ES2539262T3 - Métodos y composiciones que comprenden construcciones supramoleculares - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo sensible a la conformación, obtenible mediante una construcción antigénica que comprende un péptido antigénico que tiene la secuencia de aminoácidos de β amiloide, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, o un fragmento activo del mismo, en donde el péptido antigénico o fragmento activo del mismo está modificado para tener un polietilenglicol unido de forma covalente, uno en cada uno de los extremos, y reconstituido en un liposoma, anticuerpo que tiene especificidad de unión para el péptido antigénico y (a) muestra una sensibilidad conformacional y una afinidad por el antígeno que está potenciada en comparación con un anticuerpo producido por el péptido antigénico palmitoilado; y (b) induce una transición de lámina β a hélice α de péptido amiloide.

Description

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El anticuerpo monoclonal o el anticuerpo policlonal, o ambos se pueden marcar directamente con un marcador detectable para identificar un agente objetivo en una muestra biológica como se describe a continuación. Los marcadores para usar en inmunoensayos son conocidos en general por los expertos en la técnica, e incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas incluyendo partículas coloreadas, tales como oro coloidal y perlas de látex. Los anticuerpos también se pueden unir a una fase sólida para facilitar la separación de los complejos de anticuerpo-antígeno de los componentes que no han reaccionado en un inmunoensayo. Las sustancias de ejemplo de la fase sólida incluyen, pero sin limitar, placas de microtitulación, tubos de ensayo, perlas magnéticas, de plástico o vidrio, y portaobjetos. Métodos para acoplar anticuerpos a las fases sólidas son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Alternativamente, el anticuerpo se puede marcar indirectamente por reacción con sustancias marcadas que tienen afinidad por la inmunoglobulina, tales como proteína A o G o segundos anticuerpos. El anticuerpo se puede conjugar con una segunda sustancia y detectar con una tercera sustancia marcada que tiene afinidad por la segunda sustancia conjugada con el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y el conjugado de anticuerpo-biotina se puede detectar usando avidina o estreptavidina marcada. Igualmente, el anticuerpo se puede conjugar con un hapteno y el conjugado de anticuerpo-hapteno se puede detectar usando anticuerpo dirigido contra hapteno marcado. Estos y otros métodos de marcaje de anticuerpos y conjugados de ensayo son bien conocidos para el experto en la técnica.

El anticuerpo se puede marcar indirectamente por reactividad con un segundo anticuerpo que se ha marcado con un marcador detectable. El segundo anticuerpo preferiblemente es uno que se une a anticuerpos del animal del cual se obtiene el anticuerpo monoclonal. En otras palabras, si el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón, entonces el segundo anticuerpo marcado es un anticuerpo dirigido contra Ig de ratón. Para el anticuerpo monoclonal que se va a usar en el ensayo descrito a continuación, este marcador preferiblemente es una perla revestida de anticuerpo, en particular una perla magnética. Para el anticuerpo policlonal que se va a usar en el inmunoensayo descrito en la presente memoria, el marcador preferiblemente es una molécula detectable tal como una sustancia radiactiva, fluorescente o electroquimioluminiscente.

Formulaciones

La proteína, péptido o fragmento de proteína que se produce de forma natural o sintética, que contiene todo o una parte activa de una proteína o péptido inmunogénico se puede preparar en una formulación fisiológicamente aceptable, tal como en un vehículo farmacéuticamente aceptable, usando técnicas conocidas. Por ejemplo, la proteína, péptido o fragmento de proteína se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición terapéutica.

Alternativamente, el gen para la proteína, péptido o fragmento de proteína, que contiene todo o una parte activa del péptido inmunogénico, se puede suministrar en un vector para la administración continua usando técnicas de terapia génica. El vector se puede administrar en un vehículo que tiene especificidad para un sitio objetivo, tal como un tumor.

Las composiciones se pueden administrar en forma de un sólido, líquido o aerosol. Ejemplos de composiciones sólidas incluyen píldoras, cremas y unidades de dosificación que se pueden implantar. Las píldoras se pueden administrar por vía oral. Las cremas terapéuticas se pueden administrar por vía tópica. Las unidades de dosificación que se pueden implantar se pueden administrar de forma local, por ejemplo en el sitio de un tumor, o se pueden implantar para la liberación sistémica de la composición terapéutica, por ejemplo, por vía subcutánea. Ejemplos de composiciones líquidas incluyen formulaciones adaptadas para la inyección intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterial, y formulaciones para la administración tópica e intraocular. Ejemplos de formulaciones de aerosol incluyen formulaciones de inhalador para la administración en los pulmones.

Las composiciones se pueden administrar por vías de administración convencionales. En general, la composición se puede administrar por vía tópica, oral, rectal, nasal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular). Además, la composición se puede incorporar en matrices de liberación sostenida tales como polímeros biodegradables, implantándose los polímeros cerca de donde se desea el suministro, por ejemplo, en el sitio de un tumor. El método incluye la administración de una dosis individual, la administración de dosis repetidas en intervalos de tiempo predeterminados y la administración sostenida para un periodo de tiempo predeterminado.

Una matriz de liberación sostenida, como se usa en la presente memoria, es una matriz hecha de materiales, normalmente polímeros que son degradables por hidrólisis enzimática o ácida/básica o por disolución. Una vez insertada en el cuerpo, la matriz actúa sobre las enzimas y fluidos corporales. La matriz de liberación sostenida se elige convenientemente de materiales biocompatibles tales como liposomas, polilactidas (poli(ácido láctico)), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactida-co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), polianhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, poli(vinil-propileno), polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de uno cualquiera de polilactida, poliglicolida o polilactida-co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).

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El antígeno químicamente modificado después se reconstituye en liposomas que consisten en fosfolípidos y colesterol (3). Ejemplos de liposomas adecuados incluyen, pero sin limitar DOPG, DOPEA, Chol. (El lípido A estaba en una concentración de 40 g/mol de fosfolípido). En la Figura 2 se muestra un esquema representativo que muestra el liposoma reconstituido con un antígeno amiloide químicamente modificado.

Las construcciones antigénicas supramoleculares descritas en esta memoria tienen amplias ventajas frente a los antígenos palmitoilados, reconstituidos en liposomas. Principalmente, las cadenas de PEG largas (n = 8 -5000) potencian significativamente la exposición y accesibilidad de la secuencia peptídica. La presentación de antígeno se mejora y se potencia la sensibilidad a la conformación de los anticuerpos producidos Otra ventaja es que se pueden usar secuencias de péptidos en diferentes conformaciones. La mayor distancia entre la secuencia y la superficie del liposoma asegura que la superficie no interactúe con la secuencia, por lo tanto, influya posiblemente en su conformación. También, la antigenicidad de la construcción se hace significativamente mayor que la de las secuencias palmitoiladas reconstituidas en liposomas. Se obtienen títulos altos de anticuerpos comprendidos entre 1:5000 y 1:10000 en ratones, en unas semanas. Adicionalmente, la afinidad de los anticuerpos por el antígeno aumentó significativamente. En el caso de la secuencia amiloide FRHDSGY (SEQ ID NO: 1), el anticuerpo producido por inyección ip o iv de la construcción, solubiliza eficazmente fibras A1-40 y fibras A1-42, protegiendo células PC12 in vitro contra la apoptosis e inhibición metabólica (reducción con MTT) inducida por fibras A1-42 y A1-40.

En un caso descrito en esta memoria, se usa la secuencia FRHDSGY (SEQ ID NO: 1) de la proteína amiloide, pero se puede sustituir por cualquier otra secuencia de proteína amiloide. Los anticuerpos monoclonales obtenidos de ratones inmunizados con la construcción descrita presentan, además de las propiedades in vitro mencionadas antes para los anticuerpos policlonales, actividad biológica en ratones transgénicos FVB APP[V717I] para la enfermedad de Alzheimer humana. En estos ratones se observan niveles significativos de restauración de la memoria y de despertar de la curiosidad. Los mAb no inducen hemorragia en el cerebro de ratones transgénicos inmunizados.

Aunque sin querer estar ligados por la siguiente teoría, basándose en estudios in vitro de la interacción de mAb antiamiloide (contra la secuencia 1-16, generada por los métodos de la presente invención) principalmente en la solubilización de fibras y espectros de CD, parece que los anticuerpos se unen con preferencia al -amilode en su conformación de hélice . Esto explicaría el efecto de solubilización de la fibra amiloide en términos termodinámicos. Puesto que el anticuerpo, al unirse con preferencia a la hélice , elimina la hélice  del amiloide del equilibrio:

A (hélice )  A (lámina )

aumentando así las cantidades de -amiloide en conformación de lámina , sufre una transición conformacional a la forma de hélice  soluble con el fin de restablecer el equilibrio. Las observaciones estequiométricas hechas apoyan la idea de que los mAb influyen directamente en el equilibrio de conformaciones.

Como estudió Selkoe (2002), la enfermedad de Alzheimer aparece como un fallo sináptico. En las primeras etapas de la enfermedad, la pérdida de memoria puede originar dicho fallo. Se cree que los oligómeros solubles A1-40, por ejemplo, pueden ser capaces de bloquear la sinapsis. Los anticuerpos monoclonales, generados por los métodos de la presente invención, se unen a oligómeros solubles A1-40. La medición de la conductividad de la sinapsis en presencia y ausencia de los anticuerpos, permite la determinación de la acción del anticuerpo en la sinapsis, en presencia de oligómeros solubles.

Los autores de la presente invención comprobaron la actividad de una serie de mAb obtenidos con los epítopos tales como A4-11 (SEQ ID NO: 2), A22-35 (SEQ ID NO: 3), y AP29-40 (SEQ ID NO: 4) embebidos en una construcción supramolecular (véase la Figura 5). Se determinó que la secuencia 4-11 era el epítopo para el mAb producido por el antígeno A1-16 palmitoilado (SEQ ID NO: 5).

De acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, se usaron péptidos nuevos y modificados de forma única con el fin de producir mAb:

Restos 22-35: EDVGSNKGAIIGLM (SEQ ID NO: 3)

Se ha encontrado que las uniones entre los dominios extracelular y transmembrana (TM) son dirigidas por anticuerpos inhibidores (tales como anticuerpos anti-HER2/neu Herceptin-Trastuzumab), y en proteínas de TM de multiexpansión, para formar bolsillos que son dirigidos por inhibidores de bajo peso molecular (Dragic et al., 2000). Aunque sin querer estar ligados por la siguiente teoría, es probable que esta secuencia sea crucial para la capacidad de oligomerización de A1-42 y A1-40, ya que representa la transición entre regiones polares e hidrófobas (en donde la frase “secuencia extracelular” se usa para referirse a las secuencias extracelulares en la secuencia amiloidogénica A1-42). La secuencia contiene los dos primeros motivos GXXXGXXXG de las secuencias A1-42 y A1-40. GXXXG son inductores clave de la oligomerización de secuencias hidrófobas (Russ y Engelmann, 2000). Es interesante que se predice que el primer motivo GXXXG es extracelular, mientras que los dos siguientes se predice que están situados en la membrana. Sin querer estar ligados por la teoría, se puede suponer, por analogía, que la oligomerización de los péptidos A es provocada específicamente por los motivos GXXXG.

Restos 29-40: GAIIGLMVGGW (SEQ ID NO: 4)

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como la encefalopatía espongiforme ovina, la PrPSc alcanza concentraciones en todo el cerebro de 10 a 20 veces mayores que la PrPc, que se asemeja notablemente a los datos listados en la Tabla 1 para las 2 concentraciones de PrP106-126.

El procedimiento de la muerte celular programada por PrP106-126 está asociado, entre otros, a la inducción del gen de mensaje 2 prostático inhibido por testosterona (TRPM-2). Se sabe si la apoptosis es activada in vivo en las encefalopatías relacionadas, pero la expresión del ARNm de TRPM-2 aumenta 10 veces en los hámsteres infectados por la encefalopatía espongiforme ovina.

A partir de estos datos, parece que un mecanismo neurotóxico es posiblemente el responsable de la pérdida de células neuronales en las encefalopatías relacionadas y también podría ser importante en la enfermedad de Alzheimer.

El posible mecanismo de esta neurotoxicidad se investigó en un sistema modelo dirigido a detectar y analizar las formaciones de canales iónicos tras la interacción de péptidos o proteínas con bicapas lipídicas.

El pH bajo que favorece la formación del canal por la PrP106-126, también convierte este péptido de una conformación en hélice alfa en lámina R. Mientras que la cartografía del péptido de PrPSc con secuenciación de Edman y la espectrometría de masas no puso de manifiesto diferencias entre su secuencia de aminoácidos y la predicha a partir de la secuencia génica de PrPc; no se encontraron modificaciones químicas que pudieran distinguir PrPSc de PrPp; sin embargo, la espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier y la espectroscopía de dicroísmo circular pusieron de manifiesto una diferencia conformacional significativa entre PrPSc y PrPp.

La PrPc es esencialmente hélice  con poco o nada de lámina R, mientras que PrPSc tiene un alto contenido de lámina  y menos estructura de hélice .

La secuencia KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (PrP106-126) (SEQ ID NO: 6) no sólo es muy hidrófoba, sino que también se convierte a pH bajo en la conformación de lámina . Además, en disolución puede convertir otros péptidos a la conformación de lámina .

Basándose en estas observaciones y mediante técnicas desarrolladas en esta memoria, se desarrolló una “vacuna” contra las enfermedades produciendo una fuerte respuesta inmunitaria humoral y celular en ratones a PrP106-126 neurotóxica, y después estimulando los ratones inmunizados con extractos de cerebro de ratones con encefalopatía espongiforme ovina.

Como en los ejemplos previos, las lisinas pegiladas se unieron covalentemente a cada extremo de la secuencia de PrP106-126. La longitud de la cadena de PEG era 12 -4000. Las cadenas de PEG se acoplaron cada una a una molécula de fosfatidiletanolamina y se reconstituyeron en liposomas de PG-PEA-chol -lípido A.

Inyectadas en los ratones, estas construcciones antigénicas supramoleculares produjeron una respuesta inmunitaria humoral fuerte, dando anticuerpos con alta afinidad para la secuencia de PrP106-126, y que tenían efectos solubilizantes en ésta.

EJEMPLO 1

Como se detalla en el Ejemplo 1, se demuestra que la muerte neuronal se produce por la exposición crónica de cultivos primarios hipocámpicos de rata a concentraciones micromolares de un péptido que corresponde a los restos 106-126 de la secuencia de aminoácidos deducida del ADNc de PrPc humana, de una forma dependiente de la concentración. Los datos se muestran en la Tabla 1.

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presentó dificultades. Los intentos de separar estos productos usando cromatografía de exclusión por tamaños también demostraron no ser satisfactorios, seguramente debido a su polidispersidad relativamente grande. No obstante, los autores de la presente invención usaron la cromatografía de intercambio catiónico para separar los productos mono-y di-acoplados antes de las desprotecciones finales de las cadenas laterales. Las posteriores desprotecciones de las cadenas laterales de los péptidos y la separación del exceso de DSPE-PEG-SPA inactivado permiten aislar los conjugados deseados con mucha mayor pureza.

EJEMPLO 3

Comparación de la inmunogenicidad de antígenos PEGilados y Palmitoilados, ensayos ELISA y de Desagregación

Se prepararon los antígenos liposómicos como se ha descrito antes. Las secuencias de PEG-A1-16, -A4-11 y -A22-35 se reconstituyeron en una construcción que consistía en liposomas hechos de dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPEA), dimiristoil-fosfatidilglicerol (DMPG) y colesterol (relaciones molares 0,9: 0,1: 0,1: 0,7) que contenían monofosforil-lípido A (fosfolípidos 40 mg/mM).

ELISA

Los antígenos y la A1-16 palmitoilada se usaron para la inmunización de ratones C57BL/6 en intervalos de 2 semanas. Se inmunizaron 10-12 animales con cada antígeno. Se recogieron sueros 5 días después de los refuerzos y se llevó a cabo el análisis por ELISA con varias diluciones de los sueros. Los resultados comparativos que muestran la inmunogenicidad de los diferentes antígenos se presentan en la Figura 7.

Los datos de ELISA mostraban que PEG-A1-16 liposómico es significativamente más inmunogénico que A1-16 palmitoilado. El ALUM adicional no potenció la inmunogenicidad de A1-16 en los ratones. La respuesta de anticuerpos inducida por PEG-A4-11 era más lenta en comparación con PEG-A1-16.

Ensayos de desagregación

Se usaron nueve sueros (dilución 1:100) de los animales inmunizados con PEG-A4-11-liposómico en un ensayo en el que se incubaron fibras de A1-42 preformadas con los antisueros. El ensayo se llevó a cabo como se ha descrito (Nicolau et al., 2002).

Se observó la solubilización de las fibras A1-42 por los diferentes sueros en un tiempo de incubación de 24 h (Figura 8). Algunos de los sueros solubilizaron las fibras en una extensión de 75% (sueros de los ratones 5 y 6). Las células de bazo de estos ratones se usaron para la producción de anticuerpos monoclonales.

EJEMPLO 4

Ensayo de Solubilización

A partir de dos animales inmunizados con A1-16 palmitoilado/liposomas/lípido A, se obtuvieron 25 líquidos sobrenadantes de los clones de hibridoma generados recientemente, que se mostró que eran específicos para los anticuerpos específicos de A1-42. Se ensayaron en un ensayo de solubilización de acuerdo con métodos y protocolos descritos en PNAS 2002, 99, 2332-2337. Los resultados se resumen en la Figura 9.

Se encontró que los líquidos sobrenadantes de 5 clones de hibridoma eran capaces de solubilizar las fibras de amiloide in vitro en una extensión de hasta 75%. Se seleccionaron los dos clones mejores, 15 y 27, para la purificación de los anticuerpos monoclonales. Se usan para posteriores investigaciones como mAb de control positivo in vivo.

EJEMPLO 5

Investigación de la transición de lámina  a hélice  del péptido A1-42 por espectroscopía de RMN de estado sólido.

Para evitar la pérdida de aminoácidos marcados con 13C, la síntesis de A1-42 por síntesis de péptido con Fmoc se verificó mediante una síntesis de ensayo sin aminoácidos marcados. La identidad del péptido A1-42 obtenido se pudo verificar por espectroscopía de masas MALDI y se pudo establecer un procedimiento de purificación usando HPLC con una columna de fase inversa y un gradiente de acetonitrilo y agua tamponada con amoniaco4.

A la preparación satisfactoria de un protocolo para la síntesis y purificación del péptido -amiloide le sigue la síntesis del péptido marcado que incluye una valina marcada con 13C en la posición 12 (12val) y una tirosina marcada con 13C en la posición 10 (10tyr).

El A1-42 marcado se usó para generar fibras incubando la disolución de péptido en tampón PBS durante una semana a 37ºC. Los espectros de RMN de 13C de las fibras liofilizadas confirmaron la estructura de lámina  y están de acuerdo con los resultados publicados. La incubación de las fibras con anticuerpo específico de A1-16 durante 2 días no mostró un cambio significativo del espectro de 13C. Las primeras evaluaciones de las mediciones de RMN

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indican un cambio en la estructura secundaria (Figura 10).

EJEMPLO 6

Anticuerpos Producidos por Construcciones Antigénicas Supramoleculares

Fabricación de los mAb: Los antígenos liposómicos se prepararon como se ha descrito (Nicolau et al., 2002, PNAS, 99, 2332-37). Las secuencias PEG-A1-15, -A1-16, A4-11 -A22-35 y A29-40 se reconstituyeron en una construcción que consistía en liposomas hechos de dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPEA), dimiristoil-fosfatidilglicerol (DMPG) y colesterol (relaciones molares 0,9: 0,1: 0,1: 0,7) que contenían monofosforillípido A (fosfolípidos 40 mg/mM). Estos antígenos y A1-16 palmitoilado se usaron para la inmunización de ratones C57BL/6 en intervalos de 2 semanas. Se inmunizaron 10-12 animales con cada antígeno. Después de 3 a 6 refuerzos, se seleccionaron para una fusión los ratones con valoraciones terapéuticas (cuando una dilución 1:5.000 de los sueros era positiva en ELISA). La fusión de los linfocitos B de ratón de los bazos se llevó a cabo con la línea celular de mieloma SP2-0. Se seleccionaron los clones de hibridoma que producían IgG y se ensayó su unión específica al péptido A1-42 por ELISA.

Caracterización del mAb: Los ensayos de desagregación, estudios de RMN, mediciones de QELS y SPR se usaron para la caracterización de los mAb. Los mAb mostraron una desagregación de las fibras de amiloide preformadas de hasta 80% (Tabla 1). Se observó una transición de lámina  a hélice  inducida por los anticuerpos (Figuras 11, 12). Las mediciones de dispersión de la luz cuasielástica (QELS) mostraron que la incubación de las fibras de amiloide con los anticuerpos monoclonales producía fibras con un tamaño de ≤ 800 nm, (40-60% de todas las fibras presentes) mientras que el amiloide solo daba agregados muy grandes (> 4 m).

Tabla 1

mAb obtenido por inmunización con PEG-A1-15, -A4-11 y Palin-A1-16

Antígeno

Mab/hibridoma desagregación [%] constantes de disociación

PEG A1-15

ET-1H6 75 nd

PEG A1-15

ET-7E3 55 2 x 10-7

PEG A4-11

EN-4H7 80 nd

PEG A4-11

EN-9H2 35 nd

Palm A1-16

EJ-1A9 55 8 x 10-8

Palm A1-16

EJ-7H3 60 7 x 10-8

Palm A1-16

AN9C-E4 60 nd

Estudios de RMN: Con el fin de evaluar el efecto del los mAb en las fibras, se incubó una disolución de fibras A con el anticuerpo durante 12 días. Se llevaron a cabo mediciones de difusión de espín dirigida por protón (PDSD) para medir un espectro de correlación de 13C-13C 2D. Las Figuras 11-13 proporcionan los datos y análisis de RMN: RMN: espectro de correlación de 13C-13C de fibras del péptido -amiloide antes y después de incubación con EN4H7, ET1H6 o AN9C-E4 durante 12 días (A, B). Columna (D) y una fila (C) extraídas del espectro de correlación. El espectro (-anticuerpo) muestra un espectro de las fibras puras, mientras que (+ anticuerpo) muestra un espectro en presencia del mAb.

Los espectros de 13C de las fibras liofilizadas permiten la asignación de las resonancias. Los valores de los desplazamientos químicos del C y C de la Val12 y Tyr10 confirman la estructura de lámina  de las fibras puras (Figura 11). Los desplazamientos de las resonancias de los núcleos de C y C de la 12Val indican claramente una transición de la lámina  a la hélice . Por otra parte, el desplazamiento de la resonancia del C y C de la Tyr 10 no indica claramente una transición de la estructura secundaria. El comportamiento de la resonancia de la Tyr 10 se puede explicar por un modelo en el que la Tyr10 está en la interfase entre una sección de lámina  y una sección de bucle del péptido A en fibras de amiloide.

En un segundo experimento, se incubaron fibras enriquecidas en 13C con los anticuerpos EN4H7 y ET1H6 (véase la Tabla 1) durante 12 días. Las fibras incubadas presentan desplazamientos de las resonancias del núcleo de C de la 12Val de 32 ppm a 28 ppm, indicando una transición de la lámina  a la hélice  para una fracción significativa del péptido (Figuras 12 y 13) para ambos anticuerpos. Las resonancias del C y C para la 10Tyr se hacen anchas en presencia de los anticuerpos. Esto indica una transición a una conformación más bien no estructurada para la

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Referencias:

1. C. Nicolau, R. Greferath, T.S. Balaban, J. Lazarte y R. Hopkins (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99,2332 2337.

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