JP2015145414A - アミロイドベータペプチド、アミロイドベータペプチドを含む可溶性オリゴマー、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを利用した、疾患の治療に適した化合物の同定方法、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを利用した、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーと反応する結合タンパク質の選択方法、医薬組成物の製造における、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーの使用、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを含む医薬製剤、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを含むワクチン、アミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチド、アミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを含む発現系、およびアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物 - Google Patents
アミロイドベータペプチド、アミロイドベータペプチドを含む可溶性オリゴマー、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを利用した、疾患の治療に適した化合物の同定方法、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを利用した、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーと反応する結合タンパク質の選択方法、医薬組成物の製造における、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーの使用、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを含む医薬製剤、アミロイドベータペプチドあるいは可溶性オリゴマーを含むワクチン、アミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチド、アミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを含む発現系、およびアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】野生型のアミロイドベータペプチドアミノ酸配列中の21および30位のアラニンは、本発明により、分子内ジスルフィド結合をもたらすシステインに置換されている。
【選択図】図1
Description
疎水性 AVLIPFWM
(無極性) [PL DA NL]
極性 GSTCYNQ
(非荷電) [SC HC CL]
極性 DEKRH 正電荷 H K R[OR]
(荷電) [OR] 負電荷 ED
a)試験化合物を提供し、
b)前記試験化合物を本発明のペプチドと接触させ、
c)試験化合物がペプチドと結合し、および/またはペプチドオリゴマーの形成を阻害するかどうかを測定し、
d)タンパク質フィブリルの沈着またはアミロイド病により引き起こされるかまたは関連する疾患の治療に適しているとして前記化合物を同定することを含み得る。
ヒトAβ(40):
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(配列番号:1)
ヒトAβ(42):
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号:2)
ヒトAβ(40)A21C/A30C:
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFCEDVGSNKGCIIGLMVGGVV(配列番号:3)
ヒトAβ(42)A21C/A30C:
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFCEDVGSNKGCIIGLMVGGVVIA(配列番号:4)
前記β−ヘアピン構造を破壊せずにジスルフィド結合により共有結合となり得る、たったの2個の残基である。2つの幾何学的な基準、すなわち(i)結合する位置の間のCα−Cα距離が4.4〜6.8Åの範囲内であり、(ii)同じ2個の残基間のCβ−Cβ距離が3.45〜4.50Åの範囲内であること(Clarke,J.,and Fersht,A.,Biochemistry 32:4322−4329(1993))は、このような安定なジスルフィド結合の良好な取り込みを満足させなければならない。さらに、類似のペプチド工学は、一時的に占有するモノマー種として、または安定なオリゴマー種として、前記ヘアピン構造を形成し得る、全てのAβペプチド誘導体に適用可能であると思われる。したがって、本発明は、野生型の配列を有する、39〜43残基長に相当するA21C/A30C Aβペプチドに限定されず、家族性ADの発生の増加をもたらす天然のAβ−ペプチドの変異体に相当するA21C/A30C Aβペプチドをも含む。これらの変異は、あらゆるAPPの39〜43長ペプチドのAβペプチド誘導体において見いだすことができる。本発明には、E22Gアークティック変異(配列番号:5)、E22Qダッチ変異(配列番号:6)、D23N Iowa変異(配列番号:7)およびイタリアンE22K変異(配列番号:8)を有するA21C/A30C Aβペプチド、ならびに出現すると思われる他の家族性変異が含まれるが、これらに限定されない。さらに、35位にメチオニンスルホキシドまたはスルホンを含む前記配列中のヘアピン構造は本発明により安定化することができる。このメチオニンは、多くにより毒性の本質的要素であると思われる(例えば、Butterfield,D.A.,and Kanski,J,Peptides 23:1299−1309(2002)参照)。
本発明のトランスジェニック動物の作成方法は当業者に周知である(一般的に、Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner,ed.,Oxford University Press,Inc.(2000)を参照されたい)。一実施態様においては、トランスジェニックマウスの作成は、マウスのAPP遺伝子の破壊、および変異型ヒトAPPをコードする遺伝子の1個以上のコピーのマウスゲノム、好ましくは内因性マウスAPP遺伝子と同じ位置への導入を含む。
Putten ら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148−6152)である。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で分割球を培養することにより容易にかつ効率的に得られる(上述したVan der Putten;Stewart ら(1987)EMBO J.6:383−388)。また、感染は後の段階で実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を分割腔に注入することができる(Jahner ら(1982)Nature 298:623−628)。非ヒトトランスジェニック動物を作成する細胞のサブセット内においてのみ組み込みが起こるので、ほとんどの創始細胞はトランス遺伝子についてモザイクであろう。さらに、創始細胞は、ゲノムの種々の位置で、結果において一般的に分離されるであろうトランス遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含むかもしれない。さらに、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖細胞系にトランス遺伝子を導入することも可能である(上述のJahner ら(1982))。
このフィブリル化アッセイは、50、150および250μMの濃度のペプチドをもアッセイし、参考試料中のTCEP濃度を10mM TCEPに上昇させたことを除き、実施例1のように実施した。また、各測定に先立ち、オービタルシェーカーで5分間振盪し(幅5mm)、15分毎にデータポイントを記録した。二重の試料を各濃度において分析し、結果を図3に示す。
50mM K+リン酸塩、50mM NaCl、pH7.2で平衡化したSuperdex 75 10/300カラム(GE Healthcare)によりSECを実施した。流速は0.8mL/分であり、カラムはAKTA Explorerユニット(GE Healthcare)により操作した。全てのカラムの溶出は室温(21℃)で実施した。同様の条件下、低分子量ゲルろ過検定キット(Amersham Biosciences)を用いてカラムを検定した。通常、各溶出の際にペプチド500μLをこのカラムに注入した。
ペプチド内に分子内ジスルフィド結合のみが形成されたことが示された。
Superdex 75 10/300カラムによるSECを実施例3のように実施した。1.0mL/分で溶出し、1mLを装填したことを除き、大きいSuperdex
75 16/60カラム(GE Healthcare)を小さい10/300カラムと同様に操作した。
1mLをカラムに注入し、1.3mL/分で溶出し、Sephacryl S−300 26/60カラム(GE Healthcare)を用いて、実施例3のようにSECを実施した。カラムは、実施例3のように、前もって検定した。6M GdmCl、50mM K+リン酸塩、50mM NaCl,pH7.2中で変性させた、約1.7mMのAβ(40)A21C/A30Cペプチド溶液を大きなカラムに注入し、溶出プロフィールを図7Aに示す。これらの条件下、高分子量画分は、約170kDaおよび80kDaにおいてβ−構造オリゴマーとして溶出するが、コイル状オリゴマーは小さいタンパク質として溶出する。
可溶性Aβ−ペプチドオリゴマーの合成分子模倣物を認識する、精製したウサギ免疫グロブリン(A11ポリクローナル抗体)は、タンパク質の誤った折りたたみの疾患に関与する他のタンパク質内の類似のオリゴマーをも認識すると思われる(Kayed,R.ら、Science 300:486−489(2003))。これらの疾患において、オリゴマー構造は有毒種であると思われるので、これは発症の一般的なメカニズム、それ故、おそらく類似の有毒構造が関与することをも示唆する(Haass,C,and Selkoe,D.J.,Nature Reviews Mol.Cell.Biol.8:101−112(2007);Glabe,C.G.,Trends Biochem.Sci.29:542−547(2004))。
コイルからβ−構造への変換は、野生型Aβペプチドのオリゴマー化およびフィブリル化、ならびにその毒性と密接に関連する。4℃での20〜100μMのAβペプチド溶液において、この変換は、Aβ(42)について24時間以内、Aβ(40)について数日で自発的に起こる(Stine,W.B.ら、J.Biol.Chem.278:11612−11622(2003))。Aβ(40)A21C/A30Cペプチドについては、この構造変換は、原線維が形成することなく、熱により促進され得る。図11Aは、20〜80℃の2℃/分の温度上昇勾配、次いで再び戻すことによる変性の前(コイル状構造)および後(β構造)の、1.1mMのAβ(40)A21C/A30Cペプチドの2つのCDスペクトルを示す。変換は、220nmで観察するように、図11Bにおいて示される。以下の実施例8において、このように形成されたβ構造はプロトフィブリル様であることが示される。プロトフィブリルは、多くの人々によって、原線維の前駆体であると考えられる(例えば、Walsh,D.M.,ら、J.Biol.Chem.274:25945−25952(1999))。この試料が、この厳しい処理およびこの濃度の後でさえ、非晶質の沈殿または原線維を示さないことに留意すべきである。原線維形成に対する、この弾性は、Aβペプチドの全ての誘導体について前例がない。
MegaView CCDカメラ(Olympus)を備えたLEO 912 AB OMEGA電子顕微鏡(Carl Zeiss SMT AG)によりTEM画像を得た。酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色を全ての試料において用いた。Formvar/carbonでコーティングしたニッケルグリッドを5分間のUV光により活性化し、その後、5〜10μLのタンパク質試料を各グリッドに2分間乗せた。フィルター処理した脱イオンH2O 約10μLの2段階洗浄を染色に先行させた。フィルター処理した脱イオンH2O中の2%酢酸ウラニル溶液による2分間の処理でグリッドの調製を完了し、貯蔵または即時の分析前に数分間空気乾燥した。
データポイントを10分毎に記録した以外は、実施例2のようにフィブリル化アッセイを実施した。Aβ(42)A21C/A30Cの濃度は約117μMであった。結果を図13に示す。
実施例5のように、Sephacryl S300 16/60カラム上でSECを実施し、実施例6のようにドットブロットを実施した。結果を図14に示す。
実施例5のようにして得られた、Aβ(40)A21C/A30Cペプチドの80kDaの画分を20μMまで濃縮し、50mM K+リン酸緩衝液、50mM NaClおよび0.05%アジド中、37℃でインキュベートした。試料を、2ヶ月間、定期的な間隔で除去し、分析まで−24℃に貯蔵した。実施例6のようにドットブロットを実施し、結果を図15Aに示す。A11エピトープは、濃縮工程の間に既に急速に生成し、全ての実験の間(約60日間)、安定なままであった。蛍光強度は1日あたり、0.1%だけ減少した。
Claims (17)
- 配列番号:4のアミノ酸17〜21に相当するアミノ酸配列L−V−F−F−C、および配列番号:4のアミノ酸30〜36に相当するアミノ酸配列C−I−I−G−L−M−Vを含み、
配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するアミノ酸であるC(システイン)を含み、アミノ酸21および30に相当するシステイン残基の間にジスルフィド結合を含む、
アミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が保存的置換により配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で置換されているか、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。 - 配列番号:4のアミノ酸17〜36に相当するアミノ酸配列L−V−F−F−C−E−D−V−G−S−N−K−G−C−I−I−G−L−M−Vを含む、請求項1に記載のアミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が保存的置換により配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で置換されているか、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。 - 配列番号:4のアミノ酸1〜40に相当するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のアミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が保存的置換により配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で置換されているか、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸が配列番号:4のアミノ酸21および30に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。 - 配列番号:4のアミノ酸22に相当する位置にグリシン置換を含む、請求項2または3に記載のアミロイドベータペプチド。
- 配列番号:4のアミノ酸35に相当する位置にメチオニンスルホキシド残基置換を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチド。
- (a)1または2個の末端アミノ酸がマレイミド化され;
(b)1または2個の末端アミノ酸がシステイニル化され;
(c)N−末端アミノ酸がアセチル化され;および/または
(d)C−末端アミノ酸がアミド化されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチド。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドを含む可溶性オリゴマー。
- 1)アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
2)クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
3)パーキンソン病、
4)アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患の治療に適した化合物の同定方法であって、
a)試験化合物を提供し、
b)前記試験化合物を、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーと接触させ、
c)前記試験化合物が前記アミロイドベータペプチドまたは前記可溶性オリゴマーと結合するか、および/または可溶性オリゴマーの形成を阻害するかどうかを検査し、
d)ステップc)で、前記試験化合物が前記アミロイドベータペプチドまたは前記可溶性オリゴマーと結合するか、および/または可溶性オリゴマーの形成を阻害するという結果であれば、前記疾患の治療に適しているとして前記化合物を同定する、
ステップからなる同定方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーを利用した、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーと反応する結合タンパク質の選択方法。
- 前記結合タンパク質が、
1)Fab断片、(Fab)2断片、単一鎖Fab断片、単一鎖Fv断片、又または単一鎖Fv二量体のような抗体断片、または
2)アンチカリンの誘導体、アフィボディ、FNfn10、ネオカルチノスタチン、アンキリン反復タンパク質、PDHフィンガー、CDR3グラフト化緑色蛍光タンパク質、及びおよびE.coliペリプラズム結合タンパク質骨格のような、遺伝子工学で設計された非天然の受容体誘導体、
のいずれかである、請求項9に記載の方法。 - 1)アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
2)クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
3)パーキンソン病、
4)アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患の予防的または治療的処置のための免疫を意図する医薬組成物の製造における、場合によりアジュバントと組み合わせた、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーの使用。 - 場合によりアジュバントと組み合わせて、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーの治療的有効量を含む医薬製剤。
- 場合によりアジュバントと組み合わせて、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項7に記載の可溶性オリゴマーを含む、
1)アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
2)クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
3)パーキンソン病、
4)アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患に対して、ヒトを含む哺乳動物を免疫するためのワクチン。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチド。
- 請求項14に記載のヌクレオチドを含む発現系。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物であって、
アミロイドベータペプチドが好ましくは配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9および配列番号:10から選択される、
非ヒトトランスジェニック動物。 - 前記非ヒトトランスジェニック動物が、脊索動物から選択され、好ましくはトランスジェニックマウスである、請求項16に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
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