ES2537701T3 - Un método de hidrólisis de péptidos, uso de una composición como agente bacteriostático y bactericida y los usos de la forma activa de LytM de S. aureus - Google Patents

Abstract

Un método de hidrólisis de péptidos que comprende la etapa en que la forma activa de LytM se pone en contacto con sustrato peptídico, en entorno acuoso de conductividad inferior a 2 mS/cm, y en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homóloga al fragmento LytM180-316 que corresponde a los residuos 180-316 de secuencia SEC ID Nº1 o a LytM185-316 de secuencia SEC ID Nº 2, preferentemente la forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytM180-316 que corresponde a los residuos 180-316 de secuencia SEC ID Nº 1 o LytM185-316 de secuencia SEC ID Nº 2; y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytM185-316 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID Nº 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila, y en el cual el contacto se realiza preferentemente a un intervalo de temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 37ºC, preferentemente a una temperatura por debajo de 10ºC.

Description

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25-05-2015

en lisis celular. Los tampones se prepararon como 50 mM con pH ajustado a 8,0 usando NaOH. Para comparación también se comprobó la lisis en agua dd. (C) Efecto de diversos aminoácidos. Se ensayaron D,Lalanina-NaOH (Ala), L-arginina-HCl (Arg), ácido L-glutámico-NaOH (Glu), (12) ácido diaminopimélico (DAP)-NaOH de pH 8,0. Se realizaron experimentos de lisis como se describe en el Ejemplo 8.

5 Figura 9 ilustra la comparación de la actividad de la forma activa de LytM (LytM185-316) y lisostafina (Lss) en diversas temperaturas. Los resultados se presentan como porcentaje de la DO inicial (%DO600) de la suspensión celular de S. aureus. Los resultados se obtuvieron para reacciones realizadas durante 60 min. en tampones óptimos para cada enzima en temperaturas de 4ºC, 23ºC y 37ºC. Figura 10 ilustra la actividad de la forma activa de LytM a diversas temperaturas. Los resultados se presentan

10 como porcentaje de la DO inicial (%DO600) de la suspensión celular de S. aureus. Los resultados se obtuvieron para la reacción realizada durante 60 min. en tampones óptimos para cada enzima en temperaturas de 0, 4, 10, 15, 23, 37 y 45ºC, respectivamente.

Descripción de realizaciones

15 [0051] Los siguientes ejemplos se presentan solamente para ilustrar la invención y para explicar cierto aspecto de la misma y no para limitar la invención, por lo tanto no deben identificarse con su alcance completo, que se define en las reivindicaciones adjuntas.

20 Ejemplos

Ejemplo 1

Producción de diversas formas de proteína LytM

25 [0052] Los fragmentos de ADN correspondientes a las proteínas LytM24-105, LytM185-316 y LytM26-316 se amplificaron por PCR a partir del clon LytM de longitud completa descrito previamente (Odintsov et al., 2004, J. Mol. Biol. 335:775-785), se insertaron en el vector pET15mod y se llamaron pET15modLytM24-105, pET15modLytM185-316, pET15modLytM26-316, respectivamente. Se fusionaron marcas de histidina a una parte N-terminal de las

30 construcciones codificadas por los fragmentos LytM. La secuencia codificante de LytM185-316 estaba precedida por una marca His de la siguiente secuencia MGHHHHHHEF. Las formas solubles de LytM24-105, LytM185-316 y LytM26-316 se obtuvieron expresando las construcciones en la cepa de E. coli BL21(DE3) del modo descrito para LytM185-316 en Odintsov S.G. et al., 2004, J.Mol. Biol. 335:775-785. La expresión de proteínas se indujo durante la fase logarítmica del crecimiento bacteriano (DO595 de 0,8) mediante la adición de IPTG 1 mM y se continuó durante 4 h a 25ºC. La

35 proteína recombinante se purificó por cromatografía de afinidad sobre una columna de nitrilo-ácido triacético (NTA) agarosa cargada con Ni2+ (Qiagen), seguido de filtración en gel en una columna Sephacril S200 (Amersham Bioscience) de acuerdo con la descripción del fabricante. En los ejemplos presentados a continuación se usó la forma estable y activa de LytM185-316 con marca His pero no se observaron diferencias en la unión y actividad de la forma activa de LytM con y sin marca His.

40 [0053] Los mutantes puntuales N117A, H210A, D214A, H291A, H293A se crearon por mutagénesis basada en PCR usando el kit Stratagene. Todos los mutantes se generaron en vector pET15modLytM155-316. La expresión y purificación de las proteínas mutadas fueron iguales que para la proteína LytM185-316. La lisostafina (forma madura) usada en los ejemplos presentados se adquirió de Sigma y se usó sin purificación adicional.

45 Ejemplo 2

Generación de anticuerpos policlonales anti-LytM185-316

50 [0054] Se crearon anticuerpos policlonales contra LytM185-316 en conejo (Pineda Antibody Service, Berlín, Alemania). La purificación de anticuerpo se realizó por afinidad a proteína LytM185-316 acoplada a Sepharose 4B activado por CNBr (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de lavado, los anticuerpos se eluyeron con glicina 100 mM pH 2,7. El pH del eluyente se neutralizó inmediatamente mediante la adición de 1/10 volumen de Tris-HCl 2 M pH 8,0. La concentración de los anticuerpos en el eluyente se estimó en

55 base a la absorción a DO280.

Ejemplo 3

Generación de fragmentos de pared celular y peptidoglucanos de S. aureus

60 [0055] Se recogieron cultivos en fase exponencial tardía de S. aureus cultivados en medio de caldo CASO a 37ºC por centrifugación, se resuspendieron en tampón A (Tris-HCl 20 mM pH 7,5) y se sometieron a autoclave durante 20 min. El extracto crudo se obtuvo después de sonicar las células durante 3 min. Los polímeros de pared secundarios se retiraron por los siguientes métodos:

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Claims (1)

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