ES2335373A1

ES2335373A1 - If-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento.

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Publication number: ES2335373A1
Application number: ES200701319A
Authority: ES
Inventors: Jose Manuel Cueva Marcos; Alvaro Ortega Moreno; Paula Garcia Huerta
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2010-03-25
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: ES2335373B1

Abstract

IF-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento. La presente invención se refiere al uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido, que codifica para la proteína IF-1, una versión mutante de ésta (H49K) y homólogos de las mismas capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria.

Description

IF-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento.

La presente invención se refiere al uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido, que codifica para la proteína IF-1, una versión mutante de ésta (H49K) y homólogos de las mismas capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria.

Estado de la técnica anterior

Las mitocondrias desarrollan un papel fundamental en el suministro de energía metabólica al sintetizar el ATP celular. La ATP sintasa (ATPasa) es el complejo enzimático de la membrana interna de la mitocondria que lleva a cabo la síntesis de ATP utilizando para ello el gradiente electroquímico de protones generado por la actividad de la cadena respiratoria. Pullman y Monroy (Pullman M.E. and Monroy G.C. (1963) J Biol Chem 238:3762-9) descubrieron una proteína (IF-1) que inhibía la actividad hidrolasa de la ATP sintasa a valores bajos de pH ((Green, D.W., and Grover, G.J. Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1458: 343-355 (2000)).

Posteriormente, se detectó que la versión mutante de IF-1 denominada como H49K (Richard Schinicer et al, Biochem. Biophys. Acta (1996) vol. 1292: 241-249) era capaz de unirse a la ATPasa independientemente del pH de la mitocondria e inhibir la actividad de su diana (Cabezón, E. et al.,(2000) Modulation of the oligomerization state ofthe bovine F1-ATPase inhibitor protein, IF-1, by pH. J. Biol. Chem. 275(33):25460-4).

En años posteriores se observó que se producía una represión específica de la expresión de la subunidad \beta de la ATP sintasa en biopsias de pacientes con cáncer de hígado, colon, pulmón, riñón, mama, estómago y esófago (Cuezva, J.M et al. (2002). The bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor progression. Cancer Res; 62 (22): 6674-6681; Cuezva, J.M et al., (2004). The bioenergetic signature of lung adenocarcinomas is a molecular marker of cancer diagnosis y prognosis. Carcinogenesis, 25, 1157-1163; Isidoro, A et al., (2004). Alteration of the bioenergetic phenotype of mitochondria is a hallmark of breast, gastric, lung and esophageal cancer. Biochem. J; 378 (Pt 1): 17-20; Isidoro A et al., (2005) Breast carcinomas fulfill the Warburg hypothesis and provide metabolic markers of cancer prognosis. Carcinogenesis; 26:2095-104), lo que indicaba que a medida que un tumor se hacía más agresivo la ATP-asa disminuía su expresión en los tejidos tumorales. Estos datos sugerían la posible implicación del fenotipo bioenergético de la mitocondria en los procesos de carcinogénesis y que la inhibición de IF-1 en células tumorales podía originar tumores agresivos o altamente proliferativos.

Explicación de la invención

Los autores de la presente invención han tratado de desarrollar una metodología que permitiera la interferencia con la función bioenergética de la mitocondria a nivel molecular, con el objetivo de obtener tumores agresivos y así conocer mejor la implicación de la mitocondria en los proceso tumorales. Persiguiendo este objetivo, se han llevado a cabo diferentes experimentos de inhibición de la ATP-sintasa, que sorprendentemente han resultado en una inhibición del crecimiento células tumorales, cuando lo esperado habría sido obtener células tumorales altamente proliferativas.

Inicialmente, se han realizado estudios sobre el efecto de la sobre-expresión del inhibidor fisiológico de la ATP sintasa (IF-1) y una forma mutante del mismo (H49K) en dos líneas celulares: NRK (normal) y HepG2 (tumoral), con objeto de determinar la implicación de la fosforilación oxidativa en la progresión tumoral. Para ello, se ha generado y clonado IF-1 (SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5) y el mutante de IF-1, conocido como H49K (SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:7-8), el cual para su correcto procesado en el interior celular fue transfectado en su forma precursora también mutada (SEQ ID NO:4 -en esta secuencia la mutación se encuentra en la posición 74, aunque a lo largo de la descripción nos referimos a ella como H49K; SEQ ID NO:9-10). Los experimentos han demostrado que en las líneas celulares estudiadas, dependientes de la fosforilación oxidativa, la sobre-expresión de IF-1 y H49K en transfección transitoria produce un aumento del flujo glucolítico en ambas líneas, lo que indica una interferencia de IF-1 y H49K con la ATP sintasa y, por tanto, con la provisión de energía metabólica por fosforilación oxidativa.

Sin embargo, sorprendentemente, se ha observado que la sobre-expresión de IF-1 y H49K tiene un efecto diferencial en el potencial de membrana mitocondrial (\Delta\Psim) que es dependiente del tipo celular estudiado. Concretamente, en células NRK la expresión de IF-1 o H49K promueve un aumento de \Delta\Psim que coincide con un aumento de la proliferación celular en ausencia de cambios significativos en la producción de ROS (radicales libres de oxigeno) y, por el contrario, en células HepG2 la expresión de IF-1 o H49K promueve la disminución de \Delta\Psim que coincide con una disminución de la proliferación celular y de la producción de ROS.

Así, un primer aspecto de la presente invención está referido al uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido con al menos un 40% de homología con la secuencia polipeptídica de la proteína IF-1, mutantes de IF-1 o precursores de los mismos, donde dicho polipéptido es capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria. En realizaciones sucesivamente más preferidas de este aspecto de la invención el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene una homología de al menos el 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98% con la proteína IF-1, mutantes de la misma o precursores de los mismos. En una realización aun más preferida, el mutante de IF-1 tiene al menos la sustitución H49K (mutante H49K). Y en una realización todavía más preferida los polinucleótidos, que codifican para polipéptidos homólogos al mutante H49K o precursores del mismo, mantienen la sustitución H49K. En adelante este polinucleótido será denominado como "polinucleótido de la invención".

En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención el polinucleótido de la invención codifica para un polipéptido que tiene al menos un 40% de homología, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%, con la proteína IF-1 o precursores de la misma (polipéptidos homólogos a IF-1), cuya secuencia comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

i): SEQ ID NO:1.

ii): SEQ ID NO:2, ó

iii): R-SEQ ID NO:1, donde R es un polipéptido de direccionamiento a mitocondrias.

En una realización todavía aun más preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido de la invención, que codifica para los polipéptidos homólogos a IF-1, comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

i): SEQ ID NO:5,

ii): SEQ ID NO:6,

iii): R'-SEQ NO:5

iv): R'-SEQ ID NO:5-R'', ó

v): SEQ ID NO:6-R'';

donde R' es un polinucleótido de direccionamiento a mitocondrias y R'' es una secuencia de terminación de la transcripción.

En una realización también más preferida de este aspecto de la invención el polinucleótido de la invención codifica para un polipéptido que tiene al menos un 40% de homología, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%, con el mutante H49K o precursores del mismo (polipéptidos homólogos al mutante H49K), cuya secuencia comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

i): SEQ ID NO:3,

ii): SEQ ID NO:4, ó

iii): R-SEQ ID NO:3, donde R es un polipéptido de direccionamiento a mitocondrias.

En una realización todavía más preferida los polipéptidos homólogos al mutante H49K, codificados por el polinucleótido de la invención, mantienen la sustitución H49K.

En una realización todavía aun más preferida de este aspecto de la invención el polinucleótido de la invención, que codifica para los polipéptidos homólogos al mutante H49K, comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

i): SEQ ID NO:7,

ii): SEQ ID NO:8,

iii): SEQ ID NO:9,

iv): SEQ ID NO:10,

v): R'-SEQ NO:7-8,

vi): R'-SEQ ID NO:7-8-R'', ó

vii): SEQ ID NO:9-I0-R'',

donde R' es un polinucleótido de direccionamiento a mitocondrias y R'' es una secuencia de terminación de la transcripción, cuya secuencia comprende preferentemente la SEQ ID NO:11.

En este aspecto de la invención también queda recogido el uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de fragmentos del polinucleótido de la invención, donde dichos fragmentos mantienen la capacidad de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-sintasa. En adelante estos fragmentos serán denominados como "fragmentos polinucleotídicos de la invención".

Un segundo aspecto de la invención se relaciona con el uso como medicamento del polipéptido codificado por el polinucleótido o fragmentos polinucleotídicos de la invención. En adelante este polipéptido será denominado como "polipéptido de la invención". En una realización más preferida el polipéptido de la invención comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de la misma:

i): SEQ ID NO:1.

ii): SEQ ID NO:2

iii): SEQ ID NO:3

iv): SEQ ID NO:4.

v): R-SEQ ID NO:1 ó 3, donde R es un polipéptido de direccionamiento a mitocondrias.

Un tercer aspecto de la invención se relaciona con el uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un vector caracterizado porque comprende al polinucleótido o fragmentos polinucleotídicos de la invención. En adelante este vector será denominada como "vector de la invención".

Un cuarto aspecto de la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polinucleótidos, fragmentos polinucleótidos, polipéptidos, vectores de la invención o combinaciones de los mismos. En una realización preferida esta composición farmacéutica es empleada para el tratamiento del cáncer.

Un quinto aspecto de la invención se relaciona con el uso de cualquiera de los aspectos de la invención definidos anteriormente o combinaciones de los mismos para la elaboración de un medicamento, preferentemente frente al cáncer.

Un sexto aspecto de la invención se relaciona con un método para el tratamiento del cáncer que comprende suministrar a un individuo una cantidad terapéuticamente del polinucleótido, polipéptido o vector de la invención.

Un séptimo aspecto de la invención se relaciona con el empleo uso del polinucleótido, polipéptido o vector de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Definiciones

El término "polinucleótido", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polímera de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Este término se refiere exclusivamente a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye DNA bi- y mono-catenario, así como RNA bi- y mono-catenario. El término también incluye polinucleótidos derivados que han sufrido procesos de modificación, tales como metilaciones, etc.

El termino "polipéptido" hace referencia a una especie molecular de aminoácidos no referido a una longitud de cadena especifica, incluyendo así a péptidos, polipéptidos o proteínas.

El término "replicón" hace referencia a cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, etc, que se comporta como una unidad autónoma de replicación de un polinucleótido dentro de una célula.

El "vector" es un replicón al que se une al menos un polinucleótido (segmento unido) a fin de producir la replicación o expresión del segmento unido. De este modo, el vector puede comprender, sin ningún tipo de limitación, promotores, inductores, secuencias que permitan el direccionamiento del segmento unido a diferentes partes de la célula tales como la mitocondria o la membrana plasmática, etc. Cuando el vector posibilite la sobre expresión del segmento unido, dicho vector será denominado como vector de sobreexpresión, pudiendo ser dicha sobreexpresión inducible o constitutiva.

El término "secuencia homóloga que mantiene una mutación concreta" está referido a una secuencia con un determinado grado de identidad, respecto a una secuencia de referencia mutada, y que tras ser alineada con ésta se comprueba que también tiene la mutación, aunque dicha mutación pueda localizarse en una posición distinta debido a diferente longitud de las dos secuencias. En la figura 7 pueden apreciarse secuencias homológas en las que el aminoácido H49 ocupa una posición distinta en función del organismo que se trate.

Los términos "ATP sintasa mitocondrial o ATP-asa mitocondrial" a lo largo de la descripción hacen referencia a un mismo complejo enzimático de la membrana interna de la mitocondria que lleva a cabo la síntesis o la hidrólisis de ATP, en función del tipo celular y la condición fisiológica en que se encuentre.

El término "células dependientes de la fosforilación oxidativa" está referido a células que obtienen la mayor parte de su energía metabólica por el proceso de respiración acoplada a la fosforilación oxidativa y cuyo flujo glucolítico aumenta en respuesta a la inhibición de la ATP-asa mitocondrial por oligomicina, o cualquier otro tipo de molécula inhibidora de la ATP-asa.

El término "dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria" está referido a células cuyo potencial de membrana disminuye cuando son tratadas con inhibidores de la ATP-asa.

El término "secuencia de terminación de la transcripción" hace referencia a polinucleótidos que posibilitan la liberación de la ARN polimerasa durante el proceso de transcripción. Estas secuencias pueden comprender sin ningún tipo de limitación: codones de terminación, regiones ricas en timina (colas poli-T), regiones ricas en citosina-guanina, regiones palindrómicas, etc.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Fig 1.- Esta figura muestra la medida del flujo glucolítico en la células NRK (Fig 1-A y B) y HepG2 (Fig 1 C). Fig. 1 A; Incremento en la concentración de lactato en el medio para células tratadas con (cuadrados) y sin (rombos) oligomicina. Fig. 1 B y C; Flujo glucolítico en la presencia (barra negra) y ausencia (barra blanca) de oligomicina. Los resultados son medias \pm SEM de 10-12 experimentos. *, p<0,01 cuando se compara con no-tratadas por la t de Student. Así, los datos muestran una significativa estimulación de la oligomicina sobre el flujo glucolítico basal indicando que estas células son dependientes de la fosforilación oxidativa.

Fig 2.- Esta figura muestra la medida del flujo glucolítico y la expresión de IF-1 y H49K en células transfectas. Fig 2A; Flujo glucolítico en células NRK transfectadas con IF-1, H49K y pcDNA (control). Los resultados son medias \pm SEM de 8 experimentos. *, p<0,05 cuando se compara con controles por la t de Student. Los datos indican el aumento del flujo glucolítico en las células transfectadas con IF-1 y H49K y que no existen diferencias significativas entre las células NRK transfectadas con IF-1 y H49K en cuanto al aumento del flujo glucolítico. Fig 2B; Western Blot de células transfectadas que muestra la sobre-expresión de IF-1 y de H49K. Se muestra la expresión de GAPDH como control de carga.

Fig. 3.- Esta figura muestra la medida del flujo glucolítico en células HepG2 transfectadas con IF-1, H49K y pcDNA (control). Los resultados son medias \pm SEM de 4 experimentos. *, p<0,05 cuando se compara con el control por la t de Student. Los datos indican el aumento del flujo glucolítico en las células transfectadas con IF-1 y H49K y que no existen diferencias significativas entre las células HepG2 transfectadas con IF-1 y H49K en cuanto al aumento del flujo glucolítico.

Fig 4.- Esta figura muestra un análisis del potencial de membrana mitocondrial en células NRK (Fig. 4A) y HepG2 (Fig.4B) transfectadas con IF-1, H49K y pcDNA, indicando la existencia de un efecto diferencial de IF-1 y H49K sobre el potencial de membrana dependiendo del tipo celular que los exprese. Los resultados son medias \pm SEM de 4 experimentos. *, p<0,05 cuando se compara con el control por la t de Student.

Fig 5.- Las figuras muestran el crecimiento de las células NRK (no tumorales) (A) y HepG2 (tumorales) (B) transfectadas con IF-1 (rombo), H49K (cuadrado) y pcDNA (triángulo), observándose una clara disminución en la proliferación celular cuando las células HepG2 expresan IF-1 y su versión mutante (H49K), siendo este efecto más acusado para H49K. Los resultados son medias de dos experimentos.

Fig 6.- Esta figura muestra análisis de la producción de ROS en células transfectadas con IF-1, H49K y pcDNA (control), indicando cómo IF-1 y H49K producen una disminución en los niveles de ROS respecto de los controles en los tipos celulares dependientes de la fosforilación oxidativa (NRK y HepG2). Los resultados son medias \pm SEM de 3 experimentos. *, p<0,05 cuando se compara con los controles por la t de Student.

Fig 7.- Esta figura muestra el alineamiento de secuencias peptídicas de IF-1 y de su precursor para diferentes organismos. En todas estas secuencias se observa cómo el aminoácido 49, que es una histidina (H49), se encuentra conservado para todos los organismos. Dicho aminoácido es el que se encuentra mutado (H49K) en el polipéptido de la invención.

Exposición detallada y modos de realización

La transfección de células dependientes de la actividad ATP-asa con IF-1 y el mutante del mismo H49K, ha revelado un comportamiento metabólico diferencial en función de si la célula transfectada era tumoral o no. Así, se han detectado diferencias en los potenciales de membrana, en los niveles de ROS producidos y en la tasas de proliferación de las células HepG2 (tumoral) y NRK (no tumoral).

En conjunto, los resultados han permitido concluir que en ambos tipos celulares la sobre-expresión de IF-1 o de su forma mutante producen una alteración de la función bioenergética de la mitocondria (Figs. 2 y 3). Es decir, la expresión de estas proteínas (IF-1 o H49K) interfiere la actividad de síntesis de ATP de la H+-ATP sintasa ya que, como en el caso de la oligomicina (Fig. 1), se incrementa el flujo de la vía glucolítica posiblemente para compensar el déficit energético celular que produce la inhibición del complejo.

A continuación se detallan los materiales y métodos que han sido empleados para el desarrollo de la presente invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo de manifiesto la eficiencia de la transfección con H49K en la inhibición de la proliferación de células tumorales dependientes de la fosforilación oxidativa.

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Materiales y métodos Construcción del mutante H49K

Se realizó la mutagénesis dirigida por PCR sobre el clon BC009677.1 de IF-1 de humano utilizando los oligos SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13 como sentido y antisentido, respectivamente. El DNA se clonó en el mismo vector (pCMV-Sport6) y la mutación se confirmó por secuenciación.

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Cultivos y transfecciones celulares

Se emplearon células HEK (riñón embrionario humano), NRK (riñón normal de rata) y Hep G2 (hepatocarcinoma humano) cultivadas en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FCS. La preparación del DNA plasmídico de IF-1, H49K y pCDNA se realizó utilizando el kit maxi de purificación de DNA plasmídico Jet Star 2.0 (Genomed). Para transfectar HepG2 se utilizó el reactivo Jet PEI (Polyplus transfection). Para transfectar NRK se utilizó el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) combinado con Lipofectamina Reagent (Invitrogen). En ambos casos se realizó cotransfección con el plásmido de la proteína verde (GFP) o roja (HcRed1) fluorescente como control de la transfección y/o para la selección por citometría. Se asumió que las células verdes o rojas también habían incorporado el plásmido de interés.

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Determinación del flujo glucolítico

Para medir el flujo glucolítico las células se dejaron crecer durante 24 h antes de incubarlas en presencia o ausencia de oligomicina 6 \muM o de proceder a su transfección con los distintos plásmidos. Se tomaron alícuotas del medio a diferentes tiempos para analizar la producción de lactato.

Las muestras recogidas se precipitaron con ácido perclórico 6% y los sobrenadantes fueron neutralizados y usados para la determinación enzimática del lactato empleando LDH y NAD+.

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Electroforesis de proteínas y ensayos de Western blot

Las células se resuspendieron en tampón de lisis (5 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 0,5% Tritón X-100 con inhibidores de proteasas). Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se fraccionaron en geles del 9% ó 15% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se incubaron con los anticuerpos utilizados en este estudio a las diluciones apropiadas: anti-IF-1 (1:500), anti-Hsp60 (1:2000), anti-GAPDH (1:20.000). Como anticuerpo secundario se utilizó IgGs anti-ratón marcadas con peroxidasa. El revelado se realizó mediante el método potenciado de quimioluminiscencia del ECL (Amersham).

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Medida del potencial de membrana mitocondrial (\Delta\Psim)

Para determinar \Delta\Psim se utilizó la sonda fluorescente TMRM+ (Molecular Probes) a una concentración 0,5 \muM. Se utilizó el agente desacoplante mitocondrial FCCP (5 \muM) para la determinación de la fluorescencia inespecífica. La fluorescencia se midió utilizando el citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) seleccionando sólo las células que emitían fluorescencia en el verde. Se analizaron \sim10.000 células en cada ensayo.

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Medida de la producción de los radicales libres de oxígeno (ROS)

Para analizar la producción de ROS se utilizó la sonda lipofílica fluorescente C-2938 a una concentración final de 5 \muM. Se analizaron por citometría 10.000-30.000 células de las que se seleccionaron aquellas que emitían fluorescencia en el rojo.

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Ejemplo 1 Relevancia del metabolismo energético mitocondrial en células en cultivo

A partir de la secuencia nativa de IF-1 (SEQ ID NO:6) y su mutante de expresión H49K (SEQ ID NO:10), obtenido por mutagénesis dirigida, se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de su expresión sobre el metabolismo energético mitocondrial en células en cultivo. En primer lugar se seleccionaron aquellas líneas celulares que tuviesen dependencia de la fosforilación oxidativa como vía de obtención de energía metabólica. Para ello, se estudió el efecto que la oligomicina tiene sobre el flujo glucolítico en diversas líneas celulares analizando la producción de lactato.

Como resultado de los análisis se pudo comprobar que en las células HEK la oligomicina no promueve variaciones en el flujo glucolítico, al contrario de lo que sucedía con las células NRK y HepG2 donde el flujo glucolítico se estimulaba muy significativamente (Fig. 1a y 1b) y HepG2 (Fig. 1c). Esta circunstancia indica que ambos tipos celulares tienen dependencia de la fosforilación oxidativa como vía de obtención de energía metabólica, puesto que la inhibición de la ATP sintasa produce un aumento del flujo glucolítico, a diferencia de lo que sucede con las células HEK.

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Ejemplo 2 Efecto de la expresión de IF-1 y H49K en el flujo glucolítico de las células

Se transfectaron células NRK con IF-1, H49K y pcDNA (control) con objeto de verificar el efecto de la expresión de estas proteínas en el metabolismo energético celular. De este modo, se pudo comprobar (Fig. 2a) que la expresión de IF-1 y H49K aumenta significativamente (\sim 80%) el flujo glucolítico de las células cuando se compara con las células transfectadas con pcDNA (controles). Además, la sobre-expresión de ambas proteínas se verificó por Western Blot con anti-IF-1 (Fig. 2b), empleándose la expresión de GAPDH como control de carga del gel (Fig 2b).

Resultados muy similares se obtuvieron cuando se transfectaron las células HepG2 (Fig. 3) aunque en este caso el aumento del flujo glucolítico sólo fue significativo cuando se expresaba H49K (Fig.3).

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Ejemplo 3 Efecto de la expresión de IF-1 y H49K en el potencial de membrana de la mitocondria

Se analizó el efecto de la expresión de IF-1 y H49K sobre el potencial de membrana de la mitocondria de células NRK (Fig. 4a) y HepG2 (Fig. 4b) por citometría de flujo. Para este tipo de análisis se hizo la cuantificación del potencial de membrana mitocondrial (\Delta\Psim) tanto de las células que expresaban GFP como del conjunto de las células transfectadas. Se han resumido los datos obtenidos de células verdes, esto es, células que expresan GFP, a los que se les ha restado el valor de fluorescencia en presencia del agente desacoplante FCCP con objeto de detectar específicamente los cambios en \Delta\Psim atribuibles a la acción de los inhibidores de la ATP sintasa. Así, se pudo comprobar que la expresión de IF-1 y H49K en células NRK promueve un aumento de \Delta\Psim cuando se compara con células transfectadas con pcDNA (Fig. 4a) y, por el contrario, la expresión de IF-1 en células HepG2 promovía un descenso de \Delta\Psim, que es aún más acusado cuando se expresa H49K (Fig. 4b).

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Ejemplo 4 Efecto de la expresión de IF-1 y H49K en proliferación celular

Se analizó el efecto de la expresión de IF-1 y H49K sobre la proliferación de células NRK (Fig. 5a) y HepG2 (Fig. 5b), observándose que en células NRK la interferencia con la función bioenergética de la mitocondria estimula la proliferación celular siendo ésta más acusada cuando se expresa H49K (Fig. 5a). Por el contrario, en células HepG2 tumorales se apreció que la expresión de IF-1 y H49K afectaron negativamente a la proliferación celular (Fig. 5b), mas acusado el efecto de la expresión H49K.

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Ejemplo 5 Efecto de la expresión de IF-1 y H49K en la producción de ROS (radicales libres de oxígeno)

Por último, se analizó por citometría de flujo el efecto de la expresión de IF-1 y H49K sobre la producción de ROS en células NRK (Fig. 6a) y HepG2 (Fig. 6b). En ambos tipos celulares se observó que la producción de ROS disminuía con la expresión de los inhibidores de la ATP sintasa.

<110> Universidad Autónoma de Madrid.

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<120> IF-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento.

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<130> ES1595.5

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<160> 13

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<170> PatentIn versión 3.4

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<210> 1

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<211> 81

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens (secuencia polipeptídica IF-1)

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<400> 1

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7

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<210> 2

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<211> 106

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens (secuencia polipeptídica del precursor de IF-1)

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<220>

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<221> Secuencia de direccionamiento a mitocondrias

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<222> (1)..(25)

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<400> 2

8

9

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<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (Secuencia polipeptídica del mutante de IF-1- H49K-)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificada por SEQ ID NO:7 o 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Mutación H49K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)..(49)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (Secuencia polipeptídica del precursor del mutante de IF-1-H49K-)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificada por SEQ ID NO:9 o 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia de direccionamiento a mitocondrias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Mutación H49K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (74)..(74)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (Secuencia codificante de SEQ ID NO:1)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (Secuencia codificante de SEQ ID NO:2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm13

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (mutante de IF-1 H49K-SEQ ID NO:3)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mutación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (144)..(146)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mutación H49K

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (mutante de IF-1 H49K-SEQ ID NO:3-)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mutación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (144)..(146)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mutación H49K

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (precursor del mutante de IF-1 H49K-SEQ ID NO:4-)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mutación H49K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (219)..(221)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm17

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (precursor del mutante de IF-1 H49K-SEQ ID NO:4-)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Mutación H49K

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (219)..(221)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (secuencia de terminación)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> secuencia de terminación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(122)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm22

Claims

```
\global\parskip0.950000\baselineskip
```
1. Uso de un polipéptido inhibidor del crecimiento de células tumorales con al menos un 40% de identidad con:

a.

la proteína IF-1 o precursores de la misma, o

b.

la proteína IF-1 mutada (H49K) o precursores de la misma, donde dicho polipéptido codificado mantiene la mutación H49K,

para la elaboración de un medicamento.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
2. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 donde la identidad es al menos el 80%.
3. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la secuencia de IF-1 o precursores de la misma es seleccionada del grupo:

a.

SEQ ID NO: 1,

b.

SEQ ID NO: 2,

c.

R-SEQ ID NO: 1, donde R es una secuencia de direccionamiento a mitocondrias.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
4. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la secuencia de IF-1 mutada (H49K) o precursores de la misma es seleccionada del grupo:

a.

SEQ ID NO: 3,

b.

SEQ ID NO: 4,

c.

R-SEQ ID NO: 3, donde R es una secuencia de direccionamiento a mitocondrias.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
5. Uso de un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4 para la elaboración de un medicamento.
6. Uso de un polinucleótido aislado según la reivindicación 5 donde su secuencia es seleccionada del grupo:

a.

SEQ ID NO: 5,

b.

SEQ ID NO: 6,

c.

R'-SEQ NO: 5

d.

R'-SEQ ID NO:5-R'', ó

e.

SEQ ID NO: 6-R'';

donde R' es un polinucleótido de direccionamiento a mitocondrias y R'' es una secuencia de terminación de la transcripción.
```
\vskip1.000000\baselineskip
```
7. Uso del polinucleótido aislado según la reivindicación 5 donde su secuencia es seleccionada del grupo:

a.

SEQ ID NO: 7,

b.

SEQ ID NO: 8,

c.

SEQ ID NO: 9,

d.

SEQ ID NO: 10,

e.

R'-SEQ NO: 7-8,

f.

R'-SEQ ID NO: 7-8-R'', ó

g.

SEQ ID NO: 9-10-R'';

donde R' es un polinucleótido de direccionamiento a mitocondrias y R'' es una secuencia de terminación de la transcripción.
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
8. Uso del polinucleótido aislado según cualquiera de la reivindicaciones 6 ó 7 donde R'' comprende la SEQ ID NO: 11.
9. Uso de un vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para la elaboración de un medicamento.
10. Uso del vector según la reivindicación 9, que además comprende al menos una secuencia que permite el control de la expresión del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
11. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, o del vector según cualquiera de la reivindicaciones 9 ó 10 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
12. Composición farmacéutica que comprende:

a.

un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

b.

un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, o

c.

un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10.