ES2560302T3 - Sensores para la detección de metabolitos intracelulares - Google Patents

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Abstract

Una célula modificada mediante ingeniería genética con respecto a su tipo salvaje, que comprende una secuencia génica que codifica para una proteína autofluorescente, dependiendo la expresión de la proteína autofluorescente de la concentración intracelular de un metabolito determinado y superproduciendo la célula después de una mutación este metabolito, - en la que la secuencia génica que codifica para la proteína autofluorescente se encuentra bajo el control de un promotor heterólogo, que en el tipo salvaje de la célula controla la expresión de un gen, cuya expresión en la célula de tipo salvaje depende de la concentración intracelular del metabolito, o - en la que la secuencia génica que codifica para la proteína autofluorescente está relacionada funcionalmente con una secuencia de ADN, que a nivel del ARNm puede unirse al metabolito, influyéndose en función de la unión del metabolito al ARNm en la transcripción a lo largo del ADN o en la traducción en los ribosomas.

Description

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regulador de ArgP. La secuencia de ADN del promotor de argO regulado por el regulador de ArgO está reproducida en la SEQ. ID. N.º 15 y la secuencia del regulador de ArgP en sí está reproducida en la SEQ. ID. N.º 16.
Además, en el caso de la célula modificada mediante ingeniería genética de acuerdo con una configuración especialmente preferida de la primera forma de realización puede tratarse de una célula modificada mediante ingeniería genética, preferentemente de una célula de Corynebacterium glutamicum modificada mediante ingeniería genética, que comprende una secuencia génica que codifica para una proteína autofluorescente, que se encuentra bajo el control del promotor de lysE (con respecto al promotor de lysE y su regulador LysG véase Microbiology, 147 (2001), página 1.765). En este caso una concentración intracelular elevada de L-lisina, L-arginina, L-histidina y Lcitrulina lleva a una expresión de la proteína autofluorescente. Una célula de este tipo presenta además del promotor de lysE y de la secuencia génica que se encuentra bajo el control de este promotor para una proteína autofluorescente preferentemente también una secuencia génica que codifica para el regulador de LysG. La secuencia de ADN del promotor de lysE regulado por el regulador de LysG está reproducida en la SEQ. ID. N.º 17 y la secuencia del regulador de LysG en sí está reproducida en la SEQ. ID. N.º 18.
En Corynebacterium glutamicum el gen lysE codifica para un portador secundario, que ni a nivel molecular ni a nivel estructural presenta similitudes con una de las 12 superfamilias de transportadores conocidas, que participan en el flujo de salida están de moléculas orgánicas y cationes. Debido a la función novedosa y la estructura extraordinaria se identificó LysE como primer miembro de una nueva familia de translocadores. Entretanto, a esta familia se asocia en el marco de la secuenciación genómica numerosas proteínas, no obstante, hasta el momento, una función mayormente desconocida aún. La familia de LysE, a la que pertenece LysE, forma con la familia de RhtB y la familia de CadD, la superfamilia de LysE, a la que están asociados hasta el momento en total 22 miembros. De la familia de LysE, el exportador de lisina de Corynebacterium glutamicum puede ser el único miembro funcionalmente característico hasta el momento. A nivel genético se regula lysE mediante el regulador LysG (governing L-lysine export). LysG presenta altas similitudes con proteínas reguladoras bacterianas de la familia de LTTR (LysR type transcriptional regulador). A este respecto, L-lisina actúa como inductor de la transcripción mediada por LysG de lysE. Además de L-lisina, también los dos aminoácidos básicos L-arginina y L-histidina, así como L-citrulina son inductores de la expresión de lysE mediada por LysG.
Además, en el caso de la célula modificada mediante ingeniería genética de acuerdo con la primera forma de realización particular puede tratarse de una célula modificada mediante ingeniería genética, preferentemente de una célula de Escherichia coli modificada mediante ingeniería genética, que comprende una secuencia génica que codifica para una proteína autofluorescente, que se encuentra bajo el control del promotor de fadE o fadBA (con respecto al regulador de FadR en Escherichia coli véase por ejemplo Mol. Biol., 29 (4) (2002), páginas 937-943). En este caso una concentración intracelular elevada de acil-coenzima A lleva a una expresión de la proteína autofluorescente. Una célula de este tipo presenta además del promotor de fadE o fadBA y de la secuencia génica que se encuentra bajo el control de este promotor para una proteína autofluorescente preferentemente también una secuencia génica que codifica para el regulador de FadR. La secuencia de ADN del promotor de fadE regulado por el regulador de FadR está reproducida en la SEQ. ID. N.º 19 y la secuencia del regulador de LysG en sí está reproducida en la SEQ. ID. N.º 20.
También, en el caso de la célula modificada mediante ingeniería genética de acuerdo con la primera forma de realización particular puede tratarse de una célula modificada mediante ingeniería genética, preferentemente de una célula de Bacillus subtilis modificada mediante ingeniería genética, que comprende una secuencia génica que codifica para una proteína autofluorescente, que se encuentra bajo el control del promotor de fadM (con respecto al regulador de FabR en Bacillus subtilis véase por ejemplo J. Bacteriol., 191 (2009), páginas 6.320-6.328). También en este caso, una concentración intracelular elevada de acil-coenzima A lleva a una expresión de la proteína autofluorescente. Una célula de este tipo presenta además del promotor de fadM y de la secuencia génica que se encuentra bajo el control de este promotor para una proteína autofluorescente preferentemente también una secuencia génica que codifica para el regulador de FabR. La secuencia de ADN del promotor de fadM regulado por el regulador de FabR está reproducida en la SEQ. ID. N.º 21 y la secuencia del regulador de FabR en sí está reproducida en la SEQ. ID. N.º 22.
Además, en el caso de la célula modificada mediante ingeniería genética de acuerdo con la primera forma de realización particular puede tratarse de una célula modificada mediante ingeniería genética, preferentemente de una célula de Escherichia coli modificada mediante ingeniería genética, que comprende una secuencia génica que codifica para una proteína autofluorescente, que se encuentra bajo el control del promotor de rhaSR, rhaBAD o rhaT (con respecto al regulador de RhaR y RhaS en Escherichia coli véase por ejemplo J. Bacteriol., 189 (1) (2007), 269271). En este caso una concentración intracelular elevada de ramnosa lleva a una expresión de la proteína autofluorescente. Una célula de este tipo presenta además del promotor de rhaSR, rhaBAD o rhaT y de la secuencia génica que se encuentra bajo el control de este promotor para una proteína autofluorescente preferentemente también una secuencia génica que codifica para el regulador de RhaR o RhaS. La secuencia de ADN del promotor de rhaSR regulado por el regulador de RhaR está reproducida en la SEQ. ID. N.º 23, la secuencia del promotor de rhaBAD en la SEQ. ID. N.º 24, la secuencia del regulador de RhaR en la SEQ. ID. N.º 25 y la secuencia del regulador de RhaS en la SEQ. ID. N.º 26.
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célula se forma la proteína autofluorescente. El gen para la proteína autofluorescente actúa por lo tanto como gen indicador para una concentración de metabolito intracelular elevada.
En la etapa de procedimiento iii) del procedimiento de acuerdo con la invención se identifican por lo tanto células individuales en la suspensión celular con concentración intracelular elevada de este metabolito determinado mediante detección de la actividad de fluorescencia intracelular. Para ello se expone la suspensión celular a radiación electromagnética en aquella frecuencia que excita a las proteínas autofluorescente para la emisión de luz.
De acuerdo con una configuración particular del procedimiento de acuerdo con la invención tiene lugar a continuación, preferentemente directamente a continuación de la identificación de las células en la etapa de procedimiento iii) una etapa de procedimiento adicional iv), en la que las células identificadas se separan a partir de la suspensión celular, teniendo lugar esta separación preferentemente por medio de citometría de flujo (FACS = fluoroescens activated cell sorting), de manera muy especialmente preferente por medio de citometría de flujo de alto rendimiento (HAT-FACS = high througput fluoroescens activated cell sorting). Detalles con respecto al análisis de suspensiones celulares por medio de citometría de flujo pueden extraerse por ejemplo de Sack U, Tarnok A, Rothe G (Hrsg): Zelluläre Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie, Basel, Karger, 2007, páginas 27 -70.
Por medio del procedimiento de acuerdo con la invención es por lo tanto posible, en una suspensión celular, en la que se han generado mutaciones dirigidas o no dirigidas en las células, sin influir en la vitalidad de las células, aislar de manera dirigida aquellas células en las que la mutación ha llevado a una concentración intracelular aumentada de un metabolito determinado.
Una contribución a la solución de los objetivos mencionados al principio la produce también un procedimiento para la producción de una célula modificada mediante ingeniería genética con respecto a su tipo salvaje con producción optimizada de un metabolito determinado tal como se define en la reivindicación 12.
De acuerdo con las etapas de procedimiento I) a IV) se generan en primer lugar células con concentración intracelular elevada de un metabolito determinado mediante mutagénesis y se separan a partir de una suspensión celular, pudiendo remitirse en este caso a las etapas de procedimiento i) a iv) descritas anteriormente.
En la etapa de procedimiento V) se identifican entonces en las células identificadas y separadas por medio del procedimiento de ingeniería genética conocido por el experto, aquellos genes modificados mediante ingeniería genética Gl a Gn o aquellas mutaciones M1 a Mm, que son responsables de la concentración intracelular elevada del metabolito determinado, dependiendo el valor numérico de n o m del número de genes modificados observados o de las mutaciones observadas en la célula identificada y separada. Preferentemente se procede a este respecto de modo que en primer lugar se analiza la secuencia de aquellos genes o secuencias de promotor en las células de las que se conoce que estimulan la formación de un metabolito determinado. En el caso de L-lisina como metabolito estos son por ejemplo los genes lysC, hom, zwf, mqo, leuC, gnd o pyk. Si no se reconoce una mutación en ninguno de estos genes, entonces se analiza todo el genoma de la célula identificada y separada, para identificar opcionalmente otros genes modificados Gi u otras mutaciones Mi. De esta manera pueden identificarse secuencias génicas modificadas ventajosas Gi o mutaciones ventajosas Mi, que en una célula llevan a un aumento de la concentración intracelular de un metabolito determinado.
En una etapa de procedimiento adicional VI) puede producirse entonces una célula modificada mediante ingeniería genética con respecto a su tipo salvaje con producción optimizada del metabolito determinado, cuyo genoma comprende al menos uno de los genes Gl a Gn y/o al menos una de las mutaciones Ml a Mm. Para ello se introduce o introducen uno o varios de los genes G modificados ventajosos, observados en la etapa de procedimiento V) y/o mutaciones modificadas M de manera dirigida en una célula. Esta introducción dirigida de determinadas mutaciones puede tener lugar por ejemplo por medio de sustitución de genes (“gene replacement”). En el caso de este procedimiento se produce una mutación tal como por ejemplo una deleción, inserción o cambio de bases en el gen de interés in vitro. El alelo producido se clona a su vez en un vector no de replicación para el huésped diana y, a continuación, este, mediante transformación o conjugación, se convierte en el huésped diana. Después de la recombinación homóloga por medio de un primer acontecimiento de “cross-over” que provoca la integración, y de un segundo acontecimiento de “cross-over” adecuado, que provoca una escisión en el gen diana o en la secuencia diana, se consigue la incorporación de la mutación o del alelo.
Una contribución a la solución de los objetivos mencionados al principio la produce también una célula con producción optimizada de un metabolito determinado, que se obtuvo mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Una contribución a la solución de los objetivos mencionados al principio la produce también un procedimiento para la producción de metabolitos, que incluye las etapas de procedimiento:
(a) producir una célula modificada mediante ingeniería genética con respecto a su tipo salvaje con producción optimizada de un metabolito determinado mediante el procedimiento descrito anteriormente;
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utilizaron los siguientes dipéptidos: L-alanil-L-metionina (Ala-Met), L-metionil-L-metionina (Met-Met), así como Lalanil-L-alanina (Ala-Ala). Para conseguir diferentes concentraciones de L-metionina, se utilizaron las siguientes relaciones de mezcla: Ala-Met 0,3 mM más Ala-Ala 2,7 mM, Ala-Met 0,6 mM más Ala-Ala 2,4 mM, Ala-Met 0,9 mM más Ala-Ala 2,1 mM, Ala-Met 1,5 mM más Ala-Ala 1,5 mM, Ala-Met 2,1 mM más Ala-Ala 0,9 mM, Ala-Met 2,7 mM más Ala-Ala 0,3 mM, Ala-Met 3 mM, Met-Met 3 mM, que se añadieron al medio CGXII (Keilhauer et al., 1993, J Bacteriol. 175:5595-603). El cultivo tuvo lugar con 0,6 ml de medio a escala de microtitulación (Flowerplate ® MTP48-B) en el sistema BioLector (m2p-labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Alemania). Siete minutos después de la adición de los péptidos se separaron células a partir de 200 l de la suspensión celular mediante centrifugación con aceite de silicona del medio y se inactivaron tal como se describe en Klingenberg y Pfaff (Methods in Enzymology 1967; 10: 680-684). La fracción citoplasmática de las muestras se procesó tal como se describe en Ebbinghausen et al. (Arch. Microbiol. (1989), 151:238-244) y se cuantificó la concentración de aminoácidos por medio de HPLC de fase inversa tal como se indica en Lindroth y Mopper (Anal. Chem. (1979) 51, 1167-11174). La fluorescencia de los cultivos de ATCC13032 pJC1lrp-brnF’eYFP con las diferentes concentraciones de péptido se registró con el sistema BioLector (m2plabs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Alemania). La correlación de la concentración de L-metionina interna con la señal de salida de fluorescencia se muestra en la Figura 6. Puede apreciarse que el plásmido de sensor pJC1lrpbrnF’eYFP permite la detección intracelular de metionina en una región lineal de aproximadamente 0,2-25 mM. Puede detectarse ya una acumulación de metionina por debajo de la región mM (< 1 mM).
Ejemplo 4
Utilización de un sensor de metabolitos para el aislamiento de células con formación de lisina aumentada e identificación de nuevas mutaciones que llevan a la formación de lisina.
a) Construcción de un tipo salvaje recombinante de Corynebacterium glutamicum con el sensor de lisina pSenLysTK-C
El vector pJC1 se describe en Cremer et al. (Molecular and General Genetics, 1990, 220:478-480). Este vector se cortó con BamHIy SalI, y con se ligó con el fragmento de 1.765 kb BamHI-<-EYFP-lysE’-lysG->-SalI (SEQ. ID. N.º 56) sintetizado mediante GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz).
El vector resultante pSenLysTK se digirió con la enzima de restricción BamHI, y se ligó con el fragmento de 2.506 kb BamHI-T7terminator-<-Crimson----lacIQ->-BamHI (SEQ.-ID:-Nr. 57) sintetizado por GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz).
El vector resultante se denominó pSenLysTK-C. Este contiene EYFP como fusión transcripcional y como marcador vivo la proteína Crimson. El plásmido de sensor pSenLysTK-C se introdujo en células competentes del tipo salvaje tal como se describe en Tauch et al. (Curr. Microbiol. 45 (2002), páginas 362-7), y se obtuvo la cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-C.
b) Mutagénesis de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-C
La cepa producida ATCC13032 pSenLysTK-C se cultivó durante la noche en el medio “Difco Brain Heart Infusion” (Difco, Becton Dikinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ EE.UU.) a 30 °C, y 5 ml de este cultivo se mezclaron con 0,1 ml de una disolución de 0,5 mg de N-metil-N-nitroso-N’-nitroguanidina, disueltos en 1 ml de dimetilsulfóxido. Este cultivo se agitó a 30 °C durante 15 minutos. A continuación se separaron por centrifugación las células a 4 °C y
2.500 g, y se resuspendieron en 5 ml de NaCl al 0,9 %. La etapa de centrifugación y la resuspensión se repitieron. A la suspensión celular así obtenida se añadieron 7,5 ml de glicerol al 80 %, y se almacenaron alícuotas de esta suspensión celular mutada a -20 °C.
c) Citometría de flujo de alto rendimiento (HT-FACS = “high throughput fluoroescence activated cell sorting”) y clasificación celular
De la suspensión celular obtenida en b) se añadieron 200 l en 20 ml de medio líquido CGXII-Kan25 (Keilhauer et al., J. Bacteriol. 1993; 175(17):5595-603) y se incubó el cultivo a 30 °C y 180 rpm. Después de 45 minutos se añadió isopropil--D-tiogalactopiranósido en una concentración final de 0,1 mM. Después de incubación adicional durante 2 horas tuvo lugar el análisis de las propiedades ópticas y la clasificación de partículas celulares en el clasificador celular FACS Aria II de Becton Dickinson (Becton Dikinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ EE.UU.). Los ajustes de FACS como límites umbral para “forward scatter”y “side scatter” ascendieron a 500 con una intensificación electrónica de 50 mV para “forward scatter” (filtro ND 1.0) y 550 mV para “side scatter”. La excitación de EYFP tuvo lugar a una longitud de onda de 488 nm y la detección por medio de “parameter gain” (PMT) de 530 a 30 a 625 mV. La excitación de Crimson tuvo lugar a una longitud de onda de 633 nm y la detección por medio de PMT de 660 a 20 a 700 mV. Se clasificaron 2 millones de células Crimson-positivas en 20 ml de CGXII-Kan25 y el cultivo se cultivó durante 22 horas a 180 rpm y 30 °C. A continuación se añadió de nuevo isopropil--Dtiogalactopiranósido en una concentración final de 0,1 mM. Después de 2 horas más se analizaron 18.000.000 células con una velocidad de análisis de 10.000 partículas por segundo en cuanto a la fluorescencia de Crimson y EYFP, y se separaron 580 células que se leyeron automáticamente con ayuda del clasificador celular FACS Aria II
16 5
15
25
35
45
55
65
sobre placas de BHIS-Kan25. Las placas se incubaron durante 16 h a 30 °C. De las 580 células leídas crecieron
270. Todas estas se transfirieron en 0,8 ml de CGXII-Kan25 a placas de microtitulación, y se cultivaron durante 48 h a 400 rpm y 30 °C. Las placas se centrifugaron durante 30 min a 4 °C en el rotor de placas de microtitulación a 4000 x g, los sobrenadantes se diluyeron con agua 1 : 100 y se analizaron por medio de HPLC. Se identificaron 185 clones como formadores de lisina. Para la caracterización detallada se llevó a cabo de nuevo un análisis de 40 de estos clones para detectar la formación de producto en 50 ml de CGXII-Kan25 en matraces con agitación. Mientras que de la cepa de partida ATCC13032 pSenLysTK-C no se separaba nada de lisina, los 40 mutantes forman diferentes cantidades de lisina, en la región de 2 -35 mM (Figura 7).
d) Identificación de mutaciones en lysC, hom, thrB y thrC
Para la caracterización adicional de los 40 mutantes se aisló su ADN cromosómico por medio del kit DNeasy de Quiagen (Quiagen, Hilden, Alemania). El gen lysC se amplificó con los cebadores lysC-32F (SEQ. ID. N.º 58) y lysC1938R (SEQ. ID. N.º 59), y los amplicones se secuenciaron en Eurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Alemania).
lysC-32F 5’-GAACATCAGCGACAGGACAA-3’
lysC-1938R 5’-GGGAAGCAAAGAAACGAACA-3’
Se obtuvieron las mutaciones ya conocidas T311I, T308I, A279T, A279V y A279T. Adicionalmente se obtuvieron las nuevas mutaciones H357Y (cac->tac), T313I (acc->atc), G277D (ggc->gac) y G277S (ggc->agc). Entre paréntesis está indicado en cada caso el triplete codificante del tipo salvaje, y a continuación el mutado correspondiente del mutante.
El gen hom se amplificó con los cebadores hom-289F (SEQ. ID. N.º 60) y thrB-2069R (SEQ. ID. N.º 61), y los amplicones se secuenciaron en Eurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Alemania).
hom-289F 5’-CCTCCCCGGGTTGATATTAG-3’
thrB-2069R 5’-GGCCAGCACGAATAGCTTTA-3’
Se obtuvieron las nuevas mutaciones A346V (gct->gtt), V211F (gtc->ttc), G241S (ggt->agt), A328V (gct->gtt), T233I (acc->atc), así como la mutación doble R158C (cgc->tgc) T351I (acc->atc).
La secuenciación adicional de thrB en los mutantes con el par de cebadores hom-1684F (SEQ. ID. N.º 62) y thrB2951R (SEQ. ID. N.º 63) dio como resultado la nueva mutación S102F (tcc->ttc).
hom-1684F 5’-AGGAATCTCCCTGCGTACAA-3’
thrB-2951R 5’-CCGGATTCATCCAAGAAAGC-3’
La secuenciación adicional de thrC en los mutantes con el par de cebadores thrC-22F (SEQ. ID. N.º 64) y thrC2046R (SEQ. ID. N.º 65) dio como resultado la nueva mutación A372V (gcc->gtc).
thrC-22F 5’-GCCTTAAAACGCCACTCAAT-3’
thrC-2046R 5’-GGCCGTTGATCATTGTTCTT-3’
e) Identificación de una mutación en murE
Para la identificación adicional de mutaciones en mutantes que no presentan mutaciones ni en lysC, ni hom, thrB o thrC, se secuenció adicionalmente murE. El gen murE se amplificó con los cebadores murE-34F (SEQ. ID. N.º 66) y murE-1944R (SEQ. ID. N.º 67), y los amplicones se secuenciaron en GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz).
murE-34F 5’-AACTCCACGCTGGAGCTCAC-3’
murE-1944R 5’-AGAACGCGGAGTCCACG-3’
Se determinó la secuencia génica de murE (SEQ. ID. N.º 69), que presenta una transición de C a T en el nucleótido 361 (ctc->ttc), lo que en la proteína MurE (SEQ. ID. N.º 68) lleva al cambio de aminoácido L121F en la posición 121 de la proteína.
f) Repercusión de la mutación de murE sobre la formación de lisina en el tipo salvaje
Por medio de los cebadores 7-39-L-F (SEQ. ID. N.º 70) y 7-39-R-R (SEQ. ID. N.º 71) se amplificó 1 kb del gen murE con ADN cromosómico del mutante M39 de C. glutamicum del Ejemplo e) y por lo tanto se obtuvo un fragmento de murE, que porta la mutación recién identificada. El amplicón obtenido se clonó a través de BamHIy SalI en el vector pK19mobsacB no de replicación en C. glutamicum (Schäfer et al., Gene 1994; 145:69-73) y se introdujo por medio de recombinación homóloga en el genoma de tipo salvaje (Tauch et al., Curr. Microbiol. 45 (2002), páginas 362-7; Schäfer et al., Gene 1994; 145:69-73). La cepa resultante C. glutamicum Lys39 se cultivó a continuación en 50 ml de
17
BHIS-Kan25 a 30 °C y 130 rpm durante 12 h. A partir de este cultivo se transfirieron 500 l a 50 ml de CGXII-Kan25, y se cultivó de nuevo a 30 °C y 130 rpm durante 24 h. A partir de esto se inocularon los 50 ml de cultivo principal de CGXII con una DO inicial de 0,5 y se cultivó durante 48 h a 130 rpm y 30 °C. El sobrenadante de cultivo se diluyó con agua 1 : 100, y se determinó por medio de HPLC la concentración de L-lisina obtenida en la Tabla 1.
7-39-L-F 5’-TAGGATCCCGACAACATCCCACTGTCTG-3’
7-39-R-R 5’-AAGTCGACGTCTGCTTCTTGCCCAAGG-3’
Tabla 1
Cepa
L-lisina (mM)
C. glutamicum ATCC13032
0,5
C. glutamicum Lys39
3,4
L-lisina en el sobrenadante de C. glutamicum
SECUENCIAS SEC ID Nº 01
imagen13
SEC ID Nº 02
imagen14
SEC ID Nº 03
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SEC ID Nº 04
imagen16
SEC ID Nº 05
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18
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