ES2562224T3

ES2562224T3 - Monómeros y oligómeros de beta amiloide estables

Info

Publication number: ES2562224T3
Application number: ES09732855.3T
Authority: ES
Inventors: Torleif HÄRD; Anders Sandberg
Original assignee: ALZINOVA AB
Current assignee: ALZINOVA AB
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2016-03-03
Anticipated expiration: 2029-04-14
Also published as: AU2009236699B2; US10023622B2; US10138281B2; JP5817060B2; JP2015145414A; WO2009128772A1; EP2262526A4; PL2262526T3; CY1117283T1; JP6128450B2; US9688734B2; EP2262526A1; HRP20160177T1; CN102065881B; CA2721156A1; CN102065881A; EP2262526B1; CA2721156C; US20170355737A1; DK2262526T3

Abstract

Péptido beta amiloide que comprende la secuencia de aminoácidos L-V-F-F-C correspondiente a los aminoácidos 17 a 21 de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos C-I-I-G-L-M-V correspondiente a los aminoácidos 30 a 36 de SEQ ID NO: 4, comprendiendo además dicho péptido beta amiloide un enlace disulfuro entre residuos de cisteína correspondientes a los aminoácidos 21 y 30 de SEQ ID NO: 4, o variante de dicho péptido beta amiloide en la que uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos se han sustituido mediante sustitución conservativa, uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos se han delecionado, o uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos se han insertado, teniendo dicho péptido beta amiloide o dicha variante de dicho péptido beta amiloide exactamente dos cisteínas, correspondiendo dichas cisteínas a Cys21 y Cys30 en SEQ ID NO: 4.

Description

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que se desnaturalizó en GdmCl 6 M antes de la CEM. Los recuadros por debajo del cromatograma representan transferencias puntuales de las fracciones (la cantidad de muestra aplicada a la membrana se normalizó según la absorbancia a 280 nm) sometidas a ensayo para determinar la capacidad de unión al anticuerpo A11.

La figura 15A representa un ensayo dependiente del tiempo de una fracción de CEM de A(40) A21C/A30C de 80 kDa que se concentró hasta 20 M y se incubó a 37ºC. Se tomaron puntos de tiempo y se sometieron a ensayo para detectar la presencia del epítopo de A11.

La figura 15B representa un ensayo dependiente del tiempo de una fracción de CEM de A(42) A21C/A30C de 10 kDa que se concentró hasta 50 M y se incubó a 37ºC. Se tomaron puntos de tiempo y se sometieron a ensayo para detectar la presencia del epítopo de A11.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona péptidos A restringidos covalentemente que tienen sustituciones de enlaces disulfuro A21C/A30C que son resistentes frente a la fibrilogénesis, y su uso en la selección de agentes terapéuticos frente a especies oligoméricas tóxicas implicadas en Alzheimer y otras enfermedades por plegamiento erróneo de proteínas. Los péptidos según la invención también pueden usarse directamente como inmunógenos para generar una respuesta inmunitaria frente a formas tóxicas del péptido A. La invención es un ejemplo del uso de la modificación por ingeniería genética racional de péptidos para modificar las propiedades de péptidos para adecuarlas a nuevas necesidades; siendo la necesidad en este caso detener la fibrilogénesis del péptido A a nivel oligomérico tóxico de modo que estas especies puedan aislarse y utilizarse. Los ejemplos presentados a continuación demuestran que los péptidos según la invención comparten muchas propiedades del péptido A de tipo natural excepto por la alta tendencia del péptido A de tipo natural a experimentar fibrilación.

En el presente documento, el término oligómero se usa como término colectivo para agregados solubles que contienen una pluralidad de monómeros del péptido A. Estos monómeros son fragmentos peptídicos derivados de la APP (entrada de Swiss-Prot P05067), y comprenden comúnmente de 39 a 43 aminoácidos. La secuencia de longitud completa se describe en Kang, J., et al., Nature 325: 773-776 (1987). La invención proporciona péptidos estabilizados correspondientes a todos los derivados de 39 a 43 residuos de longitud de la APP incluyendo los dos derivados que se encuentran más frecuentemente, A(40) y A(42), para los que las secuencias son:

A(40) humano:

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A(42) humano:

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Por consiguiente, un aspecto preferido de la invención proporciona péptidos que comprenden las siguientes secuencias:

A(40) A21C/A30C humano:

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A(42) A21C/A30C humano:

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Los símbolos de una única letra y los símbolos de tres letras son intercambiables y se usan para indicar los aminoácidos. Estos símbolos, que los conoce bien el experto en la técnica, tienen el siguiente significado: A = Ala = alanina, C = Cys = cisteína, D = Asp = ácido aspártico, E = Glu = ácido glutámico, F = Phe = fenilalanina, G= Gly = glicina, H = His = histidina, I = Ile = isoleucina, K = Lys = lisina, L = Leu = leucina, M= Met = metionina, N = Asn = asparagina, P = Pro = prolina, Q = Gln = glutamina, R = Arg = arginina, S = Ser = serina, T = Thr = treonina, V = Val = valina, W = Trp = triptófano e Y = Tyr = tirosina.

Los péptidos según la invención se diseñaron específicamente con el fin de impedir la fibrilación de los péptidos A derivados de la APP. El diseño de los péptidos según la invención (figura 1A) se basa en la estructura de RMN determinada recientemente (n.º de registro de Protein Data Bank 2OTK) del péptido A (Hoyer, W., et al., Proc. Natl.

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opciones de Bl2seq se ajustan tal como sigue: se ajusta -i a un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que va a compararse (por ejemplo, C:\seq1.txt); se ajusta -j a un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que va a compararse (por ejemplo, C:\seq2.txt); se ajusta -p a blastp; se ajusta -o a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y se dejan todas las demás opciones en sus parámetros por defecto. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida diseñado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida diseñado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineadas, se determina el número de coincidencias contando el número de posiciones en las que está presente un residuo de aminoácido o nucleótido idéntico en ambas secuencias. Se determina el porcentaje de identidad dividiendo el número de coincidencias entre la longitud de la secuencia expuesta en una secuencia identificada seguido por la multiplicación del valor resultante por 100. Por ejemplo, si se compara una secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12 (la longitud de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12 es 770) y el número de coincidencias de es de 693, entonces la secuencia tiene un porcentaje de identidad de 90 (es decir, 693  770 x 100 = 90) con respecto a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12.

Producción de animales transgénicos

En la técnica se conocen bien métodos para generar animales transgénicos de la presente invención (véase, en general, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). En una realización, la generación del ratón transgénico puede implicar opcionalmente la alteración de los genes de APP murina y la introducción de una o más copias del gen que codifica para una APP humana mutada en el genoma murino, preferiblemente en la misma ubicación que el gen de APP murina endógeno.

Los animales no humanos transgénicos de la invención se producen preferiblemente introduciendo transgenes en la línea germina del animal. Pueden usarse células diana embrionarias en diversas fases de desarrollo para introducir los transgenes. Se usan diferentes métodos dependiendo de la fase de desarrollo de la célula diana embrionaria. La(s) línea(s) específica(s) de cualquier animal usado para poner en práctica esta invención se selecciona(n) para lograr una buena salud general, buenos rendimientos de embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión y buena capacidad reproductora. Cuando van a producirse ratones transgénicos, se usan a menudo variedades tales como C57BL/6 o C57BL/6 x DBA/2 F1, o líneas FVB (obtenidas comercialmente de Charles River Labs, Boston, Mass., The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, o Taconic Labs.).

La introducción del transgén en el embrión puede lograrse mediante cualquier medio conocido en la técnica tal como, por ejemplo, microinyección, electroporación o lipofección. Por ejemplo, el transgén puede introducirse en un mamífero mediante microinyección del constructo en los pronúcleos del/de los óvulo(s) de mamíferos fertilizado(s) para hacer que una o más copias del constructo se conserven en las células del/de los mamífero(s) en desarrollo. Tras la introducción del constructo de transgén en el óvulo fecundado, el óvulo puede incubarse in vitro durante cantidades variables de tiempo, o reimplantarse en el huésped sustituto, o ambos. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlos en el huésped sustituto. La reimplantación se logra usando métodos convencionales. Habitualmente, el huésped sustituto se anestesia, y se insertan los embriones en el oviducto. El número de embriones implantados en un huésped particular variará según la especie, pero será habitualmente comparable al número de crías que la especie produce de manera natural.

También puede usarse infección por retrovirus para introducir transgenes en animales no humanos. El embrión no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para infección por retrovirus (Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264). Se obtiene una infección eficaz de los blastómeros mediante tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El sistema de vector viral usado para introducir el transgén es normalmente un retorvirus de replicación defectuosa que porta el transgén (Jahner et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152). La transfección se obtiene fácil y eficazmente cultivando los blastómeros sobre una monocapa de células que producen virus (Van der Putten, citado anteriormente; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). Alternativamente, la infección puede realizarse en una fase posterior. Pueden inyectarse virus o células que producen virus en el blastocele (Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). La mayoría de los fundadores serán un mosaico para el transgén puesto que la incorporación se produce sólo en un subconjunto de las células que formaron el animal no humano transgénico. Además, el fundador puede contener diversas inserciones por retrovirus del transgén en diferentes posiciones en el genoma que se segregarán generalmente en las crías. Además, es posible introducir transgenes en la línea germinal mediante infección por retrovirus intrauterina del embrión a mediados de la gestación (Jahner et al. (1982) citado anteriormente).

Un tercer tipo de célula diana para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria (ES). Pueden introducirse eficazmente transgenes en las células ES mediante transfección de ADN o mediante transfección mediada por retrovirus. Tales células ES transformadas pueden combinarse después de eso con blastocistos de un

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M., et al., J. Biol. Chem. 274: 25945-25952 (1999)).

Se llevó a cabo SDS PAGE usando el sistema de gel Criterion (Bio-Rad) y geles de Tris-Tricina al 16,5% prefabricados (Bio-Rad) a un voltaje constante de 120 V. El medio de ejecución fue Tris-HCl 100 mM, Tricina 100 mM y SDS al 0,1% (pH 8,3). En la figura 4C, se mezcló una muestra 300 M de péptido A(40) A21C/A30C en una razón 1:1 con tampón de carga (Tris-HCl 50 mM, SDS al 1%, glicerol al 20% y azul de bromofenol al 0,23%), y también se preparó una muestra con TCEP 2,5 mM. Se incubó la muestra que contenía TCEP a 95ºC durante 5 min, mientras que se incubó la muestra que carecía de TCEP a temperatura ambiente (21ºC) durante aproximadamente 20 min. Entonces se cargó un volumen de 6 l sobre el gel junto con marcadores peptídicos. Se ejecutó el gel, se fijó en metanol al 50% y ácido acético al 10% (durante aproximadamente 1 h), y se tiñó con azul brillante de Coomassie durante 16 h (Coomassie al 0,1%, 2-propanol al 2,5%, ácido acético al 10%). Tras eliminar la tinción (metanol al 5%, ácido acético al 7%) se analizaron los geles. Tal como se muestra en la figura 4C, ambas muestras migran próximas a la banda del marcador peptídico de 6,2 kDa, demostrando así que sólo se ha formado un enlace disulfuro intramolecular en el péptido A(40) A21C/A30C.

Se midió la espectroscopía de RMN de 15N-HSQC en un espectrómetro Varian Inova 800 MHz con péptido A(40) A21C/A30C marcado con 15N a concentraciones de 50 M y 1,9 mM de oligómeros de bajo peso molecular (con estructura helicoidal), y con una muestra de 50 M y 450 M de oligómeros de alto peso molecular (con estructura ). El espectro en la figura 4D con péptido 50 M es indicativo de un péptido de tipo helicoidal no estructurado, y es similar a los espectros publicados del péptido A de tipo natural (Hou, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 1992-2005 (2003)). Ambos espectros de 50 M son casi idénticos (no mostrado). El espectro de 1,9 mM de oligómeros de bajo peso molecular y el de oligómeros de alto peso molecular 450 M también eran idénticos con sólo unos cuantos picos visibles (no mostrado), indicando que estas estructuras son demasiado grandes para RMN en disolución. Los picos visibles en los dos últimos espectros provienen probablemente de las partes móviles de estos oligómeros.

Tomado conjuntamente, es ejemplo demuestra por tanto que los péptidos según la invención tienen propiedades estructurales muy similares a las del péptido A de tipo natural a pesar de la presencia de un enlace disulfuro intramolecular. Se demuestra que se forma el enlace disulfuro en los ejemplos 1 y 2.

Ejemplo 4. Análisis de CEM de las tendencias oligoméricas del A(40) A21C/A30C.

Se llevó a cabo CEM en la columna Superdex 75 10/300 como en el ejemplo 3. Se hizo funcionar la columna Superdex 75 16/60 columna (GE Healthcare) más grande de manera similar a la columna 10/300 más pequeña, excepto porque se ejecutó a 1,0 ml min-1 y que se cargó 1 ml.

La figura 5 muestra un experimento para someter a ensayo la distribución de oligómeros a una concentración de péptido mayor que la usada en la figura 4A. Se desnaturalizó el péptido A(40) A21C/A30C en cloruro de guanidinio (GdmCl) 6 M, fosfato de K+ 50 mM, NaCl 50 mM (pH 7,2), lo que destruye los oligómeros preexistentes. GdmCl es un compuesto usado de manera rutinaria como desnaturalizante de proteínas. Se inyectó una disolución de péptido desnaturalizado aproximadamente 1,8 mM en la columna Superdex 75 16/60. En la columna, las moléculas de péptido se separan del GdmCl y pueden oligomerizarse libremente. En estas condiciones, el péptido A(40) A21C/A30C eluye como una distribución de estructuras solubles. El pico predominante eluye en una posición que, según el kit de calibración de proteínas (igual que en el ejemplo 3), corresponde a una proteína globular de aproximadamente 42 kDa. De nuevo, se cree que la CEM no proporciona una determinación precisa de los tamaños de péptido A, y estos números sólo pueden usarse en un sentido relativo. La espectroscopía de DC demostró que los oligómeros en este pico tienen una estructura de tipo helicoidal (no mostrado; el espectro de DC de UV lejano es prácticamente idéntico al de la figura 4B). La distribución de estas estructuras helicoidales se extiende hasta especies que eluyen como proteínas de aproximadamente 8 kDa. La especie oligomérica más grande que eluye como una especie de 85 kDa tiene un espectro de DC de UV lejano que concuerda con la estructura  (no mostrado; el espectro de DC de UV lejano de esta fracción es prácticamente idéntico al de la figura 7B).

En un experimento relacionado mostrado en la figura 6A, se cargó una concentración similar de péptido A(40) A21C/A30C desnaturalizado sobre una columna Superdex 10/300. El perfil de elución presenta las mismas características que en la figura 5, aunque con menor resolución. Como comparación, la CEM con la misma muestra desnaturalizada pretratada en primer lugar con -mercaptoetanol aproximadamente 35 mM durante 10 min a temperatura ambiente (21ºC) y sometida a filtración en gel en el mismo tampón complementado con TCEP 5 mM proporciona casi exclusivamente oligómeros de alto peso molecular o protofibrillas que eluyen en el volumen inicial (>100 kDa) (figura 6B). En el espectro de DC de esta fracción predomina la estructura  (no mostrado; el espectro de DC de UV lejano de esta fracción es prácticamente idéntico al de la figura 7B).

La fracción superior del pico oligomérico alrededor de 10,8 ml en la figura 6A, que tiene una concentración de 200 M, se incubó durante 4 días a 4ºC y luego se sometió a filtración en gel de nuevo. El perfil de elución de esta muestra en la figura 6C muestra que se ha establecido un nuevo equilibrio durante este tiempo, y que ahora predomina la especie que eluye como una proteína de 8 kDa. En cambio, la agrupación de todas las fracciones del

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una caja oscura. Tal como se muestra en la figura 9, la detección es máxima en la fracción que aparece más temprano, que corresponde por tanto a la más grande de las especies oligoméricas de alto peso molecular, mientras que el pico de 7-8 kDa no reacciona con el anticuerpo A11.

En un experimento similar mostrado en la figura 10A, se aplicaron 500 l de una disolución de péptido A(40) A21C/A30C aproximadamente 800 M en GdmCl 6 M, fosfato de K+ 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, a una columna Superdex 75 10/300 (GE Healthcare), y se transfirieron las fracciones como anteriormente. De nuevo, el anticuerpo A11 reacciona con la más grande de las especies oligoméricas con estructura . Sin embargo, no reconoce los oligómeros helicoidales. La primera fracción que tenía la capacidad de unión a A11 máxima contenía aproximadamente 20 M de péptido A(40) A21C/A30C. Se incubó esta fracción durante 16 h a 4ºC y luego volvió a analizarse en la misma columna, produciendo el perfil de elución mostrado en la figura 10B que también se sometió a ensayo para determinar la capacidad de unión a A11. Como anteriormente, el anticuerpo A11 tiene una mayor reactividad hacia la más grande de las especies oligoméricas. La figura 10B también demuestra que la formación de oligómeros con estructura  es al menos parcialmente reversible, y que son relativamente estables una vez formados (en analogía con el ensayo de agregación en la figura 8).

Ejemplo 7. Transición de helicoidal a  en A(40) A21C/A30C.

La transición de estructura helicoidal a  está íntimamente relacionada con la oligomerización y fibrilización del péptido A de tipo natural, y con su toxicidad. En disoluciones de péptido A 20-100 M a 4ºC, esta transición se produce espontáneamente en el plazo de 24 horas para A(42) y días para A(40) (Stine, W. B., et al., J. Biol. Chem. 278: 11612-11622 (2003)). Para el péptido A(40) A21C/A30C, esta transición estructural puede acelerarse mediante calor sin que se produzca fibrilogénesis. La figura 11A muestra los dos espectros de DC de un péptido A(40) A21C/A30C 1,1 mM antes (estructura helicoidal) y después (estructura ) de desnaturalizarse mediante un gradiente de 2ºC min-1 de temperatura creciente desde 20 hasta 80ºC y viceversa. La transición se muestra en la figura 11B tal como se monitoriza a 220 nm. En el ejemplo 8 a continuación, se demuestra que las estructuras  así formadas son de tipo protofibrillar. Muchos creen que las protofibrillas son los precursores de las fibrillas (por ejemplo Walsh, D. M., et al., J. Biol. Chem. 274: 25945-25952 (1999)). Debe indicarse que esta muestra no presenta precipitación amorfa ni fibrillas incluso tras este tratamiento duro y a esta concentración. Esta resistencia frente a la fibrilogénesis no tiene precedentes para todos los derivados del péptido A.

Ejemplo 8. Análisis de TEM de oligómeros con estructura helicoidal y  de A(40) A21C/A30C, y especies de tipo protofibrilar.

Se obtuvieron imágenes de TEM mediante un microscopio electrónico LEO 912 AB OMEGA (Carl Zeiss SMT AG) equipado con una cámara MegaView CCD (Olympus). Se usó tinción negativa con acetato de uranilo en todas las muestras. Se activaron rejillas de níquel recubiertas con Formvar/carbono con luz UV durante 5 minutos, tras lo cual se aplicaron 5-10 l de muestra de proteína a cada rejilla durante 2 minutos. Dos etapas de lavado con aproximadamente 10 l de H2O desionizada filtrada precedieron a la tinción. Un tratamiento de dos minutos con disolución de acetato de uranilo al 2% en H2O desionizada filtrada completó la preparación de las rejillas, que se permitió que se secaran al aire durante unos cuantos minutos antes de su almacenamiento o análisis inmediato.

En la figura 12A, se aplicó a las rejillas una disolución aproximadamente 500 M que contenía A(40) A21C/A30C en conformación helicoidal. En la figura 12B, se desnaturalizó a 60ºC durante 20 minutos la misma disolución usada para preparar la muestra en la figura 12A antes de aplicarse a la rejilla. En la figura 12C, se analizó una disolución aproximadamente 150 M de oligómeros de A(40) A21C/A30C con estructura  (obtenida como en el ejemplo 5).

La barra de escala es de 200 nm en la figura 12. Las estructuras esféricas observadas en la figura 12A y la figura 12C son similares en morfología y dimensiones entre sí, teniendo diámetros de 15 nm a 35 nm. También son similares a imágenes de TEM publicadas anteriormente que han usado la misma técnica de tinción. Estas estructuras esféricas de péptido A(40) de tipo natural se observaron recientemente para oligómeros de A(40) que tenían estructura  (Chimon, S., et al., Nature Struct. Mol. Biol. 14: 1157-1164 (2007)). En esta publicación, Chimon et al. reivindican que estas estructuras son la especie tóxica.

Las estructuras observadas en la figura 12B son de tipo protofibrillar, con una dimensiones promedio de 6-7 nm de anchura y aproximadamente 36 nm de longitud (aunque las longitudes varían). Son muy similares en morfología y dimensiones a las protofibrillas de A(40) de tipo natural, que tienen anchuras promedio de 6-10 nm y longitudes de 5-160 nm (Walsh, D. M., et al., J. Biol. Chem. 272: 22364-22372 (1997)).

Ejemplo 9. Ensayo de fibrilación de A(42) A21C/A30C.

El ensayo de fibrilación se llevó a cabo como en el ejemplo 2 con la excepción de que se registraron puntos de datos cada 10 min. La concentración de A(42) A21C/A30C era de aproximadamente 117 M. El resultado se presenta en la figura 13.

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Claims

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