ES2550238T3 - Poblaciones celulares que co-expresan CD49c y CD90 - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una población celular aislada derivada de médula ósea humana, en el que entre el 100 % y el 90 % de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en el que la población celular tiene un tiempo de duplicación de menos de 30 horas, que comprende las etapas de: a) cultivar una fuente de la población celular en condiciones de bajo contenido de oxígeno de menos del 15 % de oxígeno para producir una población celular adherente; y, b) cultivar la población celular adherente a una densidad de siembra de menos de 2500 células/cm2.

Description

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La población aislada de células que co-expresan CD49c y CD90 obtenida por los métodos de la invención cuando se administra al ser humano puede responder a señalización celular y señales fisiológicas en el ser humano y migrar al área de lesión o traumatismo y, por lo tanto, usarse como vehículos de suministro para proteínas y genes de interés.
5 También se describe en este documento un método para tratar a un ser humano que padece una afección neurológica (por ejemplo, lesión de médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, apoplejía, lesión cerebral traumática, enfermedad de Fabry, distrofia metacromática, leucodistrofia suprarrenal, enfermedad de Canavan, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher, enfermedad de Nieman-pick, un tumor cerebral) cultivando una fuente de una población celular a una densidad de siembra de menos de aproximadamente 100 células/cm2 en condiciones de bajo contenido de oxígeno; seleccionando de la fuente cultivada de la población celular, una población de células que co-expresan CD49c y CD90; y administrando la población de células que coexpresan CD49c y CD90 al ser humano.
El trasplante de las poblaciones celulares aisladas obtenidas por los métodos de la invención a un paciente que
15 padece una afección neurológica puede provocar la diferenciación de las células de la invención en células que normalmente funcionan en el tejido nervioso afectado en el ser humano con la afección neurológica tratando de ese modo una miríada de afecciones neurológicas incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, ALS, lesión de médula espinal, tumores cerebrales, apoplejía. Asimismo, las poblaciones celulares aisladas obtenidas por los métodos de la invención pueden usarse para tratar a un ser humano que padece una afección no neurológica tal como una quemadura, enfermedad cardiaca, diabetes, osteoartritis y artritis reumatoide. Las poblaciones celulares aisladas obtenidas por los métodos de la invención administradas a un paciente (también mencionado en este documento como individuo, en particular un ser humano) que padece una afección cardiaca (por ejemplo, infarto de miocardio) pueden diferenciarse en células de músculo cardiaco (también mencionadas en este documento como cardiomiocitos).
25 Las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención pueden tener la capacidad de responder a señales intrínsecas (por ejemplo, en los sitios de trasplante o cuando se incorporan en tejidos y órganos) y señales exógenas para diferenciarse en numerosos tipos celulares (por ejemplo, neuronales, gliales, astrocitos, oligodendrocitos) en el ser humano. Las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención pueden proporcionar una fuente fácilmente disponible de células para su uso en el tratamiento de seres humanos. Las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención pueden aislarse fácilmente de tejidos adultos o embrionarios, proliferan a altas tasas, tienen gran potencial de expansión, pueden ser estables durante largos periodos de tiempo, pueden ser sensibles a señales exógenas y pueden producir suficientes cantidades terapéuticas de moléculas de interés.
35 Por consiguiente, también se describe en este documento un método para preparar una célula progenitora comprometida cultivando (por ejemplo, en condiciones de bajo contenido de oxígeno, un 5 % de oxígeno) una fuente de una población celular (por ejemplo, células de médula ósea, células de médula ósea humana, grasa, sangre de cordón umbilical, piel) y seleccionando de la fuente cultivada de la población celular, las células que co-expresan CD49c y CD90. La población de células que co-expresan CD49c y CD90 se modifica para que se convierta en células progenitoras comprometidas. La selección de células de la fuente cultivada de la población celular células que co-expresan CD49c y CD90 se consigue mediante condiciones de bajo contenido de oxígeno (por ejemplo, oxígeno por debajo del oxígeno atmosférico, 5 % de oxígeno).
45 "Célula progenitora comprometida", como se usa en este documento, se refiere a una célula precursora obtenida de una fuente (por ejemplo, médula ósea humana, grasa, sangre de cordón umbilical, piel) que se desarrolla en una célula con un fin particular. Una célula progenitora comprometida puede ser, por ejemplo, una célula CD49c/CD90 derivada de médula ósea humana que puede diferenciarse o desarrollarse en, por ejemplo, una neurona, célula glial, astrocito, oligodendrocito o célula de músculo cardiaco.
También se describe en este documento un método para tratar a un ser humano que padece una afección neurológica cultivando una fuente de una población celular (por ejemplo, aspirados de médula ósea) y seleccionando (por ejemplo, mediante condiciones de cultivo de bajo contenido de oxígeno) de la fuente cultivada de la población celular, las células que co-expresan CD49c y CD90; co-expresan CD49c, CD90 y telomerasa; o co
55 expresan CD49c, CD90 y un marcador de linaje óseo. Las células seleccionadas que co-expresan, por ejemplo, CD49c y CD90 se modifican para convertirse en una célula progenitora comprometida y se administran a un ser humano con una afección neurológica (por ejemplo, una lesión de médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, apoplejía, una lesión cerebral traumática, enfermedad de Fabry, distrofia metacromática, leucodistrofia suprarrenal, enfermedad de Canavan, enfermedad de Pelizaeus Merz-bacher, enfermedad de Niemanpick y un tumor cerebral).
Las técnicas para evaluar si una célula de la población sustancialmente homogénea de células de la invención que co-expresa CD49c y CD90; co-expresa CD49c, CD90 y telomerasa; o CD49c, CD90 pero no expresa sialoproteína ósea (BSP) para convertirse en células progenitoras comprometidas pertenecen a la experiencia de los especialistas
65 en la técnica. Por ejemplo, las células que co-expresan CD49c y CD90 pueden cultivarse, seleccionarse y modificarse para producir y expresar los marcadores de células neuronales, tales como noggina, musashi o Sox2,
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Los métodos de la invención pueden incluir adicionalmente seleccionar de las células tratadas, las células que coexpresan CD49c, CD90 y al menos un factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco (por ejemplo, GATA4, Irx4, Nkx2.5).
5 En una realización, la población celular de la invención puede ser una población de células madre. En otra realización, la población celular de la invención puede ser una población celular aislada o una población aislada de células madre.
Las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención, en particular, las poblaciones celulares que coexpresan al menos un factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco pueden usarse para tratar una afección cardiaca tal como infarto de miocardio o fallo cardiaco congestivo en un ser humano. Las poblaciones celulares encuentran aplicación en un método para tratar un infarto de miocardio o fallo cardiaco congestivo en un individuo (por ejemplo, un ser humano), que comprende la etapa de administrar una población celular
15 sustancialmente homogénea que co-expresa CD49c, CD90, al menos un factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco al individuo.
El factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco expresado por las células usadas para tratar el infarto de miocardio en el ser humano se selecciona entre el grupo que consiste en GATA4, Irx4 y Nkx2.5 (también mencionado en este documento como "Nkx2.5/CSX").
Las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención pueden administrarse próximas a la localización de la afección cardiaca (por ejemplo, infarto de miocardio, fallo cardiaco congestivo). Por ejemplo, en un ser humano que padece un infarto de miocardio, las poblaciones celulares obtenidas por los métodos de la invención
25 pueden administrarse próximas al infarto de miocardio (por ejemplo, en el músculo cardiaco en el sitio del infarto). Las poblaciones celulares pueden administrarse directamente en el tejido de músculo cardiaco o espacios del corazón (los espacios ventriculares o auriculares).
También se describe en este documento un método para tratar un infarto de miocardio o un fallo cardiaco congestivo en un ser humano que comprende las etapas de cultivar una fuente de una población celular (por ejemplo, células de médula ósea adulta) en condiciones de bajo contenido de oxígeno; tratar la fuente cultivada de la población celular con un inhibidor de proteína quinasa C (por ejemplo, queleritrina) y un inhibidor de la metilación del ADN (por ejemplo, 5-azacitidina); y administrar la población celular tratada al ser humano.
35 También se describe en este documento un método para tratar un infarto de miocardio o un fallo cardiaco congestivo en un ser humano, que comprende las etapas de tratar la población celular (por ejemplo, células de médula ósea adulta) que co-expresa CD49c y CD90 con un inhibidor de proteína quinasa C (por ejemplo, queleritrina) y un inhibidor de la metilación del ADN (por ejemplo, 5-azocitidina). Las células tratadas se administran al ser humano. La población celular que se trata con el inhibidor de proteína quinasa C y el inhibidor de la metilación del ADN puede incluir adicionalmente una población celular que co-expresa telomerasa. El método puede incluir adicionalmente seleccionar de las células tratadas, las células que co-expresan, CD49c, CD90, al menos un factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco (por ejemplo, GATA4, Irx4, Nkx2.5) y, opcionalmente, telomerasa.
También se describe en este documento un método para formar un tipo de célula progenitora comprometida, que
45 comprende la etapa de combinar una población sustancialmente homogénea de células que co-expresan CD49c y CD90 con una población de células que incluye al menos un tipo de célula progenitora comprometida. El tipo de célula progenitora comprometida puede formarse in vitro o in vivo. La formación del tipo de célula progenitora comprometida puede formarse in vivo administrando la población sustancialmente homogénea de células que coexpresan CD49c y CD90 a un humano. Por ejemplo, el método puede usarse para formar una célula neuronal combinando la población celular sustancialmente homogénea con una población celular neuronal (por ejemplo, el sistema nervioso central o periférico).
La población de células, que se combinan con las células obtenidas por los métodos de la invención para formar un tipo de célula progenitora comprometida, pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en una población de
55 células nerviosas y una población de células de músculo cardiaco. La población de células que co-expresan CD49c y CD90 también puede expresar telomerasa. La población de células que co-expresan CD49c y CD90 y, opcionalmente, telomerasa, también puede expresar al menos un factor de transcripción relacionado con músculo cardiaco. La población sustancialmente homogénea de células usada para formar un tipo de célula progenitora comprometida puede estar aislada. La población sustancialmente homogénea de células que se emplea en el método para formar las células progenitoras comprometidas puede ser una población de células madre sustancialmente homogénea.
La población celular aislada que co-expresa CD49c y CD90 obtenida por los métodos de la invención tiene un tiempo de duplicación menor de 30 horas cuando se cultiva en condiciones de bajo contenido de oxígeno (por
65 ejemplo, menos de aproximadamente el 15 % en volumen de oxígeno, menos de aproximadamente el 10 % en volumen de oxígeno, menos de aproximadamente el 5 % en volumen de oxígeno).
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Cuando se necesita o desea aplicación parenteral, las mezclas particularmente adecuadas para las células son soluciones estériles inyectables, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios y remojo en GELFOAM®. En particular, los vehículos para
5 administración parenteral incluyen soluciones acuosas de dextrosa, solución salina, agua pura, etanol, glicerol, propilenglicol, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y polímeros de bloque de polioxietileno. Las mezclas farmacéuticas adecuadas para su uso son bien conocidas para los especialistas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17ª Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) y el documento WO 96/05309.
Las células que co-expresan CD49c y CD90 obtenidas por el método de la invención pueden usarse solas o en cualquier combinación cuando se administran a un ser humano que padece una afección neurológica. Por ejemplo, pueden co-administrarse esteroides o fármacos sintéticos farmacéuticos con las células. Asimismo, el tratamiento de lesión de médula espinal puede incluir la administración/trasplante de las células obtenidas por el método de la invención en un ser humano cuya médula se ha estabilizado físicamente.
15 La dosificación y frecuencia (dosis únicas o múltiples) de la administración o trasplante de las células a un ser humano, incluyendo la cantidad real de células trasplantadas en el ser humano, pueden variar dependiendo de diversos factores, incluyendo la afección particular que se esté tratando (por ejemplo, afección neurológica, afección cardiaca, tal como un infarto de miocardio, afección degenerativa, lesión aguda), tamaño, edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal, dieta del ser humano, naturaleza y grado de los síntomas de la afección neurológica (por ejemplo, enfermedad de Parkinson de aparición temprana frente a enfermedad de Parkinson avanzada; traumatismo de médula ósea frente a seccionamiento parcial o completo de la médula ósea), o afección cardiaca (por ejemplo, fallo cardiaco congestivo, infarto de miocardio); tipo de tratamiento concurrente (por ejemplo, esteroides); complicaciones de la afección neurológica o cardiaca; grado de tolerancia al tratamiento u otros
25 problemas relacionados con la salud.
Los seres humanos con una afección neurológica o cardiaca pueden tratarse durante días (por ejemplo, 30) con células obtenidas por los métodos de la invención (por ejemplo, aproximadamente 106 células), por varias vías de administración (por ejemplo, intra-tecal, intravenosa).
También se prevé que los métodos descritos en este documento puedan emplearse para tratar afecciones neurológicas en mamíferos diferentes al ser humano. Por ejemplo, un mamífero no humano en necesidad de tratamiento veterinario, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas).
35 La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no son pretenden ser limitantes de ningún modo.
Ejemplificación
Ejemplo 1: Aislamiento de un células adherentes como unidades formadoras de colonias o "CFU" de aspirados de médula ósea después de lisis de los glóbulos rojos
Se aspiraron células de médula ósea de la cresta ilíaca de voluntarios humanos adultos sanos. El componente de
45 glóbulos rojos del aspirado se lisó mezclando el aspirado con un tampón de cloruro de amonio que consistía en cloruro de amonio 155 mM, bicarbonato de potasio 10 mM y EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) 0,1 mM, pH 7,2, a una proporción 1:20 de aspirado de médula a tampón. La suspensión celular resultante se agitó en vórtice durante 2 segundos, se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugó (10 minutos a 500 x g). El sedimento celular mononuclear resultante se resuspendió en medio completo y se centrifugó (10 minutos a 500 x g). El medio completo es medio esencial mínimo-alfa (Gibco BRL, Rockville, MD) suplementado con glutamina 4 mM y suero bovino fetal de lote de suero seleccionado al 10 % (FBS, Gibco BRL, Rockville, MD). El sedimento celular después se resuspendió en el medio completo y se centrifugó una segunda vez (10 minutos a 500 x g).
El sedimento resultante se resuspendió en el medio completo y se determinó la cantidad de células viables por
55 exclusión de azul de tripano. La suspensión celular mononuclear después se sembró en matraz T75 tratado con cultivo tisular a una densidad de 50.000 células/cm2 y se incubó a 37 ºC en una atmósfera que consistía en 5 % de dióxido de carbono, 5 % de oxígeno, y 90 % de nitrógeno. En el quinto día de cultivo, las células no adherentes y el medio condicionado (también mencionado en este documento como "medio gastado") se aspiraron de los matraces y a las células adherentes se les volvió a administrar medio completo fresco. Las unidades formadoras de colonias (CFU) adherentes se expandieron durante 3-5 días adicionales.
La generación de CFU se controló en placas de 6 pocillos iniciadas de forma concurrente en condiciones idénticas a los matraces T75. El medio gastado se retiró de las placas de 6 pocillos y las células adherentes se fijaron durante 5 minutos en metanol al 100 %, y después se tiñeron con azul de metileno para visualizar las CFU. Una densidad de
65 siembra inicial de 75.000 células/cm2 generó de forma eficaz CFU. Después de procesar el aspirado de médula ósea por separación en gradiente de densidad de FICOLL® o lisis con cloruro de amonio, la eficacia de CFU se vio
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