KR20130096163A - 세포내의 신진대사 산물 감지용 센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자가형광 단백질이 특정 신진대사물질의 세포 내 농도에 의존하는 자가형광 단백질을 위한 유전자 서열 코딩을 포함하며, 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포에 대한 것이다.
본 발명은 또한, 특정 신진대사물질의 증가된 세포 내 농도를 갖는 세포 식별 방법, 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포 생산 방법, 상기 방법에 의해 얻어진 세포, 혼합의 준비를 위한 방법 및 신진대사물질의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

세포내의 신진대사 산물 감지용 센서{Sensors for intracellular metabolite detection}
본 발명은 유전적으로 야생형(wild type)으로 변형된 세포, 특정 신진대사물질의 세포내 농도를 증가시키는 세포의 식별방법, 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포의 생산 방법, 이런 방식으로 얻어진 세포, 신진대사물질의 생산과 그 혼합물을 준비하기 위한 방법과 관련된 것이다.
미생물학적으로 생산된 신진대사 물질은 그 높은 경제성으로 관심의 대상이 되고 있다. 그래서 L-리신(L-lysine), L-테오닌(L-theonine), L-메티오닌(L-methionine)과 L-트리포탄(L-tryptophan) 같은 아미노산(amino acids)은 사료 첨가물로 사용되고 있고, L-글루타메이트(L-glutamate)는 향신료 첨가제로, L-이소루신(L-isoleucine)과 L-타이로신(L-tyrosine)은 의약품 산업에 사용되고 있다. L-아르기닌(L-arginine)과 L-이소루신(L-isoleucine)은 약제로 사용되거나 L-글루타메이트(L-glutamate),L-아스파테이트(L-aspartate)와 L-페니라라닌(L-phenlalanine)은 정제화학약품의 합성을 위한 시작물질로서도 사용되고 있다. 산업적 관점에서 관련된 또 다른 신진대사물질은 옥소글루타르산(oxoglutarate)이다. 이것은 식품보충제로 사용되거나 호르몬과 인슐린의 성장을 촉진시켜주는 아르기닌 α-케토글루타르산(arginine alpha-ketoglutarate)의 전구물로써 사용된다.
이런 신진대사물의 선호되는 생산방법은 미생물을 사용하는 생명공학적 생산이다. 특히, 아미노산(amino acids) 생산에서, 특정 신진대사물질의 생물학적인 활성형(active form)과 시각적인 활성형은 이런식으로 직접 얻어낼 수 있다. 게다가 간단하고 비싸지 않은 원재료들이 이용될 수 있다. 사용되는 미생물들은 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium gluamicum), 이것의 동류인, 플라엄(Flavum)과 ssp. 락토페레멘텀(ssp. lactofermentum(Leibl et al., int. J System Bacteriol. 1991, 41:255 to 260)) 혹은 에세리키아 콜리(Escherichia coli)와 관련된 박테리아이다.
상기 설명된 미생물학적인 방식의 신진대사물의 생산에서, 특정 신진대사물질의 생합성 규칙은 전통적으로는 돌연변이에 의한 변경이다. 그런 돌연변이는 자신의 필요이상으로 생산되고 그 매질 속으로 분비된다. 그래서, 예를 들면, WO-A-2005/059139는 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 계통을 가지고(펜토오스 인산(pentose phosphate) 신진대사 경로를 통해 증가된 신진대사가 L-리신(L-lysine) 생산을 증가시킨다.) L-리신(L-lysine)을 생산을 공개하고 있다. WO-A-97/23597에서, 미생물에서의 L-리신(L-lysine)같은 아미노산의 생산은 외부 운반자(이것들은 이런 아미노산들을 세포로부터 씻어낸다)들의 활동성을 높임으로써 증가된다.
그런 과잉생산자들은 일반적으로 특히 많은 양의 신진대사물질은 만들어내는 돌연변이를 수색함으로써 얻어지고 있다. 이런 수색은 스크리닝(screening)이라고 불린다. 스크리닝에서, 무작위 돌연변이과정들(비표적 돌연변이생성)은 대개 전통적인 화학물질 혹은 물리적 돌연변이 유발요인(예, MNNG 혹은 UV)을 사용하여 압박을 시작함으로써 유도된다. 그리고 돌연변이는 종래의 미생물학적 방법을 사용하여 선택된다. 신진대사물질을 과잉생산을 하게 하는 또 다른 가능성은 표적 유전자 과잉발현(targeted gene over-expressions) 혹은 과잉결실 혹은 경쟁합성경로(competing synthesis pathways)를 회피함으로써 특정 합성경로 강화시키는 것에 있다.
여기서 문제는 특히 비표적 돌연변이생성의 경우에 세포들의 축적에 있어서 세포내 신진대사물질의 합성을 중점적으로 증가시키는 세포 돌연변이를 감지하기 어렵다는 것이다. 이를 위한 스크리닝 방법들은 매우 시간이 많이 소요되고 비용도 크다.
본 발명은 특정 신진대사물질을 과잉 생산시키는 유전적으로 변형된 세포들을 감지하는 것과 연관된 이전의 기술로부터 나온 불리한 점들을 극복하기 위한 연구에 기반을 두고 있다.
특히, 본 발명은 돌연변이 과정 후에 특정 신진대사물질을 과잉생산 시키는 돌연변이체들이 간단한 방식으로 식별될 수 있고, 선택적으로 남아있는 세포들로부터 분리 될수 있는 유전적으로 변형된 세포들을 제공하는데 목적을 두고 있다.
본 발명에서 더 나아간 목표는 특정 신진대사물질의 세포내 농도를 증가시키는 세포의 식별 방법을 제공함에 있다. 이것은 간단하고 작은 비용으로 식별을 가능하게 만드는 것이며 많은 수의 세포들로부터(예를 들면, 셀 서스펜션(cell suspension)으로부터) 마음대로 선택된 한 세포를 분리해 내는 것이다.
본 발명은 또한, 상기에서 설명한 스크리닝에 의해 식별된 유전자나 돌연변이과정에서 나온 특정 신진대사 물질의 최적화된 생산이 가능한 세포를 제공하는데 목표를 두고 있다. 상기 설명된 이런 신진대사물질의 과잉생산을 위해 유리한 만큼 목표화 된 방식으로 도입되거나, 표적 돌연변이과정에 의해 생산된다.
위에서 언급한 목표들을 달성하기 위해서는, 야생형에 대하여 유전적으로 변형되고 자가형광(autofluorescent) 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 포함하되, 상기 자가형광 단백질은 특정 신진대사물질의 세포내 농도에 의존하는 세포를 만들어 내야 한다.
여기서 신진대사물질(metabolite)란 용어는 생화학 대사 경로 중에 있는 중간생산재의 의미로써 일반적으로 사용된다. 아미노산이나 아미노산 파생물 발명에 따라, 예를 들면 L-이소루신(L-isoleucine), L-루이신(L-leucine), L-발린(L-valine), L-리신(L-lysine), L-아르기닌(L-arginine), L-시트루린(L-citrulline), L-히스티딘(L-histidine), L-메티오닌(L-methionine), L-시스테인(L-cysteine), L-트리포탄(L-tryptophan), L-글리신(L-glycine) 또는 O-아세틸-L-세린(O-acetyl-L-serine), 뉴클레오티드(nucleotides) 또는 뉴클레오티드 파생물(nucleotide derivatives)이다. 예를 들어, 크산틴(xanthine), GTP 또는 순환하는 디구아노신 1인산(cyclic diguanosine monophosphate), 지방산(fatty acids) 또는 지방산 파생물(fatty acid derivatives), 예를들면, 아실기 코엔자임 A 티오에스테르(acyl-coenzyme A thioesters), 당분 또는 당 파생물(sugar derivatives), 예를들면, 글루코스(glucose), 람노오스(rhamnose), 리불로오스 재인산염(ribulose bis-phosphate), 베타 D 갈락토시드(beta-D-galactosides) 또는 D-글루코사민 6-인산염(D-glucosamine 6-phosphate), 케토산(keto acids), 예를 들면, 옥소글루타르산(oxoglutarate), 항생물질(antibiotics), 예를들면, 티에나미신(thienamycin), 어빌라미신(avilamycin), 노카디신(nocardicin) 또는 테트라시클린(tetracyclines), 비타민(vitamins) 또는 비타민 파생물(vitamin derivatives), 예를들면, 비오틴(biotin) 또는 티아민 피로인산염 (thiamine pyrophosphate), 또는 푸린 알칼로이드(purine alkaloids), 예를들면, 테오필린(theophylline)이다. 위에서 설명한 신진대사물질의 파생물(derivatives)은 특히 아민(amines), 인산염(phosphates) 혹은 이스터(esters)에 상응하는 혼합물을 의미하는 것으로 이해된다. 매우 선호되는 신진대사물질은 아미노산이다. 특히 L-이소루신(L-isoleucine), L-루이신(L-leucine), L-발린(L-valine), L-리신(L-lysine), L-아르기닌(L-arginine), L-시트루린(L-citrulline), L-히스티딘(L-histidine), L-메티오닌(L-methionine), L-시스테인(L-cysteine), L-트리포탄(L-tryptophan), O-아세틸-L-세린(O-acetyl-L-serine)으로 구성된 그룹과 L-리신(L-lysine), L-아르기닌(L-arginine), L-시트루린(L-citrulline)과 L-히스티딘(L-histidine)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산이다. 본 발명에서 가장 선호되는 신진대사물질은 엘 라이신(L-lysine)이다.
세포의 야생형은 게놈(genome)이 자연적인 진화를 거쳐 형성된 것과 같은 상태에 있는 세포로 이해된다. 용어는 전체세포와 개개의 유전자 모두에 사용된다. 특히 유전자 서열이 최소 사람에 의해 부분적으로(유전자재조합의 방법으로) 조작된 세포나 유전자들은 야생형이란 용어에 해당되지 않는다.
본 발명은 특정 신진대사물질을 과잉 생산시키는 유전적으로 변형된 세포들을 감지하는 것과 연관된 이전의 기술로부터 나온 불리한 점들을 극복할 수 있다.
특히, 본 발명은 돌연변이 과정 후에 특정 신진대사물질을 과잉생산 시키는 돌연변이체들이 간단한 방식으로 식별될 수 있고, 선택적으로 남아있는 세포들로부터 분리 될수 있는 유전적으로 변형된 세포들을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 세포의 첫 번째 전형에 있는 자가형광 단백질(afp)의 유전자 서열이 프로모터(lysE 프로모터)의 통제하에 있는 가능한 구조를 보여준다.
도 2는 예제 1(lysE'eYFP, coding sequence of the LysE'eYFP fusion protein; lysG, coding sequence of the regulator protein LysG; kanR, coding sequence of the kanamycin-mediated resistance; repA: replication origin; BamHI: recognition sequence and cleavage site of the restriction enzyme BamHI)에서 만들어진 벡터 pJC1lysGE'eYFP를 보여준다.
도 3은 예제 1에서 얻어진 ATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP (위) 와 DM1800 p JC1lysGE'eYFP (아래)의 공초점(confocal) 현미경의 이미지를 보여준다.
도 4는 는 리보스위치 요소와 이 리보스위치 요소에 기능적으로 연결된 유전자 서열과 자가형광 단백질에 대한 코딩을 구성하고 있는 리보스위치 요소에 근거한 예제 2에서 생산된 유전자 서열을 보여준다.
도 5는 벡터 pJC1lrp-brnF'eYFP를 보여준다.
도 6은 예제 3에서 얻어진 ATCC13032pJC1lrp-brnF'-eYFP배양체의 형광발광 산출 신호를 가진 내부의 엘메토이오닌(L-methoionine)과의 상관관계를 보여준다.
도 7은 예제 4c)의 ATCC13032pSenLysTK-C을 시작하는 돌연변이체에 의한 L리신(Lysine)의 형태를 보여준다.
본 발명에서, 특히 선호되는 세포들은 코리네박테리움 ( Corynebacterium ), 브레비박테리움(Brevibacterium ),바실루스(Bacillus ),락토바실루스(Lactobacillus ),락토코쿠스(Lactococcus ),캔디다(Candida ),피치아(Pichia ),클루버미세스(Kluveromyces ),사카로미세스(Saccharomyces ),에세리키아(Escherichia ),자이모모나스(Zymomonas ),예로위어(Yarrowia ),메틸로박테리움(Methylobacterium ),랄스토니아(Ralstonia )와 클로스트리윰(Clostridium )이다. 특히 브레비박테리움 플라엄(Brevibacteriumflavum ), 브레비박테리움 락토페르멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 에세리키아콜리 ( Escherichiacoli ), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae ),클루버미세스 락티스(Kluveromyces lactis ),캔디다 블랭키(Candida blankii ),캔디다 로고사(Candida rugosa ), 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum ), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens), 자이모모나스 모빌리스(Zymonomas mobilis ), 예로위어 리폴리티카(Yarrowia lipolytica ),메틸로박테리움 엑스토켄스(Methylobacterium extorquens),랄스토니아 에트로파(Ralstonia eutropha ), 그리고 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 선호된다. 본 발명에 따라 가장 선호되는 세포들은 코리네박테리움( Corynebacterium)과 에세리키아(Escherichia)의 종들이다. 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum ) 과 에세리키아콜리(Escherichiacoli)는 특히 선호되는 박테리아 계통이다.
신진대사물질이 L-리신인 경우에, 유전적으로 변형된 세포들은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032(Corynebacterium glutamicumATCC13032), 코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806(Corynebacterium acetoglutamicumATCC15806), 코리네박테리움 아세토산오필럼 ATCC13870(Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870), 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965(Corynebacterium melassecolaATCC17965), 코리네박테리움 테모아미노유전자 FERMBP-1539(Corynebacterium thermoaminogenes FERMBP-1539),브레비박테리움 플라엄 ATCC14067(Brevibacterium flavumATCC14067),브레비박테리움 락토페레멘텀 ATCC13869(BrevibacteriumlactofermentumATCC13869)과 브레비박테리움 디바리카텀 ATCC14020 (Brevibacterium divaricatumATCC14020)으로 구성된 그룹으로부터 선택에 세포에서 끌어낼 수 있다. 그리고 돌연변이체와 변종은 L-아미노(L-amino)를 만들어낸다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P1709 (Corynebacterium glutamicum FERM-P1709),브레비박테리움 플라엄 FERM-P1708(Brevibacterium flavum FERM-P1708), 브레비박테리움 락토페레멘텀 FERM-P1712(Brevibacterium lactofermentum FERM-P1712), 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P6463(Corynebacterium glutamicum FERM-P6463), 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P6464 (Corynebacterium glutamicum FERM-P6464)과 코리네박테리움 글루타미컴 DSM5715(Corynebacterium glutamicum DSM5715)를 만들어내는 L-리신(L-lysine) 이나 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC21608(Corynebacterium glutamicumATCC21608)를 만들어내는 L-메토이닌(L-methionine)이다. 적절한 Escherichia coli 의 예는 Escherichia coli AJ11442( JP 56-18596 and US 4,346,170 참조), Escherichia coli VL611 와 EscherichiacolistrainWC196(WO-A-96/17930참조)이다.
야생형에 대하여 유전학적으로 변형되고, 자가형광(autofluorescent) 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 포함하되, 자가형광 단백질은 특정 신진대사물질의 세포 내 농도에 의존하는 것을 특징으로 한다.
자가형광 단백질을 코드화하는 기술에 숙련된 사람에게 알려진 모든 유전자서열들은 자가형광 단백질을 코드화하는 유전자서열로써 가능하다. 그린형광단밸질(GFP)같은 Aequora의 형광단백질을 코드화하는 유전자서열들과 다른 파장대(예들들면, 노란 형광 단백질(yellow fluorescent protein), YFP; 파란 형광 단백질(blue fluorescent protein), BFP; 청록 형광 단백질(cyan fluorescent protein), CFP )의 형광성인 혹은 형광성이 강화된 변종들이 특히 선호된다. 다른 자가형광 단백질을 코드화하는 유전자서열들은(예; DsRed, HcRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, AcGFP, ZsYellow. 이는 미국의 프랭클린 레이크스의 BD 생명과학으로부터 알려져 있다.) 더 나아가 본 발명에 의해 사용될 수 있다.
자가형광 단백질의 발현은 특정 신진대사물질의 세포내 농도에 달려있고, 따라서 이런 신진대사물질 농도의 한 기능으로써 세포에 의해 통제될 수 있다는 특징은 본 발명에서 여러 가지 방식으로 실현될 수 있다.
본 발명의 첫 번째 특정 세포의 전형에 따라, 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩의 컨트롤은 전사 레벨(transcription level)에서 특정 신진대사물질의 세포내 농도에 대한 기능으로써 영향을 받는다. 특정신진대사물질의 세포내 농도에 따라, 자가형광 단백질을 형성하기 위해 리보솜에서 변환될 수 있는 대략의 mRNA가 결과적으로 만들어진다.
본 발명의 첫 번째 특정 세포의 전형에 연결되어, 이종기원의 프로모터 영향하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩의 컨트롤은 유전자의 발현을 통제한다. 야생형 세포에서의 발현은 특정신진대사물질의 세포내 농도에 달려있다. 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열은, 또한, 그런 프로모터로부터 나오는 프로모터의 통제하에 있을 수 있다.
"이종기원의 프로모터 통제하에"(under the control of a heterologous promoter) 라는 문구는 자연스런 상태에 있는 프로모터는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 규제하지 않음을 나타낸다. 특히, 야생형 타입의 세포에서, 프로모터 서열은 분리되고 프로모터 효율을 높이기 위해 선택적으로 유전자 변형이 된다. 이런 이유로, "그런 프로모터로부터 나온"(which is derived from such a promoter) 이란 문구는 유전자 변형된 세포에 포함되어 있고, 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 컨트롤하는 프로모터는 야생형 세포에서 동일한 핵산을 포함해야만 하는 프로모터일 필요는 없다는 것을 의미한다. 오히려, 프로모터 효율을 높이기 위해, 이 프로모터 서열은 변형될 수 있다. 예를 들면 삽입, 삭제 혹은 개개의 기반의 교환, 개개의 핵산 서열의 팰린드로마제이션(palindromization)의 의한 것이다. 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 컨트롤하는 프로모터는 유전적으로 변형된 세포자체의 게놈에 포함되어 있는 프로모터로부터 파생되어 나올 필요는 없다. 그럼에도 불구하고, 프로모터가 유전적으로 변형된 세포자체의 게놈에 포함되어 있는 프로모터라면, 전체적으로 이로운 것으로 판단될 수도 있다. 그러나 특정 신진대사물질의 세포내 농도에 따라 결정되는 유전자 발현을 컨트롤한다.
본 발명의 세포의 이런 전형에서, 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 프로모터의 통제하에 있다. “프로모터의 통제 하에(under the control of a promoter)”라는 용어는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 기능적으로 프로모터에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 이런 두가지 서열과 선택적으로 터미네이터(terminator)같은 조절요소(regulative elements)가 순차적으로 배열되어 있다면, 프로모터와 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 기능적으로 연결되어 있다. 조절요소 각각이 핵산서열의 유전자 이식의 발현에 있어서 자신의 기능을 이행할 수 있도록 되어 있다. 이러하기에, 화학적 상식 선에서 직접적인 연결이 필수적인 것은 아니다. 개선제 서열(enhancer sequence)같은 유전적 통제서열이 제거된 포지션으로부터 목표 서열에 대해 혹은 다른 DNA 분자들로부터 그의 기능을 이행할 수 있다. 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 프로모터 서열 뒤(예를 들면 3번째 끝에)에 위치해있는 배열이 선호된다. 그래서 두 서열들은 공유 결합으로 서로 묶여져 있다. 이런 맥락 속에 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩과 프로모터 서열간의 거리는 200 염기쌍 이하가 선호된다. 특히 100쌍 이하가, 그보다는 50쌍 이하가 매우 선호된다. 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩과 프로모터 서열이 이런 두 유전자 서열 사이에 상동의 유전자 부분 서열이 있기 때문에 서로 기능적으로 연결되어 있는 것이 가능하다. (말하자면 야생형 세포에서 발현된 유전자는 프로모터에 의해 규제된다.) 이런 DNA 의 발현에서, 자가형광 단백질로부터의 융합단백질과, 상동의 유전자의 상응되는 부분 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열이 얻어진다. 상동의 유전자의 이런 부분 서열의 길이는 자가형광 단백질의 기능적 수용력의 길이만큼 중요하지는 않다. 말하자면 특정 파장의 빛으로 자극된 상태의 속성은 현격히 손상되지 않는다.
프로모터와 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열의 코딩에 추가로, 본 발명에서 제어자(regulator)를 위한 유전자 서열 코딩을 구성할 수 있다. 제어자는 어떤 방식으로든 신진대사 물질과 프로모터와 교류할 수 있고, RNA 폴리메라아제(polymerase)에 프로모터의 결속된 친화도에 영향을 주는 단백질이 선호된다. 이런 맥락에서 제어자와 프로모터 서열간의 상호 교류는 신진대사 물질의 나타남에 달려있다. 일반적으로 신진대사 물질은 제어자의 특정한 기능적 영역에 존재하게 되어 있고, 이런 식으로 제어자의 형태의 변화에 영향을 끼친다. 제어자는 제어자와 프로모터 서열 사이의 상호 작용에 영향을 끼친다. 이런 이유로 제어자는 원칙적으로 활성제(activator) 혹은 억제제(repressor)가 될 수 있다.
본 발명에서 가능한 프로모터들은 기본적으로 기능적인 연결과 특정 신진대사 물질의 세포내 농도에 따라 결정되는 유전자의 발현을 통해 제어되는 모든 프로모터들이 해당된다. 특히, 유전자의 발현을 제어하는 프로모터가 매우 선호된다. 그 발현은 특정 신진대사 물질의 세포내 농도에 달려 있고, 신진대사 물질의 화학반응을 통하거나, 세포로부터 신진대사 물질을 씻어내어, 신진대사 물질의 세포내 농도를 감소시키는 단백질을 코드화한다. 그러므로 이 단백질은 신진대사물질의 반응이 신진대사의 산물(이는 신진대사 물질과는 다르다)에 촉매작용을 하는 효소(enzyme)이거나, 세포로부터 신진대사물질을 유출시키는데 촉매작용을 하는 활동적인 혹은 수동적인 전달자이다.
더 나아가 프로모터들은 신진대사물질 속에서 특정한 활성제와 교류하는 프로모터가 될 수 있다. 이런 방식으로 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 발현시킨다. 혹은 억제제에 의해 제약을 받는 프로모터들, 특정 신진대사물질과의 상호작용에 의해 프로모터로부터 퍼진 억제제는, 결과적으로 그 제약이 없어지고 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩이 영향을 받는다.
본 발명의 첫 번째 적절한 예는 이제 더욱 자세히 다음에 기술될 것이다. 그러나 본 발명은 다음 예에 국한되지 않음을 강조한다.
첫 번째 예에서, 유적적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)세포가 선호된다. 이 세포는 bkd 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (Pseudomonas putida의 BkdR 제어자 대해, 예를 들면 ,J. Bact.,181(1999) 페이지 2,889-2,894, J. Bact.,187(2005),페이지 664를 참조) L-이소루신(L-isoleucine), L-루이신(L-leucine), L-발린(L-valine) 또는 D-루이신(D-leucine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. bkd 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 BkdR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다.(가지사슬케토산 탈수소효소 제어 단백질 - branched-chain keto acid dehydrogenase regulatory protein) BkdR 제어자에 의해 제어되는 bkd 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 01에서 재생산되고 BkdR 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 02에서 재생산된다.
더 나아가 첫 번째 예에서 유적적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)세포가 선호된다. 이 세포는 ackA 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (CodY 억제제에 대해 Mol . Mic .62(2006) 페이지 811 참조) 여기 또한, L-이소루신(L-isoleucine), L-루이신(L-leucine), L-발린(L-valine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. ackA 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 CodY 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. CodY 활성자에 의해 제어되는 ackA 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 03에서 재생산되고 CodY 활성자 자체의 서열은 SEQ ID No. 04에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유적적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 슈도모나스 푸티다 세포가 선호된다. 이 세포는 mdeA 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (MdeR 제어자에 대해 J. Bacteriol., 179 (1997)페이지 3,956 참조) 여기 또한, L-메테이오닌(L-methionine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. mdeA 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 MdeR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. MdeR 제어자에 의해 제어되는 mdeA 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 05에서 재생산되고 MdeR 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 06에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유적적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미컴 세포가 선호된다. 이 세포는 brnF 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (코리네박테리움 글루타미컴에 있는 Lrp 제어자에 대해 J. Bact., 184 (14) (2002) 페이지 3,947-3,956 참조) L-이소루신(L-isoleucine), L-루이신(L-leucine), L-발린(L-valine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. brnF 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 Lrp 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. Lrp 제어자에 의해 제어되는 brnF 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 07에서 재생산되고 Lrp 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 08에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유적적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 에세리키아 콜리세포가 선호된다. 이 세포는 cysP 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (에세리키아 콜리에 있는 CysB 제어자에 대해 Mol. Mic., 53 (2004),페이지 791참조) O-아세틸-L-세린의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. cysP 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 CysB 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. CysB 제어자에 의해 제어되는 cysP 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 09에서 재생산되고 CysB 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 10에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 에세리키아 콜리세포가 선호된다. 이 세포는 cadB 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (에세리키아 콜리에 있는 CadC 제어자에 대해 Mol. Mic. 51 (2004),페이지 1,401-1,412참조) 카다베린(cadaverine)이나 푸트레신(putrescine) 같은 디아민(diamines)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. cadB 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 CadC 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. CadC 제어자에 의해 제어되는 cadB 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 11에서 재생산되고 CadC 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 12에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미컴 세포가 선호된다. 이 세포는 metY, metK,hom,cysK,cysI 또는suuD 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (코리네박테리움 글루타미컴에 있는 McbR 제어자와 이것에 의해 제어되는 프로모터 서열에 대해 Mol. Mic. 56 (2005), ,페이지 871-887 참조) S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. metY, metK, hom, cysK, cysI 또는 suuD 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 McbR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. McB 제어자에 의해 제어되는 metY 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 13에서 재생산되고MecR 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 14에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 에세리키아 콜리세포가 선호된다. 이 세포는 argO 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. L-리신(L-lysine)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. argO 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 ArgP 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. ArgO 제어자에 의해 제어되는 argO 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 15에서 재생산되고 ArgP 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 16에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미컴 세포가 선호된다. 이 세포는 lysE 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (lysE 프로모터와 이것의 제어자 LysG 대해 Microbiology, 147 (2001),페이지 1,765참조) L-리신(L-lysine),L-아르기닌(L-arginine),L-히스티딘(L-histidine)과L-시트루린(L-citrulline)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. lysE 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 LysG 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. LysG 제어자에 의해 제어되는 lysE 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 17에서 재생산되고 LysG 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 18에서 재생산된다.
코리네박테리움 글루타미컴에서 두번째 운반자를 위한 lysE유전자 코드는 12가지로 알려진 운반자 슈퍼패밀리(superfamilies) 중 하나로 분자레벨이나 구조적 레벨에 있어 비슷함이 없다. 새로운 기능과 특이한 구조를 기반으로 lysE 는 새로운 수송체 패밀리의 첫번째 멤버로써 확인되었다. 게놈 서열의 맥락에서, 지금까지 많은 부분에서 알려진 부분이 없음에도 이 패밀리에 많은 단백질들을 할당하는 것이 가능했다. lysE 가 속한 형태의 lysE 패밀리는 RhtB 패밀리와 CadD 패밀리, LysE 슈퍼 패밀리와 함께 전체 22개의 멤버에게 지금까지 할당되었다.. lysE 패밀리 중에, 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 L-리신 엑스포터 (lysine exporter)는 지금껏 유일하게 기능적으로 특유의 구성원이다. 유전학적 수준에서 lysE 는 제어자 LysG에 의해 제어된다.( L-리신 엑스포터를 지배하는) LysG는 LTTR패밀리의 박테리아 제어자 단백질들과 높은 유사성을 갖고 있다.(LysR 타입 전사제어인자) 이런 이유로, L-리신은 lysE의 LysG 매개 전사(LysG-mediated transcription)의 유도자로써 행동한다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 에세리키아 콜리세포가 선호된다. 이 세포는 fadE 또는 fadBA 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (에세리키아 콜리에 있는 FadR 제어자에 대해 Mol. Biol., 29 (4) (2002),페이지 937-943참조) 아실조효소A(acyl-coenzyme A) 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. adE 또는 fadBA 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 FadR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. FadR 제어자에 의해 제어되는 fadE 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 19에서 재생산되고 LysG 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 20에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 바실루스 서브틸리스 세포가 선호된다. 이 세포는 fadM 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (바실루스 서브틸리스 에 있는 FabR 제어자에 대해 J. Bacteriol., 191 (2009), 페이지 6,320-6,328참조) 아실조효소A(acyl-coenzyme A) 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. fadM 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 FabR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. FabR 제어자에 의해 제어되는 fadM 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 21에서 재생산되고 FabR 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 22에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 에세리키아 콜리세포가 선호된다. 이 세포는 the rhaSR,rhaBAD또는 rhaT 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (에세리키아 콜리에 있는 RhaR 와 RhaS 제어자에 대해 J. Bacteriol., 189 (1) (2007), 269-271 참조) 람노오스 (rhamnose)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. rhaSR, rhaBAD 또는 rhaT 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 RhaR 또는 RhaS 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. RhaR 제어자에 의해 제어되는 rhaSR 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 23에서 재생산되고, rhaBAD프로모터의 서열은 SEQ ID No. 24에서 재생산된다. RhaR제어자의 서열은 SEQ ID No. 25에서 재생산되고, RhaS제어자의 서열은 SEQ ID No. 26에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 아나베나 sp . (Anabaena sp .) 세포가 선호된다. 이 세포는 hetC, nrrA또는 devB 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (아나베나 sp . 에 있는 NtcA 제어자에 대해, J.Bacteriol.,190(18)(2008),페이지 6,126-6,133참조) 옥소글루타르산 (oxoglutarate) 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. hetC, nrrA또는 devB 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 NtcA 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. NtcA 제어자에 의해 제어되는 hetC 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 27에서 재생산되고, nrrA 프로모터의 서열은 SEQ ID No. 28에서 재생산된다. devB 프로모터의 서열은 SEQ ID No. 29에서 재생산되고, NtcA 제어자의 서열은 SEQ ID No. 30에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 마이코박테리아 sp . (Mycobacterium sp .) 세포가 선호된다. 이 세포는 cbbLS-2 또는 cbbLS-1 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (마이코박테리아 sp .에 있는 CbbR 제어자에 대해 , Mol. Micr. 47 (2009), 페이지 297참조) 리불로오스비스포스페이트(ribulose bis-phosphate) 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. cbbLS -2 또는 cbbLS-1 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 CbbR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. CbbR 제어자의 DNA 서열은 SEQ ID No. 31에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 스트렙토미세스 카틀레야(Streptomyces cattleya) 세포가 선호된다. 이 세포는 pcbAB 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (스트렙토미세스 카틀레야에 있는 ThnU 제어자에 대해, Mol.Micr.,69(2008),페이지 633참조) thienamycin 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. pcbA 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 ThnU 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. ThnU 제어자에 의해 제어되는 pcbAB 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 32에서 재생산되고, ThnU제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 33에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 스트렙토미세스 비리도크로모진스(Streptomyces viridochromogenes ) 세포가 선호된다. 이 세포는 aviRa 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (스트렙토미세스 비리도크로모진스에 있는 AviC1 또는 AviC2 제어자에 대해, J. Antibiotics,62(2009),페이지 461참조) avilamycin 의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. aviRa 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 AviC1 and/or AviC2 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. AviC1 and/or AviC2 제어자에 의해 제어되는 aviRa 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 34에서 재생산되고, AviC1 and/or AviC2 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 35에서 재생산된다.
첫 번째 예에서 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 세포, 유전적으로 변형된 노카르디아 유니포미스(Nocardia uniformis ) 세포가 선호된다. 이 세포는 nocF 프로모터 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩으로 구성되어 있다. (노카르디아 유니포미스에 있는 NocR 제어자에 대해, J.Bacteriol.,191(2009),페이지 1,066참조) 노카르딘(nocardicin)의 증가된 세포내 농도는 자가형광 단백질의 발현을 이끈다. nocF 프로모터와 이런 프로모터의 통제하에 있는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열에 추가로, 이런 세포는 또한 NocR 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 포함한다. NocR 제어자에 의해 제어되는 nocF 프로모터의 DNA 서열은 SEQ ID No. 36에서 재생산되고, NocR 제어자 자체의 서열은 SEQ ID No. 37에서 재생산된다.
상기 기술한 프로모터를 구성하는 본 발명의 첫 번째 예에서 보면 기본적으로 세포를 생산하는 데는 다양한 가능성이 있고, 자가형광 단백질을 코드화하는 핵산은 이런 프로모터의 통제 아래에 있다.
첫번째 가능성은 예를 들어 한 세포에서 시작된다. 게놈은 이미 상기 언급한 프로모터들 중에 하나와 해당하는 제어자를 위한 유전자 서열 코딩을 구성하고 나서 세포의 게놈에 자가형광단백질을 위한 유전자 서열 코딩을 도입한다. 이런 유전자 서열은 프로모터의 통제하에 있다. 적절하다면 게놈으로 자가형광단백질을 위한 유전자 서열 코딩의 통합 전에 또는 후에, 프로모터의 효율성을 높이기 위해 하나 이상의 뉴클레오티드 교환, 삭제 혹은 삽입에 의해 프로모터 자체의 핵산 서열은 변경될 수 있다.
두번째 가능성은 예를 들어 세포에 하나 이상의 핵산 구조를 도입하는 것에 있다. 이 핵산 구조는 프로모터 서열과 유전자 서열을 구성하고 있다. 여기서 자가형광단백질을 위한 코드는 프로모터의 통제하에 있다. 또한, 프로모터의 효율성을 높이기 위해 하나이상의 뉴클레오티드 교환, 삭제 또는 삽입에 의해 체의 핵산 서열을 수정하는 것이 가능하다. 핵산 구조의 삽입은 염새체로(chromosomally) 또는 염색체외적(extrachromosomally)(예를 들면 염색체외로 자기 복제되는 매개체(vector)로)으로 발생할 수 있다. 적절한 매개체들은 특정 박테리아 종에 자기 복제되는 것들이다. 많이 알려진 플라스미드 매개체들(plasmid vectors)는, 예를 들어, pZ1 (Menkel et al., Applied 와 Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) 또는 pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)), 수수께끼 같은 플라스미드, pHM1519, pBL1 또는 pGA1를 기반으로 하고 있다. 다른 플라스미드 매개체들은, 예를 들어, pCG4 (US 4,489,160), 또는 pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), 또는 pAG1 (US 5,158,891)를 기반으로 하는, 같은 방식으로 이용될 수 있다. 그러나 이 목록은 본 발명에 국한되지 않는다.
프로모터를 구성하고 있는 유전자 구조체의 생산과 이런 프로모터의 통제하에 있는 유전자 서열에 대한 설명, 세포의 염색체안으로 이런 구조체를 씻어 내거나, 이런 유전자 구조체를 구성하고 있는 복제하는 매개체를 염색체외로 씻어 내는 것은 숙련된 사람에게는 충분히 알려져 있다. 예를 들면, 마틴(Martin) 외(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), 구레로(Guerrero)외 (Gene 138, 35-41 (1994)), 츄치야(Tsuchiya)와 모리나가(Morinaga) (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), 에키만스(Eikmanns)외 (Gene 102, 93-98 (1991)), EP-A-0 472 869, US 4,601,893, 슈와져(Schwarzer) 와 퍼러(Puhler) (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), 렘치드(Remscheid)외 (응용 미생물학과 환경미생물학60, 126-132 (1994)), 라베레(LaBarre)외 (박테리아 저널175, 1001-1007 (1993)), WO-A-96/15246, 말럼브레(Malumbres)외 (유전자 134, 15-24 (1993), JP-A-10-229891, 젠슨(Jensen) 과 해머(Hammer) (Biotechnology 와 Bioengineering 58, 191-195 (1998)) 그리고 유전학과 분자생물학 교과서에 알려져 있다.
본 발명의 두 번째 예에서 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열의 코딩에 대한 컨트롤은 이른바 리보스위치(riboswitch )의 도움을 받아 특정 신진대사 물질의 세포내 농도의 한 기능으로써 영향을 받는다. 전사레벨(transcription level)과 트랜스레이션 레벨(translation level)에서 이런 리보스위치를 가지고 제어되는 발현이 가능하다. 리보스위치는 mRNA를 독점적으로 구성하고 있는 제어 요소로써 이해된다. 이것은 센서로써 동시에 제어 요소로써 작동한다. 리보스위치의 개요는 예를 들어, 비트레착(Vitrechak)., TrendsinGenetics,20(1)(2004),페이지 44-50에서 개시된다. 리보스위치를 이용하는 유전자 발현 제어에 대한 더욱 자세한 것은 조나스 노에스케(Jonas Noeske (2007))의 논문, "Strukturelle Untersuchungen an Metabolit-bindenden Riboswitch-RNAs mittels NMR"에서 개시된다. 이 논문은 프랑크푸르트암마인에 있는 요한 볼프강 괴테 대학의 생화학, 화학, 약학 학부에 제출되었다.
본 발명의 두 번째 예에서 리보스위치는 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩이 DNA 서열에 따라 기능적으로 결합되는 식으로 세포 내에서 사용될 수 있다. DNA 서열은 신진대사 물질을 mRNA레벨에서 DNA에 따른 전사(transcription)나 mRNA에 신진대사물질을 결합하는 기능으로써 영향을 받는 리보솜의 변형으로 결합할 수 있다. 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩의 발현은 전사레벨 혹은 같은 방식의 트랜스레이션레벨에서 리보스위치에 의해 제어된다. 리보스위치 요소들에 관련한 본 발명의 세포내에서, 신진대사물질은 mRNA의 5'-UTR에 있는 구조화된 영역에 어떤 단백질 요소들의 개입 없이 직접적으로 결합되고 RNA 두번째 구조의 변화를 유도한다. 5'-UTR에서 구조의 이런 변화는 다음의 자가형광 단백질에 대한 유전자 코딩의 발현에 대한 모듈레이션(modulation)을 이끈다. 이런 이유로, 유전자를 제어하는 행위는 전사 또는 변형에 영향을 미치는 것에 의해 달성될 수 있다. 또는 RNA 프로세싱(processing)이 적절하다면. 리보스위치(앱타머 영역-aptamer domain)의 신진대사물질이 결합되는 영역은 모듈식의, 독립적인 RNA 영역이다. 리보스위치(발현 플랫폼-expression platform)의 남은 부분은 대개 앱타머 영역의 하류(downstream)에 놓여있다. 신진대사물질이 앱타머 영역에 결합되어 있는지 아닌지에 따라, 발현 플랫폼은 앱타머 영역에 염기짝짓기(base pairings)로 들어갈 수 있다. 발현 플랫폼과 앱타머 영역 사이의 대부분의 염기짝짓기는 신진대사 물질에 결합되지 않은 상태에서 발생하고, 유전자 발현의 활성화를 이끈다. 반대로 이런 염기짝짓기는 대개 유전자 발현을 억제시키는 리간드결합(ligand-bound)상태에 방해를 받는다. 제어 매커니즘이 전사나 변형에 영향을 갖는지는 두번째 구조에 따라 결정된다. 발현 플랫폼은 신진대사물질 결합 상태 또는 결합되지 않는 상태를 취하게 된다. 발현 플랫폼은 자주 전사 종결자(transcription terminator)와 전사 반종결자(transcription antiterminator)를 형성할 수 있는 서열들을 포함한다. 그러나 이 두 구조는 서로 상호 배타적이다. 자주 발생하는 또 다른 주제는 SD서열(Shine-Dalgarno 서열)이 신진대사물질 결합상태에 따라, 단사구조 형태(single-stranded form)나 가려진(masked) 구조로 변환되는 두 번째 구조이다. SD서열이 두번째 구조의 형태에 의해 가려진다면, SD 서열은 리보솜에 의해 인식될 수 없다. 전사의 너무 이른 중단 또는 변환의 시작은 이런 방식으로 리보스위치에 의해 제어될 수 있다.
전사레벨이나 트랜스레이션레벨에서 자가형광 단백질의 발현에 대한 가능한 통제를 수행하는 적절한 리보스위치 요소들의 예는 다음과 같다. 바실루스 서브틸리스로부터 라이신 리보스위치 (Grundy외에 의해 개시됨,2009), 바실루스 서브틸리스로부터 글라이신(glycine) 리보스위치 (Mandald외에 의해 개시됨, Science306(2004),페이지 275-279), 바실루스 서브틸리스로부터 아데닌(adenine)리보스위치 (Mandal과 Breaker, Nat . Struct . Mol . Biol .11(2004),페이지 29-35) 또는 Bacillus anthracis 로부터 TPP 탠덤(tandem) 리보스위치 Bacillus anthracis (Welz 와 Breaker에 의해 개시됨, 13 (2007), 573-582). 이렇게 자연스레 발생하는 리보스위치 요소들에 추가로, 합성 리보스위치 요소들은 예를 들면, 테오필린(theophylline) 리보스위치( Jenison 외에 의해 개시됨,Science 263(1994), 페이지1,425-1,429 또는 Desai와 Gellivan, J. AM. Chem.Soc 126(2004), 페이지 1.3247-54), 비오틴(biotin)리보스위치 (Wilson외에 의해 개시됨,Biochemistry 37(1998), 페이지14,410-14,419) 또는 테트(Tet)리보스위치(Berens외에 의해 개시됨 ,Bioorg . Med . Chem. 9 (2001), 페이지 2,549-2,556).
위에 언급된 목적을 달성하려는 노력은 셀 서스펜션(cell suspension)에서 특정 신진대사물질의 증가된 세포내 농도를 갖는 세포의 식별을 위한 방법을 만들어 내는 것에 있다. 그것은 다음 단계를 따른다.
i) 본 발명에서 설명하고 있는 야생형에 대하여 유전적으로 변형되고 자가형광 단백질을 위한 유전자 서열 코딩을 구성하고 있는 셀 서스펜션의 공급, 자가형광 단백질의 발현은 특정 신진대사 물질의 세포내 농도에 따라 결정된다;
ii) 셀 서스펜션을 얻기 위해 세포들의 유전적 변형, 이 세포들은 특정신진대사 물질의 세포내 농도에 대해서는 다르다;
iii) 세포내 형광발광 활동의 감지에 의해 이런 특정 신진대사 물질의 증가된 세포내 농도를 유발시키는 셀 서스펜션에서 개개의 세포들의 식별.
본 발명의 단계 i)에서, 배양매체(nutrient medium)와 상기 설명된 많은 수의 유전적으로 변형된 세포들을 구성하고 있는 셀 서스펜션은 첫 번째로 제공된다.
본 발명의 단계 ii)에서 셀 서스펜션에서 하나 또는 그 이상의 세포들은 셀 서스펜션을 얻기 위해 유전적으로 변형된다. 그 세포들은 특정 신진대사물질의 세포내 농도 대해서와는 다르다.
셀 서스펜션의 유전적 변형은 표적 또는 비표적 돌연변이 생성에 의해 이행된다. 특히 비표적 돌연변이가 선호된다. 표적 돌연변이 생성에서, 돌연변이 과정은 아주 세심히 관리된 방식으로 세포의 특정 유전자에서 만들어진다. 가능한 돌연변이 과정은 전이(transitions), 염기전환(transversions), 삽입과 삭제이다. 엔자임(enzyme)활동에서 아미노산 교환의 영향에 따라, "미스센스 돌연변이(missensemutations )" 또는 "넌센스 돌연변이(nonsensemutations )"로 불린다. 한 유전자에서 적어도 한 염기쌍의 삽입 또는 삭제는 잘못된 아미노산이 포함되거나 변환이 너무 이르게 중단됨으로써 "틀 이동 돌연변이(frame shift mutations )"를 이끈다. aucaucr의 코돈(codons)의 삭제는 전형적으로 엔자임 활동의 완벽한 소실을 이끈다. 그런 돌연변이 과정을 만들어내는 지침들은 과거 기술에 속하고, 유전학 교과서와 분자생물학 교과서에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, Knippers의 책 ("MolekulareGenetik", 6판 ,GeorgThieme-Verlag,슈트트가르트,독일,1995), Winnacker의 책("GeneundKlone",VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,독일,1990) 또는 Hagemann의 책("AllgemeineGenetik",Gustav Fischer-Verlag,슈트트가르트,1986)
표적 돌연변이를 생성하는 방법과 관련된 유용한 참고물에 대한 자세한 것은 예를 들면, DE-A-102 24 088에서 찾아볼 수 있다.
그러나 본 발명에서는 단계 ii)에서의 유전적 변형이 비표적 돌연변이생성에 의해 수행되는 것이 특히 선호된다. 비표적 돌연변이생성의 예는 N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine 같은 화학물질이 있는 세포의 처리 또는 자외선으로 세포를 투사하는 것이다. 돌연변이를 유도하는 이런 방법들은 일반적으로 알려져 있고 Miller("A Short Coursein Bacterial Genetics,A Laboratory Manual 과 Handbook for EscherichiacolI 와 Related Bacteria"(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992))에 있는 inter alia 또는 American Society for Bacteriology의 "Manual of Methods for General Bacteriology"(WashingtonD.C.,USA,1981)에서 개시되어 있다.
단계 ii)에서 세포의 유전적 변형에 의해, 세포 내에서 발생해온 돌연변이 과정의 본질에 따라, 예를 들면 증가된 또는 감소된 엔자임 활동의 결과로 특정 엔자임의 발현이 증가되거나 감소되고, 특정 전달자 단백질의 활동이 증가되거나 감소되고, 특정 전달자 단백질의 발현, 제어자 단백질에서 돌연변이 과정, 구조 단백질에서 돌연변이 과정, RNA통제인자에서 돌연변이 과정이 증가되거나 감소되고, 프로모터를 통해 해당되는 제어자 단백질과 상호작용하며 또는 리보스위치 요소와 상호작용하여 자가형광 단백질의 발현에 영향을 주는 신진대사물질의 세포내 농도가 증가 할 수 있다. 특정 신진대사물질의 농도가 돌연변이 과정의 결과로써 증가되므로, 세포는 이런 세포 내에서 형성된 자가형광 단백질과는 구별된다. 따라서 자가형광 단백질에 대한 유전자는 증가된 세포내 신진대사물질의 농도를 위해 리포터 유전자로써 행동한다.
본 발명의 단계 iii)에서, 이런 특정 신진대사물질의 세포내 농도를 증가시키는 셀 서스펜션에 있는 개별 세포들은 그러므로 세포내 형광발광 활동의 감지에 의해 식별된다. 이를 위해, 셀 서스펜션은 자가형광 단밸질을 자극시켜 빛을 방출시키는 주파수의 전자기 방사선에 노출된다.
본 발명에서 방법의 특정 배열에 따르면, 단계 iii)에서 세포의 식별 후에 직접적으로 단계 iv)가 수행되고, 식별된 세포들은 셀 서스펜션으로부터 분리되고, 이런 분리는 유동 세포 분석법(flow cytometry) (FACS = fluorescence activated cell sorting)의 도움으로 선호적으로 이행된다. 특히 고성능 유동 세포 분석법(HAT-FACS = high throughput fluorescence activated cell sorting)이 선호된다. 유동 세포 분석법에 의한 셀 서스펜션의 자세한 분석은, 예를 들면 Sack U, Tarnok A, Rothe G (eds.): Zellulare Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie, Basel, Karger, 2007, 페이지 27 - 70에 개시되어 있다.
본 발명의 방법에 따라, 표적 또는 비표적 돌연변이 과정이 생성되는 셀 서스펜션에서 세포의 활력에 영향을 주지 않고, 표적화된 방법으로 분리시키는 것이 가능하다. 그런 세포들에서 돌연변이 과정은 특정 신진대사물질의 증가된 세포내 농도를 이끈다.
상기 언급된 목적을 달성하려는 노력은 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포 생산 방법을 만드는 것에 있다. 그것은 다음 단계를 따른다.
I) 상기 설명한 야생형에 대하여 유전적으로 변형되고 자가형광 단백질(이것의 발현은 특정 신진대사 물질의 세포내 농도에 따라 결정된다)에 대한 유전자 서열 코딩을 구성하고 있는 세포를 구성하고 있는 셀 서스펜션의 제공.
II) 셀 서스펜션을 얻기 위해 세포들(이 세포들은 특정신진대사 물질의 세포내 농도에 대해서와는 다르다)의 유전적 변형;
III) 세포내 형광발광 활동의 감지에 의해 이런 특정 신진대사 물질의 증가된 세포내 농도를 유발시키는 셀 서스펜션에서 개개의 세포들의 식별.
IV) 셀 서스펜션으로부터 식별된 세포의 분리
V) 유전적으로 변형된 유전자 G1에서 Gn , 또는 식별되고 특정 신진대사 물질의 증가된 세포내 농도에 대해 책임이 있는 분리된, 세포들의 돌연변이 과정 M1에서 Mm 의 식별
VI) 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포(게놈이 최소한 유전자 G1에서 Gn , 중에 하나, 그리고/또는 최소한 돌연변이 과정 M1에서 Mm 중에 하나를 구성하고 있는)의 생산.
단계 I)에서 IV)에 따르면, 특정 신진대사 물질의 세포내 농도를 증가시키는 세포들은 돌연변이 생성에 의해 처음으로 만들어지고 셀 서스펜션으로부터 분리된다.
단계 V)에서, 식별되고 분리된 세포에서, 유전적으로 변형된 유전자 G1에서 Gn, 특정 신진대사 물질의 증가된 세포내 농도에 대해 책임이 있는 돌연변이과정 M1에서 Mm 은 관찰되는 변형된 유전자의 수에 따라 n과 m의 수치와 식별되고, 분리된 세포에서 관찰되는 각각의 돌연변이 과정에 숙련된 사람에게 알려진 유전적 방법으로 식별된다. 이런 이유로 절차는 특정 신진대사 물질의 형성을 자극하는 것으로 알려진 세포내의 유전자들의 서열이나 프로모터의 서열이 처음으로 분석된다. 신진대사물질로써 L-리신의 경우에, 이것들은 예를 들어, 유전자 lysC, hom, zwf, mqo, leuC, gnd 또는 pyk 이다. 만약 이런 유전들에서 돌연변이가 인식되지 않는다면, 식별되고 분리된 세포의 전체 게놈은 적절한 선에서 식별되기 위해 더 변형된 유전자 Gi 또는 더 돌연변이 된 Mi이 분석된다. 이로운 변형된 유전자 서열 Gi 또는 세포에서 특정 신진대사 물질의 세포내 농도를 증가시키는 이로운 돌연변이 된 Mi 은 이런 방식으로 식별될 수 있다.
더 나아간 단계 VI)에서, 게놈은 최소한 유전자 G1에서 Gn그리고/혹은 최소한 돌연변이 과정M1에서 Mm 중에, 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포가 생산될 수 있다. 이를 위해 하나 이상의 이로운 유전자 G 그리고/혹은 단계 V)에서 관찰된 변형된 돌연변이 M은 목표화된 방식으로 세포 속으로 도입된다. 이런 특정 돌연변이의 목표화된 도입은 예를 들면, 유전자 대체(gene replacement)를 가지고 이행될 수 있다. 이런 방식으로, 예를 들면 삭제, 삽입, 또는 염기 교환 같은 돌연변이과정은 시험관에서 진행되어 만들어진다. 생산된 대립형질(allele) 유전자는 차례로 목표 호스트를 복제하지 않고, 이것은 다시 변환과 활용에 의해 목표 호스트로 전화되는 매개체(vector)로 복제된다. 통합에 영향을 주는 첫 번째 “크로스 오버(cross - over )”에 의한 상동의 재조합과 적절한 목표 유전자의 또는 목표 서열의 제거에 영향을 주는 두 번째 “크로스 오버” 후에, 돌연변이나 대립형질의 유전자의 결합이 달성된다.
상기 언급한 목적을 이루기 위해서는 앞서 언급한 방법에 의해 얻어진 특정 신진대사 물질의 최적화된 생산이 되는 세포를 만들어야 한다.
상기 언급한 목적을 이루기 위해서는 신진대사 물질의 생산을 위한 프로세스를 만들어야 한다. 구성되는 방법은 다음과 같다:
(a) 상기 언급한 방법을 가지고 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포의 생산;
(b) 세포가 영양분에서 특정 신진대사 물질을 만들어내는 조건하에 있는 배양매체(cluture medium)에 있는 세포의 배양
본 발명의 단계 (a)에서 생산된 특정 신진대사 물질의 최적 생산된 유전적으로 변형된 세포들은 신진대사 물질의 생산을 위해 연속적으로 배양될 수 있고, 또는 비연속인 일괄방식으로(batch cultivation), 또는 페드 방식으로(Feed method), 또는 반복적인 페드 일괄방식으로(repetitive feed method) 단계 (b)의 배양매체(nutrient medium)에서 배양될 수 있다. GB-A-1009370에 설명된 것 같은 반연속적인(semi-continuous)방법 또한 가능하다. 알려진 배양 방식의 요약은 Chmiel("Bioprozesstechnik1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik " (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))의 교과서 또는 StorhasStorhas ("BioreaktorenundperiphereEinrichtungen ",ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)의 교과서에 개시되어 있다.
사용될 배양기는 적절한 방식으로 특정 종의 요구사항을 반드시 맞추어야 한다. 다양한 미생물의 배양기에 대한 설명은 American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)의 "Manual of Methods for General Bacteriology" 핸드북에 개시되어 있다.
배양기는 포도당(glucose), 자당(sucrose), 젖당(lactose), 과당(fructose), 맥아당(maltose), 당밀(molasses), 녹말(starch) 같은 탄수화물(carbohydrates) 그리고 셀루로오스(cellulose), 오일(oils) 그리고 콩 오일(soya oil), 해바라기 오일(sunflower oil), 땅콩오리(groundnut oil) 그리고 코코넛 지방(coconut fat) 같은 지방(fats), 팔미트 산(palmitic acid), 스테우아르 산(stearic acid) 같은 지방산(fatty acids) 그리고 리놀레산(linoleic acid), 글리세롤(glycerol) 같은 알코올 그리고 메탄올(methanol), 메텐(methane) 같은 탄화수소(hydrocarbons), L-글루타메이트 또는 L-발린같은 아미노산(amino acids), 또는 탄소의 원천으로써 아세틱산(acetic acid) 같은 유기산(organic acids)으로 구성될 수 있다. 이 물질들은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.
배양지는 펩톤(peptones), 이스트 추출물(yeast extract), 육류 추출물(meat extract), 맥아 추출물(malt extract), 옥수수 침지액(corn steep liquor), 콩 밀가루(soya bean flour)와 요소(urea)같은 유기 질손 포함 화합물(nitrogen-containing compounds) 또는 질소의 원천으로써 암모늄 황산염(ammonium sulphate), 암모늄 염화물(ammonium chloride), 암모늄 인산염(ammonium phosphate), 암모늄 탄산염(ammonium carbonate) 과 암모늄질산염(ammonium nitrate)같은 무기화합물로 구성될 수 있다. 질소의 원천은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.
배양지는 인산(phosphoric acid), 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate) 또는 이황산수소인산염(dipotassium hydrogen phosphate) 또는 인(phosphorus)의 원천으로써 해당되는 소디움(sodium)을 포함한 소금으로 구성될 수 있다. 배양지는 뿐만 아니라 성장에 필요한 황산마그네슘(magnesium sulphate) 또는 황산 철(iron sulphate)같은 금속성의 소금으로 구성되어야 한다. 마지막으로 아미노산과 비타민 같은 필수 성장 물질들 또한 상기 언급한 물질들에 추가로 이용될 수 있다. 적절한 전구체(precursor)들이 배양지에 첨가될 수 있다. 언급된 시작 물질들은 일회성(one-off) 배치 형태의 배양체에 추가가 될 수 있거나 적절한 방법으로 배양하는 동안 먹이를 공급받을 수 있다.
수산화물(hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 암모니아(ammonia) 또는 수분을 함유한 암모니아(aqueous ammonia)같은 기본적인 화합물 또는 인산(phosphoric acid) 또는 황산(sulphuric acid)같은 산성 화합물(acidic compounds)은 배양체의 pH를 조절하기 위해 적절한 방법으로 이용될 수 있다. 폴리글리콜 에스테르 지방산(fatty acid polyglycol esters)같은 거품억제 에인전트(Antifoam agents)는 거품의 성장을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 항생물질 같이 선택적인 행동을 하게 해주는 적절한 물질들은 플리스미드(plasmids)의 안정성을 유지하기 위해 배양지에 추가될 수 있다. 산소 또는 산소를 포함하는 공기같은 가스 혼합물들은 유산소 상태를 유지하기 위해 배양체에 도입된다. 배앙체의 온도는 대개 20 ℃ 에서 45 ℃ 이고 25 ℃ 에서 40 ℃가 선호된다.
상기 언급한 목적을 이루기 위해서는 혼합물의 준비를 위한 방법을 만들어야 한다. 그 방법은 다음과 같다:
(A) 상기 설명된 방법으로 신진대사 물질의 생산
(B) 신진대사 물질과는 다른 혼합 구성체를 가진 신진대사물질의 혼합화
신진대사물질이 아미노산이라면, 특히, L-리신(L-lysine), 그 혼합물은 식료품이 선호된다. 특히 동물성 사료나 약제 구성요소들이 선호된다.
이제 본 발명은 숫자와 제한 없는 예제들로 더욱 자세하게 설명된다.
도 1은 본 발명의 세포의 첫 번째 전형에 있는 자가형광 단백질(afp)의 유전자 서열이 프로모터(lysE 프로모터)의 통제하에 있는 가능한 구조를 보여준다.
도 2는 예제 1(lysE'eYFP, coding sequence of the LysE'eYFP fusion protein; lysG, coding sequence of the regulator protein LysG; kanR, coding sequence of the kanamycin-mediated resistance; repA: replication origin; BamHI: recognition sequence and cleavage site of the restriction enzyme BamHI)에서 만들어진 벡터 pJC1lysGE'eYFP를 보여준다.
도 3은 예제 1에서 얻어진 ATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP (위) 와 DM1800 p JC1lysGE'eYFP (아래)의 공초점(confocal) 현미경의 이미지를 보여준다. 아래쪽 이미지의 하얀색 bar는 10 um 길이다. 3 ul 셀 서스펜션의 각 경우는 슬라이드 위에 놓여있고, 1% 아가로스(agarose)의 얇은 층에 의해 움직이지 못한다. 움직이지 못하는 서스펜션은 514 nm 파장대의 빛과 700 ms의 노출시간으로 자극된다. eYFP의 형광 배출 측정은 505nm에서550nm범위의 광대역 필터(broadband filter)에서 Zeiss AxioImager M1에 의해 이행된다.
도 4는 는 리보스위치 요소와 이 리보스위치 요소에 기능적으로 연결된 유전자 서열과 자가형광 단백질에 대한 코딩을 구성하고 있는 리보스위치 요소에 근거한 예제 2에서 생산된 유전자 서열을 보여준다.(bold: aptamer; italics: terminator sequence; underlined: EYFP)
도 5는 벡터 pJC1lrp-brnF'eYFP를 보여준다.
도 6은 예제 3에서 얻어진 ATCC13032pJC1lrp-brnF'-eYFP배양체의 형광발광 산출 신호를 가진 내부의 엘메토이오닌(L-methoionine)과의 상관관계를 보여준다.
도 7은 예제 4c)의 ATCC13032pSenLysTK-C을 시작하는 돌연변이체에 의한 L리신(Lysine)의 형태를 보여준다.
도 1은 본 발명의 세포의 첫 번째 전형에 있는 자가형광 단백질(afp)의 유전자 서열이 프로모터(lysE 프로모터)의 통제하에 있는 가능한 구조를 보여준다. 변종 A는 신진대사물질에 종속된 제어자가 목표 유전자(lysE ) 에 근접한 위치에 있는 시작 상황을 가리킨다. 목표 유전자는 신진대사 물질 농도에 따라 제어한다. 변종 B는 목표 유전자가 형광 단백질(afp)에 의해 대체되는 가장 단순한 경우이다. 변종 C는 형광단백질 성분의 목표 유전자의 첫 번째 아미노산의 변환적 융합(translational fusion)이 일어난 경우이다. 변종 D에서는 프로모터 영역에서 시작된 오랜 전사가 형성되어 전사적 융합(transcriptional fusion)이 일어났다. 그 프로모터 영역은 목표 유전자의 첫 번째 아미노산과 리보솜 속박 사이트(ribosome-binding site)가 따르는 종결 코돈에 의한 끝과 형광 단백질에 대한 개방형 해독틀로 구성되어 있다. 변종 E에서는 프로모터 영역에서 시작된 오랜 전사가 형성되어 전사적 융합(transcriptional fusion)이 일어났다. 그 프로모터 영역은 목표 유전자의 첫 번째 아미노산과 리보솜 속박 사이트(ribosome-binding site)가 따르는 종결 코돈에 의한 끝과 E. coli,LacZ에서의 β-갈락토시다아제(beta-galactosidase)같은 잘 발현된 단백질의 시작으로 구성되어 있다. 이것은 차례로 형광 단백질과 결합한다.
실시예 1
세포의 첫 번째 전형에 따르면 세포의 생산은 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열이 lysE 프로모터 통제하에 있고, 그의 발현이 세포내 L-리신(L-lysine) 농도에 따라 결정된다.
a) 매개체 pJC1lysGE'eYFP의 제조
lysE' 와 리포터 유전자 eyfp(SEQ ID No. 49; protein sequence of the eYFP: SEQ ID No. 72)의 융합은 오버랩 익스텐션(overlap extension) lysE의 서열 코딩과 다른 형태어 바뀌어진 제어자 LysG (Bellmann et al. ,2001; Microbiology 1471765-74)와 pEKEx2-yfp-tetR (Frunzke et al.,2008; JBacteriol . 190:5111-9) 를 함께 수반하고, 탬플릿으로써 행동하는 eyfp 의 확대를 가능케 하는 PCR.pUC18-2.3-kb-lysGE-BamHI에 의해 이루어진다. lysGE'eyfp 조각(fragment)을 세우기 위해서, lysGE'와 lysGE'ns(1,010 bp)의 코딩 서열이 올리고핵산염 조합 plysGE_for (SEQ ID No. 38) 와 plysGE_rev (SEQ ID No. 39)으로 확대되었다. eyfp의 코딩 서열의 확대를 위해 두 가지 올리고핵산염 조합 peYFP_rev (SEQ ID No. 40) 와 peYFP_fw2 (SEQ ID No. 41)이 사용되었다.
plysGE_for 5'-CGCGGATCCCTAAGCCGCAATCCCTGATTG-3'
plysGE_rev 5'- TCCGATGGACAGTAAAAGACTGGCCCCCAAAGCAG-3'
peYFP_rev 5'-TGAGGATCCTTATTACTTGTCAGCTCGTCCATGCCGA-GAGTGATCC-3'
peYFP_fw2 5'-CTTTTACTGTCCATCGGAACTAGCTATGGTGAGCAAG-GGCGAGGAGCTGTTCACC-3'
1% 강도 아가로오스겔로부터 확대한 조각의 정제 후에, 아우터 프라이머(outer primers) plysGE-for 그리고 peYFP_rev와 두번째 PCR반응에서 매트릭스로써 이용되었다. 내부의 올리고 핵산염 프라이머 plysGE_rev 와 peYFP_fw2로부터 만들어진 17 bp의 상호보완적인 영역에서 템플릿 조각의 교배(hybridization)에 의해, 오버랩 익스탠션 조각을 세우는 것이 가능 했다. 이런 방식으로 형성된 생산물 lysGE'eyfp은 제한 엔자임 BamHI과 소화되었고, 반응 배치의 정제 후에, BamHI-opened 와 디포스포릴 매개체(dephosphorylated vector) pJC1와 똑같이 리게이션 반응(ligation reactions)에 이용되었다. 리게이션 배치는 E. coli DH5αMCR의 변환에 직접적으로 사용되었고, 형질전환주(transformants)의 선택은 카나마이신(kanamycin) 50 ug/ml와 함께 LB 판(plates)위에서 이행되었다. 이런 판들에서 자라고 카나마이신에 손상되지 않았던 20개의 군집은 PCR 군집을 위해 사용되었다. PCR군집은 lysGE'eyfp 조각이 매개체 pJC1에 삽입되었는지를 확인하기 위해 상기 설명한 올리고핵산염 조합과 함께 각 경우에 이행되었다. 아가로오스겔에 있는 PCR군집에 대한 분석은 분석된 샘플에서 1,010 bp크기의 예상되는 PCR 생산에서 보여졌다. 후에 군집은 더 큰 규모로 플라스미드 준비를 위해 배양되었다. 제한 엔자임 BglII, XhoI 그리고 PvuI 와 테스트 클리브지(test cleavage)를 통해서 삽입된 조각 pJC1lysGE'eYFP의 존재를 증명하는 것이 가능했다. 삽입은 서열은 예상된 서열과 100% 일치함을 보여주었다.
b) pJC1lysGE'eYFP를 가지고 Corynebacterium glutamicumf 를 변환
C. glutamicum 계통 ATCC 13032 와 DM1800 의 항체 반응을 일으키는 세포들은 Tauch et al ., 2002 ( Curr Microbiol . 45(5) (2002), pages 362-7)에 의해 개시된 것으로 준비 되었다 . ATCC 13032계통은 라이신을 숨기는 야생형이다. 반면 DM1800계통은 유전자에 의해 지시된 돌연변이( gene - directed mutations )( Georgi et al . Metab Eng . 7 (2005), pages 291-301)에 의한 라이신 분비선( lysine secretor)으로 만들어졌다. 이런 세포들은 Tauch et al . ( Curr Microbiol . 45(5) (2002), pages 362-7)에 의해 개시된 pJC1lysGE'eYFP 으로 하는 전기천공법( electroporation )에 의해 변형되었다. 형질전환주의 선택은 카나마이신 25 ug/ml로 BHIS 플레이트에서 수행되었다. 이런 플레이트에서 성장했고 카나마이신에 손상되지 않았던 군집은 플라스미드 준비, 그리고 엔자임 Bgl II , Xho I a와 Pvu I 로 테스트 클리브지에 의한 매개체의 존재를 확인했다. 각 경우에 하나의 맞는 복제물은 지정된 ATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP 와 DM1800 pJC1lysGE'eYFP 였다 .
c) 라이신에 국한된(lysine-specific) 형광성의 감지
형광성의 체내 분출은 Zeiss AxioImager M1이 있는 광초점 현미경으로 테스트되었다. 이런 목적으로, ATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP 와 DM1800 pJC1lysGE'eYFP의 3 ul 셀 서스펜션은 한 슬라이드 위에 놓였다. 1% 강도 아가로오스의 얇은 층은 고정을 위해 사전에 적용되었다. 고정된 서스펜션은 파장대 514 nm의 빛과 700 ms 시간 노출에 자극되었다. eYFP의 형광성 분출 측정은 505 nm 에서 550 nm의 범위에 있는 광대역 필터를 사용하여 수행되었다. 형광성의 세포들은 AxioVision 4.6소프트웨어의 도움으로 디지털방식으로 문서화되었다. 형광성의 분출은 라이신을 형성하는 DM1800 pJC1lysGE'eYFP의 경우 발생하는 반면 라이신을 형성하지 않는 ATCC13032 pJC1lysGE'eYFP는 형광성이 없는 이미지를 보인다.
실시예 2
자가형광 단백질의 발현은 아데닌 리보스위치(adenine riboswitch (ARS))에 의해 제어되고, 세포내 아데닌 농도에 따라 결정되는 두 번째 세포의 예에 따른 세포의 생산.
바실루스 서브틸리스 Bacillus subtilis ( Mandai 와 Breaker, Nat Struct Mol Biol , 11 (2004), 페이지 29-35 참조)로부터 나온 아데닌 리보스위치는 프라이머 ARS_for (SEQ ID No.　42) 와 ARS_rev (SEQ ID No.　43)를 가진 바실루스 서브틸리스의 유전체 DNA에서 시작하여 확대되었다. 두 번째 PCT에서, Qiagen MinElute Gel Extraction Kit 를 가지고 정제된 ARS 앰플리피케이트(amplificate)로부터 시작하여, 프라이머 ARS_for_BamHI 와 ARS_rev_NdeI를 사용하고, 5'-terminal BamHI와 3'-terminal NdeI cleavage site를 가진 ARS 앰플리피케이트는 확대되고 이런 제한 엔자임들로 쪼개졌다.
리포터 유전자 eyfp은 프라이머 EYFP_for_NdeI (SEQ ID No.　44) 와 EYFP_rev_EcoRI (SEQ ID No.　45)의 기반 위에 확대되었고, 엔자임 NdeI 와 EcoRI로 제한되었고, Qiagen MinElute Gel Extraction Kit를 가지고 똑같이 정제되었다.
ARS_for: 5'-TCAACTGCTATCCCCCCTGTTA-3'
ARS_rev: 5'-AAACTCCTTTACTTAAATGTTTTGATAAATAAA-3'
EYFP_for_NdeI: 5'-TACATATGGTGAGCAAGGGCGA-3'
EYFP_rev_EcoRI: 5'-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3'
두 개의 제한된 PCR생산물은 매개체 EKEx2에 묶여 있었고, 이전에는 BamHI 와 EcoRI에 묶여있어서 IPTG 유도 프로모터 ptac. E. coli XL1 blue의 제어 하에 있었고, 리게이션 배치로 변환되었다.
카나마이신에 손상되지 않는 형질전환주는 pEKEx2-ARS-EYFP (primers pEKEx2_for (SEQ ID No.　46) 와 EYFP_rev (SEQ ID No.　47))구조를 나타내기 위해 PCR 군집에 의해 테스트되었다. 그리고 플라스미드는 더 자세한 분석을 위해 정제되었다.
구조 pEKEx2-ARS-EYFP를 확인하기 위해, 이것은 제한 엔자임 NdeI로 쪼개지고 밴드 패턴(band pattern)을 가지고 테스트했다.
도 4에서 아데닌 센서의 서열(SEQ ID No.　48)은 아데닌 의존 리보스위치(adenine-dependent riboswitch (ydhL))와 자가형광 단백질 EYFP의 손상되지 않는 온전한 결합을 확인해 주었다.
pEKEx2_for: 5'-CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC-3'
EYFP_rev: 5'-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3'
실시예 3
자가형광 단백질의 유전자 서열 코딩은 brnFE 프로모터에 의해 제어되고, 세포내 L-메테이오닌(L-methionine) 농도에 따라 결정되는 첫 번째 세포의 예에 따른 세포의 생산.
a) 매개체 pJC1lrp-brnF'eYFdml 제조
brnF 와 리포터 유전자 eyfp의 결합을 만드는 절차는 다음과 같았다. 두 개의 서로 다른 반응에서, 첫 번째 코딩 lrp 와 첫번째 유전자사이 영역(560　bp) 에 있는 brnF서열(brnF')의 30개 뉴클레오티드(nucleotides)는 올리고핵산염 염기쌍 lrp-fw-A-BamHI (SEQ ID No.　50)　/　lrp-brnF-rv-I-NdeI (SEQ ID No.　51) 으로 확대되었다. 그리고 eyfp (751　bp)은 올리고핵산염 염기쌍 eyfp-fw-H-NdeI (SEQ ID No.　52)　/　eyfp-rv-D-SalI (SEQ ID No.　53)로 확대되었다. C. glutamicum 와 매개체 pEKEx2-yfp-tetR (Frunzke et al., 2008, J. Bacteriol. 190: 5111-5119)에서 나온 유전체 DNA는 템플릿으로써 역할을 하는 eyfp의 확대를 가능케 한다. 올리고핵산염 fw-A-BamHI 와 lrp-brnF-rv-I-NdeI는 5'-terminal BamHI, NdeI restriction cleavage sites, 올리고핵산염 eyfp-fw-H-NdeI로 보완되었고 eyfp-rv-D-SalI는 5'-terminal NdeI 와 SalI restriction cleavage sites로 보충되었다. BamHI 와 NdeI함께 lrp-brnF' 앰플리피케이트의 제한과 NdeI, SalI와 함께 eyfp 앰플리피케이트의 제한 후에, lrp-brnF' 앰플리피케이트는 리게이션 배치에서 NdeI cleavage site의 프리 엔드(free ends)를 통해서 eyfp 앰플리피케이트와 결합되었다. 그리고 동시에 매개체 pJC1로 복제되었다. 이것은 BamHI 와 SalI (Fig.　5)에 의해 개방되는 것과 같다. 리게이션 배치는 E. coli DH5α 변환을 위해 직접적으로 사용되었다. 형질전환주에 대한 선택은 50 ug/ml 카나마이신을 가지 LB플레이트위에서 이행되었다. 이런 플레이트에서 자라고 카나망신에 손상되지 않았던 군집들은 PCR 군집에 이용되었다. lrp-brnF'eyfp 조각이 매개체 pJC1에 삽입되었던 것을 체크하기 위해, 군집 PCR은 매개체 pJC1의 "multiple cloning site"영역 옆에 위치하고 있는 올리고핵산염으로 수행되었다. 더 큰 규모로 플라스미드 준비를 위해 군집을 재배했던 이후에, 아가로오스겔의 군집 PCR에 대한 분석은 1,530 bp크기의 분석된 샘플의 예상되는 PCR생산물에서 알 수 있었다. 삽입된 조각의 존재 유무는 제한 엔자임 BamHI, NdeI, SalI로 하는 테스트 클리브에이지(test cleavage)를 통해 증명되었다. 삽입의 서열은 예상된 서열과 100% 일치했다. 컴피턴트 C. glutamicum세포와 매개체 pJC1lrp-brnF'eYFP의 변환은 Tauch 와 Kirchner (Curr. Microbiol . (2002) 45:362- 367)의 방법으로 수행되었고 C. glutamicum ATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFP 이 획득되었다.
lrp-fw-A-BamHI 5'-GCGCGGATCCTCACACCTGGGGGCGAGCTG-3'
lrp-brnF-rv-I-NdeI 5'-GCGCCATATGATATCTCCTTCTTAAAGTTCAGC-TTGAATGAATCTCTTGCG-3'
eyfp-fw-H-NdeI 5'-GCGCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'
eyfp-rv-D-SalI 5'-GCGCGTCGACTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-TC-3'
Seq_pJC1_for1 (SEQ ID No.　54) 5'-CGATCCTGACGCAGATTTTT-3'
Seq_pJC1_rev1 (SEQ ID No.　55) 5'-CTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'
b) 세포내 메테이오닌(methionine) 농도와 형광성 산출의 상호 연관성
더욱 자세한 특성화를 위해, L-메테이오닌(L-methionine)에 대한 민감도와 센서의 다이나믹 영역(dynamic region)이 결정되었다. 이를 위해 다양한 메테이오닌의 내부 농도가 ATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFP 의 펩티드(peptides)로 설정되었다. 예를 들면, 이 방법은 et al., (J. Bacteriol. 2005, 187: 3786-3794)에 의해 설명된다. 다음의 디펩티드(dipeptides)가 사용되었다: L-alanyl-L-methionine (Ala-Met), L-methionyl-L-methionine (Met-Met), 그리고 L-alanyl-L-alanine (Ala-Ala). 다른 L-메테이오닌(L-methionine)의 농도를 만들기 위해서, 다음의 혼합 비율이 사용되었다: 0.3　mM Ala-Met plus 2.7　mM Ala-Ala, 0.6　mM Ala-Met plus 2.4 mM Ala-Ala, 0.9 mM Ala-Met plus 2.1 mM Ala-Ala, 1.5 mM Ala-Met plus 1.5 mM Ala-Ala, 2.1 mM Ala-Met plus 0.9 mM Ala-Ala, 2.7 mM Ala-Met plus 0.3 mM Ala-Ala, 3 mM Ala-Met, 3 mM Met-Met. 이것은 CGXII 배양액(medium) Keilhauer et al., 1993, J Bacteriol. 175:5595-603)에 추가되었다. 바이오렉터(BioLector)시스템(m2p-labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany)의 마이크로티터 스케일(microtiter scale (Flowerplate MTP-48-B))위의 0.6 ml배양액에서 배양되었다. 펩티드의 추가후 7분후에 200 ul 셀 서스펜션에서 나온 세포들은 실리콘 오일 원심분리(silicone oil centrifugation)에 의한 배양액으로부터 분리되었고, Klingenberg 와 Pfaff (Methods in Enzymology 1967; 10: 680-684)가 개시한대로 비활성화되었다. 샘플의 세포질의 부분(cytoplasmic fraction)은 Ebbinghausen et al . (Arch . Microbiol. (1989), 151:238-244)가 개시한 대로 활동이 일으켜졌고, 아미노산 농도는 Lindroth 와 Mopper (Anal . Chem. (1979) 51, 1167-1174)에 의해 개시된 리버스드 훼이스 HPLC(reversed phase HPLC)를 가지고 수량화되었다. 다양한 펩티드 농도를 가진 ATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFP의 배양조직의 형광성은 바이오렉터 시스템(m2p-labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany)의 온라인에서 감지되었다. 메테이오닌(methionine) 농도와 형광성 산출 신호의 상호 연관성은 Fig. 6에서 보여진다. 센서 플라스미드 pJC1lrp-brnF'eYFP는 메테이오닌의 세포내 감지를 선형 범위 약 0.2 - 25　mM에서 가능케하는 것으로 보여진다. 메테이오닌의 축적은 이미 하위 mM region (<　1　mM)에서 감지될 수 있다.
실시예 4
증가된 라이신 형성을 갖는 세포의 분리를 위해 신진대사물질 센서의 사용과 라이신 형성을 이끄는 새로운 돌연변이의 식별
a) 라이신 센서 pSenLysTK-C으로 Corynebacterium glutamicumd의 재조합된 야생형의 제작
매개체 pJC1는 Cremer et al. (Molecular and General Genetics, 1990, 220:478-480)에 의해 개시된다. 이 매개체는 BamHI 와 SalI로 쪼개졌고 1,765 kb조각 BamHI-<-EYFP-lysE'-lysG->-SalI (SEQ ID No.　56)로 결합되었으며, GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz)에 합성되었다.
결과로 나온 매개체는 pSenLysTK-C로 불려진다. 이는 전사적 결합으로써 EYFP와 살아있는 표시물로써 프로테인 크림슨(protein crimson)을 포함하고 있다. 센서 플라스미드 pSenLysTK-C는 Tauch et al. (Curr . Microbiol. 45 (2002), pages 362-7)가 개시한 야생형의 컴피턴트 셀에 도입되었고, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-C이 얻어졌다.
b) Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-C의 돌연변이생성
만들어진 ATCC13032 pSenLysTK-C는 30 ℃ "Difco Brain Heart Infusion"배양액(Difco, Becton Dickinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)속에서 자랐고, 1 ml 2메틸1산화황(dimethylsulfoxide)이 용해된 0.5 mg N-methyl-N-nitroso-N'-nitroguanidine의 0.1 ml 용액이 5 ml 이 배양조직에 추가되었다. 이 배양조직은 30 ℃에서 15분간 흔들려졌다. 세포들은 4 ℃에서 2,500 g 원심 분리되었고, 5 ml의 0.9 % NaCl에 다시 떠 있게 되었다. 원심분리단계와 재부유(resuspension)는 반복되었다. 5 ml의 80 % 강도 글리세롤이 이런 방식으로 셀 서스펜션에 더해졌고, 이 돌연변이가 된 셀 서스펜션의 부분 표본(aliquots)은 -20 ℃에서 저장되었다.
c) 고효율 시토메트리(cytometry)(HT-FACS = "high throughput fluorescence activated cell sorting")와 세포 분류
b)에서 얻어진 200 ul 셀 서스펜션이 20 ml CGXII-Kan25 액체 배양액(Keilhauer et al., J. Bacteriol. 1993; 175(17):5595-603)에 추가되었고 30 ℃, 180 rpm 에서 배양되었다. 45분 후에 isopropyl β-D-thioglactopyranoside이 0.1 mM의 최종 농도에 추가되었다. 2시간 동안의 추가적인 배양 후에, Becton Dickinson (Becton Dickinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)의 FACS Aria II 세포 분류기에 대한 광학적 특성과 세포입자의 분류에 대한 분석이 수행되었다. 전방산란(forward scatter)과 측면산란(side scatter )에 대한 허용한계로써 FACS 셋팅은 전방산란(ND filter 1.0)에 대해 50　mV의 전자기기 증폭과 측면산란에 대해 550　mV의 전자기기 증폭에서 500이었다. EYFP의 자극은 488 nm 파장과 625 mV에서 530 에서 30의 "parameter gain" (PMT)을 이용한 감지에 영향을 받았다. 크림슨(crimson)의 흥분은 633 nm 파장과 700 mV에서 660 에서 20의 PMT를 이용한 감지에 영향을 받았다. 2백만 크림슨-파지티브(positive) 세포들은 20 ml CGXII-Kan25에 분류되었고, 배양조직은 180 rpm, 30 ℃에서 22시간 동안 배양되었다. Isopropyl β-D-thioglactopyranoside 이 0.1 mM 마지막 농도에 다시 추가되었다. 추가 2시간 후에, 18,000,000개 세포들은 EYFP에 대해 분석되었고, 초당 10,000입자의 분석속도에서의 크림슨 형광성과 580개의 세포들이 분류되었고, 자동적으로 FACS Aria II분류기를 사용하여 BHIS-Kan25플레이트 위에 두었다. 플레이트는 30 ℃, 16 시간 동안 배양되었고, 580개의 세포에서 270개가 자라났다. 이들은 모두 마이크로티터 플레이트(microtiter plates)에 있는 0.8 ml CGXII-Kan25으로 전환되었고, 400 rpm , 30 ℃에서 48시간 동안 배양되었다. 플레이트는 마이크로티터 플레이트 회전자 안에서, 4,000 x g, 30 min, 4 ℃에서 원심 분리되었고, 상청액(supernatants)은 불과 1:100으로 희석되었고, HPLC를 가지고 분석되었다. 185개의 복제물들은 라이신을 형성하는 대리인으로써 식별되었다. 더욱 자세한 특성화를 위해서, 이런 40개의 복제물에 대한 분석이 흔들리는 플라스크(shaking flasks)에 있는 50 ml CGXII-Kan25으로 다시 수행되었다. ATCC13032 pSenLysTK-C는 라이신을 분비하지 않는 동안, 40개의 돌연변이는 2 - 35 mM 범위에서 다양한 양의 라이신을 형성한다(도 7).
d) lysC, hom, thrB and thrC 에서 돌연변이의 식별
40개의 돌연변이의 특성에 대해, 이들의 염색체(chromosomal DNA)는 DNeasy kit에 의해 Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany)로부터 격리되었다. 유전자 lysC는 프라이머 lysC-32F (SEQ ID No. 58) 와 lysC-1938R (SEQ ID No. 59)로 확대되었고 앰플리피케이트는 Eurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Germany)에 의해 서열화되었다.
lysC-32F 5'-GAACATCAGCGACAGGACAA-3'
lysC-1938R 5'-GGGAAGCAAAGAAACGAACA-3'
이미 알려진 돌연변이, T311I, T308I, A279T, A279V , A279T이 얻어졌다. 추가로 새로운 돌연변이 H357Y (cac->tac), T313I (acc->atc), G277D (ggc->gac), G277S (ggc->agc)이 얻어졌다. 돌연변이의 상응하는 돌연변이 된 3쌍에 뒤이은, 야생형의 트리플넷 코딩(coding triplet )은 각 경우에 주어진다.
유전자 hom은 프라이머 hom-289F (SEQ ID No. 60) 와 thrB-2069R (SEQ ID No. 61)으로 확대되었고 앰플리피케이트는 Eurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Germany)에 의해 서열화되었다.
hom-289F 5'-CCTCCCCGGGTTGATATTAG-3'
thrB-2069R 5'-GGCCAGCACGAATAGCTTTA-3'
새로운 돌연변이 A346V (gct->gtt), V211F (gtc->ttc), G241S (ggt->agt), A328V (gct->gtt), T233I (acc->atc), 그리고 두배의 돌연변이 R158C (cgc->tgc) T351I (acc->atc)가 얻어졌다.
프라이머 쌍 hom-1684F (SEQ ID No.　62) 와 thrB-2951R (SEQ ID No. 63)를 가진 돌연변이에 있는 thrB의 서열은 새로운 돌연변이 S102F (tcc->ttc)를 주었다.
hom-1684F 5'-AGGAATCTCCCTGCGTACAA-3'
thrB-2951R 5'-CCGGATTCATCCAAGAAAGC-3'
프라이머 쌍 thrC-22F (SEQ ID No. 64) 와 thrC-2046R (SEQ ID No. 65) 를 가진 돌연변이에 있는 thrC의 서열은 새로운 돌연변이 A372V (gcc->gtc)를 주었다.
thrC-22F 5'-GCCTTAAAACGCCACTCAAT-3'
thrC-2046R 5'-GGCCGTTGATCATTGTTCTT-3'
e) murE 에서 돌연변이의 식별
돌연변이 lysC나 hom, thrB 또는 thrC, murE를 포함하지 않는 돌연변이의 식별을 위해, murE가 추가적으로 서열화되었다. 유전자 murE는 프라이머 murE-34F (SEQ ID No.　66) 와 murE-1944R (SEQ ID No.　67)으로 확대되었고 앰플리피케이트는 GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz)에 의해 서열화되었다.
murE-34F 5'-AACTCCACGCTGGAGCTCAC-3'
murE-1944R 5'-AGAACGCGGAGTCCACG-3'
뉴클레오티드 361(ctc->ttc)에 있는 C에서 T 변환(transition)을 포함하고, MurE에서 단백질(SEQ ID No.　68)이 포지션 121의 L121F로 아미노산 교환을 이끄는, 유전자 murE서열 (SEQ ID No. 69)이 결정되었다.
f) 야생형의 라이신 형성에서 murE 돌연변이의 효과
프라이머 7-39-L-F (SEQ ID No. 70) 와 7-39-R-R (SEQ ID No. 71)를 이용하여, 1　kb 유전자 murE 이 예제 e)에서 C. glutamicum mutant M39의 염색체로 확대되었고 새로이 식별된 돌연변이를 갖고 있는 murE 조각이 얻어졌다. 얻어진 앰플리피케이트는 BamHI 와 SalI 를 통해 매개체 pK19mobsacB로 복제되었다. 이것은 C. glutamicum (Schafer et al., Gene 1994; 145:69-73)에서 복제되지 않고 이종재결합(Tauch et al., Curr . Microbiol . 45 (2002), pages 362-7; Schafer et al., Gene 1994; 145:69-73)을 이용해 야생형 게놈으로 도입되었다. 결과적으로 C. glutamicum Lys39은 50 ml BHIS-Kan25에서 30 ℃, 130 rpm, 2시간 동안 배양되었다. 이 배양조직의 500 ul 는 50　ml CGXII-Kan25로 전환되었고 다시 30 ℃, 130 rpm, 24시간 동안 배양되었다. 이것에서 출발하여, 처음의 0.5 OD를 가진 50 ml CGXII 주용 배양조직이 접종되었고 이 배양조직은 130 rpm, 30 ℃ 에서 48시간 동안 배양되었다. 배양조직 상청액은 물과 1 : 100으로 희석되었고 표 1에서 얻어진 L-리신 농도는 HPLC를 가지고 결정되었다.
7-39-L-F 5'-TAGGATCCCGACAACATCCCACTGTCTG-3'
7-39-R-R 5'-AAGTCGACGTCTGCTTCTTGCCCAAGG-3'
Strain L-Lysine (mM)
C. glutamicum ATCC13032 0.5
C. glutamicum Lys39 3.4
L-Lysine in the supernatant of C. glutamicum
Sequences
SEQ ID No.　01
agtttgcgca tgagacaaaa tcaccggttt tttgtgttta tgcggaatgt ttatctgccc 60
cgctcggcaa aggcaatcaa ttgagagaaa aattctcctg ccggaccact aagatgtagg 120
ggacgctga 129
SEQ ID No.　02
ctattcgcgc aaggtcatgc cattggccgg caacggcaag gctgtcttgt agcgcacctg 60
tttcaaggca aaactcgagc ggatattcgc cacacccggc aaccgggtca ggtaatcgag 120
aaaccgctcc agcgcctgga tactcggcag cagtacccgc aacaggtagt ccgggtcgcc 180
cgtcatcagg tagcactcca tcacctcggg ccgttcggca atttcttcct cgaagcggtg 240
cagcgactgc tctacctgtt tttccaggct gacatggatg aacacattca catccagccc 300
caacgcctcg ggcgacaaca aggtcacctg ctggcggatc acccccagtt cttccatggc 360
ccgcacccgg ttgaaacagg gcgtgggcga caggttgacc gagcgtgcca gctcggcgtt 420
ggtgatgcgg gcgttttcct gcaggctgtt gagaatgccg atatcggtac gatcgagttt 480
gcgcat 486
SEQ ID No.　03
aacctatagt gaatgtgtct gaaaataacg acttcttatt gtaagcgtta tcaatacgca 60
agttgacttg aaaagccgac atgacaatgt ttaaatggaa aagtc 105
SEQ ID No.　04
atggctttat tacaaaaaac aagaattatt aactccatgc tgcaagctgc ggcagggaaa 60
ccggtaaact tcaaggaaat ggcggagacg ctgcgggatg taattgattc caatattttc 120
gttgtaagcc gcagagggaa actccttggg tattcaatta accagcaaat tgaaaatgat 180
cgtatgaaaa aaatgcttga ggatcgtcaa ttccctgaag aatatacgaa aaatctgttt 240
aatgtccctg aaacatcttc taacttggat attaatagtg aatatactgc tttccctgtt 300
gagaacagag acctgtttca agctggttta acaacaattg tgccgatcat cggaggcggg 360
gaaagattag gaacacttat tctttcgcgt ttacaagatc aattcaatga cgatgactta 420
attctagctg aatacggcgc aacagttgtc ggaatggaaa tcctaagaga aaaagcagaa 480
gaaattgaag aggaagcaag aagcaaagct gtcgtacaaa tggctatcag ctcgctttct 540
tacagtgagc ttgaagcaat tgagcacatt tttgaggagc ttgacggaaa tgaaggtctt 600
cttgttgcaa gtaaaattgc tgaccgtgtc ggcattaccc gttctgttat tgtgaacgca 660
ctcagaaagc tggagagcgc cggtgttatc gagtctagat cattaggaat gaaaggtact 720
tatatcaagg tactaaacaa caaattccta attgaattag aaaatctaaa atctcattaa 780
SEQ ID No.　05
tgttgttttt atgtcagtga gcggcgcttt tcgtaggcgt atttggaaaa atttaagccg 60
gtccgtggaa taagcttata acaaaccaca agaggcggtt gccatg 106
SEQ ID No.　06
tcaaatatgc ttctgtgcca ccggaatcac ccgcttctcc ttcaccgcct tgaacgagaa 60
gctcgaatag atctccttca cccccggcag ccgctgcagt acctcgcggg tgaactcgcc 120
gaacgactcc agatcccgcg ccagaatctc cagcaggaag tcatagcgcc cggagatgtt 180
gtggcacgcc acgatttcgg ggatatccat cagccgctgc tcgaatgccc gggccatctc 240
cttgctgtgc gaatccatca tgatgctgac gaaggcggtc actccgaagc ccagtgcctt 300
gggtgacagg atggcctgat agccggtgat gtagcccgac tcctccagca gcttgacccg 360
ccgccagcac ggcgaggtgg tcagggcgac gctgtcggcg agctcggcca cggtcagtcg 420
ggcattgtct tgcagcgcgg ccagcagtgc gcggtcggta cggtcgatgg cgctaggcat 480
SEQ ID No.　07
tttttagacc ttgcgcgatt tcgtagcgcc gataaccttt atcatctggt tccagggctg 60
ccttggatgg cgacacctcc aggcttgaat gaatctcttg cgttttttgc acactacaat 120
catcacacaa ttgccgggta gttttgttgc cagtttgcgc acctcaacta ggctattgtg 180
caatat 186
SEQ ID No.　08
atgaagctag attccattga tcgcgcaatt attgcggagc ttagcgcgaa tgcgcgcatc 60
tcaaatctcg cactggctga caaggtgcat ctcactccgg gaccttgctt gaggagggtg 120
cagcgtttgg aagccgaagg aatcattttg ggctacagcg cggacattca ccctgcggtg 180
atgaatcgtg gatttgaggt gaccgtggat gtcactctca gcaacttcga ccgctccact 240
gtagacaatt ttgaaagctc cgttgcgcag catgatgaag tactggagtt gcacaggctt 300
tttggttcgc cagattattt tgtccgcatc ggcgttgctg atttggaggc gtatgagcaa 360
tttttatcca gtcacattca aaccgtgcca ggaattgcaa agatctcatc acgttttgct 420
atgaaagtgg tgaaaccagc tcgcccccag gtgtga 456
SEQ ID No.　09
aacttattcc cttttcaact tccaaatcac caaacggtat ataaaaccgt tactcctttc 60
acgtccgtta taaatatgat ggctattag 89
SEQ ID No.　10
atgaaattac aacaacttcg ctatattgtt gaggtggtca atcataacct gaatgtctca 60
tcaacagcgg aaggacttta cacatcacaa cccgggatca gtaaacaagt cagaatgctg 120
gaagacgagc taggcattca aattttttcc cgaagcggca agcacctgac gcaggtaacg 180
ccagcagggc aagaaataat tcgtatcgct cgcgaagtcc tgtcgaaagt cgatgccata 240
aaatcggttg ccggagagca cacctggccg gataaaggtt cactgtatat cgccaccacg 300
catacccagg cacgctacgc attaccaaac gtcatcaaag gctttattga gcgttatcct 360
cgcgtttctt tgcatatgca ccagggctcg ccgacacaaa ttgctgatgc cgtctctaaa 420
ggcaatgctg atttcgctat cgccacagaa gcgctgcatc tgtatgaaga tttagtgatg 480
ttaccgtgct accactggaa tcgggctatt gtagtcactc cggatcaccc gctggcaggc 540
aaaaaagcca ttaccattga agaactggcg caatatccgt tggtgacata taccttcggc 600
tttaccggac gttcagaact ggatactgcc tttaatcgcg cagggttaac gccgcgtatc 660
gttttcacgg caacggatgc tgacgtcatt aaaacttacg tccggttagg gctgggggta 720
ggggtcattg ccagcatggc ggtggatccg gtcgccgatc ccgaccttgt gcgtgttgat 780
gctcacgata tcttcagcca cagtacaacc aaaattggtt ttcgccgtag tactttcttg 840
cgcagttata tgtatgattt cattcagcgt tttgcaccgc atttaacgcg tgatgtcgtt 900
gatgcggctg tcgcattgcg ctctaatgaa gaaattgagg tcatgtttaa agatataaaa 960
ctgccggaaa aataa 975
SEQ ID No.　11
tttttattac ataaatttaa ccagagaatg tcacgcaatc cattgtaaac attaaatgtt 60
tatcttttca tgatatcaac ttgcgatcct gatgtgttaa taaaaaacct caagttctca 120
cttacagaaa cttttgtgtt atttcaccta atctttagga ttaatccttt tttcgtgagt 180
aatcttatcg ccagtttggt ctggtcagga aatagttata catcatgacc cggactccaa 240
attcaaaaat gaaattagga gaagagcatg 270
SEQ ID No.　12
ttattctgaa gcaagaaatt tgtcgagata aggtacaaca taaggaacag aagtctggaa 60
tataccattt tcaatccagt aaagggtgtt tgcccctggg cgtaaattaa aggcggtgag 120
atatgcatca gctgcttccc ggttcatccc cttcatttca taaaccttgc caagcaacac 180
ataatttagc caggacattt caagatcaat gccagtattt atcgcctggt aagactcatc 240
tgttttacct tttaccagag cactgaccgc ttttatttga tatataatgg acaggttgtt 300
caattccggc agtgtaacaa tgttatctat ttctgtgttc agtgctgcta attgtttttc 360
atctaaagga tgttgagaat ggcgcacgat atcaactaat gctttttctg ctctcgcgta 420
ggtaaattct ggggatgatt gaacaatctc acctaataat tcactggcac ggttcaatga 480
tttatcatcg ccatgcagta aataatcatg tgcctgataa aaattagtta ataacgcacc 540
acgatgcggc aaaattttct ggagcgtctc ctgcattcgt tgtggccacg gttggtttaa 600
cgcttttgat aaactctcca gtaaatcatt ttgaatcgcc agctgattac cgttagtgat 660
gacataacgt ttatccagca tggttgaacc atctgcattg tctaccaatt ttatcgacat 720
aaagcattgt tgagcacggt attggcgctg attaacaaac gcaatagata atgttttacc 780
ggaactgctc ggttcatcaa tgttgtagtt gattttgtca tgcaccataa aggtggagaa 840
ggtgttaagt gatgtcgcca ccaaatcacc cacgcctatc gcgtaagaga gctgatacgg 900
ggaactccag ctgttacaac ttttatttac catattaatg tcaatatcgc gtggattgag 960
caaaatacgc gatttgctca taggaagacg tgtatcaaga cttgaaaacg ctaccagtgc 1020
tacacagata cctaacgaca acaggaaaaa aaaccatacc caaaaggtag tgaatcgttt 1080
gcttttaact ggggattgtt caggtggcgt tgcggtgttt tgaatgttaa gactgtggga 1140
gggagaatct gtggcaggaa ccgcctctgg tataggggga ggcgaagata gcattatttc 1200
ctctccctct tcttcgctgt accagataac cggcaccatt aatttatagc cgcgctttgg 1260
tacagtagcg atatagacag gactatcttc atcattatct tttaatgact tacgtagttc 1320
tgagatactc tgcgtcacaa cgtgattggt gacaatactt ctcttccaga cattatcgat 1380
aagttcatcc ctgctaagta cttcgccact gtgttgagca aagaaaacca gaagatcgat 1440
taatctcggc tcaagggtaa gttgacgccc attgcggcta atttggttta tggacggagt 1500
aacaagccat tcgccaacgc gaactacagg ttgttgcat 1539
SEQ ID No.　13
tagaccaaga tgttca 16
SEQ ID No.　14
ctaaattgag tagtccgcag gtggagccga caacaactgc cgagccaaat cgcgagccgt 60
ctcaagagga ctgatgttgt ggaccaatcg agatccagca agtccaccat caaggaacac 120
caacagctga ttcgcctggg tggtgcctgg gtagccgttc ttctcagtga gcaaatcagt 180
cagagtctta tgacaccact cgcggtgctc taacactgct gcaacaatgc ccttttcgct 240
atcagtttcg gggcgagggt actcactagc cgcattctga aagtgcgagc cgcggaaatc 300
tttttctggt tcttcctcaa tgcactgatc aaagaacgcg atgattttat cttccggatc 360
cttcataccg acggtgcgct cacgccacgc ttcacgccac agctgatcga ggttctccag 420
gtatgcaata accaaggcgt ccttcgatcc gaaaagggaa tagaggctcg ccttcgccac 480
gtcagcttca cggaggatac gatcaatacc gatgacgcga ataccttctg tggtgaaaag 540
gttggttgcg ctatcgagga gacgctgtcg ggggcttggt cgattgcgac gacggtttgc 600
cccggcactt gttttactct tgcctgaagc gctagcagcc ac 642
SEQ ID No.　15
cttattagtt tttctgattg ccaattaata ttatcaattt ccgctaataa caatcccgcg 60
atatagtctc tgcatcagat acttaattcg gaatatccaa c 101
SEQ ID No.　16
atgaaacgcc cggactacag aacattacag gcactggatg cggtgatacg tgaacgagga 60
tttgagcgcg cggcacaaaa gctgtgcatt acacaatcag ccgtctcaca gcgcattaag 120
caactggaaa atatgttcgg gcagccgctg ttggtgcgta ccgtaccgcc gcgcccgacg 180
gaacaagggc aaaaactgct ggcactgctg cgccaggtgg agttgctgga agaagagtgg 240
ctgggcgatg aacaaaccgg ttcgactccg ctgctgcttt cactggcggt caacgccgac 300
agtctggcga cgtggttgct tcctgcactg gctcctgtgt tggctgattc gcctatccgc 360
ctcaacttgc aggtagaaga tgaaacccgc actcaggaac gtctgcgccg cggcgaagtg 420
gtcggcgcgg tgagtattca acatcaggcg ctgccgagtt gtcttgtcga taaacttggt 480
gcgctcgact atctgttcgt cagctcaaaa ccctttgccg aaaaatattt ccctaacggc 540
gtaacgcgtt cggcattact gaaagcgcca gtggtcgcgt ttgaccatct tgacgatatg 600
caccaggcct ttttgcagca aaacttcgat ctgcctccag gcagcgtgcc ctgccatatc 660
gttaattctt cagaagcgtt cgtacaactt gctcgccagg gcaccacctg ctgtatgatc 720
ccgcacctgc aaatcgagaa agagctggcc agcggtgaac tgattgactt aacgcctggg 780
ctatttcaac gacggatgct ctactggcac cgctttgctc ctgaaagccg catgatgcgt 840
aaagtcactg atgcgttact cgattatggt cacaaagtcc ttcgtcagga ttaa 894
SEQ ID No.　17
gcaaagtgtc cagttgaatg gggttcatga agctatatta aaccatgtta agaaccaatc 60
attttactta agtacttcca taggtcacga tggtgatcat ggaaatcttc 110
SEQ ID No.　18
atgaacccca ttcaactgga cactttgctc tcaatcattg atgaaggcag cttcgaaggc 60
gcctccttag ccctttccat ttccccctcg gcggtgagtc agcgcgttaa agctctcgag 120
catcacgtgg gtcgagtgtt ggtatcgcgc acccaaccgg ccaaagcaac cgaagcgggt 180
gaagtccttg tgcaagcagc gcggaaaatg gtgttgctgc aagcagaaac taaagcgcaa 240
ctatctggac gccttgctga aatcccgtta accatcgcca tcaacgcaga ttcgctatcc 300
acatggtttc ctcccgtgtt caacgaggta gcttcttggg gtggagcaac gctcacgctg 360
cgcttggaag atgaagcgca cacattatcc ttgctgcggc gtggagatgt tttaggagcg 420
gtaacccgtg aagctaatcc cgtggcggga tgtgaagtag tagaacttgg aaccatgcgc 480
cacttggcca ttgcaacccc ctcattgcgg gatgcctaca tggttgatgg gaaactagat 540
tgggctgcga tgcccgtctt acgcttcggt cccaaagatg tgcttcaaga ccgtgacctg 600
gacgggcgcg tcgatggtcc tgtggggcgc aggcgcgtat ccattgtccc gtcggcggaa 660
ggttttggtg aggcaattcg ccgaggcctt ggttggggac ttcttcccga aacccaagct 720
gctcccatgc taaaagcagg agaagtgatc ctcctcgatg agatacccat tgacacaccg 780
atgtattggc aacgatggcg cctggaatct agatctctag ctagactcac agacgccgtc 840
gttgatgcag caatcgaggg attgcggcct tag 873
SEQ ID No.　19
gtaccggata ccgccaaaag cgagaagtac gggcaggtgc tatgaccagg actttttgac 60
ctgaagtgcg gataaaaaca gcaacaatgt gagctttgtt gtaattatat tgtaaacata 120
ttgctaaatg tttttacatc cactacaacc atatcatcac aagtggtcag acctcctaca 180
agtaaggggc ttttcgtt 198
SEQ ID No.　20
atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat tgaaagtatc 60
tggaataacc gcttccctcc cgggactatt ttgcccgcag aacgtgaact ttcagaatta 120
attggcgtaa cgcgtactac gttacgtgaa gtgttacagc gtctggcacg agatggctgg 180
ttgaccattc aacatggcaa gccgacgaag gtgaataatt tctgggaaac ttccggttta 240
aatatccttg aaacactggc gcgactggat cacgaaagtg tgccgcagct tattgataat 300
ttgctgtcgg tgcgtaccaa tatttccact atttttattc gcaccgcgtt tcgtcagcat 360
cccgataaag cgcaggaagt gctggctacc gctaatgaag tggccgatca cgccgatgcc 420
tttgccgagc tggattacaa catattccgc ggcctggcgt ttgcttccgg caacccgatt 480
tacggtctga ttcttaacgg gatgaaaggg ctgtatacgc gtattggtcg tcactatttc 540
gccaatccgg aagcgcgcag tctggcgctg ggcttctacc acaaactgtc ggcgttgtgc 600
agtgaaggcg cgcacgatca ggtgtacgaa acagtgcgtc gctatgggca tgagagtggc 660
gagatttggc accggatgca gaaaaatctg ccgggtgatt tagccattca ggggcgataa 720
SEQ ID No.　21
ttaatttgca tagtggcaat tttttgccag actgaagagg tcataccagt tatgacctct 60
gtacttataa caacaacgta aggttattgc gctatgcaaa cacaaatcaa agttcgtgga 120
tatcatctcg acgtttacca gcacgtcaac aacgcccgct accttgaat 169
SEQ ID No.　22
atgggcgtaa gagcgcaaca aaaagaaaaa acccgccgtt cgctggtgga agccgcattt 60
agccaattaa gtgctgaacg cagcttcgcc agcctgagtt tgcgtgaagt ggcgcgtgaa 120
gcgggcattg ctcccacctc tttttatcgg catttccgcg acgtagacga actgggtctg 180
accatggttg atgagagcgg tttaatgcta cgccaactca tgcgccaggc gcgtcagcgt 240
atcgccaaag gcgggagtgt gatccgcacc tcggtctcca catttatgga gttcatcggt 300
aataatccta acgccttccg gttattattg cgggaacgct ccggcacctc cgctgcgttt 360
cgtgccgccg ttgcgcgtga aattcagcac ttcattgcgg aacttgcgga ctatctggaa 420
ctcgaaaacc atatgccgcg tgcgtttact gaagcgcaag ccgaagcaat ggtgacaatt 480
gtcttcagtg cgggtgccga ggcgttggac gtcggcgtcg aacaacgtcg gcaattagaa 540
gagcgactgg tactgcaact gcgaatgatt tcgaaagggg cttattactg gtatcgccgt 600
gaacaagaga aaaccgcaat tattccggga aatgtgaagg acgagtaa 648
SEQ ID No.　23
ccgtcatact ggcctcctga tgtcgtcaac acggcgaaat agtaatcacg acgtcaggtt 60
cttaccttaa attttcgacg gaaaaccacg taaaaaacgt cgatttttca agatacaagc 120
gtgaattttc aggaaatggc ggtgagcatc ac 152
SEQ ID No.　24
atcaccacaa ttcagcaaat tgtgaacatc atcacgttca tctttccctg gttcccaatg 60
gcccattttc ctgtagtaac gagaacgtcg cgaattcagg cgctctttag actggtcgta 120
atgaaattca gcaggatcac attatgacc 149
SEQ ID No.　25
gtggcgcatc agttaaaact tctcaaagat gatttttttg ccagcgacca gcaggcagtc 60
gctgtggctg accgttatcc gcaagatgtc tttgctgaac atacacatga tttttgtgag 120
ctggtgattg tctggcgcgg taatggcctg catctggttt tgcagaatat tatttattgc 180
ccggagcgtc tgaagctgaa tcttgactgg cagggggcga ttccgggatt taacgccagc 240
gcagggcaac cacactggcg cttaggtagc atggggatgg cgcaggcgcg gcaggttatc 300
ggtcagcttg agcatgaaag tagtcagcat gtgccgtttg ctaacgaaat ggctgagttg 360
ctgttcgggc agttggtgat gttgctgaat cgccatcgtt acaccagtga ttcgttgccg 420
ccaacatcca gcgaaacgtt gctggataag ctgattaccc ggctggcggc tagcctgaaa 480
agtccctttg cgctggataa attttgtgat gaggcatcgt gcagtgagcg cgttttgcgt 540
cagcaatttc gccagcagac tggaatgacc atcaatcaat atctgcgaca ggtcagagtg 600
tgtcatgcgc aatatcttct ccagcatagc cgcctgttaa tcagtgatat ttcgaccgaa 660
tgtggctttg aagatagtaa ctatttttcg gtggtgttta cccgggaaac cgggatgacg 720
cccagccagt ggcgtcatct caattcgcag aaagattaa 759
SEQ ID No.　26
gtggcgcatc agttaaaact tctcaaagat gatttttttg ccagcgacca gcaggcagtc 60
gctgtggctg accgttatcc gcaagatgtc tttgctgaac atacacatga tttttgtgag 120
ctggtgattg tctggcgcgg taatggcctg catgtactca acgatcgccc ttatcgcatt 180
acccgtggcg atctctttta cattcatgct gacgataaac actcctacgc ttccgttaac 240
gatctggttt tgcagaatat tatttattgc ccggagcgtc tgaagctgaa tcttgactgg 300
cagggggcga ttccgggatt taacgccagc gcagggcaac cacactggcg cttaggtagc 360
atggggatgg cgcaggcgcg gcaggttatc ggtcagcttg agcatgaaag tagtcagcat 420
gtgccgtttg ctaacgaaat ggctgagttg ctgttcgggc agttggtgat gttgctgaat 480
cgccatcgtt acaccagtga ttcgttgccg ccaacatcca gcgaaacgtt gctggataag 540
ctgattaccc ggctggcggc tagcctgaaa agtccctttg cgctggataa attttgtgat 600
gaggcatcgt gcagtgagcg cgttttgcgt cagcaatttc gccagcagac tggaatgacc 660
atcaatcaat atctgcgaca ggtcagagtg tgtcatgcgc aatatcttct ccagcatagc 720
cgcctgttaa tcagtgatat ttcgaccgaa tgtggctttg aagatagtaa ctatttttcg 780
gtggtgttta cccgggaaac cgggatgacg cccagccagt ggcgtcatct caattcgcag 840
aaagattaa 849
SEQ ID No.　27
tatcggaaaa aatctgtaac atgagataca caatagcatt tatatttgct ttagtatctc 60
tctcttgggt gggattc 77
SEQ ID No.　28
gtaattgtgg ctagagtaac aaagactaca aaaccttggg catgggcttg ttactttgaa 60
attcatcgac gctaag 76
SEQ ID No.　29
cctcgcccct catttgtaca gtctgttacc tttacctgaa acagatgaat gtagaattta 60
taaaactagc atttgat 77
SEQ ID No.　30
atgatcgtga cacaagataa ggccctagca aatgtttttc gtcagatggc aaccggagct 60
tttcctcctg ttgtcgaaac gtttgaacgc aataaaacga tcttttttcc tggcgatcct 120
gccgaacgag tctactttct tttgaaaggg gctgtgaaac tttccagggt gtacgaggca 180
ggagaagaga ttacagtagc actactacgg gaaaatagcg tttttggtgt cctgtctttg 240
ttgacaggaa acaagtcgga taggttttac catgcggtgg catttactcc agtagaattg 300
ctttctgcac caattgaaca agtggagcaa gcactgaagg aaaatcctga attatcgatg 360
ttgatgctgc ggggtctgtc ttcgcggatt ctacaaacag agatgatgat tgaaacctta 420
gcgcaccgag atatgggttc gagattggtg agttttctgt taattctctg tcgtgatttt 480
ggtgttcctt gtgcagatgg aatcacaatt gatttaaagt tatctcatca ggcgatcgcc 540
gaagcaattg gctctactcg cgttactgtt actaggctac taggggattt gcgggagaaa 600
aagatgattt ccatccacaa aaagaagatt actgtgcata aacctgtgac tctcagcaga 660
cagttcactt aa 672
SEQ ID No.　31
atgaccaacg cgcgattgcg agctctggtc gaactggcgg ataccggttc ggtgcgcgcc 60
gctgctgagc gactcgtggt caccgaatct tcgatctcct cggctttacg cgcattgagc 120
aacgacatcg gcatcagctt ggtcgaccgg catggccgcg gggtgcggct gactcctgcc 180
ggcctgcgtt acgtcgaata cgcgcggcgg atcctcggct tgcacgacga ggcgatattg 240
gctgcccgcg gagaggccga cccggagaat ggctcgatcc ggctggctgc ggtcacctcc 300
gcgggggaac tgctcatccc cgccgcgttg gcatcgttcc gtgccgcgta ccccggtgtc 360
gttctgcatc tggaggtggc ggcgcgcagc ttggtgtggc ctatgctggc ccgccacgag 420
gtcgacctcg ttgtggcggg acggccgccg gacgaattgg tccggaaagt gtgggtgcgc 480
gccgtcagcc cgaacgcgct tgtcgtcgtg ggaccacccg cggtagcgaa gggattccag 540
cccgccaccg cgacctggct gctgcgtgag accggatccg gtacccgctc tacgttgacg 600
gcactgcttg acgacctcga tgtcgcgcca cctcaattgg tgctcggatc gcacggcgcg 660
gtggttgccg cggcggtggc cgggctgggc gtgacgttgg tgtcgcgtca ggctgtgcag 720
cgcgaactgg ccgccggcgc actcgtcgaa ctgccggtgc ccggtactcc gataagccgg 780
ccatggcatg tggtcagcca gatcagtccg acgatgtcga ccgaactgct catcaagcac 840
ctcttgtccc agcgagacct gggctggcgc gatatcaaca ccacccttcg gggagccgtt 900
accgcctga 909
SEQ ID No.　32
gtgctggtcc cgcaccgggc ggtggacagc ttccggcggc agctgaccgg ccgctacttc 60
ggcggcccgg acacctcccg cgagggcgtg ctcttcctgg ccaactacgt cttcgacttc 120
SEQ ID No.　33
atggacgcag acgactgttg ggcgcgggcg ggcaccgtgc ggatccgcct gctcggcccg 60
gtggagctgg cctgcggcac gcggccggtg ccggtgaccg ggcggcgcca gttgagggtg 120
gtggccgcgc tcgcgctgga ggccggacgg gtgctctcca ccgcggggct gatcgcctcg 180
ttgtgggcgg acgagccgcc gcgcaccgcc gcccggcagc tccagaccag cgtgtggatg 240
atccgccggg cgctcgcctc ggtgggcgcg ccgcagtgcg tcgtccgctc caccccggcc 300
ggctacctgc tcgacccggc ccactacgaa ctcgacagcg accggttccg gcacgcggtg 360
ctgaccgccc gggagttgca gcgggacggg cggctggccc aggcccgggc ccgggtcgac 420
gaggggctgg cgctgtggcg cggccccgcc ctcggcgcgg cggcgggcgc cggactccag 480
ccccgggccc gccggctgga ggaggaacgg gtcttcgccc tggagcagcg cgccgggctc 540
gacctcgcgc tcggccgcca cgagacggcc atcggcgaac tcctcgacct catcgcccag 600
catccgctgc gcgaggcggc ctacgccgac ctgatgctcg ccctgtaccg ttccggccgc 660
cagtccgacg cgctcgccgt ctaccgcagg gcgcagcggg tgctcgccga cgagctggcc 720
gtccgccccg gcccccgcct cgccggcctg gagcgggcca tcctgcggca ggacgagtcg 780
ctgctggccg gcgcggcggt gccctga 807
SEQ ID No.　34
tcaggggcct gcctccagca cgtcggctgc ccggaccagt acggccgagc gggtgccgat 60
cttcagccgc tccagggcct ttacgggagc caccgggatc ttacggctgc ggtcggtgac 120
SEQ ID No.　35
ctaggaaccc gcggacgtat cgggtggatg gtcggatccc tctgcatcgc cgatgtgtcc 60
gggaagcccg tgggcgaagg caaccagtcc ggcctgaaga cgggattcga ccccgagctt 120
cgccagtatc tgggccatat gagccttgac ggtgcgctcg gtgaccccga gcagcgcggc 180
gatctcacgg ttggagtagc cgtggctcag caggaggaag acctggagct cgcggtcgga 240
gagtaaatgt acctggctga gcccttccag ccaggggaac tggtcctcgt ggagaaatcg 300
atcgtcgcca gaatcactgg aatcgcagcc ggaatatggc aaagtctggc ccccgtatga 360
gcgtgtggtc cttgcatgcc ctaagaggtc atccgacgca tcgagtatca aggcgccgaa 420
gggcgccacc actgaactat gaagacgtga gggcgatacc acccatgcga cgaatgggtc 480
ctggacatta ctcatcttga tcatcttatc gcatctacgg ccgggttggg gcgccttggt 540
gccgcctgct gtcgtgagca gggcccgccg aggcgtgggc aaggcggata aggcggcccg 600
tgcccggtgt gtgcacggca a 621
SEQ ID No.　36
catcacgaac ctccagccgt gggatcgccc tccggcagca tttatagacg gtttgcttat 60
cgatccgttt tcacattcac ccgcagtgat aaggaattga taaacgattt tcctagcctg 120
agcggactat 130
SEQ ID No.　37
gtgcgcgcgg gcgggcgccg ggtccaggtc ggcgggccgc gccagcggac ggtgctggcg 60
acgctgctgc tcaacgccga ccgcgtggtg tcggtggacg cgctggccga gacggtctgg 120
ggcgcccggc ccccgtcgac cagccggacg caggtggcga tctgcgtgtc cgcgctgcgc 180
aaggcgttcc gcgcgagcgg cgccgacgag gtgatcgaga ccgtcgcgcc ggggtacgtc 240
ctgcgctccg gcgggcaccg gctggacacc ctggacttcg acgaactggt ggcgctggcg 300
agggcggcgg cccggcaggg ccggggcgcg gaggccgtcc ggctgtacgg ctcggcgctc 360
gcgctgcgcc ggggcccggt gctggcgaac gtgaccggga cggtgcccga gcacctgtcc 420
tgccagtggg aggagaccct gctcaccgcc tacgaggagc aggtcgagct gcgcctggcg 480
ctgggcgagc accgcctgct ggtcgccggg ctcgcggcgg cggtcgagcg gcacccgctg 540
cgcgaccggc tctacggcct gctcatcatc gcccagtacc gctccggcca ccgggccgcg 600
gcgctggaga cgttcgcccg gttgcgccgc cgctcggtcg acgagctcgg cctggagccg 660
gggatggagc tgcgccggct gcacgagcgc atcctgcgcg acgaggaccg cccggcggtc 720
gagcgcccgc cgtcgcagct gcccgccgcg acgcaggtgt tcgtcgggcg cgccgaggag 780
ctggcggtgc tggaccggct ggccgccgag gacgggcagg cgggcgcgcc gccgctcgga 840
ctgctggtcg gcggcgtcgg cgtgggcaag accgcgctgg cggtgcggtg ggcgcacgcc 900
aacgccgacc tgttccccga cggccagctg ttcgtcgacc tgggcgggca cgacccgcac 960
cacccgccgt cggcccccgg cgccgtgctc gcgcacctgc tgcacgcgct gggcgtgccg 1020
cccgagcggg tgccggtcgc cgccgaacga cccgcgctgt tccgcaccgc gatggccgcc 1080
cgccggatgc tgctggtgct ggacgacgcc cgcgacgcgg cccaggtctg gccgctgctg 1140
ccgaacaccg ccacctgccg ggtgctggtg acctcccgcg acccgctgcg cgagctggtc 1200
gcccgcagcg gggcggtgcc gctgcggctg ggcggcctcg ggttcgacga gtccgtggcg 1260
ctggtgcgcg gcatcatcgg cgaggcgcgg gccgggcgcg acccggacgc cctggtcggg 1320
ctggtcgagc tggtcgagct gtgcggtcgg gtgccgggcg cgctgctggc cgccgccgcg 1380
cacctggcca gcaaaccgca ctggggcgtg cccaggatgg tccgggagct caaccgcccg 1440
cgcagcaggc tgtccggcct cggcgggcag cacctgcgcg acgggctcgc ctccagcgcc 1500
cgctgcctgg acccggtggc ggccgacctg taccgggcgc tgggcggcct gcccacgccg 1560
gagctgacgt cctggacggc cacggccctg ctgggctgct cgacacccga ggccgacgac 1620
gtgctggagc gcctggtcga cgcgcacctg ctggagcccg ccggggcggg cgccggcggc 1680
gagagccact accggctgcc cagcctgtcc cacgcctacg cggcgaactt gccacgaccg 1740
gcccgtga 1748
SEQ ID No.　38
cgcggatccc taagccgcaa tccctgattg 30
SEQ ID No.　39
tccgatggac agtaaaagac tggcccccaa agcag 35
SEQ ID No.　40
tgaggatcct tattacttgt cagctcgtcc atgccgagag tgatcc 46
SEQ ID No.　41
cttttactgt ccatcggaac tagctatggt gagcaagggc gaggagctgt tcacc 55
SEQ ID No.　42
tcaactgcta tcccccctgt ta 22
SEQ ID No.　43
aaactccttt acttaaatgt tttgataaat aaa 33
SEQ ID No.　44
tacatatggt gagcaagggc ga 22
SEQ ID No.　45
tagaattctt atctagactt gtacagctcg 30
SEQ ID No.　46
cggcgtttca cttctgagtt cggc 24
SEQ ID No.　47
tagaattctt atctagactt gtacagctcg 30
SEQ ID No.　48
tcaactgcta tcccccctgt tattaaaacg cttacattga ttattatagt catttaattt 60
taaatgtcta tacttttata aaataaatat aatcatattt ttttccggtt caccgtttta 120
taaatttttc tatggaagat tcattcataa tgtggtacac tcatcaacgg aaacgaatca 180
attaaatagc tattatcact tgtataacct caataatatg gtttgagggt gtctaccagg 240
aaccgtaaaa tcctgattac aaaatttgtt tatgacattt tttgtaatca ggattttttt 300
tatttatcaa aacatttaag taaaggagtt tgttatggtg agcaagggcg aggagctgtt 360
caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 420
cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 480
caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccttcg gctacggcct 540
gcagtgcttc gcccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 600
gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 660
ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 720
cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 780
caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg 840
ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 900
cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agctaccagt ccgccctgag 960
caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 1020
gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtctagataa 1060
SEQ ID No.　49
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccacct tcggctacgg cctgcagtgc ttcgcccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcaacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgagggcg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagctacc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtctaga 720
taa 723
SEQ ID No.　50
gcgcggatcc tcacacctgg gggcgagctg 30
SEQ ID No.　51
gcgccatatg atatctcctt cttaaagttc agcttgaatg aatctcttgc g 51
SEQ ID No.　52
gcgccatatg gtgagcaagg gcgaggag 28
SEQ ID No.　53
gcgcgtcgac ttatctagac ttgtacagct cgtc 34
SEQ ID No.　54
cgatcctgac gcagattttt 20
SEQ ID No.　55
ctcaccggct ccagatttat 20
SEQ ID No.　56
ggatccttat tacttgtaca gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa 60
ctccagcagg accatgtgat cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactggta 120
gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg 180
gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgcc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac 240
cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta 300
ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag ttgatgccct tcagctcgat 360
gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc 420
gtccttgaag aagatggtgc gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa 480
gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg ggcgaagcac tgcaggccgt agccgaaggt 540
ggtcacgagg gtgggccagg gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt 600
cagcttgccg taggtggcat cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt 660
tacgtcgccg tccagctcga ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt 720
gctcaccata tgatatctcc ttcttaaagt tcatctaggt ccgatggaca gtaaaagact 780
ggcccccaaa agcagacctg taatgaagat ttccatgatc accatcgtga cctatggaag 840
tacttaagta aaatgattgg ttcttaacat ggtttaatat agcttcatga accccattca 900
actggacact ttgctctcaa tcattgatga aggcagcttc gaaggcgcct ccttagccct 960
ttccatttcc ccctcggcgg tgagtcagcg cgttaaagct ctcgagcatc acgtgggtcg 1020
agtgttggta tcgcgcaccc aaccggccaa agcaaccgaa gcgggtgaag tccttgtgca 1080
agcagcgcgg aaaatggtgt tgctgcaagc agaaactaaa gcgcaactat ctggacgcct 1140
tgctgaaatc ccgttaacca tcgccatcaa cgcagattcg ctatccacat ggtttcctcc 1200
cgtgttcaac gaggtagctt cttggggtgg agcaacgctc acgctgcgct tggaagatga 1260
agcgcacaca ttatccttgc tgcggcgtgg agatgtttta ggagcggtaa cccgtgaagc 1320
taatcccgtg gcgggatgtg aagtagtaga acttggaacc atgcgccact tggccattgc 1380
aaccccctca ttgcgggatg cctacatggt tgatgggaaa ctagattggg ctgcgatgcc 1440
cgtcttacgc ttcggtccca aagatgtgct tcaagaccgt gacctggacg ggcgcgtcga 1500
tggtcctgtg gggcgcaggc gcgtatccat tgtcccgtcg gcggaaggtt ttggtgaggc 1560
aattcgccga ggccttggtt ggggacttct tcccgaaacc caagctgctc ccatgctaaa 1620
agcaggagaa gtgatcctcc tcgatgagat acccattgac acaccgatgt attggcaacg 1680
atggcgcctg gaatctagat ctctagctag actcacagac gccgtcgttg atgcagcaat 1740
cgagggattg cggccttagg tcgac 1765
SEQ ID No.　57
ggatcccgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 60
tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 120
cgtcccattc gccaatccgg atatagttcc tcctttcagc aaaaaacccc tcaagacccg 180
tttagaggcc ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc 240
ttcctttcgg gctttgttag cagccggatc tcagtgggaa ttcctactgg aacaggtggt 300
ggcgggcctc ggcgcgctcg tactgctcca ccacggtgta gtcctcgttg tgggaggtga 360
tgtcgagctt gtagtccacg tagtggtagc cgggcagctt cacgggcttc ttggccatgt 420
agatggactt gaactcacac aggtagtggc cgccgccctt cagcttcagc gccatgtggt 480
tctcgccctt cagcacgccg tcgcgggggt agttgcgctc agtggagggc tcccagccca 540
gagtcttctt ctgcattacg gggccgtcgg aggggaagtt cacgccgatg aacttcacgt 600
ggtagatgag ggtgccgtcc tgcagggagg agtcctgggt cacggtcacc acgccgccgt 660
cctcgaagtt catcacgcgc tcccacttga agccctcggg gaaggactgc ttgaggtagt 720
cggggatgtc ggcggggtgc ttgatgtacg ccttggagcc gtagaagaac tggggggaca 780
ggatgtccca ggcgaagggc agggggccgc ccttggtcac ttgcagcttg gcggtctggg 840
tgccctcgta gggcttgccc tcgcccacgc cctcgatctc gaactcgtgg ccgttcacgg 900
agccctccat gtgcaccttg aagcgcatga agggcttgat gacgttctca gtgctatcca 960
tatgtatatc tccttctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat atcttttaat 1020
tctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacattatac gagccgatga 1080
ttaattgtca acagctcatt tcagaatatt tgccagaacc gttatgatgt cggcgcaaaa 1140
aacattatcc agaacgggag tgcgccttga gcgacacgaa ttatgcagtg atttacgacc 1200
tgcacagcca taccacagct tccgatggct gcctgacgcc agaagcattg gtgcaccgtg 1260
cagtcgataa gcccggatca gcttgcaatt cgcgcgcgaa ggcgaagcgg catgcattta 1320
cgttgacacc atcgaatggt gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 1380
gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 1440
cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 1500
aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 1560
acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 1620
gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 1680
cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 1740
tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 1800
cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 1860
gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 1920
tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 1980
ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 2040
agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 2100
gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 2160
aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata 2220
cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 2280
tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 2340
gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 2400
tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgtcggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc 2460
gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac gaaggcttga ggatcc 2506
SEQ ID No.　58
gaacatcagc gacaggacaa 20
SEQ ID No.　59
gggaagcaaa gaaacgaaca 20
SEQ ID No.　60
cctccccggg ttgatattag 20
SEQ ID No.　61
ggccagcacg aatagcttta 20
SEQ ID No.　62
aggaatctcc ctgcgtacaa 20
SEQ ID No.　63
ccggattcat ccaagaaagc 20
SEQ ID No.　64
gccttaaaac gccactcaat 20
SEQ ID No.　65
ggccgttgat cattgttctt 20
SEQ ID No.　66
aactccacgc tggagctcac 20
SEQ ID No.　67
agaacgcgga gtccacg 17
SEQ ID No.　68
MATTLLDLTK LIDGILKGSA QGVPAHAVGE QAIAAIGLDS SSLPTSDAIF AAVPGTRTHG 60
AQFAGTDNAA KAVAILTDAA GLEVLNEAGE TRPVIVVDDV RAVLGAASSS IYGDPSKDFT 120
FIGVTGTSGK TTTSYLLEKG LMEAGHKVGL IGTTGTRIDG EEVPTKLTTP EAPTLQALFA 180
RMRDHGVTHV VMEVSSHALS LGRVAGSHFD VAAFTNLSQD HLDFHPTMDD YFDAKALFFR 240
ADSPLVADKQ VVCVDDSWGQ RMASVAADVQ TVSTLGQEAD FSATDINVSD SGAQSFKINA 300
PSNQSYQVEL ALPGAFNVAN ATLAFAAAAR VGVDGEAFAR GMSKVAVPGR MERIDEGQDF 360
LAVVDYAHKP AAVAAVLDTL RTQIDGRLGV VIGAGGDRDS TKRGPMGQLS AQRADLVIVT 420
DDNPRSEVPA TIRAAVTAGA QQGASESERP VEVLEIGDRA EAIRVLVEWA QPGDGIVVAG 480
KGHEVGQLVA GVTHHFDDRE EVRAALTEKL NNKLPLTTEE G 521
SEQ ID No.　69
atggcaacca cgttgctgga cctcaccaaa cttatcgatg gcatcctcaa gggctctgcc 60
cagggcgttc ccgctcacgc agtaggggaa caagcaatcg cggctattgg tcttgactcc 120
tccagcttac ctacctcgga cgctattttt gctgcagttc caggaacccg cactcacggc 180
gcacagtttg caggtacgga taacgctgcg aaagctgtgg ccattttgac tgacgcagct 240
ggacttgagg tgctcaacga agcaggagag acccgcccag tcatcgttgt tgatgatgtc 300
cgcgcagtac ttggcgcagc atcatcaagc atttatggcg atccttcaaa agatttcacg 360
ttcattggag tcactggaac ctcaggtaaa accaccacca gctacctctt ggaaaaagga 420
ctcatggagg caggccacaa agttggtttg atcggcacca caggtacacg tattgacggg 480
gaagaagtac ccacaaagct caccactcca gaagcgccga ctctgcaggc attgtttgct 540
cgaatgcgcg atcacggtgt cacccacgtg gtgatggaag tatccagcca tgcattgtca 600
ttgggcagag ttgcgggttc ccactttgat gtagctgcgt ttaccaacct gtcgcaggat 660
caccttgatt tccaccccac catggatgat tactttgacg cgaaggcatt gttcttccgc 720
gcagattctc cacttgtggc tgacaaacag gtcgtgtgcg tggatgattc ttggggtcag 780
cgcatggcca gcgtggcagc ggatgtgcaa acagtatcca cccttgggca agaagcagac 840
ttcagcgcta cagacatcaa tgtcagcgac tctggcgccc agagttttaa gatcaacgcc 900
ccctcaaacc agtcctacca ggtcgagcta gctcttccag gtgcgttcaa cgttgctaac 960
gccacgttgg catttgccgc tgcggcacgc gtgggtgttg atggcgaagc gtttgctcga 1020
ggcatgtcca aggtcgcggt tccaggccgt atggaacgca ttgatgaggg acaagacttc 1080
cttgcagtgg tggattatgc ccacaagcct gctgcagtgg ctgctgtgtt ggatacgttg 1140
aggacccaga ttgacgggcg cctcggagtg gttatcggtg ctggtggaga ccgcgattcc 1200
accaagcgtg gccccatggg gcagttgtcc gcacagcgtg ctgatctagt tattgtcact 1260
gatgacaacc ctcgttcaga ggtgcctgcc acgattcgcg cagcagtcac tgcaggagca 1320
cagcagggtg cttcagagtc cgaacgaccg gtggaagtcc tagaaattgg tgaccgtgca 1380
gaagcaattc gcgttttggt cgagtgggca cagcctggag atggcattgt agtagctgga 1440
aaaggccatg aagttggaca actagttgct ggtgtcaccc accattttga tgaccgcgaa 1500
gaagttcgcg ctgctttgac agaaaagctc aacaataaac ttccccttac tacggaagaa 1560
ggatag 1566
SEQ ID No.　70
taggatcccg acaacatccc actgtctg 28
SEQ ID No.　71
aagtcgacgt ctgcttcttg cccaagg 27
SEQ ID No.　72
VSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT GKLPVPWPTL 60
VTTFGYGLQC FARYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV 120
NRIELKGINF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNG IKVNFKIRHN IEGGSVQLAD 180
HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSYQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT LGMDELYKSR 240

Claims (24)

  1. 야생형에 대하여 유전학적으로 변형되고, 자가형광(autofluorescent) 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 포함하되, 상기 자가형광 단백질은 특정 신진대사물질의 세포 내 농도에 의존하는 것을 특징으로 하는 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩의 컨트롤은 전사 레벨(transcription level)에서 특정 신진대사물질의 세포 내 농도의 기능에 영향을 받게 되는 것을 특징으로 하는 세포.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 이종 프로모터(heterologous promoter)의 컨트롤 하에 행해지고, 상기 이종 프로모터의 컨트롤은 세포의 야생형 내에서 유전자의 발현을 컨트롤 하며, 상기 야생형 세포 내에서 발현은 특정 신진대사물질의 세포 내 농도에 의존하는 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 자가형광 단백질에 대한 상기 유전자 서열 코딩의 컨트롤은 전사 레벨에서 특정 신진대사물질의 세포 내 농도의 기능에 영향을 받게 되는 것을 특징으로 하는 세포.
  5. 청구항 2 또는 4에 있어서,
    상기 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩은 DNA 서열에 기능적으로 결합되고, 상기 DNA 서열은 mRNA 레벨에서 리보스위치(riboswitch)의 기능으로 추정되며, 상기 리보스위치의 기능은 전사 레벨 또는 트랜스레이션 레벨(translation level) 에서 자가형광 단백질에 대한 유전자 서열 코딩을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 코리네박테륨속(genus Corynebacterium) 또는 에세리키아(Escherichia) 의 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신진대사물질은 아미노산, 뉴클레오티드, 지방산 및 탄수화물(carbohydrates)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 신진대사물질은 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 아미노산은 L-리신(L-lysine) 인 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 청구항 2 및 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 lysE 프로모터이고, 상기 유전자는 lysE 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자가형광 단백질은 그린 자가형광 단백질(GFP) 또는 이 단백질의 변종인 것을 특징으로 하는 세포.
  12. i) 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 세포를 포함하는 셀 서스펜션(cell suspension)의 준비단계;
    ii) 세포들이 특정 신진대사물질의 세포 내 농도와 관련하여 다르게 되는 셀 서스펜션을 얻기 위한 세포들의 유전자 변형 단계; 및
    iii) 상기 세포 내 자가형광 활동의 탐지에 의해 이 특정 신진대사물질의 증가된 세포 내 농도를 갖는 셀 서스펜션 내에서 개별 세포들을 식별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 셀 서스펜션 내에서 특정 신진대사물질의 증가된 세포 내 농도를 구비하는 세포 식별 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 유전자 변형 단계 내에서 유전자 변형은 비표적 돌연변이(non-targeted mutagenesis)에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 식별 방법.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서,
    ⅳ) 상기 셀 서스펜션으로부터 식별된 세포들을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 식별 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 분리단계는 유세포분석기(flow cytometry) 의 수단에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 식별 방법.
  16. Ⅰ) 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 세포를 포함하는 셀 서스펜션(cell suspension)의 준비단계;
    Ⅱ) 세포들이 특정 신진대사물질의 세포 내 농도와 관련하여 다르게 되는 셀 서스펜션을 얻기 위한 세포들의 유전자 변형 단계;
    Ⅲ) 상기 세포 내 자가형광 활동의 탐지에 의해 이 특정 신진대사물질의 증가된 세포 내 농도를 갖는 셀 서스펜션 내에서 개별 세포들을 식별하는 단계;
    Ⅳ) 상기 셀 서스펜션으로부터 식별된 세포들을 분리하는 단계;
    Ⅴ) 상기 특정 신진대사물질의 증가된 세포 내 농도를 대표하는 상기 식별되고 분리되는 세포 내에서 유전학적으로 변형된 유전자 G1 내지 Gn 또는 돌연변이 M1 내지 Mm 의 식별단계; 및
    Ⅵ) 게놈은 유전자 G1 내지 Gn 중 적어도 하나 및/또는 돌연변이 M1 내지 Mm 중 적어도 하나를 포함하며, 상기 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포의 생산단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포 생산 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 유전자 변형 단계 내에서 유전자 변형은 비표적 돌연변이(non-targeted mutagenesis)에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 생산 방법.
  18. 청구항 16 또는 17에 따른 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 세포.
  19. (a) 청구항 16 또는 17에 따른 방법에 의해 특정 신진대사물질의 최적화된 생산을 구비하는 야생형에 대하여 유전학적으로 변형된 세포의 생산단계; 및
    (b) 세포가 영양분으로부터 특정 신진대사물질을 생산하는 조건 하에서 영양분을 포함하는 배양 매체(culture medium) 내에서 세포의 배양단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신진대사물질의 생산 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 신진대사물질은 아미노산, 뉴클레오티드, 지방산 및 탄수화물(carbohydrates)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신진대사물질의 생산 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 신진대사물질은 아미노산인 것을 특징으로 하는 신진대사물질의 생산 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 아미노산은 L-리신(L-lysine) 인 것을 특징으로 하는 신진대사물질의 생산 방법.
  23. (A) 청구항 19 내지 22 중 어느 한 항에 따른 방법에 의한 신진대사물질의 생산단계; 및
    (B) 상기 신진대사물질과는 다른 혼합 요소를 구비하는 신진대사물질의 혼합단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합 준비 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 신진대사물질은 L-리신 이고, 혼합 요소는 식품(foodstuff)이거나, 약품 성분(pharmaceutical composition)인 것을 특징으로 하는 혼합 준비 방법.

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