los microorganismos patogenicos pueden ser enteropatogenos. Por ejemplo, la actividad inhibitoria de cepas de Lactobacillus segun la invencion, podrfa ser contra: enteropatogenos (por ejemplo Salmonella enteriditis, Vibrio Cholereae, Escherichia coli).
Otra realizacion de la invencion propone el uso de bacteria lactica probiotica para proteger productos alimentarios fermentados contra patogenos alimentarios, tales como Lysteria o Salmonella, Campylobacter o Clostridium, inhibiendo el desarrollo de tales patogenos alimentarios.
Otra realizacion de la invencion propone el uso de bacteria lactica probiotica de la invencion como se definio anteriormente para producir acido butfrico durante la fermentacion haciendo uso de tal bacteria.
Otra realizacion de la invencion proporciona un metodo para producir acido butfrico que comprende las etapas de fermentar bacteria lactica probiotica de la invencion bajo condiciones adecuadas y recolectar el acido butfrico producido durante la fermentacion de dicha bacteria.
Estos y otros aspectos, caracterfsticas y ventajas de la invencion se haran aparentes para los expertos en la tecnica al leer la descripcion proporcionada en la presente memoria junto con los dibujos adjuntos. La descripcion detallada, mientras que se indican realizaciones preferentes de la invencion, solo se da a modo de ilustracion.
Breve descripcion de los dibujos.
La figura 1 muestra la evolucion del pH durante 24 h de incubacion de clones de la invencion y cepas de referencia en leche de burra.
La figura 2 muestra una huella genetica de 8 clones aislados a partir de leche de burra cruda.
Las figuras 3a a 3e muestran los electroferogramas de clones 37, 38, 41, 43 y 48, respectivamente, tras el analisis de la huella genetica.
La figura 4 muestra el resultado de hibridacion ADN-ADN entre clones 37, 38 y 48, usando ADN de L. plantarum marcado con digoxigenina-dUTP como una sonda.
La figura 5 muestra el resultado de hibridacion ADN-ADN entre clones 37, 38, y 48 donde el ADN-ADN hibridizado con ADN de cepas tipo L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus, en una sonda marcada con ADN del clon 37.
Descripcion detallada
Durante las pasadas decadas, el papel de los probioticos sobre la salud humana gano gran relevancia tanto a nivel cientffico como industrial, causando un incremento sensible en la demanda del mercado, asf como una mayor produccion y consumo de productos. En el aspecto de viabilidad es de mucha importancia que las cepas probioticas tengan la capacidad de vencer el pH extremadamente bajo del acido gastrico y el efecto detergente de las sales biliares y de llegar a un estado fisiologico viable en el lugar de accion: el epitelio intestinal. Las bacterias probioticas son capaces de colonizar el colon, para afectar positivamente el resultado de las infecciones de bacteria patogena, para estimular el sistema y disminuir la concentracion desfavorable de metabolitos. Ademas, algunas cepas, estando incluidas las bacterias de la invencion, pueden proporcionar cierta reduccion de colesterol y concentraciones de triaglicerol del plasma.
Durante el paso por el tracto gastrointestinal (GI), se requieren cultivos probioticos para tolerar la presencia de pepsina y el pH bajo en el estomago, las condiciones ricas en proteasas en el duodeno, y la actividad antimicrobiana de las sales biliares. Aunque el pH del estomago puede incrementar hasta 6,0 o mas alto despues de la toma de alimento, generalmente esta en el intervalo de 2,5 a 3,5. Despues del paso por el estomago, el intestino delgado es la segunda gran barrera del tracto GI. Aunque el pH del intestino delgado (es decir, 7,0 a 8,5) es mas favorable para
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la supervivencia de las bacterias, la presencia de sales biliares puede tener efectos adversos. Tradicionalmente, la capacidad de un candidato probiotico a sobrevivir al transito GI se valora usando tecnicas convencionales de plaqueo que proporcionan informacion del numero de celulas viables y reproductivas durante la incubacion en jugos GI simulados como se describe por ejemplo en un artfculo de Charteris et al. “Development of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper gastrointestinal tract” J. Appl. Microbiol. 84: 759-768 (1998).
Por lo tanto, para caracterizar organismos probioticos se pueden usar varios metodos basados de cultivo, tal como resistencia a jugos gastricos, resistencia a sales biliares, capacidad de hidrolizar sales biliares, evaluacion de hidrofobicidad, actividad antimicrobiana, sensibilidad a antibioticos. Estas pruebas se describen completamente en los ejemplos de la seccion ejemplos siguiente.
En una realizacion de la invencion, la bacteria probiotica cumple al menos uno de los siguientes criterios:
- al menos 75% CFU/ml se retienen despues de resistir a la evaluacion de jugo gastrico como se describe en la presente memoria,
- al menos 75% CFU/ml se retienen despues de resistir a la evaluacion de sales biliares como se describe en la presente memoria,
- una agregacion microbiana visible en un portaobjetos de microscopio con sulfato amonico 0,5 M o menos, preferentemente con sulfato amonico 0,1 M o menos, en la prueba de hidrofobicidad como se describe en la presente memoria,
- una actividad antimicrobiana baja frente a otros Lactobacillus spp, segun se mide por la prueba de halo, es decir, un halo menor de 0,5 cm, preferentemente menor de 0,2 cm como se describe en la presente memoria,
- una actividad inhibitoria frente a Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, o Esqueriquia coli, como se mide por el metodo de halo, es decir, un halo mayor de 0,5 cm, preferentemente mayor de 0,8 cm como se describe en la presente memoria.
Los clones 37, 38, 48, 43, 41, 32, 34 y 57 representan realizaciones especfficas de la invencion. Se han depositado el 8 de diciembre, 2008 (para clones 37, 38, 48, 43, 41) y en el 26 de abril, 2010 (para clones 32, 34, 57) con el “Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH” (DSMZ) en conformidad con el Tratado de Budapest, bajo el numero de acceso:
Clon 37
DSM 22098
Clon 38
DSM 22099
Clon 48
DSM 22100
Clon 43
DSM 22102
Clon 41
DSM 22101
Clon 32
DSM 23558
Clon 34
DSM 23559
Clon 57
DSM 23560
Los clones 37, 38 y 48 pertenecen a las subespecies Lactobacillus plantarum asini y los clones 43, 32, 34, 57 y 41 pertenecen a las especies Lactobacillus asini. Mas particularmente, el clon 32 pertenece a una subespecie llamada Lactobacillus asini spp. butyricus, el clon 34 pertenece a una subespecie llamada Lactobacillus asini spp. lactis, y el clon 57 pertenece a una subespecie llamada Lactobacillus asini spp. caudatus.
Dicha bacteria probiotica se puede proporcionar como un cultivo fresco o como complemento alimentario seco, tal como un complemento de dieta. En el ultimo caso, la biomasa puede ser liofilizada o secada por pulverizado, para proporcionar un cultivo en polvo de alta calidad, que comprende por ejemplo al menos 108 CFU/g, preferentemente 109 CFU/g.
Segun la invencion, se puede usar bacteria probiotica en la preparacion de productos alimentarios o bebidas, para consumo humano o animal. Los productos alimentarios o bebidas incluyen productos alimentarios fermentados, tales como productos lacteos frescos, leches fermentadas, yogures. Leche normalmente se refiere a leche de vaca. En el contexto de la invencion, puede ser preferente leche de burra, aunque tambien se pueden usar otras leches para preparar productos lacteos, leche de yegua, leche de cabra, leche de camella, leche de oveja.
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Los metodos para preparar tales productos lacteos fermentados estan al alcance de personas con habilidades normales en la tecnica. Preferentemente, la bacteria probiotica se proporciona o mantiene en una forma viable hasta el consumo. La leche se puede usar fresca, o en polvo y reconstituida con agua. Se pueden anadir diversos ingredientes a la leche, para mejorar la fermentacion, o para proporcionar beneficios de salud adicionales al consumidor (tal como adicion de vitaminas o minerales).
Despues de la fermentacion, la leche se puede transformar en queso cottage o quark, anadiendo cuajo a la leche fermentada por ejemplo. Tales procedimientos son muy conocidos por el experto en la tecnica.
En otra realizacion, la bacteria probiotica se usa como un ingrediente en una composicion alimentaria o de bebida, sin fermentacion de dicha composicion. En otras palabras, dicha bacteria prebiotica es un complemento dietetico o nutricional. En este caso, es preferente que la bacteria probiotica se proporcione en una forma viable.
La bacteria lactica probiotica segun la presente invencion tambien se puede usar para proteger productos alimentarios tales como productos alimentarios fermentados, frente a patogenos alimentarios, tales como Lysteria o Salmonella, Campylobacter o Clostridium, inhibiendo el desarrollo de tales patogenos alimentarios. En ese caso, se mezcla una composicion que comprende la bacteria probiotica deseada, como se describe en la presente memoria, con un producto alimentario o de bebida. El ultimo producto se puede fermentar independientemente de la composicion que comprende la bacteria probiotica deseada. En cualquier caso, es preferente que la fermentacion dure no mas de aproximadamente 24 horas. Normalmente, las cepas probioticas han alcanzado la fase estacionaria de la fermentacion en este periodo de tiempo.
En una realizacion de la invencion, la fermentacion se para cuando ha alcanzado la fase estacionaria de fermentacion, preferentemente en aproximadamente 24 horas de haber realizado la inoculacion del producto alimentario bajo condiciones favorables del metabolismo de dicha bacteria lactica probiotica.
La invencion tambien se refiere al uso de bacteria lactica probiotica en la preparacion de una composicion para tratar un trastorno asociado con la colonizacion de las membranas mucosas por microorganismos patogenos. Las membranas mucosas incluyen, pero no son limitantes a la mucosa de intestino y la mucosa del estomago. Por ejemplo, los microorganismos patogenicos pueden ser enteropatogenos. Por ejemplo, la actividad inhibitoria de cepas de Lactobacillus segun la invencion, podrfan ser contra: enteropatogenos (por ejemplo Salmonella enteriditis, Vibrio cholereae, Escherichia coli). Esto esta asociado con la capacidad de las bacterias probioticas de adherirse a las celulas del epitelium, tal como celulas del intestino y, actualmente se comprende, que excluyen hasta un cierto grado, tales bacterias patogenas del intestino. Por el contrario, esto podrfa estar correlacionado con la hidrofobicidad de la bacteria probiotica.
La invencion tambien se refiere al uso de bacteria lactica probiotica de la invencion para producir acido butfrico durante la fermentacion haciendo uso de tal bacteria, por ejemplo la fermentacion del alimento en el que se ha inoculado tal bacteria, y despues es ingerido por el usuario, la fermentacion interna en el colon o la fermentacion de un medio apropiado en condiciones apropiadas, permitiendo recoger el acido butfrico producido durante la fermentacion por dicha bacteria. Bacterias preferentes son DSM 23558, DSM 22098, DSM 22100, y DSM 22099.
Ejemplos
Metodos basados en cultivos (pruebas probioticas, capacidad de hidrolizar sales biliares, evaluacion de hidrofobicidad, actividad antimicrobiana, sensibilidad antibiotica, produccion de acidos organicos, evolucion del pH durante la incubacion).
Leche cruda de burra obtenida de crianza organica se diluyo en series en una disolucion fisiologica esteril (ClNa 0,85%) y se inoculo en platos de agar MRS (Man, de Rogosa and Sharpe) especfficos para aislar genero Lactobacillus. Los platos se incubaron en condiciones anaerobicas (Anaerogen, Oxoid) durante 48 horas a diferentes temperaturas. Las bacterias acido lacticas aisladas (aproximadamente 150) se seleccionaron aleatoriamente de los platos de agar MRS de las diluciones mas altas. Los aislados se subcultivaron en caldo MRS y se estriaron sobre agar MRS.
Pruebas de probioticidad.
1) Resistencia a jugos gastricos.
Tras el crecimiento, cada colonia se centrifugo, se lavo en disolucion fisiologica, y se redisolvio al volumen original con la misma disolucion. La evaluacion de resistencia a jugo gastrico se ensayo segun De Giulio et al “Use of alginate and cryo-protective sugars to improve the viability of lactic acid bacteria alter freezing and freeze-drying” World Journal of Microbiology & Biotechnology 21:739-746(2005), con algunas modificaciones. Se incubaron alfcuotas en un jugo gastrico simulado (pepsina 3 g/l, pH 2,5), retirando a diferentes tiempos de incubacion, hasta 180 minutos, y se puso en placa. Celulas sin tratar se usaron como un control negativo y se inocularon. La resistencia al jugo gastrico se evaluo mediante unidades formadoras de colonias (CFU/ml) y se comparo con el control negativo.
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2) Resistencia a sales gastricas y biliares.
Las colonias que eran resistentes a jugos gastricos se incubaron durante un maximo de 3 h en un jugo biliar simulado, compuesto por MRS que contenfa 0,3% de sales biliares, despues se inocularon en platos de agar MRS, segun De Giulio et al (2005). Las colonias sin tratar se usaron como un control negativo. La resistencia a sales biliares se evaluo mediante unidades formadoras de colonias (CFU/ml) y se comparo con el control negativo.
Resultados.
Entre 150 colonias de bacterias aisladas de leche cruda de burra, solo 8 se identificaron pertenecientes a genero Lactobacillus (llamadas provisionalmente Clon 32, Clon 34, Clon 37, Clon 38, Clon 41, Clon 43, Clon 48, y Clon 57), exhibiendo resistencia a jugos gastricos y sales biliares y mostraron aproximadamente 75% de CFU/ml formados en comparacion con el control sin tratar puesto como 100%. Su temperatura de crecimiento optima era aproximadamente 30 a 31°C. Solo 8 de las 150 colonias exhibieron una buena resistencia a la presencia de jugo gastrico y sales biliares simuladas. Estas colonias se estudiaron despues para las siguientes actividades: prueba de hidrofobicidad, filtracion de cultivos para actividad hidrolizante de sales biliares, actividad microbiana y sensibilidad a antibioticos.
3) Prueba de hidrofobicidad.
Se evaluo la capacidad de las colonias de adherirse potencialmente al epitelio intestinal usando el metodo indirecto de hidrofobicidad de Strus et al “The in Vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotica properties against Candida ’’Infectious Diseases in obstetrics and Gynaecology, 13(2): 69-75 (2005) y Ljungh et al “High surface hydrophobicity of autoaggregating Staphylococcus aureus strains isolates from human infections studied with the SALT aggregation test” Infection and Immunity, 47: 522-526 (1985). Las colonias crecieron en caldo MRS durante 24 horas. Se mezclaron suspensiones microbianas con volumenes iguales de sulfato amonio, previamente preparado con molaridades diferentes (en el intervalo de 20 mM a 4 M). La concentracion mas pequena de sulfato amonico
capaz de causar agregacion microbiana visible en una placa de microscopio estaba inversamente relacionada con la
prueba de agregacion de sal. Se uso una disolucion isotonica como un control.
Resultados.
- agregacion visible con sulfato amonio 0,1 M: clones 32, 37, 43 y 57.
- agregacion visible con sulfato amonio 0,5 M: clones 34, 38, 41 y 48.
De estos datos, se puede suponer una capacidad de adhesion in vitro al epitelio intestinal mas fuerte para los clones 32, 37, 43 y 57.
4) Filtracion de cultivos para actividad hidrolizante de sales biliares.
La hidrolisis de sal biliar es una reaccion metabolica importante en el mecanismo de sal biliar de mamfferos. En los ultimos anos ha incrementado el interes de usar hidrolisis de sal biliar para influenciar el metabolismo del colesterol de humanos y animales. La hidrolizacion de sales biliares y la incorporacion de colesterol en la membrana celular tiene el potencial de bajar la concentracion de colesterol del suero en humanos. La liberacion de sales biliares libres a traves de la hidrolizacion de sales biliares conjugadas en el intestino delgado da como resultado la excrecion de mas sales biliares en las heces. El principal medio por el que se elimina el colesterol del cuerpo es por excrecion en la forma de sales biliares hidrolizadas. La mayorfa de las sales biliares conjugadas se recirculan a traves de circulacion hepatica enterica. Las sales biliares que se excretan pueden ser sustituidas por nuevos acidos biliares, que se forman a partir del colesterol en el cuerpo. Asf, cuanto mas sales biliares son excretadas, mas colesterol se utiliza de los depositos del cuerpo. Ademas, las sales biliares libres no soportan la absorcion de colesterol y otros lfpidos del intestino delgado asf como sales biliares conjugadas.
La actividad hidrolizante de las sales biliares de las colonias se evaluo cuantitativamente siguiendo el metodo de control descrito por Minelli et al “Assessment of novel probiotica Lactobacillus casei strains for the production of functional Dairy foods” In. Dairy J., 14: 723-726 (2004). Brevemente, durante la noche se punteo los cultivos lfquidos de cepas (5 pL) sobre agar MRS que conterna 0,5% de mezcla de sal biliar conjugada y 0.37 g/L de CaCh, y se incubo como se describio anteriormente. La presencia de acido biliar precipitado alrededor de los puntos (halo opaco) se considero un resultado positivo, mostrando la capacidad de las cepas de hidrolizar sales biliares.
Resultados.
La capacidad de hidrolizar extractos biliares se evaluo cualitativamente. Todas las cepas fueron capaces de hidrolizar extractos biliares.
5) Actividad antimicrobiana.
El ensayo de la prueba de inhibicion de halo sobre placa de agar de empleo para investigar la actividad antimicrobiana de las cepas microbianas. Se probaron muestras contra las siguientes bacterias:
5
10
15
20
25
30
cepas no patogenas: Lactobacillus acidophilus DSM 20079, Lactobacillus casei ATCC 9595, Lactobacillus bulgaricus DSM 20081, Lactobacillus sakei DSM 20494, Lactobacillus rhamnosus DSM 20711;
- cepas patogenas Gram positiva: Lactobacillus cereus GN 101, DSM 4313 y DSM 4384, y Enterococcus faecalis ATCC 29212.
- Cepas patogenas Gram negativa: Escherichia coli (DSM 8579) y Pseudomonas aeruginosa (DSM 50071).
Todas las cepas se adquirieron de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ Alemania). Cada cepa se incubo a 37°C durante 18 h en su medio de crecimiento especffico: la bacteria acido lactica crecio en caldo Man de Rogosa Sharpe (MRS) (Oxoid), E. coli, E. faecalis, P. aeruginosa y B. cereus en Nutrient Broth (Oxoid). Las suspensiones microbianas (1 x 108 CFU/ml) se pulverizaron uniformemente sobre las placas de medio solido especffico. Se colocaron 50 pl de cada cultivo individualmente sobre las placas inoculadas. Despues de permanecer 30 minutos bajo condiciones esteriles a temperatura ambiente, las placas se incubaron a 37°C durante 24 a 48 horas, dependiendo de la cepa. El diametro de la zona clara que mostraban las placas se midio con precision y su actividad microbiana se expreso en cm. Se uso agua desionizada esteril como un control negativo; el agente antimicrobiano estandar, cloranfenicol, se uso como un positivo segun Dall'Agnol et al “Antimicrobial activity of some Hypericum species” Phytomedicine 10: 5 1 1-5 16. (2003).
Resultados.
a) Actividad antimicrobiana frente a otros Lactobacillus spp.
Los clones no exhibfan actividad antimicrobiana frente a Lactobacillus sakei 20494 (excepto el clon 57 a un grado muy bajo).
- los clones 37, 38 y 48 exhibfan una actividad inhibitoria baja frente a Lactobacillus casei ATCC 9595, L. bulgaricus ATCC 11842, L. fermentum DSM 20052, L. rhamnosus DSM 2071 1
- el clon 41 exhibfa una actividad inhibitoria baja frente a L. fermentum DSM 20052, L. rhamnosus DSM 2071 1, L. acidophilus DSM 20079
- el clon 43 exhibfa una actividad inhibitoria baja frente a L. fermentum DSM 20052 y L. acidophilus DSM 20079.
Este resultado se puede considerar usual, debido a la produccion por parte de todas las bacterias acido lacticas de sustancias antimicrobianas, como bactericidas, que pueden actuar no solo contra bacterias patogenas, tambien como “mecanismo de defensa territorial” frente a otros Lactobacilli.
b) Actividad antimicrobiana contra bacterias patogenas.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla:
32 34 37 38 41 43 48 57
B cereus GN 101
ND ND OX OX OX ND OX ND
B cereus DSM 4313
X X X X ND ND X X
B cereus DSM 4384
ND ND OX OX ND OX OX ND
Ent. Faecalis ATCC 29212
ND ND XX XX XX XX XX ND
E. coli HB101
ND X X X ND ND X ND
E. coli DSM 8579
ND ND X X ND ND X OX
Ps aeruginosa DSM 50071
ND ND XXX X XX ND X ND
10
Leyenda:
ND no detectable
OX actividad inhibitoria baja (halo: < 5mm)
X actividad inhibitoria media (halo: 6-8 mm)
XX actividad inhibitoria discreta (halo de 8 a 10 mm)
XXX actividad inhibitoria fuerte (halo > 10mm)
Es interesante observar la fuerte actividad antimicrobiana exhibida por el clon 37 frente a Ps. Aeruginosa. Los clones 37, 38 y 48 exhibfan una cierta actividad antimicrobiana frente a la cepa toxicogenica E coli DSM 8579.
6) Sensibilidad a antibiotico.
Se evaluo la sensibilidad de las colonias a diferentes antibioticos usando de 30 mg a 40 mg de los siguientes antibioticos:
15
ampicilina, y amoxicilina como inhibidor de sfntesis de la pared celular;
sulfato de gentamicina, lincomicina, sulfato de estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol y espiramicina como inhibidores de sfntesis de protefnas;
rifamixina como inhibidor de sfntesis de acidos nucleicos.
Cada uno de los antibioticos en polvo se peso cuidadosamente, disolvio, diluyo en diluentes apropiados y se esterilizo por filtrado antes de la adicion al medio MRS.
Las placas se inocularon con cepas LAB, y se incubaron como se describio anteriormente. Se evaluo la sensibilidad o resistencia a antibioticos mediante la prueba de inhibicion de halo.
20 Resultados.
Los clones exhibieron un grado variable de sensibilidad a los antibioticos usados en la prueba. Como se muestra en la tabla siguiente, el clon 32 era sensible a todos los antibioticos; por otro lado, los otros clones eran mas o menos resistentes frente a estreptomicina y lincomicina.
Clon
Sensibilidad a antibiotico
32
Sensible a todos los antibioticos probados
34
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina Baja resistencia frente a lincomicina
37
Sensible a todos los antibioticos probados Baja resistencia frente a estreptomicina y lincomicina
38
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina y lincomicina
41
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina Baja resistencia frente a lincomicina
43
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina Baja resistencia frente a lincomicina
Clon
Sensibilidad a antibiotico
48
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina Baja resistencia frente a lincomicina
57
Sensible a todos los antibioticos probados Resistente frente a estreptomicina Baja resistencia frente a lincomicina
7) Produccion de acidos organicos.
Se determino la produccion de acidos organicos despues de la fermentacion mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion del sobrenadante filtrado (Vulevic, Rastall & Gibson, 2004; Nazzaro et al. 2009), usando un aparato Gold System equipado con un detector ultravioleta (Beckman, CA, USA). Las muestras se cargaron en una columna pre- 5 envasada Aminex HPX-87 (300 7,8 mm, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y se eluyo con 0,005 mM de acido sulfurico.
El tiempo total de la prueba fue 40 minutos; la velocidad de flujo era 0,6 mm/min; el volumen de inyeccion era 20 pl;
y la longitud de onda de deteccion era 210 nm.
Resultados.
En las siguientes tablas se informa la cantidad de acido butfrico y acido cftrico producido durante la fermentacion por 10 cepas de la invencion y algunas cepas de referencia, que crecen en leche de burra. Los datos se expresan en
termino de area absoluta (mm2):
Cepa
Cantidad de acido butfrico
Lactobacillus acidofilus (comp.)
26,21
Latobacillus plantarum (comp.)
21,5
Lactobacillus fermentum (comp.)
33,56
Clon 32 (inv.)
60,3
Clon 37 (inv.)
65,41
Clon 38 (inv.)
42,91
Clon 48 (inv.)
60,37
Cepa
Cantidad de acido cftrico
Lactobacillus acidofilus (comp.)
51,37
Latobacillus plantarum (comp.)
2,95
Lactobacillus fermentum (comp.)
57,97
Clon 32 (inv.)
65,81
Clon 37 (inv.)
82,1
Clon 38 (inv.)
83,11
Clon 41 (inv.)
76,2
Clon 43 (inv.)
79,98
Clon 48 (inv.)
85,71
La produccion de acido butfrico se podrfa hacer externamente mediante alimentos fermentados en los que se ha inoculado la bacteria de la invencion, siendo tal alimento ingerido por el usuario para incrementar el acido butfrico en 15 el sistema digestivo.
5
10
15
20
25
30
35
40
El acido butfrico es un acido graso de cadena corta que tambien se puede producir a partir de la fermentacion de la bacteria en el colon, y alcanza de 60% a 70% de las necesidades de energfa de las celulas epiteliales del colon. Ademas, el acido butfrico estimula la regeneracion del epitelio del colon, yeyuno, ilion, e inhibe el crecimiento microbiano en el colon. Un metabolismo pobre en acido butfrico por el epitelio puede causar inflamacion ulcerativa del colon.
La tabla muestra que las cepas de la invencion son capaces de producir una cantidad mas alta de acido butfrico que las cepas de referencia. Por lo tanto, las cepas de la invencion permiten estimular la barrera intestinal y fortalecer el sistema inmune.
El acido cftrico se usa como un conservante natural en alimentos y bebidas. La tabla muestra que las cepas de la invencion son capaces de producir una cantidad mas alta de acido cftrico que las cepas de referencia. Por lo tanto, permiten mejorar las propiedades de almacenamiento de la composicion que comprende las cepas de la invencion.
8) Evolucion del pH durante la incubacion.
Se probo el crecimiento microbiano en leche de burra. Se obtuvo leche de burra, en forma secada por pulverizado, de la granja Eurolactis. La leche se resuspendio en agua desionizada esteril (proporcion 100 g + 600 ml de agua). Se inoculo 42 ml de tal suspension con 0,840 ml de un cultivo microbiano del aislado (2% inoculo, absorbancia inicial a A600 nm = 1). Las muestras se incubaron a 30°C.
La leche de burra se inoculo en las mismas condiciones con Lactobacilllus plantarum, Lactobacillus paraplantarum y cepas tipo Lactobacillus pentosus, mientras que se utilizo una temperatura de 37°C para Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus rhamnosus.
Se evaluo la capacidad de crecer en leche de burra y la capacidad fermentativa de cepas mediante conteo de colonias formadoras de unidades (CFU) / ml de celulas microbianas (determinado mediante cultivo anaerobico sobre agar MRS despues de 3, 6 y 24 horas de incubacion) y mediante medicion del pH resultante, respectivamente.
Resultados.
El valor de pH inicial era 7,14.
La figura 1 muestra el decrecimiento del pH durante 24 horas de incubacion de clones de la invencion y cepas de referencia en leche de burra. La referencia A designa el grupo de las cepas diferentes de la invencion. Las referencias B a F corresponden respectivamente a L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. paraplantarum, L. pentosus, y L. plantorum.
La figura 1 muestra que las cepas de referencia exhibfan una capacidad fermentativa mas acfdica, comparado con los clones de la invencion. La palatabilidad del producto esta negativamente afectada por pH bajo. Por lo tanto, los clones de la invencion permiten conservar la palatabilidad de las composiciones que comprenden tales clones.
Enfoques fenotfpicos y genotfpicos (metabolismo de azucares, huella de ADN, hibridacion DNA-DNA, comparacion de secuencia 16 S ARN)
9) Metabolismo de azucares.
Se identificaron aislados del nivel de especies usando el sistema de identificacion API 50 CHL (BioMerieux) de la fermentacion de hidratos de carbono. El medio API 50 CHL, dirigido a la identificacion del genero Lactobacillus y organismos relacionados, es un medio instantaneo que permite la fermentacion de 49 hidratos de carbono sobre la tira API 50 CH a estudiar. Se hace una suspension en el medio con los microorganismos a probar y cada tubo de la tira se inocula. Durante la incubacion, los hidratos de carbono fermentan a acidos que producen una disminucion del pH, detectado por el cambio de color del indicador. Los resultados construyen el perfil bioqufmico de la cepa y se usan para su identificacion o tipificacion. Las cepas probioticas supuestas se inocularon en tiras API 50 CHL y se llevo a cabo evaluacion de los cambios de color despues de 24 y 48 horas de incubacion a 37°C.
Cada tira estaba compuesta como se muestra en la tabla siguiente. Los resultados se analizaron usando un software API BioMerieux.
Tira 0-9
Tira 10-19 Tira 20-29
Tubo / sustrato
Tubo / sustrato
Tubo / sustrato
0 CONTROL
10 GALactosa 20 a-metil-D-Manosido
1 GLYcerol
11 GLUcosa 21 a-metil-D-Glucosido
2 ERYtritol
12 FRUctosa 22 N-acetil-glucosamina
3 D Arabinosa
13 MaNosA 23 AMIgdalina
4 L Arabinosa
14 SorBosA 24 ARButina
5 RIBosa
15 RHAmnosa 25 ESCulina
6 D Xilosa
16 DULcitol 26 SALicina
7 L Xilosa
17 INOsitol 27 CELobiosido
8 ADONitol
18 MANitol 28 MALtosa
9 p-metil-D-xilosido
19 SORbitol 29 LACtosa
Tira 30-39
Tira 40-49
Tubo /sustrato
Tubo / sustrato
30 MELibiosa
40 D TURanosa
31 Sacarosa
41 D LYXosa
32 TREhalosa
42 D TAGatosa
33 INUlina
43 D FUCosa
34 MeLeZitosa
44 L FUCosa
35 RAFinosa
45 D ARabitol
36 Almidon
46 L ARabitol
37 GLYcoGen
47 GlucoNaTo
38 XiLiTol
48 2-Keto-Gluconato
39 GENtobiosa
49 5-Keto-Gluconato
Resultados de la prueba de fermentacion (API)
Clon 32: discriminacion insuficiente Clon 34: discriminacion insuficiente
Clon 37: identificacion excelente con Lactobacillus plantarum 99,5 %
5 Clon 38: identificacion dudosa
Clon 41: identificacion dudosa preliminar Clon 43: identificacion dudosa preliminar
Clon 48: identificacion excelente con Lactobacillus plantarum 99,5%
Clon 57: discriminacion insuficiente 10 Enfoque genetico.
Se aplicaron las siguientes tecnologfas para la identificacion molecular: huella del ADN, hibridacion ADN-ADN y secuenciacion 16 S ARN.
10) Huella del ADN.
Se uso el ensayo de ADN-PCR polimorfico amplificado al azar (RAPD-PCR) para producir disenos de huellas segun 15 Ronimus et al (1997). La amplificacion de ADN se llevo a cabo en una mezcla de reaccion de 50 pL PCR que contenfa: 50-200 ng de ADN genomico, tampon 1X PCR (proporcionado como componente del kit ADN polimerasa), 3 mM MgCl2, 250 pM dNTPs, 0,5 pM de OPR-2 iniciador (5'-CACAGCTGCC-3', secuencia SEQ ID N°: 1) o OPR-13 iniciador (5'-ggacgacaag-3', secuencia ID N°: 2) y 2,5 unidades de Platinum® Taq ADN polimerasa (INVITROGEN). Las mezclas se amplificaron en un termociclo iCycler® (BIO RAD). El perfil de amplificacion consistfa en una 20 desnaturalizacion inicial de 2 min a 92°C y 35 ciclos de 15 segundos a 94°C, templando durante 15 segundos a 36°C (previamente optimizado mediante amplificacion por gradiente de temperatura) y elongacion durante 2 minutos a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
72°C. Se llevo a cabo una extension final de 7 minutos a 72°C. Se hizo electroforesis de 10-20 pL de productos PCR sobre microchip ADN 7500 (Agilent) usando un Bioanalyzer 2100 equipado con un software EXPERT 2100 (Agilent).
Resultados.
Despues de las pruebas API siguieron estudios genotfpicos. El analisis de huellas de ADN (figura 2) muestra que los clones 37, 38 y 48 parecfan pertenecer a la misma especie. En las figuras 3a a 3e, se proporcionan los electroferogramas relativos a los clones 37, 38, 41, 43 y 48.
11) Comparacion de secuencia 16 S ARN.
Se extrajo ARN total mediante el kit RiboPure-Bacteria (Ambion) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se disolvio el ARN en disolucion de almacen de ARN (Ambion), UV-cuantificado mediante un Bio-Photometer® (Eppendorf) y se almaceno a -80°C. AKcuotas de ARN (6 pg) se digirieron por RNAse-free DNAse I (kit Ambion DNA- freeTM) en una mezcla de reaccion de volumen final de 20 pL, para eliminar ADN genomico que contamina. Despues de la digestion de ADNasa, se evaluo concentracion y pureza de muestras de ARN mediante ensayo de microchip RNA-6000-Nano®, usando un Bioanalyzer 2100 equipado con un software EXPERT 2100 (Agilent), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para todas las muestras probadas el numero de integridad del ARN (RIN) era mayor de 7 (en relacion a una escala 0-10) se hizo transcripcion inversa en una mezcla de reaccion de 20 pL. Una mezcla que contema 3 pg de ARN total, segun se evaluo mediante Bioanalyzer 2100, 2 pmoles de iniciador directo 1517R (vease anteriormente), 2 mM dNTPs en un volumen total de 10 pL, se incubo durante 2 minutos a 70°C y se enfrio rapidamente a 40°C. A la mezcla se anadio 10 pL que contema 2x de un tampon adecuado (Invitrogen) 20 mM ditiotreitol, 20 unidades de inhibidor ARNasa (Invitrogen), y 200 unidades de MoMuLV Superscript@ III transcriptasa inversa (Invitrogen). La mezcla de reaccion (volumen final 20 pL) se incubo a 5 5°C durante 60 minutos y a 70°C durante 15 minutos para parar la reaccion y para degradacion de ARN. Se llevo a cabo amplificacion de 16S cDNA mediante un iCycler-iQ5® en una mezcla de reaccion de 50 pL que contema: 1x de un tampon adecuado (Invitrogen), 200 pM dNTPs, 300 nM de 16S bacterial iniciador general disenado en E. coli 16S ARN secuencia de acceso (8-directo y 1517-inverso). El perfil de amplificacion consistfa en una desnaturalizacion inicial de 3 minutos a 94°C, 25 ciclos de 30 segundos y elongacion final de 7 minutos a 72°C. Se hizo electroforesis de 5 pL de productos PCR sobre 1% de gel agarosa (Agarosa - 1000, Invitrogen) en 1x tampon TAE a 5 V/cm durante 4 h. Se incluyo bromuro de etidio (0,1 pg/mL) tanto en el gel como en el tampon de electroforesis y se detectaron productos PCR por visualizacion UV y se anotaron sobre pelfculas Polapan 55 (Polaroid). Se seco por aireacion 100-150 pL de cada mezcla amplificada y se envio a MWG (Ebersberg - Alemania), para secuenciacion. La secuenciacion se llevo a cabo usando los iniciadores 8F, 1517R y por el indicador interno 368 F, disenado en base a los primeros datos de secuencia. El conteo de secuencia se llevo a cabo por el software DNA-Baser version 2.0 utilizando los archivos de secuencia “.scf”. Las secuencias generadas “.fasta” (aproximadamente 1.400 bases de longitud) se alinearon a NBCI-BLAST un banco de datos “Ribosome Data Base Project) - RDP.
Resultados.
Se extrajo y se retro-transcribio ARN ribosomal. El cADN obtenido se amplifico y secuencio como se describio anteriormente. El conteo de secuencia de aproximadamente 1.400 bases se obtuvo y se comparo en los bancos de datos. A continuacion se da una sfntesis de comparacion de secuencias en Ribosomal Database Project (RDP). Emerge un cuadro que incluye nuestros clones en un grupo muy ajustado de especies L. plantarum, paraplantarum y pentosus que presentan (cepas tipo) un identificador 16 S RNA mayor de 99,9%. Los resultados que se dan a continuacion son porcentajes de identificadores 16 S RNA de los clones de la invencion comparado con esas especies.
Clon 41.
Bacteria dominio (20) (secuencias coincidentes)
phylum Firmicutes (20) clase “Bacilli” (20) orden “Lactobacillales” (20)
Familia Lactobacillaceae (20) genero Lactobacillus (20)
0,994 1.400 L. paraplantarum (T); DSM 10667T; A5306297 0,979 1405 L. plantarum (T); JCM 1 149; D792 10 0,984 1410 L. pentosus (T); JCM 1558; D79211 Clon 43.
Bacteria dominio (20) (secuencias coincidentes)
phylum Firmicutes (20) clase “Bacilli” (20) orden “Lactobacillales” (20)
Familia Lactobacillaceae (20) genero Lactobacillus (20)
1.400 L. paraplantarum (T); DSM 10667T; AJ306297 0,985 1405 L. plantarum (T); JCM 1 149; D792 10 0,990 1410 L. pentosus (T); JCM 1558; D79211 Clon 48.
5 Bacteria dominio (20) (secuencias coincidentes)
phylum Firmicutes (20) clase “Bacilli” (20) orden “LactobaciNales” (20)
Familia Lactobacillaceae (20) genero Lactobacillus (20)
1000 L. plantarum (T); JCM 1 149; D792 10 Clon 57.
10 Bacteria dominio (0/20/5164) (secuencias RDP seleccionadas/coincidentes/total)
phylum Firmicutes (0/20/1178) clase “Bacilli” (0/20/697) orden “LactobaciNales” (0/20/289)
Familia Lactobacillaceae (0/20/114) genero Lactobacillus (0/20/104)
0,987 1.400 L. paraplantarum (T); DSM 10667T; A5306297 0,990 1405 L. plantarum (T); JCM 1149; D79210 15 0,994 1410 L. pentosus (T); JCM 1558; D79211
12) Hibridacion ADN-ADN.
Para hibridacion ADN-ADN cuantitativa y calculo del porcentaje de homologfa el ADN se extrajo y purifico a partir de cultivo de celulas bacterianas (aproximadamente 250 mg de pelet seco por cada cepa) usando el set Genomic-DNA- Buffer y columnas Genomic-tip-100/G (QIAGEN SPA, Milan, Italia), segun las instrucciones del fabricante con 20 modificaciones menores. El ADN se disolvio en tampon TE (10 mM Tris pH 8, 1 mm EDTA) y se hicieron diluciones en serie hasta una concentracion final (WS) de 50 pg/ml, segun se evaluo mediante absorbancia UV usando un BioPhotometer (Eppendorf, Alemania). La concentracion ADN WS se confirmo mediante medicion fluorimetrica usando el kit de pruebas Quant-iT ADN (INVITROGEN, Milan, Italia); el tamano del ADN se estimo mediante electroforesis 0,8% agarosa de grado ADN (BIO-RAD) usando ADN como marcador de peso molecular (tamano del ADN 25 aproximadamente 32 kD). Las disoluciones WS se diluyeron hasta una concentracion final de 2 ng/mL en 0,1 X SSC que contenfa 5 ng/mL de ADN de esperma de arenque. El ADN se desnaturalizo mediante 10 min a 100°C y rapida inmersion en bano de agua helada. El ADN se desnaturalizo durante 10 minutos a 100°C e inmersion rapida en bano de agua helada50-100 ng de ADN de cada cepa se seco por cuadruplicado sobre membrana de nylon cargada positivamente (Roche, Alemnia) usando un aparato Dot-Blot (BIORad, Ca EEUU) conectado a vacfo suave. En el 30 grafico se incluyo una curva estandar de 20 a 200 ng ADN/punto de ADN homologo (el ADN a investigar). El ADN se reticulo con nylon mediante 3 minutos de exposicion a UV y mediante 1 hora de horneado al vacfo a 120°C. las membranas se congelaron a -20°C hasta el analisis.
Se etiqueto 1 pg de ADN a investigar durante la noche con digoxigenina-dUTP en una mezcla de reaccion de 20 pL usando el kit de etiquetado Random Primed DNA (Roche, Alemania) segun las instrucciones del fabricante. Las 35 membranas se prehibridizaron durante 3 horas a 40°C en disolucion DIG Easy-Hyb (Roche) y se hibridaron durante
la noche a 40°C en disolucion DIG Easy-Hyb que contenfa 20 pg/ml del etiquetado Dig a investigar (desnaturalizado por calor como se describio anteriormente), usando un incubador de hibridacion de tubo rotatorio (GFL). La rutina de lavados era: dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente en disolucion 2 x SSC que contenfa 0,1 SDS, dos veces durante 15 minutos a 68°C en disolucion 0,1 x SSC que contenfa 0,1 x SDS (fragmento antidigoxigenina FAB 40 conjugado con alcalina fosfatasa), el sustrato qufmico luminiscente CDP-Star, y el set DIG Wash y tampon Block, todos los reactivos e instrucciones relacionadas eran de Roche. El qufmico luminiscente se cuantifico en condicion de linealidad de tiempo de exposicion usando un aparato VersaDOC 4000 (BIO-RAD) equipado con el software Quantity-one. El porcentaje de homologfa ADN-ADN se calculo segun Jahnke (1994) poniendo como 100% el medio de los valores qufmico luminiscencia (intensidad de volumen ajustado x mm2) tomado de los puntos de ADN 45 homologo y teniendo en cuenta la respuesta linear dela curva estandar del ADN homologo. La desviacion estandar
media de las muestras replicadas no excedfa el 5% del valor medio.
Resultados.
Los datos metabolicos se confirmaron mediante hibridacion ADN-ADN, utilizando L. plantarum etiquetado por dUTP- dioxigenina como investigado. Como se muestra en la figura 4, los clones 37, 38, 48 mostraban 86, 99, 99% 50 respectivamente de homologfa ADN-ADN con L.plantarum (L. Pl en la figura 4), sabiendo que el lfmite de ADN
taxonomico para especies diferentes esta por debajo de 70% de homologfa de ADN-ADN. Para distinguir entre las tres posibilidades y para confirmar descubrimientos anteriores, los clones 37, 38 y 48 se hibridaron ADN-ADN con ADN de cepas tipo L. plantarum (PL en la figura 5), L. paraplantarum (PPL en la figura 5) y L. pentosus (PE en la figura 5), a un investigado de ADN etiquetado a partir del clon 37 (fig. 5) N-Ctr es control negativo.
5 La descripcion anterior de realizaciones preferentes de la invencion no pretende ser exhaustiva o limitar la invencion a las realizaciones descritas. Varios cambios en el ambito de la invencion seran aparentes a los expertos en la tecnica y se pueden adquirir a partir de la practica de la invencion.
En base a los resultados experimentales de hibridacion ADN-ADN y el analisis de 16S ARN, las cepas 37, 38 y 48 pertenecen a un unico grupo, en el que L. plantarum, L. pentosus y L. paraplantarum tambien estan presentes. Pero 10 son diferentes de ellos. Se considera que las cepas 37, 38 y 48 representan una subespecie de L. plantarum, que se llamara L. plantarum asini. Por razones similares, las cepas 41 y 43 aparentemente pertenecen a una especie nueva, Lactobacillus asini. En realidad, las cepas 41 y 43 presentan un 40-50% de similitud con los otros lactobacilli, principalmente con pentosus, plantarum y paraplantarum.
Las cepas 37, 38 y 48, y las cepas 41 y 43, son microorganismos que pertenecen al genero Lactobacillus, con una 15 homologfa del 16S ARN mayor de 99,2% con el grupo estricto de L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus, y con huella y perfil proteico relativamente proporcional a tal homologfa.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Bacteria lactica probiotica, particularmente aislada a partir de leche de burra, y seleccionada a partir del grupo que consiste en cepas depositadas bajo el numero de acceso DSM 22098, DSM 22099, DSM 22100, DSM 22102, DSM 22101, DSM 23558, DSM 23559 y DSM 23560 con DSMZ.
  2. 2. Composicion que comprende una o una pluralidad de especies o cepas de bacterias lacticas segun la reivindicacion 1.
  3. 3. Composicion segun la reivindicacion 2, en la que la composicion es una composicion alimentaria o una composicion de bebida.
  4. 4. Proceso para la fabricacion de una composicion alimentaria o una composicion de bebida que contiene al menos las etapas de:
    - inocular un producto alimentario con bacteria lactica probiotica viable segun la reivindicacion 1,
    - colocar el producto alimentario inoculado bajo condiciones favorables para el metabolismo de dicha bacteria lactica probiotica,
    - fermentar dicho producto alimentario hasta que se alcance una poblacion de al menos [106] CFU/ml en el producto alimentario.
  5. 5. Proceso para la fabricacion de una composicion alimentaria o una composicion de bebida contiene al menos las etapas de:
    - fermentar bacteria lactica probiotica segun la reivindicacion 1 hasta que se alcance una poblacion de al menos [106] CFU/ml,
    - proteger dicha bacteria lactica probiotica, por ejemplo por envolvimiento,
    - mezclar un producto alimentario con dicha bacteria lactica probiotica protegida.
  6. 6. Un proceso segun la reivindicacion 4 o 5, en el que la fermentacion se para cuando se alcanza la fase estacionaria de fermentacion, preferentemente en aproximadamente 24 horas de haber colocado dicha bacteria lactica probiotica bajo condiciones favorables para su metabolismo.
  7. 7. El uso de bacteria lactica probiotica segun la reivindicacion 1 en la preparacion de una composicion para tratar una afeccion asociada con la colonizacion de una membrana mucosa por un microorganismo patogenico.
  8. 8. El uso segun la reivindicacion 7, en el que dicha membrana mucosa se selecciona en el grupo que consiste dela mucosa del intestino y la mucosa del estomago.
  9. 9. El uso segun la reivindicacion 7 o 8, en el que dicho microorganismo patogenico es un enteropatogeno, tales como Salmonella esteriditis, Vibrio cholerae, Escherichia coli.
  10. 10. El uso de bacteria lactica probiotica segun la reivindicacion 1 para proteger productos alimentarios fermentados frente a patogenos alimentarios, tales como Lysteria o Salmonella, Campylobacter o Clostridium, inhibiendo el desarrollo de tales patogenos alimentarios.
  11. 11. El uso de bacteria lactica probiotica segun la reivindicacion 1 para producir acido butfrico durante la fermentacion haciendo uso de dicha bacteria.
  12. 12. Metodo para producir acido butfrico que comprende las etapas de fermentar bacteria acida probiotica segun la reivindicacion 1 bajo condiciones adecuadas y recolectar el acido butfrico producido durante la fermentacion por dicha bacteria.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20110791A1 (it) 2011-05-09 2012-11-10 Probiotical Spa Ceppi di batteri in grado di metabolizzare gli ossalati.
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ITRM20110475A1 (it) * 2011-09-09 2013-03-10 Probiotical Spa Ceppi di batteri lattici e/o bifido batteri, opzionalmente addizionati di n-acetilcisteina e/o lisozima microincapsulato gastroprotetto, aventi attivita' di inibizione/riduzione della crescita di differenti biotipi di e.coli, incluso e.coli o157:h7 e
WO2013130624A2 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Cornell University Probiotic compositions and methods
ITRM20120170A1 (it) 2012-04-19 2013-10-20 Dicofarm Spa "alimento a base di latte d'asina fortificato per neonati pretermine e/o a termine con allergia o intolleranza alle proteine del latte vaccino e relativo metodo di preparazione"
ITMI20130793A1 (it) 2013-05-14 2014-11-15 Probiotical Spa Composizione comprendente batteri lattici per uso nel trattamento preventivo e/o curativo delle cistiti ricorrenti.
ITMI20131690A1 (it) * 2013-10-14 2015-04-15 Consiglio Nazionale Ricerche Composizione alimentare.
CN107151638B (zh) * 2017-05-25 2020-05-08 中驭(北京)生物工程有限公司 一株改善肝功能的植物乳杆菌zy001及其在发酵乳中的应用
TR201712406A2 (tr) 2017-08-21 2019-03-21 Nanomik Biyoteknoloji A S Probiyotik Yüklü Mikrokapsüller Ve Bunların Üretimi

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1927813A (en) * 1928-10-03 1933-09-19 Commercial Solvents Corp Process of accelerating the production of butyric acid by fermentation
DK0760848T3 (da) 1994-05-26 1998-09-23 Bracco Spa Lactobacillusstammer af menneskelig oprindelse, deres sammensætninger og anvendelse deraf
EP0948262A1 (fr) 1996-12-24 1999-10-13 Societe Des Produits Nestle S.A. Produit laitier fermente
AU2005282182A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Medela Holding Ag Human milk fortifiers and methods for their production
US20060078546A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-13 Anders Zachrisson Use of lactic acid bacteria to reduce sick time
CN101081045A (zh) * 2006-05-30 2007-12-05 张保钢 酸羊奶及其制备方法
JP5081242B2 (ja) * 2006-08-04 2012-11-28 バイオニア コーポレイション 人間母乳から分離したプロバイオティック活性、及び体重増加抑制活性を有する乳酸菌
CN101283703B (zh) * 2008-05-13 2011-05-18 孟克 全脂酸马奶粉的制备方法

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