ES2474194T3 - PMO-7 para su uso en el tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende el morfógeno PMO-7 para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la hiperplasia de la neoíntima en un sujeto.

Description

PMO-7 para su uso en el tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la prevención, el tratamiento o la reducción de la hiperplasia de la neo�ntima.

Antecedentes de la invención

La nefropat�a crónica (NC) es una enfermedad mortal y las complicaciones cardiovasculares (incluido el fallo de los accesos arteriovenosos (AV) debido a lesiones de hiperplasia de la neo�ntima (HN) venosa) son la causa principal de morbilidad y mortalidad. (Go, A.S. et al., New Engl. J. Med. 351:1296-1305, 2004; Bert, T. y Henrich, W., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 1:8-18, 2006)1,2. Se desconocen las causas del exceso de mortalidad cardiovascular asociada con la NC, ya que el papel de los factores de riesgo habituales asociados con la mortalidad cardiovascular no supone un aumento del riesgo de NC (Bed, ib�dem).

Si bien las f�stulas AV construidas con vasos naturales son el mejor acceso vascular disponible debido a la menor incidencia de estenosis, trombosis e infección en comparación con los injertos vasculares o los catéteres venosos centrales, incluso después de la maduración, la tasa de fallo del 66 % a los 2 años sigue siendo inaceptable (Shenoy S, et al., J Vase Surg. 2003;38(2):229-235.)54 y los ingresos hospitalarios relacionados con el acceso a la hemodi�lisis siguen costando bastante más de 1.000 millones de dólares al año en Estados Unidos (Lee H, et al., Am J Kidney Dis. 2002;40(3):611-622).55

De forma predominante, la causa del fallo de los accesos AV es secundaria a la formación de lesiones hiperpl�sicas de la neo�ntima oclusivas en la anastomosis y/o en las venas eferentes seguida de trombosis in situ (Mattana J, et al., Kidney Int. 1997;52(6):1478-1485; Ezzahiri R, et al., Nephrol Dial Transplant. 1999;14(9):2110-2115; Cinat ME, et al., Ann Vase Surg. 1999;13(2):191-198; Tordoir JH, et al., EurJ Vase Endovasc Surg. 1995;9(3):305-309).56-59 A diferencia de la reestenosis observada con las arterias ateroescler�ticas preoclusivas después de la angioplastia y la colocación de endopr�tesis vasculares, la hiperplasia de la neo�ntima (HN) se observa en la anastomosis que afecta a una arteria o un injerto sintético (p. ej., ePTFE, Dacron) y a una vena de las extremidades. Aunque estos vasos sanguíneos no suelen tener placas ateroescler�ticas, presentan predisposición a la calcificación, HN preexistente y lesiones por punciones con aguja. Por lo tanto, la migración dirigida de células musculares lisas (CML) hacia la superficie luminal venosa es esencial para la formación de lesiones de HN perianastom�ticas (Roy-Chaudhury P, et al., J Am Soc Nephrol. 2006; 17(4): 1112-1127; Nikkari ST, et al., Ann Med. 1994;26(2):95-100).60,61

Se ha relacionado la NC con el desarrollo de ateroesclerosis junto con una serie de otros factores alterados tales como fuerzas hemodin�micas, mediadores inflamatorios, activación plaquetaria, cascada de coagulación y factores metabólicos. Además, existen pruebas epidemiológicas sólidas de que el fósforo s�rico es un factor de riesgo independiente para los episodios cardiovasculares agudos y la mortalidad en la NC (Kestenbaum, B. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 16:520-528, 2005; Slinin, Y. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 16:1788-1793, 2005).3,4 Se ha relacionado el fósforo s�rico con otro factor de riesgo cardiovascular, la calcificación vascular (CV) (Kestenbaum et al. 2005; London, G.M. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 18:1731-1740, 2003; Raggi, P. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 39:695-701, 2002)3,5,6, una causa importante de la rigidez vascular en la NC. La rigidez vascular por diversas causas incluida la NC, la ateroesclerosis, las enfermedades metabólicas y la diabetes, es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular, que da lugar a un aumento de la velocidad de las ondas de pulso, un aumento del esfuerzo cardíaco, hipertrofia del ventricular izquierdo y una disminución del flujo sanguíneo arterial coronario.(Raggi 2002; Zile, M.R. et al., New Engl. J. Med. 350:1953-1959, 2004; Ohtake, T. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 16:1141-1148, 2005).6-8 Además, se ha apuntado al fósforo como causa de la CV por estudios in vitro que han demostrado que induce cambios fenot�picos en las células musculares lisas vasculares al aumentar la transcripción g�nica de proteínas que participan en la función de los osteoblastos (la formación del hueso) (Tyson, K.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:489-494, 2003)9 y estimular la mineralizaci�n de la matriz (Steitz, S.A. et al., Circ. Res. 89:1147-1154, 2001; Jono, S. et al., Cir. Res. 87:e10-e17, 2000; Reynolds, J.L. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15:2857-2867, 2004)10-12. En el entorno calcificante ur�mico, se suprime la expresión de las proteínas contráctiles de las células musculares lisas vasculares, tales como la actina α de músculo liso, SM22 y la miosina de cadena pesada (Trion, A. y van der Laarse, A., Am. Heart J. 147:808-814, 2004),13 mientras que los marcadores de linaje osteobl�stico tales como la osteocalcina, la osteopontina y las proteínas morfog�nicas óseas 2 y 4, aumentan (Tyson 2003; Moe, S.M. et al., Kidney Int'l 61:638-647, 2002; Bostrom, K. et al., J Clin. Invest. 91:1800-1809, 1993; Dhore, C.R. et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21:1998-2003, 2001).9,14-16 Además, el factor de transcripción específico de osteoblastos RUNX2, que dirige la formación de los huesos esquel�ticos (Ducy, P. et al., Cell 89:747-754, 1997),17 se expresa en la vasculatura de sujetos con nefropat�a terminal (NT) (Tyson 2003; Moe, S.M. et al., Kidney Infl 63:1003-1011, 2003).9,18

Recientemente se ha identificado un modelo animal de CV estimulada por NC en el ratón ateroescler�tico deficiente en receptores de lipoprote�nas de baja densidad con una alimentación rica en grasas alimenticias (Davies, M.R. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 14:1559-1567, 2003).19 En este modelo, la NC se asocia con hiperfosfatemia. Se ha

demostrado que la hiperfosfatemia es una causa directa de CV en la NC (Davies, M.R. et al., J. Am. Soc. Neph. 16:917-928, 2005).20 Esta fue la primera demostración in vivo de que la hiperfosfatemia es la causante de una complicación cardiovascular de la enfermedad. Además, se ha demostrado que el esqueleto en la NC contribuye de forma significativa con fósforo a la hiperfosfatemia, (Davies 2005; Lund, R,J, et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15:359-369, 2004)20,21 junto con la absorción intestinal del fósforo ingerido y una eliminación renal disminuida. Esto establece una relación directa entre la remodelación del esqueleto y la CV en la NC a través del fósforo s�rico. El mecanismo de la acción del fósforo en la vasculatura no se ha demostrado aún, a pesar de los recientes avances que apuntan a acciones directas del ion (Jono 2000; Li, X. et al., Circ. Res. 98:905-912, 2006).11,22

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el morf�geno PMO-7 para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto. Además, la presente invención se refiere al uso del morf�geno PMO-7 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, evitar o reducir la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto. En algunos modos de realización, la hiperplasia de la neo�ntima se asocia con la anastomosis. En otros modos de realización, la hiperplasia de la neo�ntima est� inducida por una nefropat�a crónica.

En cualquiera de los aspectos y modos de realización descritos en el presente documento, un análogo de la PMO-7 representa cualquier PMO similar que tenga estructuras altamente homólogas, es decir, un esqueleto de seis o siete ciste�nas que, a través de puentes disulfuro, forma una estructura diferente en la parte C-terminal del polip�ptido, en el que la secuencia de amino�cidos de tal esqueleto de seis o siete ciste�nas comparte el 70, el 80, el 90 o el 95 % de similitud o identidad al mismo tiempo que conserva las ciste�nas y en el que las actividades biológicas pueden sustituir total o parcialmente a la PMO-7.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los efectos de la PMO-7 sobre la calcificación vascular en la NC.

La figura 2 muestra los efectos del CaCO3 y el LaCO3, ambos al 3 % mezclados con la dieta, sobre la calcificación vascular en la NC.

La figura 3 muestra secciones de la aorta proximal que presentan placas ateroescler�ticas calcificadas grandes en ratones LDLR-/-con alimentación rica en grasas.

La figura 4 muestra que la mineralizaci�n de la matriz se ve estimulada en cultivos de células musculares lisas vasculares humanas (hCMLV) aisladas a partir donantes ateroescler�ticos.

La figura 5 muestra la estimulaci�n de un programa de diferenciación osteobl�stica dirigida por PMO-2/MSX2 por NaH2PO4/NaHPO4 a través de la inducción de osterix.

La figura 6 muestra los efectos de un inhibidor específico de proteínas morfog�nicas óseas, la nogina, sobre la mineralizaci�n de CMLV y la expresión g�nica.

La figura 7 muestra los efectos de la inactivaci�n de osterix sobre la mineralizaci�n estimulada por fósforo realizada por células de tipo osteobl�stico. Se desarrollaron líneas celulares SAOS que expresaban ARNip para osterix como se describe en el ejemplo 11. Panel A. Los niveles de ARNm para osterix se redujeron en más del 50 % en dos líneas celulares independientes (ARNiposx#1 y ARNiposx#2). Panel B. Los niveles de proteína de osterix disminuyeron notablemente de acuerdo con el análisis Western en ARNiposx#1 y ARNiposx#2. Los niveles de histonas H3 se determinaron como un control de carga en las transferencias de bandas Western. Paneles C-G. Tinciones de von Kossa (paneles C-E) y de rojo de alizarina (paneles F,G) de cultivos estimulados por condiciones con fósforo alto. Panel C. Nódulos mineralizados en la periferia de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel D. Nódulos mineralizados en el centro de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel E. Ausencia de mineralizaci�n detectada por tinción de von Kossa en la periferia de pocillos con expresión de ARNiposx#1 después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel F. Nódulos teñidos con rojo de alizarina en la periferia de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel G. Ausencia de mineralizaci�n detectada por tinción de rojo de alizarina en la periferia de pocillos con expresión de ARNiposx#1 después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. El naranja es la tinción de fondo en las tinciones de rojo de alizarina negativas. Panel H. Niveles de calcio en las matrices de cultivos de líneas celulares que expresan ARNip para osterix.

La figura 8 muestra la expresión de marcadores de CMLV contráctiles en hCMLV.

La figura 9 muestra la expresión de diversos genes relacionados con la calcificación en aortas de diversos grupos de ratones LDLR-/-con alimentación rica en grasas medida por RT-PCR en tiempo real.

La figura 10 muestra homologías entre diversas proteínas morfog�nicas óseas .

La figura 11 es una representación esquemática de la anastomosis AV. Imagen real (B) y esquema (A) del modelo de ratón de creación de una f�stula AV con anastomosis del extremo al lateral del extremo izquierdo común de la arteria carótida al lateral izquierdo exterior de la vena yugular. Secciones transversales de 100 micrómetros de la anastomosis venosa 3 semanas después de la creación de una f�stula AV (C-F). Barra = 100 μm.

La figura 12 muestra el efecto de la administración de PMO-7 sobre la inducción en la NC de la formación de lesiones anastom�ticas de HN.

La figura 13 muestra las secuencias de diversos morf�genos.

Descripci�n detallada de la invención

Con el fin de que se pueda comprender por completo la invención descrita en el presente documento, se expone la siguiente descripción detallada.

I. Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica o probar la invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entender� que la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "comprendiendo", implican la inclusión de un elemento o grupo de elementos indicado pero no la exclusión de cualquier otro elemento o grupo de elementos.

Morf�geno de PO/PMO. Tal como se usan en el presente documento, los términos "morf�geno de PO/PMO", "PMO", "PO", "morf�geno", "proteína morf�gena ósea" y "proteína morfog�nica ósea" se usan indistintamente y significan un polip�ptido, o una variante funcional de un polip�ptido, que comprende al menos el dominio C-terminal de seis o siete ciste�nas de una proteína de mamífero seleccionada del grupo que consiste en PMO-7 (PO-1), PO-2 (PMO-8), PO-3, PMO2, PMO3, PMO4, PMO5, PMO6, PMO9 y "análogos de morf�genos". Los "análogos de morf�genos" se definen en el presente documento como proteínas que comprenden el esqueleto C-terminal de seis o siete ciste�nas (donde las ciste�nas forman una estructura que conserva las relaciones espaciales de unas con otras y con otros residuos de amino�cido) y presentan, entre los amino�cidos de este esqueleto que no son ciste�nas al menos el 65 % o, más preferentemente, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % de homología de secuencia de amino�cidos, o al menos el 50 %, más preferentemente el 55 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 99 % o más de identidad, con la secuencia de amino�cidos del dominio de siete ciste�nas de un morf�geno del que es análogo. Un análogo de morf�geno puede estar truncado en el extremo N-terminal en comparación con un morf�geno de longitud completa o puede ser una proteína correspondiente de una especie diferente. Un análogo de morf�geno se puede preparar de manera artificial. Un análogo de morf�geno puede tener modificación postraduccional o se le pueden haber incorporado ácidos no am�nicos, o puede comprender amino�cidos no naturales, tales como Damino�cidos o polisac�ridos que tienen una conformación sustancialmente similar a la de los residuos de amino�cido que reemplazaron. Un análogo de morf�geno puede tener actividades biológicas similares a las de la proteína de la que es análogo. Estas actividades son: (a) puede inducir condrog�nesis en el ensayo óseo ect�pico de Reddi-Sampath (Sampath y Reddi 1981, Pnoc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 7599-7603) o un ensayo sustancialmente equivalente, (b) puede evitar, inhibir, retardar o aliviar de forma significativa la pérdida progresiva de función renal en un modelo animal estándar de insuficiencia renal crónica o (c) puede originar una mejora cl�nicamente significativa en un marcador t�pico de la función renal cuando se administra a un mamífero con insuficiencia renal o riesgo de padecerla.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína morfog�nica ósea mineralizante" o "PMO mineralizante" se refiere a un subconjunto de morf�genos de PO/PMO (según se define anteriormente) que promueve la diferenciación de osteoblastos y la calcificación de los tejidos. Son ejemplos de PMO mineralizantes la PMO-2 y la PMO-4 y los análogos de la PMO-2 y la PMO-4.

Tal como se usa en el presente documento, "PMO que contrarresta la mineralizaci�n" significa una PMO-7, que contrarresta la actividad de una PMO mineralizante y por lo tanto, impide la mineralizaci�n de los tejidos.

Tal como se usa en el presente documento, "homología de secuencia de amino�cidos" o un porcentaje de "homología" entre dos secuencias de amino�cidos se entiende en el presente documento que incluye tanto la identidad de secuencia de amino�cidos como la sustitución conservada. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, un porcentaje de "homología" entre dos secuencias de amino�cidos indica el porcentaje de residuos de amino�cido que son idénticos o que son de sustitución conservada entre secuencias. Las "sustituciones

conservadoras" de amino�cidos cumplen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en Dayhoff et al. (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 (Supl. 3), p�gs. 354-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. As�, las "sustituciones conservadoras" son residuos que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, con similitud de tamaño, forma, carga eléctrica y/o propiedades químicas tales como la capacidad para formar enlaces covalentes o puentes de hidrógeno, o similares. Los ejemplos de sustituciones conservadoras preferentes incluyen la sustitución de un amino�cido por otro con características similares, p. ej., sustituciones dentro de los siguientes grupos: (a) Ser, Thr, Pro, Ala, Gly; (b) Asn, Asp, Glu, Gln; (c) His, Arg, Lys; (d) Met, Ile, Leu, Val; (e) Phe, Tyr, Trp. En un modo de realización muy preferente, las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un amino�cido por otro de los siguientes grupos: (a) glicina, alanina; (b) valina, isoleucina, leucina; (c) ácido asp�rtico, ácido glut�mico; (d) asparagina, glutamina; (e) serina, treonina; (f) lisina, arginina, histidina; y (g) fenilalanina, tirosina. Véase la figura 84 de Dayhoff et al. (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 (Supl. 3), p�gs. 354-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. El término "sustitución conservadora" o "variación conservadora" también incluye el uso de un amino�cido sustituido en lugar de un amino�cido original no sustituido en una cadena polipept�dica dada, con la condición de que la cadena polipept�dica resultante también tenga eficacia terapéutica.

Tal como se usa en el presente documento, se dice que un agente terapéutico (morf�geno) descrito en el presente documento tiene "eficacia terapéutica" y se dice que una cantidad del agente es "terapéuticamente eficaz", si la administración de esa cantidad del agente es suficiente para originar una mejora cl�nicamente significativa en un marcador t�pico de salud cardiovascular cuando se administra a un sujeto mamífero (p. ej., un paciente humano) con esclerosis vascular o riesgo de padecerla. Estos marcadores de esclerosis vascular son bien conocidos en la literatura m�dica e incluyen, sin limitación, la frecuencia cardíaca, el ritmo cardíaco y los resultados de pruebas como angiograf�a, pruebas de esfuerzo, electrocardiograma, ecocardiograma, tomografía computerizada, puntuación de calcio cardíaco, puntuación de calcificación cardíaca, puntuación de calcio y gammagraf�a cardíaca.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, significa la cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una subpoblaci�n de células de un animal y de este modo, bloquear las consecuencias biológicas de esa ruta en las células tratadas, con una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento m�dico.

La expresión "farmac�uticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a los compuestos, los materiales, las composiciones y/o las formas farmacéuticas que, dentro del alcance del criterio m�dico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin exceso de toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable.

La expresión "vehículo farmac�uticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmac�uticamente aceptable, tal como una carga, un diluyente, un excipiente, un disolvente o un material de encapsulado líquido o sólido, implicado en la transmisión o el transporte de los compuestos objeto desde un órgano o porción del organismo, hasta otro órgano o porción del organismo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de que sea compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmac�uticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido alg�nico; (16) agua sin pir�genos; (17) solución salina isot�nica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tamponadoras de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Tal como se usa en el presente documento, "tratar" o "que trata" significa, se refiere a aliviar o rebajar la gravedad de uno o más síntomas asociados con la afección, enfermedad o trastorno mencionado en un sujeto. El término tratar o que trata, sin embargo, no significa, ni implica de otro modo, un proceso de curación total o un tratamiento que sea eficaz al 100 % para restablecer la salud del sujeto a su estado anterior a la afección.

Tal como se usa en el presente documento, "evitar" o "prevención" significa reducir la probabilidad/el riesgo de desarrollar una afección en un sujeto (célula, tejido, órgano u organismo, etc.) o retardar la aparición de una afección en el sujeto, o rebajar la gravedad de uno o más síntomas de una afección que se pueden desarrollar en el sujeto, o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, "sujeto" se refiere a un animal. En algunos modos de realización, el animal es un mamífero, incluidos, pero sin limitación, un ser humano, un b�vido y un roedor. En un modo de realización preferente, el mamífero es un ser humano.

Tal como se usa en el presente documento con respecto a las nefropat�as en general y más específicamente, a indicaciones clónicas tales como los cilindros urinarios, la TFG medida u otros marcadores de la función renal, cada uno de los cuales se describe a continuación en el presente documento, "crónico" significa que persiste durante un periodo de al menos tres y más preferentemente, al menos seis meses. As�, por ejemplo, un sujeto con una TFG medida de forma crónica inferior al 50 % de la TFGexp es un sujeto en el que se ha medido la TFG y se ha observado que es inferior al 50 % de la TFGexp en al menos dos medidas separadas por al menos tres y más preferentemente, por al menos seis meses y para el que no hay un motivo m�dico razonable para creer que la TFG era sustancialmente (p. ej., un 10 %) mayor durante el periodo intermedio.

Tal como se usa en el presente documento, se puede considerar que un sujeto padece una nefropat�a si él o ella presenta insuficiencia renal crónica, nefropat�a terminal, nefropat�a diab�tica crónica, nefroesclerosis hipertensora, glomerulonefritis crónica, nefritis hereditaria y/o displasia renal; sujetos con una biopsia que indica hipertrofia glomerular, hipertrofia tubular, glomeruloesclerosis crónica y/o esclerosis tubulointersticial crónica; sujetos con una ecograf�a, RMN, TAC u otra exploración no invasiva que indica fibrosis renal; sujetos con una cantidad inusual de cilindros anchos presentes en el sedimento urinario; sujetos con un agar que, de forma crónica, es de menos de aproximadamente el 50 % y más en particular, de menos de aproximadamente el 40 %, el 30% o el 20 %, de la TFG esperada para el sujeto; sujetos humanos de sexo masculino que pesan al menos aproximadamente 50 kg y que, de forma crónica, tienen una TFG de menos de aproximadamente 50 ml/min y más en particular, de menos de aproximadamente 40 ml/min, 30 ml/min o 20 ml/min; sujetos humanos de sexo femenino que pesan al menos aproximadamente 40 kg y que, de forma crónica, tienen una TFG de menos de aproximadamente 40 ml/min y más en particular, de menos de aproximadamente 30 ml/min, 20 ml/min o 10 ml/min; sujetos que poseen una cantidad de unidades de nefrona funcionales de menos de aproximadamente el 50 % y más en particular, de menos de aproximadamente el 40 %, el 30 % o el 20 %, de la cantidad de unidades de nefrona que posee un sujeto sano, por lo demás similar; sujetos que tienen un único ri��n; y sujetos que son receptores de un trasplante de ri��n.

II. Visión general

La esclerosis vascular, o endurecimiento de los vasos sanguíneos, conduce a múltiples lesiones e insuficiencias cardiovasculares relacionadas. La esclerosis vascular se puede manifestar en muchas enfermedades, incluidas nefropat�as tales como la nefropat�a crónica (NC), ateroesclerosis, enfermedades metabólicas, síndrome metabólico, obesidad, osteoporosis, hipertensión, diabetes de tipo 2, etc. La NC es un fallo complejo de varios sistemas/aparatos. Se asocia con altas tasa de mortalidad debidas a episodios cardiovasculares agudos.

La hiperfosfatemia y la calcificación vascular (CV), o mineralizaci�n vascular, (estos dos términos se usan indistintamente en el presente documento) son factores de riesgo cardiovascular en la NC. En un modelo animal de ateroesclerosis y diabetes de tipo 2, se ha demostrado que la NC estimula la hiperfosfatemia y la CV. Además, en el presente documento se divulga que la hiperfosfatemia est� directamente relacionada con la CV, como se demuestra con el uso de este modelo y que la PMO-7 o la unión de fósforo intestinal corregían la hiperfosfatemia y reducían la CV establecida en este modelo.

Tambi�n se describe un procedimiento de prevención de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un morf�geno seleccionado del grupo que consiste en PMO-7, PMO-5, PMO-6, PO-2 (PMO-8) y variantes de los mismos. En el presente documento, se describe un procedimiento de prevención de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con PMO-7, PMO-5, PMO-6 o PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de prevención de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. El antagonista de la PMO mineralizante también puede ser una PMO que contrarreste la mineralizaci�n.

Tambi�n se describe un procedimiento de reducción o control de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un morf�geno seleccionado del grupo que consiste en PMO-7, PMO-5, PMO6, PO-2 (PMO-8) y variantes de los mismos. También se describe un procedimiento de reducción o control de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con PMO-7, PMO-5, PMO-6 o PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de tratamiento de la esclerosis vascular en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. EL antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser una PMO que contrarreste la mineralizaci�n. La esclerosis vascular puede acompañar o estar inducida por la NC.

Otro aspecto descrito en el presente documento es el tratamiento, la prevención o la reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto. Se describe un procedimiento de tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6, PO-2 (PMO-8) y variantes de los mismos. También se describe un procedimiento de tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas

vasculares con un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6 o PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser una PMO que contrarreste la mineralizaci�n. La hiperplasia de la neo�ntima se puede asociar con anastomosis. La hiperplasia de la neo�ntima puede acompañar o estar inducida por la NC.

Tambi�n se describe un procedimiento de prevención de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6, PO-2 (PMO-8) y variantes de los mismos. También se describe un procedimiento de prevención de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6 o PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de prevención de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. La hiperplasia de la neo�ntima se puede asociar con anastomosis. La hiperplasia de la neo�ntima puede acompañar o estar inducida por la NC.

Tambi�n se describe un procedimiento de reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6, PO-2 (PMO-8) y variantes de los mismos. También se describe un procedimiento de reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un morf�geno seleccionado de entre PMO-7, PMO-5, PMO-6 o PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto que comprende la etapa de poner en contacto células musculares lisas vasculares con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser una PMO que contrarreste la mineralizaci�n. La hiperplasia de la neo�ntima se puede asociar con anastomosis. La hiperplasia de la neo�ntima puede estar inducida por la nefropat�a crónica.

La presente divulgación también se refiere a composiciones y procedimientos para inducir la diferenciación de células musculares lisas vasculares. También se describe un procedimiento de inducción de la diferenciación de células musculares lisas vasculares que comprende la etapa de poner en contacto una célula muscular lisa vascular progenitora o una célula muscular lisa vascular sin diferenciar o desdiferenciada con un morf�geno seleccionado del grupo que consiste en PMO-7, PMO-5, PMO-6 y PO-2 (PMO-8). Preferentemente, el morf�geno es PMO-7. También se describe un procedimiento de inducción de la diferenciación de células musculares lisas vasculares que comprende la etapa de poner en contacto una célula muscular lisa vascular progenitora o una célula muscular lisa vascular sin diferenciar o desdiferenciada con un antagonista de una PMO mineralizante. La PMO mineralizante puede ser PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser la nogina. El antagonista de la PMO mineralizante puede ser una PMO que contrarreste la mineralizaci�n. La diferenciación de las células musculares lisas vasculares puede acompañar o estar inducida por la NC.

La presente divulgación también se refiere a la prevención y el tratamiento de la calcificación vascular (CV). En un aspecto, la divulgación se refiere al tratamiento profiláctico y terapéutico de la calcificación vascular que acompaña o est� inducida por la NC. En el modelo animal modelo de CV estimulada por NC descrito anteriormente, se observ� mineralizaci�n de la matriz al aumentar el fósforo en el medio en presencia de una PMO-2 y transcripción osteobl�stica dirigida por RUNX2. Esta mineralizaci�n estimulada por fósforo in vitro se silenci� con la inhibición de osterix, un factor de transcripción secundario esencial y con la inhibición de la acción de PMO-2 por un antagonista de PMO-2, la nogina.

Por tanto, un aspecto de la presente divulgación se refiere a la reducción, el control y la prevención de la mineralizaci�n de la matriz por la inhibición de PMO que promueven la mineralizaci�n. Otro aspecto de la divulgación es la reducción, el control y la prevención de la mineralizaci�n de la matriz por la inhibición de osterix. La presente divulgación también se refiere a la reducción, el control y la prevención de la mineralizaci�n de la matriz por la inhibición de la acción de PMO-2 con un antagonista de PMO, la nogina. La acción de PMO-2 se puede contrarrestar con cualquier otra PMO, por ejemplo PMO-7.

In vivo, la NC producía hiperfosfatemia y estimulaba la expresión a�rtica de osterix. El control de la hiperfosfatemia con agentes de unión de fosfato o PMO-7 reducía la expresión de osterix y la mineralizaci�n a�rtica.

Por tanto, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la reducción, el control y la prevención de la mineralizaci�n vascular por el control de la hiperfosfatemia. Un modo de realización de la presente divulgación es un procedimiento de reducción, control y prevención de la hiperfosfatemia en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar un agente de unión de fosfato, de modo que se reduce el contenido s�rico en fósforo. En otro modo de realización, se puede administrar PMO-7 para reducir, controlar o evitar la hiperfosfatemia. Un modo de

realizaci�n de la presente divulgación es un procedimiento de reducción, control y prevención de la mineralizaci�n vascular por el control de la hiperfosfatemia. Otro modo de realización de la divulgación es un procedimiento de reducción de la expresión de osterix que comprende la etapa de administrar un agente de unión de fosfato o PMO-7.

En cultivos de células musculares lisas a�rticas humanas aisladas a partir de aortas ateroescler�ticas se mostr� un programa de transcripción g�nica osteobl�stica activada por PMO-2 y -4 (Lecanda, F. et al., J. Cell Biochem. 67:386398, 1997)23. El fósforo estimulaba la mineralizaci�n de la matriz extracelular de estos cultivos análogos a la formación de hueso in vitro. Un antagonista de PMO, la nogina, bloqueaba la mineralizaci�n con una presencia elevada de fósforo. El fósforo a�ad�a una estimulaci�n crítica del programa de mineralizaci�n osteobl�stico a través del aumento de la expresión del factor de transcripción específico de osteoblastos osterix. (Nakashima, K. et al., Cell 108:17-29, 2002; Lee, M.-H., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 309:689-694, 2003)24,25. La inhibición de la mineralizaci�n se producía al reducir la expresión de osterix en presencia de mucho fosfato en el medio. Los datos in vitro coincidían a la perfección con los de la NC in vivo, en parte por la estimulaci�n de la señal de fósforo elevado. Los ratones LDLR-/-ateroescler�ticos con alimentación rica en grasas expresaban PMO-4 y RUNX2 y presentaban niveles bajos de mineralizaci�n a�rtica. La NC estimulaba la hiperfosfatemia, la expresión de osterix y la mineralizaci�n a�rtica. La mineralizaci�n era parcialmente reversible con el tratamiento de la hiperfosfatemia o con PMO-7 (que también corregía la hiperfosfatemia), relacionado con el silenciamiento de la expresión de osterix.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el morf�geno PMO-7 para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto. La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un antagonista de una PMO mineralizante para tratar, evitar o reducir la hiperplasia de la neo�ntima. En determinados modos de realización, la PMO mineralizante es PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. En algunos modos de realización, el antagonista de la PMO mineralizante es la nogina. En otros modos de realización, el antagonista de la PMO mineralizante es una PMO que contrarresta la mineralizaci�n. En algunos modos de realización, la hiperplasia de la neo�ntima se asocia con la anastomosis. En algunos modos de realización, la hiperplasia de la neo�ntima acompaña o est� inducida por una nefropat�a crónica.

III. Funciones renales básicas y sus indicadores

NUS y creatinina. La concentración en la sangre (concentración sanguínea) de nitrógeno ureico sanguíneo (NUS), conocido como urea y de creatinina (Cr) se puede medir con pruebas analíticas rutinarias. Los niveles de NUS y creatinina indican la función general de los riñones. El NUS es un subproducto metabólico de los alimentos ricos en proteínas, tales como la carne roja, las aves y determinadas hortalizas. Los riñones retiran el NUS de la sangre por filtración y lo eliminan con la orina. La creatinina se genera de forma continua con el metabolismo celular normal en los músculos. Los riñones también retiran la creatinina de la sangre por filtración y la eliminan con la orina.

Las cantidades de NUS y creatinina en la sangre son iguales a la cantidad eliminada por los riñones. Los niveles sanguíneos de NUS y Cr permanecen sin cambios a menos que se produzca un deterioro repentino de la función renal (es decir, del ri��n). Si los riñones dejan de funcionar de forma repentina, el NUS y la Cr aumentan diariamente. Esta afección se conoce como insuficiencia renal aguda. La insuficiencia renal crónica es una afección que se distingue por un aumento gradual del NUS y la Cr a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

Medida de la función renal. Cuando disminuye la función renal, aumentan los niveles sanguíneos de Cr y NUS porque los riñones no pueden limpiar la sangre de forma eficaz. También hay factores no relacionados con los riñones que afectan a los niveles de NUS y Cr. La creatinina en particular se ve afectada por la edad, el sexo, el peso y la masa muscular.

La función renal se mide para evaluar la velocidad a la que ambos riñones pueden limpiar la sangre. Para medir la función renal, es necesario recoger una muestra de orina de 24 horas. Es importante que la muestra de 24 horas est� completa (es decir, que no falte orina), con el fin de que no se subestime la función renal.

Se compara la cantidad de Cr en la muestra de orina con la concentración sanguínea de Cr. Esta cifra se conoce como aclaramiento de creatinina (AcCr), la velocidad a la que ambos riñones limpian la sangre. El AcCr normal es de aproximadamente 90 a 130 mililitros por minuto (ml/min). Mucha gente pierde función renal gradualmente a medida que envejecen. Otras medidas alternativas de la función renal se basan en tablas o fórmulas que tienen en cuenta la edad, el peso corporal, el sexo y la creatinina en sangre.

Algunos centros sanitarios de Estados Unidos ofrecen el ensayo Glofil-125 para evaluar la función renal. Se inyecta yodotalamato de sodio I-125 (un radiof�rmaco) en la piel y se toman muestras de sangre y orina para determinar la función renal. Es una prueba sencilla de realizar, es más sensible que las medidas de la creatinina en sangre y proporciona resultados en un plazo de 2 a 3 horas. Las medidas de la función renal determinan la gravedad del deterioro del ri��n. Es importante realizar un seguimiento de la función renal en el tiempo para documentar la velocidad de deterioro o de mejora con el tratamiento.

Tasa de filtración glomerular (TFG). La "tasa de filtración glomerular" o "TFG" es proporcional a la velocidad de

aclaramiento hacia la orina de una sustancia contenida en el plasma que no est� unida a proteínas s�ricas, se filtra libremente a través de los glom�rulos y ni la secretan ni la reabsorben los t�bulos renales. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, TFG se define preferentemente por la siguiente ecuación.

TFG = Oconc x V / Pconc

donde Oconc es la concentración del marcador en la orina, Pconc es la concentración plasm�tica del marcador y V es el caudal de orina en ml/min. Opcionalmente, la TFG se corrige para el área de superficie corporal. As�, se puede considerar que los valores de TFG usados en el presente documento son en unidades de ml/min/1,73 m2.

La medida de TFG preferente es el aclaramiento de inulina, pero dada la dificultad de medir la concentraciones de esta sustancia, en un entorno cl�nico se usa típicamente el aclaramiento de creatinina. Por ejemplo, para un ser humano varón sano de talla promedio (70 kg, 20-40 años de edad), se espera que la TFG típica medida por aclaramiento de creatinina sea de aproximadamente 125 ml/min, con concentraciones plasm�ticas de creatinina de 0,7-1,5 mg/dl. Para una mujer de talla promedio comparable, se espera que la TFG típica medida por aclaramiento de creatinina sea de aproximadamente 115 ml/min, con niveles de creatinina de 0,5-1,3 mg/dl. Durante �pocas de buena salud, los valores de TFG en seres humanos son relativamente estables aproximadamente hasta los 40 años de edad, cuando típicamente la TFG comienza a disminuir con la edad. Para sujetos que sobreviven hasta los 85-90 años de edad, la TFG se puede reducir al 50 % de los valores comparables a los 40.

Tasa de filtración glomerular esperada (TFGesp). Con base en las consideraciones de la edad, el peso, el sexo, el área de superficie corporal y el grado de musculatura de un sujeto y en la concentración plasm�tica de algún compuesto marcador (p. ej., creatinina) determinada por un análisis de sangre, se puede proporcionar una estimación de la "TFG esperada" o "TFGesp". As�, como ejemplo, se puede realizar una estimación de una TFG esperada o TFGesp como:

TFGesp = (140 -edad) x peso (kg) / [72 x Pconc (mg/dl)]

Esta estimación no tiene en cuenta factores tales como el área de superficie, el grado de musculatura o el porcentaje de grasa corporal. No obstante, con el uso de los niveles plasm�ticos de creatinina como marcador, se ha empleado esta fórmula para varones humanos como medio barato para realizar una estimación de la TFG. Debido a que la creatinina se produce en el músculo estriado, la TFG esperada o TFGesp de los sujetos humanos femeninos se calcula con la misma ecuación, multiplicando por 0,85 para tener en cuenta las diferencias de masa muscular que cabe esperar. (Véase Lemann, et al. (1990) Am. J. Kidney Dis. 16(3): 236).

Cilindros anchos. La exploración al microscopio del sedimento urinario para determinar la presencia de elementos formados es un procedimiento habitual en los análisis de orina. Entre los elementos formados que pueden estar presente en la orina se encuentran las masas cilíndricas de materiales aglutinados que, típicamente, representan un molde o "cilindro" de la luz de un t�bulo convoluto o t�bulo colector distal. En sujetos humanos sanos, típicamente, estos cilindros tienen un diámetro de 15-25 μm. En sujetos con insuficiencia renal crónica, sin embargo, la hipertrofia de los t�bulos puede dar lugar a la presencia de "cilindros anchos" o "cilindros de insuficiencia renal" que tienen 2-6 veces el diámetro de los cilindros normales y que suelen tener un aspecto ceroso homogéneo. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, un "cilindro ancho" significa un cilindro de sedimento urinario que tiene un diámetro de 2-6 veces lo normal, o de aproximadamente 30-150 μm para cilindros humanos.

IV. Esclerosis y calcificación vascular

Se ha demostrado que la calcificación vascular (CV) en el ratón LDLR-/-alimentado con una dieta rica en grasas es un modelo cl�nicamente relevante de CV en la diabetes de tipo 2, los síndromes metabólicos, la obesidad y las placas de ateroma (Towler, D.A. etal., J. Biol. Chem. 273:30427-30434, 1998; Shao, J.S. et al. J. Clin. Invest. 115:1210-1220, 2005) 26,27 y que es un modelo de estimulaci�n de la calcificación vascular por la NC (Davies 2003).19 En estudios anteriores se ha demostrado que la PMO-7 evita el desarrollo de la calcificación a�rtica en ratones LDLR-/-con NC alimentados con dietas ricas en grasas en parte a través de la estimulaci�n de la formación de hueso que da lugar al control de la hiperfosfatemia al aumentar el depósito esquel�tico (Davies 2003; Davies 2005).19,20 Con el fin de estudiar las acciones de la PMO-7 y el control de la hiperfosfatemia al tratar una CV establecida, se asumió un diseño experimental de "estudio de tratamiento" en el que se inici� el tratamiento en el momento que terminaban los estudios de prevención anteriores y se continu� durante un periodo de seis semanas.

A. Agentes terapéuticos

Los morf�genos descritos en el presente documento son proteínas naturales, o variantes funcionales y análogos de proteínas naturales, de la familia de proteínas osteog�nicas/proteínas morfog�nicas óseas (PO/PMO) dentro de la superfamilia de proteínas TGF-β.

(i) Familia de morf�genos PO/PMO

La "familia PO/PMO" de proteínas forma un subgrupo diferenciado dentro del agrupamiento evolutivo poco

estructurado de proteínas de secuencia relacionada conocido como la superfamilia TGF-β. Los miembros de esta familia de proteínas comprenden polip�ptidos secretados que comparten características estructurales comunes y que procesan de forma similar a partir de una proprote�na para proporcionar una proteína carboxiloterminal madura. Esta familia de proteínas también se denominan morf�genos. Como se destaca anteriormente, una proteína es morf�gena según se define en el presente documento si induce la cascada del desarrollo de acontecimientos celulares y moleculares que culmina en la formación de tejido específico de órgano nuevo.

La "familia PO/PMO" se puede clasificar además en al menos dos grupos, uno de los cuales es una familia de "PMO mineralizantes" y el otro es una familia de "PMO que contrarrestan la mineralizaci�n", como se describe anteriormente en la sección de definiciones.

En un modo de realización preferente de la presente invención, un morf�geno útil para la puesta en práctica de la invención es una proteína dim�rica, de la que cada componente polipept�dico tiene una secuencia que corresponde,

o es funcionalmente equivalente al menos al esqueleto C-terminal de seis o siete ciste�nas conservadas de las proteínas PMO humanas. Para las PMO que contrarrestan la mineralizaci�n, un modo de realización preferente usa la PMO-7 (PO-1), incluida en la SEC ID N.�: 2, y/o su análogo, que comparte el 70 % de homología de secuencia de amino�cidos o el 50 % de identidad con la PMO-7 (PO-1) en esta región. Para identificar una PMO mineralizante, un modo de realización preferente es PMO-2 o PMO-4, o un análogo de las mismas. En general, los morf�genos son competentes para inducir una cascada de acontecimientos en un entorno morfog�nicamente permisivo, que incluyen los siguientes: estimular la proliferaci�n de células progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferaci�n de células diferenciadas; y dar apoyo al crecimiento y el mantenimiento de las células diferenciadas. En condiciones apropiadas, los morf�genos también son competentes para inducir la rediferenciaci�n de células que han sufrido una diferenciación anómala. Los detalles de cómo se identificaron los morf�genos útiles en la presente invención, as� como la descripción de cómo prepararlos, usarlos y probarlos para determinar su actividad morf�gena se divulgan en numerosas publicaciones, incluidas las patentes de EE. UU. N.� 5.011.691 y

5.266.683 y las publicaciones de solicitudes de patente internacional WO 92/15323, WO 93/04692 y WO 94/03200. Tal como se divulga en esos documentos, los morf�genos se pueden purificar a partir de material de origen natural o producido de forma recombinante a partir de células huésped procariotas o eucariotas, con el uso de las secuencias genéticas divulgadas en dichos documentos. De forma alternativa, se pueden identificar secuencias morf�genas novedosas siguiendo los procedimientos divulgados en esos documentos.

Los morf�genos naturales comparten una homología de secuencia de amino�cidos sustancial en sus secuencias Cterminales (una región conocida como secuencia de "esqueleto de seis (o siete) ciste�nas" por las ciste�nas conservadas de esta región). Típicamente, un morf�geno natural se traduce como un precursor que tiene una secuencia de p�ptido señal N-terminal, típicamente de menos de 35 residuos de longitud, seguida de un "dominio pro" que se escinde para proporcionar el polip�ptido maduro, que incluye la secuencia del esqueleto C-terminal biol�gicamente activa. El p�ptido señal se escinde rápidamente después de la traducción en un sitio de escisión que se puede predecir en una secuencia dada usando el procedimiento de Von Heijne, Nucleic Acids Research 14:46834691 (1986). El "dominio pro" es variable tanto en la secuencia como en la longitud y va desde aproximadamente 200 hasta más de 400 residuos. El dominio pro se escinde para proporcionar el dominio "maduro" en C-terminal de aproximadamente 115-180 residuos, que incluye el dominio C-terminal de seis o siete ciste�nas conservadas de 97106 residuos. Típicamente, el polip�ptido pro es aproximadamente tres veces más grande que el polip�ptido maduro en C-terminal totalmente procesado. En condiciones nativas, la proteína se secreta como un d�mero maduro y se cree que el polip�ptido pro escindido permanece asociado con ella para formar un complejo prote�nico, probablemente para mejorar la solubilidad de la proteína dim�rica madura. Por lo general, se observa que la forma complejada de un morf�geno es más soluble que la forma madura en condiciones fisiológicas.

Tal como se usa en el presente documento, la "forma pro" de un miembro de la familia PO/PMO se refiere a una proteína que comprende una pareja de polip�ptidos plegados, cada uno de los cuales comprende un dominio pro asociado de forma covalente o no covalente con los dominios maduros del polip�ptido PO/PMO. La forma pro parece ser la principal forma secretada por las células de mamíferos cultivadas. La "forma madura" de la proteína se refiere al dominio C-terminal maduro que no est� asociado, ni de forma covalente ni no covalente, con el dominio pro. Se considera que cualquier preparación de PMO-7 (PO-1) contiene la forma madura cuando la cantidad de dominio pro en la preparación no supera el 5 % de la cantidad de dominio C-terminal "maduro".

T�picamente, la proteína morf�gena de origen natural en su forma nativa madura es un d�mero glucosilado que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30-36 kDa determinado por SDS-PAGE. Cuando se reduce, la proteína de 30 kDa da lugar a dos subunidades polipept�dicas glucosiladas con pesos moleculares aparentes en el intervalo de aproximadamente 16 kDa a aproximadamente 18 kDa. La proteína dim�rica no glucosilada, que también tiene actividad morf�gena, típicamente, tiene un peso molecular aparente en el intervalo de aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de 27 kDa da lugar a dos subunidades polipept�dicas no glucosiladas con pesos moleculares aparentes típicamente en el intervalo de aproximadamente 14 kDa a aproximadamente 16 kDa.

Los miembros de la familia PO/PMO útiles en el presente documento incluyen cualquiera de las proteínas nativas naturales conocidas, incluidos los homólogos al�licos y filog�nicos y otras variantes de los mismos, tanto de origen natural como producidos de forma biosint�tica (p. ej., incluidas "mute�nas" o "proteínas mutantes"), as� como

miembros activos nuevos de la familia de proteínas PO/PMO. Las secuencias particularmente útiles incluyen las que comprenden los dominios C-terminales de siete ciste�nas, con todas las ciste�nas conservadas de las PMO-7 (PO-1) de mamíferos, preferentemente la humana. Se pueden usar proteínas y polip�ptidos con actividades biológicas de PMO-7 como PMO que contrarresta la mineralizaci�n.

En un modo de realización preferente, el morf�geno de la invención es PMO-7 (PO-1). En un modo de realización particularmente preferente, la PMO-7 est� en forma soluble. En modos de realización preferentes, cada una de las subunidades polipept�dicas de una proteína morf�gena dim�rica según se define en el presente documento comprende una secuencia de amino�cidos que comparte una relación definida con una secuencia de amino�cidos de un morf�geno de referencia. En un modo de realización, las cadenas polipept�dicas morf�genas preferentes comparten una relación definida con una secuencia presente en la PMO-7 (PO-1) humana de longitud completa morfog�nicamente activa, la SEC ID N.�: 3. Sin embargo, uno cualquiera o más de las proteínas morf�genas naturales o biosint�ticas divulgadas en el presente documento se podrían usar de forma similar como secuencia de referencia. Las cadenas polipept�dicas morf�genas preferentes comparten una relación definida con al menos el esqueleto C-terminal de seis ciste�nas de la PMO-7 (PO-1) humana, los residuos 335-431 de la SEC ID N.�: 3 (o los residuos 43-139 de la SEC ID N.�: 1). Preferentemente, las proteínas morf�genas comparten una relación definida con al menos el esqueleto C-terminal de siete ciste�nas de la PMO-7 (PO-1) humana, los residuos 330-431 de la SEC ID N.�: 3 (o los residuos 38-139 de la SEC ID N.�: 1).

Las secuencias funcionalmente equivalentes incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de los residuos de ciste�nas situados dentro de la secuencia de referencia, incluidas inserciones o deleciones de amino�cidos que modifican la disposición lineal de estas ciste�nas, pero no impiden sustancialmente su relación en la estructura plegada de la proteína morf�gena dim�rica, incluida su capacidad para formar los puentes disulfuro intra-o intercatenarios necesarios para la actividad morf�gena. Las secuencias funcionalmente equivalentes incluyen además aquellas en las que uno o más residuos de amino�cido difieren del residuo correspondiente de una secuencia de referencia, p. ej., el esqueleto C-terminal de siete ciste�nas de la PMO-7 (PO-1) humana, con la condición de que esta diferencia no anule la actividad morf�gena tisular. En consecuencia, son preferentes las sustituciones conservadoras de los amino�cidos correspondientes en la secuencia de referencia.

En la tabla I que figura a continuación se resumen diversos miembros naturales de la familia PO/PMO identificados hasta la fecha, incluida su nomenclatura tal como se usa en el presente documento, sus referencias del listado de secuencia y las fuentes de publicación de las secuencias de amino�cidos de las proteínas de longitud completa que no se incluyen en el listado de secuencias. Se pretende que cada uno de los términos genéricos expuestos en la tabla I y as� deberían entenderse englobe las proteínas terapéuticas eficaces expresadas a partir de ácidos nucleicos que codifican la secuencia identificada mencionada a continuación y expuesta en el listado de secuencias, o un fragmento activo o precursor de la misma, o un equivalente funcional de la misma tal como una variante natural o biosint�tica. Las variantes naturales incluyen formas variantes al�licas aisladas a partir de otros individuos de una única especie biológica, as� como variantes de especie (homólogos) aisladas a partir de especies biológicas filogen�ticamente distintas. Estos morf�genos pueden ser PMO mineralizantes o PMO que contrarrestan la mineralizaci�n.

Tabla I. Morf�genos ejemplares

"PMO-7" o "PO-1"

se refiere de forma genérica al grupo de proteínas morfog�nicamente activas expresadas a partir de la totalidad o parte de una secuencia de ADN que codifica la proteína PO-1, incluidas la variantes al�licas y de especie de la misma, p. ej., la PMO7 (PO-1) humana ("hPMO-7 (PO-1)", de SEC ID N.�: 1, secuencia de amino�cidos de la proteína madura) o la PMO-7 (PO-1) de ratón ("mPMO-7 (PO-1)", de SEC ID N.�: 4, secuencia de amino�cidos de la proteína madura). El esqueleto de siete ciste�nas conservadas est� definido por los residuos 38 a 139 de las SEC ID N.�: 1 y 4. Las secuencias de ADNc y los amino�cidos que codifican las proteínas de longitud completa se proporcionan en las SEC ID N.�: 17 y 3 (hPMO-7 (PO-1)) y las SEC ID N.�: 18 y 19 (mPMO-7 (PO-1)). Las proteínas maduras est�n definidas por los residuos 293-431 (hPMO-7 (PO-1)) y 292-430 (mPMO-7 (PO-1)). Las regiones "pro" de las proteínas, que se escinden para proporcionar las proteínas maduras, morfog�nicamente activas, est�n definidas en esencia por los residuos 30-292 (hPMO7 (PO-1)) y los residuos 30-291 (mPMO-7 (PO-1)).

Morf�genos de referencia

"PO-2 (PMO-8)"

se refiere de forma genérica al grupo de proteínas activas expresadas a partir de la totalidad o parte de una secuencia de ADN que codifica la proteína PO-2 (conocida también como PMO-8), incluidas la variantes al�licas y de especie de la misma, p. ej., la PO-2 (PMO-8) humana ("hPO-2", de SEC ID N.�: 5, secuencia de amino�cidos de la proteína madura) o la PO-2 de ratón ("mPO-2", de SEC ID N.�: 6, secuencia de amino�cidos de la proteína madura). El esqueleto de siete ciste�nas conservadas est�

(continuación) 5

definido por los residuos 38 a 139 de las SEC ID N.�: 5 y 6. Las secuencias de ADNc y los amino�cidos que codifican las proteínas de longitud completa se proporcionan en las SEC ID N.�: 20 y 21 (hPO-2) y las SEC ID N.�: 22 y 23 (mPO-2). Las proteínas maduras est�n definidas en esencia por los residuos 264-402 (hPO-2) y 261-399 (mPO-2). Las regiones "pro" de las proteínas, que se escinden para proporcionar las proteínas maduras, morfog�nicamente activas, est�n definidas en esencia por los residuos 18-263 (hPO-2) y los residuos 18-260 (mPO-2). También se produce otro sitio de escisión 21 residuos corriente arriba para ambas proteínas PO-2.

"CPMO2"

se refiere de forma genérica a las proteínas morfog�nicamente activas expresadas a partir de una secuencia de ADN que codifica las proteínas CPMO2, incluidas variantes al�licas y de especie de las mismas, p. ej., la CPMO2A humana ("CPMO2A(fx)"), de SEC ID N.�: 10) o la CPMO2B ADN humana ("CPMO2B(fx)"), de SEC ID N.�: 11). La secuencia de amino�cidos para las proteínas de longitud completa, que en la literatura se denominan PMO2A y PMO2B, o PMO2 y PMO4, aparece en Wozney, et al. (1988) Science 242:1528-1534, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Del mismo modo, el dominio pro para la PMO2 (PMO2A) incluye los residuos 25-248 o 25-282; la proteína madura, los residuos 249-396 o 283-396. Del mismo modo, el dominio pro para la PMO4 (PMO2B) incluye los residuos 25-256 o 25292; la proteína madura, los residuos 257-408 o 293-408.

"DPP(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen DPP de Drosophila (proteína DPP, véase la SEC ID N.�: 7) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Padgett, et al (1987) Nature 325: 81-84, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 456; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 457-588. La secuencia de la DPP(fx) se muestra en la tabla II.

"VgI(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen VgI de Xenopus (proteína VgI, véase la SEC ID N.�: 8) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Weeks (1987) Cell 51: 861-867, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 246; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 247-360. La secuencia de la VgI(fx) se muestra en la tabla II.

"Vgr-1(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen murino vgr-1 (proteína Vgr1, véase la SEC ID N.�: 9) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Lyons, et al (1989) PNAS 86: 4554-4558, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 299; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 300-438. La secuencia de la Vgr-1(fx) se muestra en la tabla II.

"GDF-1(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen humano GDF-1 (proteína GDF-1, véase la SEC ID N.�: 13) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa se proporciona en la SEC ID N.�: 13. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 214; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 215-372. La secuencia de la GDF-1 se muestra en la tabla II.

"60A"

se refiere de forma genérica a las proteínas morfog�nicamente activas expresadas a partir de la totalidad o parte de una secuencia de ADN (del gen 60A de Drosophila) que codifica las proteínas 60A (véase la SEC ID N.�: 14). "60A(fx)" se refiere a las secuencias de proteínas que definen el esqueleto de siete ciste�na conservadas (residuos 354 a 455 de la SEC ID N.�: 14). Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 324; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 325-455. La secuencia de la 60A(fx) se muestra en la tabla II.

"PMO3(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen humano PMO3 (proteína PMO3, véase la SEC ID N.�: 12) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Wozney, et al (1988) Science 242: 1528-1534, cuyo contenido se

40 (continuación)

incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 290; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 291-472. La secuencia de la PMO3(fx) se muestra en la tabla II.

"PMO5(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen humano PMO5 (proteína PMO5, véase la SEC ID N.�: 15) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Celeste, et al (1991) PNAS 87: 9843-9847, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro se extiende desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 316; probablemente, la proteína madura est� definida por los residuos 317-454. La secuencia de la PMO5(fx) se muestra en la tabla II.

"PMO6(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen humano PMO6 (proteína PMO6, véase la SEC ID N.�: 16) y que definen el esqueleto de siete ciste�nas conservadas. La secuencia de amino�cidos para la proteína de longitud completa aparece en Celeste, et al (1990) PNAS 87: 9843-9847, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento. Probablemente, el dominio pro incluye desde el sitio de escisión del p�ptido señal hasta el residuo 374; probablemente, la secuencia madura incluye los residuos 375-513. La secuencia de la PMO6(fx) se muestra en la tabla II.

Las proteínas de referencia PO-2 (PMO-8) tienen un residuo de ciste�na "adicional" en esta región (p. ej., véase el residuo 41 de las SEC ID N.�: 21 y 23), además del esqueleto de ciste�nas conservadas en común con las demás proteínas de esta familia. La proteína de referencia GDF-1 tiene un inserto de cuatro amino�cidos en el esqueleto conservado (compárese la SEC ID N.�: 19 con la SEC ID N.�: 13) pero este inserto probablemente no interfiere en la relación de las ciste�nas en la estructura plegada; además, en las proteínas CPMO2 de referencia falta un residuo de amino�cido del esqueleto de ciste�nas.

Los morf�genos son inactivos cuando est�n reducidos, pero son activos como homod�meros oxidados y cuando se oxidan en combinación con otros morf�genos de la presente invención (p. ej., como heterod�meros). Por tanto, un morf�geno es una proteína dim�rica que comprende un par de cadenas polipept�dicas, en el que cada cadena polipept�dica comprende al menos el esqueleto C-terminal de seis ciste�nas definido por los residuos 43-139 de la SEC ID N.�: 1, incluidas disposiciones funcionalmente equivalentes de estas ciste�nas (p. ej., inserciones o deleciones de amino�cidos que modifican la disposición lineal de las ciste�nas en la secuencia pero no su relación en la estructura plegada), de tal forma que, cuando las cadenas polipept�dicas est�n plegadas, la especie de proteína dim�rica que comprende el par de cadenas polipept�dicas tiene la estructura tridimensional apropiada, incluidos los enlaces disulfuro intra-o intercatenarios apropiados de modo que la proteína pueda actuar como un morf�geno según se define en el presente documento. Específicamente, los morf�genos, por lo general, pueden realizar todas las funciones biológicas siguientes en un entorno morfog�nicamente permisivo: estimular la proliferaci�n de células progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferaci�n de células diferenciadas; y dar apoyo al crecimiento y al mantenimiento de las células diferenciadas, incluida la "rediferenciaci�n" de células transformadas. Además, también se prev� que estos morf�genos puedan inducir la rediferenciaci�n de células comprometidas en condiciones ambientales apropiadas.

Las siguiente publicaciones divulgan secuencias polipept�dicas de morf�genos, as� como propiedades químicas y físicas relevantes de morf�genos naturales y/o sintéticos: PMO-7 (PO-1) y PO-2 (PMO-8): en los documentos U.S. 5.011.691, U.S. 5.266.683, Ozkaynak, et al., EMBOJ. 9: 2085-2093 (1990); PO-3: en el documento WO 94/10203 (PCT US93/10520); PMO-2, PMO-3 y PMO-4: en el documento WO 88/00205, Wozney, et al., Science 242:15281534 (1988); PMO-5 y PMO-6: Celeste, et al., PNAS 87: 9843-9847 (1991); Vgr1: Lyons, et al., PNAS 86: 4554-4558 (1989); DPP: Padgett, et al., Nature 325: 81-84 (1987); Vg-1: Weeks Cell 51: 861-867 (1987); PMO-9: en el documento WO 95/33830 (PCT/US95/07084); PMO-10: en el documento WO 94/26893 (PCT/US94/05290); PMO

11: en el documento WO 94/26892 (PCT/US94/05288); PMO-12: en el documento WO 95/16035 (PCT/US94/14030); PMO-13: en el documento WO 95/16035 (PCT/US94/14030); GDF-1: en el documento WO 92/00382 (PCT/US91/04096) y Lee, et al., PNAS 88:4250-4254 (1991); GDF-8: en el documento WO 94/21681 (PCT/US94/03019); GDF-9: en el documento WO 94/15966 (PCT/US94/00685); GDF-10: en el documento WO 95/10539 (PCT/US94/11440); GDF-11: en el documento WO 96/01845 (PCT/US95/08543); PMO-15: en el documento WO 96/36710 (PCT/US96/06540); MP121: en el documento WO 96/01316 (PCT/EP95/02552); GDF-5 (CDMP-1, MP52): en los documentos WO 94/15949 (PCT/US94/00657) y WO 96/14335 (PCT/US94/12814) y WO 93/16099 (PCT/EP93/00350); GDF-6 (CDMP-2, PMO-13): en los documentos WO 95/01801 (PCT/US94/07762) y WO 96/14335 y WO 95/10635 (PCT/US94/14030); GDF-7 (CDMP-3, PMO-12): en los documentos WO 95/10802 (PCT/US94/07799) y WO 95/10635 (PCT/US94/14030). Otras proteínas útiles incluyen construcciones biosint�ticas biol�gicamente activas, incluidas proteínas morf�genas biosint�ticas novedosas y proteínas quiméricas diseñadas usando secuencias de dos o más morf�genos conocidos. Véanse también las construcciones biosint�ticas

divulgadas en la patente de EE. UU. 5.011.691 (p. ej., CPMO-7 (PO-1), CPO-3, CPO-4, CPO-5, CPO-7 y CPMO-7 (PO-1)6).

Las proteínas morf�genas incluyen aquellas en las que las secuencias de amino�cidos comprenden una secuencia que comparte al menos el 70 % de homología de secuencia de amino�cidos (identidad o sustitución conservada) y preferentemente el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % de homología, con una proteína morf�gena de referencia seleccionada de entre las proteínas morf�genas naturales ejemplares que se enumeran en el presente documento. Preferentemente, la proteína de referencia para la PMO que contrarresta la mineralizaci�n es la PMO-7 (PO-1) humana y la secuencia de referencia de la misma es el esqueleto C-terminal de siete ciste�nas presente en las formas oste�genamente activas de la PMO-7 (PO-1) humana, los residuos 330-431 de la SEC ID N.�: 3 (o los residuos 38-139 de la SEC ID N.�: 1). En consecuencia, las proteínas morf�genas incluyen variantes al�licas, homólogos filogen�ticos u otras variantes de la secuencia de referencia preferente, ya sean naturales o producidas de forma biosint�tica (p. ej., incluidas "mute�nas" o "proteínas mutantes"), as� como miembros novedosos de la familia morf�gena general de proteínas que incluye las expuestas e identificadas anteriormente. Los polip�ptidos morf�genos comparten al menos el 50 % de identidad de los amino�cidos con la secuencia de referencia preferente de la PMO-7 (PO-1) humana o cualquiera de los demás morf�genos descritos anteriormente, aún más preferentemente al menos el 55 %, el 60 %, el 65%, el 70 %, el 80%, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 99% o más de identidad de los amino�cidos con la misma.

La fig. 10 enumera el porcentaje de homología de secuencia de amino�cidos y el porcentaje de identidad en los esqueletos C-terminales de siete ciste�nas de diversos miembros representativos de la superfamilia TGF-β, usando la PMO-7 (PO-1) como la secuencia de referencia. Los porcentajes de homología enumerados en la figura se determinan mediante la alineación de las secuencias usando el programa MegaAlign (DNAstar, Inc.). Las inserciones y deleciones con respecto a la secuencia del morf�geno de referencia (el esqueleto C-terminal de siete ciste�nas biol�gicamente activo de la hPMO-7 (PO-1)) se ignoran con el fin de realizar los cálculos (véanse los detalles a continuación).

Los morf�genos que contrarrestan la mineralizaci�n incluyen los dominios C-terminales, p. ej., los residuos de amino�cido C-terminales 96-102 de Vgl, Vgr-1, PMO-7 (PO-1), PO-2 (PMO-8), GDF-1, GDF-5 (véanse la tabla II, a continuación y las SEC ID N.�: 1-13), as� como todas las proteínas que comprenden los dominios C-terminales de 60A, PMO5 y PMO6 (véanse las SEC ID N.�: 12, 14-16), todas las cuales incluyen al menos el esqueleto de seis o siete ciste�nas conservadas. Además, se divulgan construcciones biosint�ticas diseñadas a partir de las secuencias genéricas, tales como CPMO-7 (PO-1), 3-5, 7, 16, en la patente de EE. UU. N.� 5.011.691. Otras secuencias incluyen las proteínas inhibinas/activina (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.� 4.968.590 y 5.011.691). En consecuencia, otras secuencias son aquellas que comparten al menos el 70 % de homología de secuencia de amino�cidos o el 50 % de identidad y preferentemente el 80 % de homología o el 70 % de identidad con cualquiera de las secuencias anteriores. Se prev� que incluyan variantes y mutantes de alelo y de especie y mute�nas biosint�ticas, as� como miembros novedosos de esta familia de proteínas morf�genas. En la familia de proteínas relacionadas se encuentran aquellas proteínas que presentan actividad morf�gena y en las que los cambios de amino�cidos con respecto a las secuencias de referencia incluyen cambios conservadores. La información en cuanto a los cambios de amino�cidos conservados se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, Dayhoff et al. describieron en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3, p�gs. 345-362, (M.O. Dayhoff, ed., Nat'l BioMed. Research Fdn., Washington, D.C. 1978) que determinadas sustituciones de amino�cidos entre proteínas conservadas a lo largo de la evolución se producen con mayor frecuencia de lo esperado y de lo que permitiría el azar. As�, se pueden determinar las sustituciones de amino�cidos conservadas de acuerdo con la figura 84 (anteriormente). Se alinean las secuencias con una secuencia de morf�geno conocida usando el procedimiento de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol. 48:443-453) y se calculan las identidades con el programa MegaAlign (DNAstar, Inc.).

En la tabla II, expuesta a continuación, se comparan las secuencias de amino�cidos de las regiones activas de proteínas nativas que se han identificado como morf�genos, incluidas la PMO-7 humana (PO-1) (hPMO-7 (PO-1), SEC ID N.�: 1-3), la PMO-7 (PO-1) de ratón (mPMO-7 (PO-1), SEC ID N.�: 4 y 19), la PO-2 (PMO-8) humana y de ratón (SEC ID N.�: 5, 6, 21 y 23), la CPMO2A (SEC ID N.�: 10), la CPMO2B (SEC ID N.�: 11), la PMO3 (SEC ID N.�: 12), la DPP (de Drosophila, SEC ID N.�: 7), la Vgl (de Xenopus, SEC ID N.�: 8), la Vgr-1 (de ratón, SEC ID N.�: 9), la GDF-1 (de ratón, SEC ID N.�: 13), la proteína 60A (de Drosophila, SEC ID N.�: 14), la PMO5 (SEC ID N.�: 15) y la PMO6 (SEC ID N.�: 16). En esencia, las secuencias se alinean siguiendo el procedimiento de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, calculado usando el programa Align (DNAstar, Inc.). En la tabla, tres puntos indican que el amino�cido en esa posición es el mismo que el amino�cido en la hPMO-7 (PO-1). Tres guiones indican que no hay ningún amino�cido presente en esa posición y se incluyen con el fin de ilustrar las homologías. Por ejemplo, el residuo de amino�cido 60 de la CPMO-2A y la CPMO-2B "falta".

Tabla II

SEC ID N.�

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

† Entre los residuos 56 y 57 de la PMO3 hay un residuo de Val; entre los residuos 43 y 44 de la GDF-1 se encuentra la secuencia de amino�cidos Gly-Gly-Pro-Pro (SEC ID N.�: 68).

Como resulta evidente a partir de las comparaciones de secuencias de amino�cidos anteriores, se pueden realizar

5 algunos cambios de amino�cidos dentro de las secuencias genéricas al mismo tiempo que se mantiene la actividad morf�gena. La observación de las secuencias revela con facilidad que existen subfamilias dentro de esta familia: la PMO-7 humana y de ratón est�n estrechamente relacionadas y con la PMO-5, la PMO-6 y la Vgr-1, forman una subfamilia. La CPMO-2A y la CPMO-2B, junto con la DPP, forman otra subfamilia. Los residuos de amino�cido cambiados no son esenciales para las actividades biológicas y se espera que los residuos de amino�cido sean

10 intercambiables. As�, se puede entender con facilidad que, para cada subfamilia, exista una secuencia gen�ricaque tenga una secuencia que englobe todos los miembros de la subfamilia y se espera que cualquier secuencia con la secuencia genérica tenga las mismas actividades o similares.

Por ejemplo, la secuencia genérica n.� 1 (SEC ID N.�: 24) que engloba las PMO que contrarrestan la mineralizaci�n (PMO-7 de ratón y humana) y secuencias relacionadas (PMO-5, PMO-6 y VGR-1), se pueden describir como figura

15 a continuación:

Secuencia genérica 1 (SEC ID N.�: 24)

en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más amino�cidos especificados que se definen como sigue: "res." significa "residuo" y; Xaa en el res. 6 -(Arg o Gln); Xaa en el res. 8 = (Leu o Val); Xaa en 5 el res. 18 = (Glu o Lys); Xaa en el res. 23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en el res. 26 = (Glu o Asp); Xaa en el res. 30 = (Ala o Ser); Xaa en el res. 31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en el res. 33 = (Leu, Val o Met); Xaa en el res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en el res. 35 = (Ser o Ala); Xaa en el res. 36 = (Tyr o His); Xaa en el res. 51 = (Phe, Leu, o Val); Xaa en el res. 52 = (Ile o Met); Xaa en el res. 53 = (Asn o Phe); Xaa en el res. 55 = (Glu o Asp); Xaa en el res. 66 = (Gln o Lys); Xaa en el res. 67 = (Leu, o Val); Xaa en el res. 88 = (Asn o Trp); Xaa en el res. 90 = (Val, Thr, Ala o Ile);

10 Xaa en el res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gln o Glu); y Xaa en el res. 93 = (Ala o Ser). Tal secuencia genérica representa todos los morf�genos esperados que conservan las actividades de la PMO-7. Se pueden construir otras secuencias genéricas usando las secuencias de la subfamilia y permitiendo que los residuos de amino�cido sean intercambiables.

Como se destaca anteriormente, determinadas secuencias polipept�dicas morf�genas tienen más del 50 % de

identidad, preferentemente más del 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o incluso el 99 % de identidad, con la secuencia de amino�cidos que define la secuencia de referencia preferente de la hPMO-7 (PO-1) (especialmente el esqueleto de seis o siete ciste�nas conservadas de la hPMO-7 (PO-1), p. ej., los residuos 38-139 de la SEC ID N.�: 1), o con regiones equivalentes de otros morf�genos descritos en la solicitud. Estas secuencias incluyen variantes al�licas y homólogos filogen�ticos de las proteínas PMO-7 (PO-1) y PO-2, incluida la proteína 60A de Drosophila, as� como las proteínas estrechamente relacionadas PMO5, PMO6 y Vgr-1. En consecuencia, las proteínas morf�genas incluyen proteínas activas que comprenden pares de cadenas polipept�dicas dentro de la secuencia de amino�cidos genérica a la que se hace referencia en el presente documento como "POX" (SEC ID N.�: 25), que define el esqueleto de siete ciste�nas y acomoda las homologías entre varias variantes identificadas de PMO-7 (PO-1) y PO-2 (PMO-8). En consecuencia, cada "Xaa" en una posición dada en POX se selecciona independientemente de entre los residuos que se encuentran en la posición correspondiente en la secuencia C-terminal de la PMO-7 (PO-1) o la PO-2 (PMO-8) de ratón o humanas. Específicamente, cada "Xaa" se selecciona independientemente de un grupo de uno o más amino�cidos especificados según se definen a continuación (SEC ID N.�: 25):

en la que Xaa en el res. 2 = (Lys o Arg); Xaa en el res. 3 = (Lys o Arg); Xaa en el res. 11 = (Arg o Gln); Xaa en el res. 16 = (Gln o Leu); Xaa. en el res. 19 = (Ile o Val); Xaa en el res. 23 = (Glu o Gln); Xaa en el res. 26 = (Ala o Ser); Xaa en el res. 35 = (Ala o Ser); Xaa en el res. 39 = (Asn o Asp); Xaa en el res. 41 = (Tyr o Cys); Xaa en el res. 50 = (Val o Leu); Xaa en el res. 52 = (Ser o Thr); Xaa en el res. 56 = (Phe o Leu); Xaa en el res. 57 = (Ile o Met); Xaa en el res. 58 = (Asn o Lys); Xaa en el res. 60 = (Glu, Asp o Asn); Xaa en el res. 61 = (Thr, Ala o Val); Xaa en el res. 65 = (Pro o Ala); Xaa en el res. 71 = (Gln o Lys); Xaa en el res. 73 = (Asn o Ser); Xaa en el res. 75 = (Ile o Thr); Xaa en el res. 80 = (Phe o Tyr); Xaa en el res. 82 = (Asp o Ser); Xaa en el res. 84 = (Ser o Asn); Xaa en el res. 89 = (Lys o Arg); Xaa en el res. 91 = (Tyr o His); y Xaa en el res. 96 = (Arg o Lys).

Los morf�genos útiles en los procedimientos, la composición y los dispositivos descritos en el presente documento incluyen proteínas que comprenden cualquiera de las cadenas polipept�dicas descritas, tanto aisladas a partir de fuentes naturales como producidas por técnicas de ADN recombinante u otras técnicas sintéticas e incluyen variantes al�licas y de especie de estas proteínas, mutantes naturales o biosint�ticos de las mismas, as� como diversas construcciones truncadas y de fusión. También se contempla que sean activos los mutantes por deleci�n o adición, incluidos los que pueden modificar el esqueleto C-terminal de ciste�nas conservadas, con la condición de que la modificación no altere funcionalmente la relación de estas ciste�nas en la estructura plegada. En consecuencia, estas formas activas se consideran el equivalente de las construcciones descritas específicamente que se divulgan en el presente documento.

Las proteínas pueden incluir formas con patrones de glucosilaci�n variables, extremos N-terminales variables, una familia de proteínas con regiones de homología de secuencia de amino�cidos y formas activas truncadas o mutadas de proteínas nativas o biosint�ticas, producidas por la expresión de ADN recombinante en células huésped.

Los morf�genos que se contemplan en el presente documento se pueden expresar a partir de ADN intacto o gen�mico truncado o ADNc o a partir de ADN sintéticos en células huésped procariotas o eucariotas y se pueden purificar, escindir, plegar de nuevo y dimerizar para formar composiciones morfog�nicamente activas. Las proteínas dim�ricas se pueden aislar a partir del medio de cultivo y/o volver a plegar y dimerizar in vitro para formar composiciones biol�gicamente activas. se pueden formar heterod�meros in vitro al combinar cadenas polipept�dicas

distintas independientes. De forma alternativa, se pueden formar heterod�meros en una única célula al coexpresar ácidos nucleicos que codifican cadenas polipept�dicas distintas independientes. Véanse, por ejemplo, el documento W093/09229 o la patente de EE. UU. N.� 5.411941, para varios protocolos de producción de proteínas heterodim�ricas recombinantes ejemplares. Las células huésped preferentes en la actualidad incluyen, sin limitación, procariotas, incluidas las de E. coli, o eucariotas, incluidas las levaduras (tales como S. cerevisiae), células de insectos o cualquier célula huésped de mamífero adecuada, tales como células CHO, COS o BSC. Un experto en la técnica apreciar� que se pueden usar otras células huésped que supongan una ventaja. Se divulga una descripción detallada de los morf�genos útiles en los procedimientos, las composiciones y los dispositivos de la presente invención, que incluye cómo prepararlos, usarlos y probarlos para una actividad condr�gena, en numerosas publicaciones, incluidas las patentes de EE. UU. N.� 5.266.683 y 5.011.691.

Las proteínas morfog�nicamente activas tienen cadenas polipept�dicas con secuencias de amino�cidos que comprenden una secuencia codificada por un ácido nucleico que hibrida con un ADN o ARN que codifica las secuencias morf�genas de referencia, p. ej., las secuencias C-terminales que definen los esqueletos de siete ciste�nas conservadas de PMO-7 (PO-1), PO-2 (PMO-8), PMO5, PMO6, Vgr-1, 60A, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7 y similares. Tal como se usa en el presente documento, condiciones de hibridación muy rigurosas se definen como una hibridación de acuerdo con técnicas conocidas en formamida al 40 %, 5 X SSPE, 5 X solución de Denhardt y SDS al 0,1 % a 37 �C durante la noche y lavado con 0,1 X SSPE, SDS al 0,1 % a 50 �C. Las condiciones rigurosas habituales est�n bien caracterizadas en los manuales de biología molecular sobre clonaci�n ordinarios. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2� ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984); y B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

La familia de morf�genos PO/PMO también se caracteriza por las actividades biológicas que pueden comprobar con facilidad los expertos en la técnica. Específicamente, un morf�geno puede (a) inducir condrog�nesis en el ensayo óseo ect�pico de Reddi-Sampath (Sampath y Reddi 1981, Pnoc. Natl. Acad. Sci. USA 7599-7603) o un ensayo sustancialmente equivalente, (b) puede evitar, inhibir, retardar o aliviar de forma significativa la pérdida progresiva de función renal en un modelo animal estándar de insuficiencia renal crónica o (c) puede originar una mejora cl�nicamente significativa en un marcador t�pico de la función renal cuando se administra a un mamífero con insuficiencia renal o riesgo de padecerla.

El ensayo de hueso ect�pico de Reddi-Sampath se conoce bien en la técnica como un ensayo de actividad condr�gena. El ensayo, que se puede realizar fácilmente, se describe y analiza, por ejemplo, en Sampath y Reddi (1981) y funciona para caracterizar la insuficiencia renal crónica.

Por último, se puede evaluar la PO-1 para determinar su eficacia terapéutica para originar una mejoría cl�nicamente significativa en un marcador t�pico de la función renal cuando se administra a un sujeto mamífero (p. ej., un paciente humano) con insuficiencia renal crónica o riesgo de padecerla. Estos marcadores de la función renal son bien conocidos en la literatura m�dica e incluyen, sin estar limitados a ellos, tasas de aumento de los niveles de NUS, tasas de aumento de la creatinina s�rica, medidas est�ticas de NUS, medidas est�ticas de la creatinina s�rica, tasa de filtración glomerular (TFG), relaciones de NUS/creatinina, concentraciones s�ricas de sodio (Na+), relaciones en orina/plasma para la creatinina, relaciones en orina/plasma para la urea, osmolalidad de la orina, producción diaria de orina y similares (véanse, por ejemplo, Brenner y Lazarus (1994), en Harrison’s Principles of Internal Medicine, 13� edición, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, Nueva York; Luke y Strom (1994), en Internal Medicine, 4� edición, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis).

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas útiles en la presente invención pueden estar en una variedad de formas. Incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, sólidas o semis�lidas, tales como soluciones líquidas, soluciones infundibles, emulsiones, geles, suspensiones, comprimidos y pastillas. La forma preferente depende del modo de administración pretendido y de la aplicación terapéutica y la debe seleccionar un experto en la técnica. Los modos de administración pueden incluir la administración por vía oral, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intralesional, por implantación quirúrgica o típica. Las composiciones se pueden formular en formas farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración. En algunos modos de realización, las composiciones farmacéuticas se deben administrar en el tejido vascular. En otros modos de realización, las composiciones farmacéuticas se deben administrar cerca del tejido vascular objetivo. En otros modos de realización adicionales, el fármaco se debe administrar en un sitio alejado del tejido objetivo. Por ejemplo, en algunos modos de realización, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de forma sist�mica.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas también incluirán vehículos farmac�uticamente aceptables convencionales bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16� ed., Mac Publishing Company (1980)). Estos vehículos farmac�uticamente aceptables pueden incluir otros agentes medicinales, vehículos, vehículos genéticos, adyuvantes, excipientes, etc., tales como seroalb�mina humana o preparaciones plasm�ticas. Preferentemente, el vehículo es isot�nico. Los ejemplos de vehículos de este tipo

incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, soluciones acuosas tamponadas, hialuronano, ácido hialur�nico y solución de dextrosa. En el presente documento, también son útiles los vehículos no acuosos tales como los aceites fijos y el oleato de etilo.

En algunos modos de realización, las composiciones son formulaciones de liberación mantenida, formulaciones de liberación lenta o formulaciones por las que se retrasa el aclaramiento del morf�geno. Existen numerosos materiales de administración disponibles para preparar estas composiciones, incluidos, pero sin limitación, microesferas (p. ej., pol�meros de poli(ácido l�ctico)/poli(ácido glic�lico)), liposomas, polietilenglicol (PEG), gelatina y otros sistemas de administración microparticulados o formulaciones de liberación mantenida. En algunos modos de realización, el morf�geno est� enlazado covalentemente al material de administración.

En las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir diversos factores de crecimiento, citocinas, hormonas, agentes tr�ficos y agentes terapéuticos, incluidos antibióticos y agentes quimioter�picos, enzimas, inhibidores enzim�ticos y otros agentes bioactivos.

Son útiles los niveles de dosificación de entre aproximadamente 1 μg y aproximadamente 1000 μg al día, preferentemente entre 3 μg y 50 μg al día de morf�geno. Como apreciar� el experto en la técnica, pueden ser necesarias dosis menores o mayores que las mencionadas. Preferentemente las composiciones tienen forma de una dosis unitaria y habitualmente se administrarán con una pauta que depende del tratamiento tisular en particular. La composición se puede administrar una vez o varias, con una frecuencia de administración, como se conoce en la técnica, que optimice la curación o la reparación del tejido. Por ejemplo, la composición se puede administrar diariamente, semanalmente, mensualmente, quincenalmente, bimensualmente, trimestralmente, semestralmente o anualmente. La dosificación específicas y las pautas de tratamiento para cualquier paciente en particular dependerán de una variedad de factores, incluidos la actividad del morf�geno empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de eliminación, la combinación de fármacos, la gravedad del daño tisular y el criterio del m�dico encargado del tratamiento.

En términos generales, se puede usar la PO-1 en la preparación de medicamentos para el tratamiento de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto. La invención es adecuada para el tratamiento de cualquier primate, preferentemente un primate superior, tal como un ser humano. Además, no obstante, se puede emplear la invención en el tratamiento de mamíferos domésticos que viven como compañeros del ser humano (p. ej., perros, gatos, caballos), que tienen un valor comercial significativo (p. ej., cabras, cerdos, ovejas, ganado vacuno, animales para competiciones deportivas o de tracción), que tienen un valor científico significativo (p. ej., especímenes de especies en peligro de extinción en cautividad o libres, razas de animales endog�micas o genomanipuladas) o que tienen valor de otro modo.

Ejemplos

Ejemplo 1. Animales y dietas: Se adquirieron ratones sin receptores de LDL (LDLR-/-) con un acervo g�nico C57B1/6J de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) y se criaron en un entorno sin pat�genos. Se destet� a los animales a las tres semanas y pasaron a una dieta de pienso [mezcla 1:1 de pienso para roedores 20 y pienso para ratones 20 Pico Lab, con el 6,75 % de calorías como grasa]. A las 10 semanas, se mantuvo a los animales con esta dieta o se inici� una dieta rica en colesterol (0,15 %) que contenía el 42 % de calorías como grasa [Harlan Teklad, Madison Wl, N.� de producto TD88137]. Para algunos animales, se complement� la dieta con el 1 % o el 3 % de CaCO3. Se había informado previamente de dietas para animales complementadas con CaCO3.20 A los animales se les dio acceso a agua a voluntad. La PMO-7 la proporcion� Johnson and Johnson (Raritan, NJ). El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad del Estado de Washington aprob� el protocolo del estudio. Los experimentos en animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio de los NIH estadounidenses y fueron aprobados por el Comité de Estudios con Animales de la Universidad del Estado de Washington.

Ejemplo 2. Inducción de NC: Se utilizó un procedimiento en dos etapas para crear uremia como se describe anteriormente. (Davies 2003; Lund, 2004)19,21 Se tomaron muestras de sangre de la vena safena 1 semana después de la segunda intervención quirúrgica para evaluar la función renal posquir�rgica de referencia. Se sacrificó a los animales con anestesia 28 semanas después de nacer. En el momento del sacrificio, se extrajo la sangre por una perforación intracard�aca y se disecaron el corazón y la aorta en bloque. El grupo tratado con PMO-7 recibió una inyección intraperitoneal de PMO-7 de 10 μg/kg de peso en seco una vez a la semana en 100 μl de vehículo [manitol (al 5 % p/v), tampón de acetato de Na (20 mM, a pH 4,0-4,5), agua estéril]. Esta es la misma dosis usada en los estudios anteriores de los autores. (Davies 2003; Davies 2005)19,20.

Despu�s de la segunda intervención quirúrgica, se distribuyeron los animales en uno de los siete grupos con NC y alimentación rica en grasas. Otros grupos de control incluían ratones LDLR -/-testigos quirúrgicos con dieta de pienso y ratones LDLR-/-con NC con dieta de pienso. Los ratones C57B16 WT alimentados con pienso sirvieron como fuente del punto de referencia normal. Los datos de estos grupos de control no se presentan. El grupo 1 eran ratones LDLR-/-con dieta rica en grasas sacrificados a las 22 semanas. El grupo 2 eran ratones LDLR-/-con NC alimentados con la dieta rica en grasas y tratados semanalmente de 22 a 28 semanas con vehículo por vía IP. Se

esperaba que este grupo desarrollara fósforo s�rico elevado y CV. El grupo 3 era el primer grupo de tratamiento. Eran ratones LDLR-/-con NC con dieta rica en grasas que recibieron tratamiento con PMO-7 (10 μg/kg por vía IP semanalmente). El grupo 4 eran ratones LDLR-/-con NC con dieta rica en grasas tratados con sevel�mero CO3 al 1 %. El grupo 5 eran ratones LDLR-/-con NC con dieta rica en grasas tratados con sevel�mero CO3 al 3 %. El grupo 6 eran ratones LDLR-/-con NC con dieta rica en grasas tratados con CaCO3 al 3 %. El grupo 7 eran ratones LDLR-/con NC con dieta rica en grasas tratados con CaCO3 al 3 %. Una vez que se aleatorizaron los ratones en grupos, se dej� que desarrollaran la calcificación desde la semana 14 hasta la semana 22 después de nacer. El tratamiento se inici� 23 semanas después de nacer y se mantuvo hasta la semana 28 después de nacer, momento en el que se examin� a los ratones.

Ejemplo 3. Análisis de sangre: Se analizó el suero en el día de la extracción de sangre para determinar el nitrógeno ureico sanguíneo [NUS], el colesterol, el calcio y el fosfato por procedimientos de laboratorio habituales. Antes del inicio del tratamiento, se extrajo sangre a través de la vena safena. En el momento del sacrificio, se extrajo sangre a través de una perforación intracard�aca.

Ejemplo 4. Preparación de los tejidos: Las muestras resecadas se sometieron a congelación ultrarrápida con nitrógeno líquido y después se dividieron como sigue: el corazón, la aorta ascendente y el arco a�rtico se separaron de la aorta descendente y se realizó una bisección sagital a través del cono a�rtico. En la aorta descendente se realizó una bisección frontal, aproximadamente a la mitad de su longitud. Con el fin de visualizar la calcificación en las secciones tisulares, se cortaron láminas (de 5 μm de espesor) y se tiñeron con una tinción de von Kossa y Trap.

Ejemplo 5. Cuantificación química de la calcificación: similar a los planes experimentales anteriores de los autores (Davies 2003; Davies 2005).19,20 Se disecaron al aorta y los corazones durante el sacrificio y se retir� todo el tejido ajeno por disecci�n roma en un microscopio de disecci�n. Se desecaron los tejidos durante 20-24 horas a 60 �C, se pesaron y se trituraron hasta obtener un polvo con la mano de un mortero. Se eluy� el calcio en HCl 1 N durante 24 horas a 4 �C. Se sometió a ensayo el contenido en calcio del eluato usando un procedimiento de cresolftale�na complexona (Sigma, St Louis), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y se corrigieron los resultados para el peso del tejido en seco del corazón y la aorta.

Ejemplo 6. Cultivo celular: Se obtuvieron aortas de seres humanos adultos de siete donantes de órganos fallecidos rechazados debido a la ateroesclerosis por los Mid-America Transplant Services (St. Louis, MO) y se digirieron con enzimas para obtener células musculares lisas humanas (CMLH). Se separ� el tejido de la media de la capa adventicia y de la íntima y se digirió con colagenasa de tipo I (Worthington, Lakewood, NJ) a 2 mg/ml durante 1 h y se lav� con solución salina equilibrada de Hank (HBSS). A continuación, se realizó otra digestión con colagenasa de tipo II a 11 mg/ml (Worthington, Lakewood, NJ) y elastasa a 25 mg/ml (Worthington, Lakewood, NJ) durante 4 h. Se lavaron las suspensiones celulares dos veces con HBSS y se cultivaron en matraces T-75 durante tres semanas en un entorno al 95 %/5 % de aire/CO2 humidificado a 37 �C. El medio de cultivo usado fue DMEM que contenía el 4,5 % de glucosa (rico en glucosa), el 10 % de suero fetal bovino (FBS, Atlas, Fort Collins, CO), piruvato de sodio 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Sigma, St Louis, MO). Se evalu� la pureza celular por inmunotinci�n positiva para α-actina de músculo liso y calponina y para determinar la ausencia del factor de von Willebrand. En todos los protocolos experimentales, se sembraron las células a 1 x 105 células/pocillo en placas de seis pocillos. Se cambi� el medio el primer día y cada tres días a partir de entonces. En todos los casos, las células usadas se encontraban entre los pasos dos y cinco (tabla 3).

Tabla 3. Caracterización del contenido en Ca en la matriz de cultivos de hCMLVh aisladas a partir de aortas ateroescler�ticas

N.� de donante N.� de Estado inicial Efectos de Efectos de 10 ng/ml paso

PO4 2 mM de PMO-7 estudiado

1

2 4,3 29,9 20,3

2

3 6,5 31,1 20,6

3

3

5,3 28,7 18

4

2 5,6 28,6 17,9

5

3 5,7 35,6 25,8

6

3 4,9 31,4 19,8

7

2 5,5 33,5 22,1

Ejemplo 7. Inducción de calcificación: En el momento de la confluencia, se cambiaron las células a un medio de mineralizaci�n que consistía en DMEM complementado con Pi 1 o 2 mM. Para las células expuestas al tratamiento con PMO-7, se a�adi� medio de mineralizaci�n recién preparado que contenía o vehículo (manitol, ácido acético,

acetato) o PMO-7 en vehículo a 0,1, 1,0, 10, o 100 ng/ml. Se cambi� el medio cada dos o tres días. Se a�adi� nogina (Pepro Tech., Rocky Hill, NJ) al medio de mineralizaci�n a una concentración final de 100 ng/ml. Se cuantific� el contenido en calcio y se normalizó con las proteínas celulares como se describe. (Jono 2000; Moe S.M. et al., Kidney Int 67:2295-2304, 2005)11,52

Ejemplo 8. RT-PCR: Se extrajo ARN de cultivos celulares usando mini kits RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se realizó una RT-PCR semicuantitativa usando el kit de síntesis 1st Strand cDNA Synthesis Kit de Roche (Indianapolis, IN) y el kit de PCR de Invitrogen (Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando un procedimiento en dos etapas. Se sometió a transcripción inversa 1 μg de ARN total y se añadieron cebadores aleatorios durante 60 min a 42 �C, antes de la PCR. Se añadieron cebadores directo e inversos (tabla 4) y se sometieron las reacciones a PCR durante 20-35 ciclos. Se determin� para cada juego de cebadores el número de ciclos necesarios para amplificar el ADNc pero permaneciendo dentro del intervalo de amplificación exponencial. Se us� GAPDH como patrón interno para evaluar la carga. Se evalu� la contaminación gen�mica por inactivaci�n térmica de la transcriptasa inversa antes de la RT-PCR. Los cebadores se diseñaron usando el programa inform�tico Vector NTI (Invitrogen, Grand Island, NY) y se determinaron las condiciones óptimas para cada pareja de cebadores (tabla 4). Para realizar la reacción se us� un termociclador de ADN de Perkin-Elmer. Se separaron los productos en un E-gel de agarosa al 2 % (Invitrogen, Grand Island, NY) y se visualizaron con bromuro de etidio. Se analizó en primer lugar la intensidad de las bandas escaneando el gel en un generador de imágenes de geles Typhoon 9410 (Amersham Biosciences), se cuantificaron usando el programa inform�tico TotalLab V2003.03 (Nonlinear Dynamics, Durham, NC) y se normalizaron para la carga por comparación con la GAPGH. Se realizaron controles negativos mediante la inactivaci�n de la transcriptasa inversa por ebullición durante 5 min antes de la RT-PCR para garantizar que no se amplificara el ADN gen�mico.

Tabla 4. Secuencia del cebador

Gen

Secuencia del cebador (5'-3') Longitud del producto (pb) Tm (�C) SEC ID N.�.

Miocardina

F GAGAGGTCCATTCCAACTGCTCAGATGAAG 249 26 30

R

GTCTTCACTTCGAGTCTGATCCGGAGAAAG 27

Calponina

F AGCATGTCCTCTGCTCACTTCAACC 154 28 32

R

CGTCCATGAAGTTGTTGCCGAT 29 33

SM22 alfa

F TGGGTGGTGATCCACTGGATC 179 30 34

R

TTGCCTTGAGTCAGTGCGCC 31 35

αSM

F AGCCCAGCCAAGCACTGTCA 130 32 36

R

GAGCATCGTCCCCAGCAAAG 33 37

Cadena pesada

F GAAGATCGTCGACATGTACAAGGG 122 34 38

de la miosina

R

TGCATAGAATGGACTGGTCCTCC 35

Prote�na Gla de la F

GCTACACAAGACCCTGAGACTGACC 192 36 40

matriz (MGP)

R

TCTCCATCTCTGCTGAGGGGAT 37 41

Cbfa1

F CACGACAACCGCACCATGGT 181 38 42

R

TGACAGTAACCACAGTCCCATCTG 39

MSX2

F GCTGGTGAAGCCCTTCGAGA 173 40 44

R

ATGTGGTAAAGGGCGTGCG 41 45

Osterix

F AGTTCATGGCTCCAGTCCCC 146 42 46

R

TGGAGGCTGAAAGGTCACTGC 43 47

PMO2

F AGCCAACACTGTGCGCAGCT 140 44 48

25

(continuación)

R

CCTGAAGCTCTGCTGAGGTGATAA 45

Osteocalcina

F ATGAGAGCCCTCACACTCCTC 297 46 50

R

GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC 47 51

GAPDH

F TCCTGTTCGACAGTCAGCCG 122 48 52

R

TGGTGACCAGGCGCCCAATA 49 53

Osterix de ratón

F TCCCTTCTCAAGCACCAATGGACT 230 50 54

R

AGCTGTGAATGGGCTTCTTCCTCA 51

GAPDH de ratón

F TGTTCCAGTATGACTCCACTCACG 170 52 56

R

GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA 53

Ejemplo 9. RT-PCR cuantitativa en tiempo real: Después de la transcripción inversa realizada como se indica anteriormente, se realizó en tiempo real usando el MX 4000 (Strategene, La Jolla, CA), SYBR Green de Sigma (St. Louis) y el kit de PCR de Invitrogen. Se realizó cada reacción por triplicado a 95 �C, 45 s y 60 �C, 30 s y 60 s a 72 �C durante 40 ciclos. Después de esto se realizó un ciclo en fundido, que consistió en un aumento escalonado de la temperatura desde 72 �C hasta 99 �C. Se observ� un único pico predominante en la curva de disociaci�n de cada gen, lo que respalda la especificidad del producto de PCR. Se fijaron los números de Ct (valores umbral) en la fase exponencial de la PCR y se usaron para calcular los niveles de expresión de los genes de interés. Se us� la GAPDH como patrón interno y se us� para normalizar los valores. Se gener� una curva estándar que consistía en cT frente a los logaritmos de las diluciones de ADNc (correspondientes a los logaritmos de los números de copias) amplificando diluciones seriadas de ADNc correspondientes a una cantidad desconocida de amplic�n.

Ejemplo 10. Construcciones de ARNip de osterix: Se diseñaron las secuencias objetivo de ARNip de osterix (osx) humano con Enhanced siDirect (RNAi Co., Ltd.) (tabla 4). Se sintetizaron las hebras sentido y antisentido de 63meros de oligonucle�tidos de ADN con Integrated DNA Technologies. Se realizó la construcción de un vector retrov�rico para administrar ARNip usando el sistema retrov�rico pSilencer 5.1-H (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se adquirió un vector retrov�rico como control negativo de ARNip desorganizado de Ambion.

Ejemplo 11. Establecimiento de células infectadas de forma estable: Se transfectaron células de empaquetado Phoenix-A subconfluentes, regalo del Dr. Garry Nolan (Stanford University School of Medicine, Stanford, California) con vectores v�ricos de ARNip (8 μg de ADN/100 mm de placa) usando FuGene 6 (Roche). Después de 48 h, se recogió el sobrenadante, se filtr� a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm y se us� para transducir las células objetivo. Se mezcl� cada sobrenadante (5 ml) con 8 μg/ml de polibreno (Sigma). Se us� este cóctel de infección (10 ml) para infectarlo en células SaOs (2 x 105 células/100 mm de placa) durante 6 h. Se seleccionaron las células infectadas en presencia de 4 μg/ml de puromicina (Sigma) durante tres días y se sometieron a ensayo las células infectadas.

Ejemplo 12. Inmunotransferencia: Para evaluar el efecto de la inactivaci�n por ARNip, se sometió a ensayo el lisado nuclear de las células por inmunotransferencia usando anticuerpos específicos para osterix (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y la histona H3 (Cell Signaling). Se usaron anticuerpos frente a la histona H3 como control de carga. Las metodolog�as de inmunotransferencia son bien conocidas en la técnica.

Ejemplo 13. Ensayo de mineralizaci�n: Para inducir la mineralizaci�n in vitro, se cultivaron células infectadas en medio HL-1 sin suero (Lonza) con 50 μg/ml de ácido asc�rbico (Sigma) durante 7 días. Después de 7 días de cultivo, se tiñeron las células infectadas por von Kossa o rojo de alizarina para detectar la mineralizaci�n (1, 2). Para la cuantificación del calcio, se disolvió calcio en tampón Tris 0,1 M (a pH 7,2) que incluía Triton X-100 al 0,1 % y HCl 4 N durante 16 h después de la sonicaci�n. Se midió el contenido en calcio con el Calcium C-Test (Wako).

Ejemplo 14. Análisis estadístico: Se analizaron los datos para determinar su significación estadística (P < 0,05) usando un ANOVA. Se realizaron comparaciones entre animales sacrificados a las 22 semanas (grupo de control) y los sacrificados a las 28 semanas que se habían tratado con PMO-7 o CaCO3. Para el cultivo celular, se analizaron los datos del sistema para determinar la significación estadística (P < 0,05) usando un ANOVA. Estos análisis se realizaron con el programa Systat, de Software Inc, (Point Richmond, CA).

Ejemplo 15. Cuantificación del Ca a�rtico: La cuantificación del Ca a�rtico en ratones alimentados con grasas con NC inducida a las 14 semanas y sacrificados a las 22 semanas de nacer demostr� que la NC estimula la calcificación (fig. 1A). Se trat� a los ratones con 10 mcg/kg de PMO-7 inyectados por vía intraperitoneal una vez a la

semana. El panel A muestra el cambio en el grado de calcificación vascular, que aument� desde las 22 semanas hasta las 28 semanas en animales tratados con vehículo, si bien el calcio a�rtico disminuyó en animales tratados con PMO-7. El panel B muestra el nivel de fósforo en el suero de los animales de control y los animales tratados con PMO-7. En los no tratados, permaneció sin cambios entre las 22 semanas y las 28 semanas, pero se redujo a 5 niveles normales con el tratamiento con PMO-7. Los datos se expresan como media del grupo � EEM, n = 4-7. El tratamiento con el vehículo durante seis semanas comenzando a las 22 semanas de nacer y hasta la semana 28 después de nacer, dio lugar a una acumulación adicional de calcio vascular (fig. 1A). El tratamiento con PMO-7, 10 μg/kg por vía IP semanalmente, la misma dosis usada en ensayos de prevención anteriores (Davies 2003; Davies 2005),19,20 durante el periodo de las semanas 22-28 produjo una reducción significativa de la calcificación a�rtica en

10 comparación con el punto de partida de la semana 22 (fig. 1A) y la corrección de la hiperfosfatemia (fig. 1B).

Ejemplo 16. Efecto directo de la hiperfosfatemia sobre la calcificación. Dado que la PMO-7 actúa directamente sobre la vasculatura (Dorai H, et al., J. Cellular Physiol. 184:37-45, 2000; Dorai H y Sampath TK, J. Bone Joint Surg. 83:S70-S78, 2001 )28,29 además de reducir la hiperfosfatemia, los autores de la presente invención analizaron los efectos del control únicamente de la hiperfosfatemia. Inicialmente, los autores de la presente invención escogieron el

15 sevel�mero CO3, un aglutinante no absorbible del fosfato luminal del intestino y las sales biliares para corregir la hiperfosfatemia, pero este aglutinante, si bien era eficaz (tabla 5), tenía acciones pleotr�picas. (Mathew S et al., J. Am. Soc. Nephrol. 18:122-130, 2007).30

Tabla 5: Parámetros bioquímicos en los diversos grupos de animales

Grupo

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7

Cepa de ratón

LDLR-/- LDLR-/- LDLR-/- LDLR-/- LDLR-/- LDLR-/- LDLR-/-

Dieta

Grasa Grasa Grasa Grasa Grasa Grasa Grasa

Intervenci�n quirúrgica

NC NC NC NC NC NC NC

Semanas después de nacer

22 28 28 28 28 28 28

Tratamiento

PMO-7 Sevel�mero al 1 % Sevel�mero al 3 % CaCO3 al 3% Lantano al 3%

N

7 7 4 6 5 5 5

Peso antes de la intervención quirúrgica

21,74 � 0,751 17,6 � 0,390 20,05 � 0,674 22 22 19,95 � 0,712 17,4 � 0,702

Peso en el momento del sacrificio

21,64 � 0,954 18,3 � 0,839 21,47 � 0,383 29 28 20,5 � 0,694 19,5 � 0,687

Calcio (mg/dl)

10,55 � 0,396 7,8 � 0,214 8,37 � 0,229 10,4 � 0,23 13 � 0,9 6,9 � 0,589 8,2 � 0,3

F�sforo (mg/dl)

10,8 � 0,802 10,94 � 1,092 6,325 � 0,471 8,4 � 0,9 6,2 � 0,4 NR 9,7 � 0,4

NUS (mg/dl)

53,54 � 3,93 62,71 � 3,74 52,50 � 5,172 67 � 7,5 59 � 7,4 58 � 10,625 40 � 5,3

Glucosa (mg/dl)

288 � 122,8 247 � 24 191 � 13,8 291 � 21 337 � 68 124 � 13,2 201 � 19

Colesterol (mg/dl)

1210 � 526,2 1188 � 129,6 911,6 � 93,7 656 � 137 675 � 56,8 NR 889 � 80

NR -(No Realizado, suero usado en el desarrollo de un nuevo ensayo para la fetu�na). Davies et al.20 20 informaron de los efectos del CaCO3 sobre el Pi s�rico, la glucosa y el colesterol.

Por tanto, los autores de la presente invención escogieron el CaCO3, cuyas acciones pueden estar limitadas a la

uni�n de fosfato cuando est� bien mezclado en los alimentos y si el Ca s�rico no se ve afectado. También se estudi�

el LaCO3, otro aglutinante de fosfato que no contiene calcio de uso cl�nico. Mientras la calcificación vascular

aument� significativamente desde las 22 semanas hasta las 28 semanas en animales tratados con vehículo, el 25 calcio a�rtico disminuyó hasta niveles inferiores a los de las 22 semanas en animales tratados con CaCO3 al 3 %. No

se observaron cambios significativos desde las 22 semanas en los animales tratados con LaCO3 al 3 %. Los datos

se expresan como media del grupo � EEM, n = 4-5. El CaCO3 añadido a la dieta redujo significativamente la

calcificaci�n vascular en comparación con los animales del punto de inicio a las 22 semanas, de forma similar a los

efectos de la PMO-7 (fig. 2). Las acciones terapéuticas del CaCO3 fueron similares a las de los estudios publicados

de los autores lo que demuestra la prevención de la CV al evitar la hiperfosfatemia con CaCO3. (Davies 2005)20 El CaCO3 no afectaba al Ca s�rico (tabla 5). El LaCO3 también evit� el aumento de la calcificación vascular de las semanas 22 a 28 de forma similar al CaCO3, pero no redujo los niveles de calcio vascular por debajo de los observados a las 22 semanas. El tratamiento con sevel�mero CO3 redujo el colesterol s�rico, pero ninguno de los demás tratamientos afect� a la hipercolesterolemia de los ratones LDLR-/-.

Se incluyeron ratones adicionales en el estudio para realizar un análisis cualitativo de las aortas para cuantificar los efectos de los tratamientos, porque las aortas de los animales experimentales se destruyeron con la técnica de cuantificación del contenido en calcio a�rtico. La calcificación vascular estaba asociada en gran medida a placas ateroescler�ticas (fig. 3) y se observaron calcificaciones puntiformes en la t�nica media. Panel A: Placa grande cargada de lípidos (entre las flechas) en la aorta proximal de un ratón LDLR-/-con alimentación rica en grasas operado de forma simulada. Las flechas gruesas indican calcificaciones focales en la base de la placa. Panel B: Una placa grande calcificada (entre las flechas) en la aorta proximal de un ratón LDLR-/-con alimentación rica en grasas y NC. Panel C: Una placa grande cargada de lípidos (entre las flechas) en la aorta proximal de un ratón LDLR-/-con alimentación rica en grasas y NC tratado con PMO-7. La tinción es de rojo de alizarina. En A-C el aumento es de 400x. El tratamiento con PMO-7, CaCO3 o LaCO3 redujo el depósito de calcio asociado a placas, pero no redujo el tamaño de las lesiones ateroescler�ticas (fig. 3).

Ejemplo 17. Mineralizaci�n de la matriz in vitro. Con el fin de analizar el mecanismo de la calcificación vascular estimulada por fósforo, los autores de la presente invención estudiaron la mineralizaci�n de la matriz mediante células musculares lisas vasculares humanas (hCMLV) aisladas a partir de donantes ateroescler�ticos (tabla 3) in vitro para imitar este modelo de ratón ateroescler�tico. Los autores de la presente invención aumentaron el fósforo del medio para imitar la hiperfosfatemia de la NC. El concepto del modelo sigue sistemas de cultivo de células musculares lisas vasculares calcificantes previamente establecidos10-12 adaptados a tejidos humanos. Las hCMLV usadas en el presente documento, no mineralizaron la matriz extracelular en condiciones basales, pero al exponerlas a un aumento del fósforo de 1 mM con respecto al ya presente en el medio de cultivo (Pi final de 2 mM), las hCMLV mineralizaron su matriz con el tiempo (fig. 4). Se cultivaron hCMLV de siete donantes en DMEM como se describe en el ejemplo 6 (grupo A) u OMEM complementado con NaH2PO4/NaHPO4 1 mM a pH 7,4 (grupo B). En los grupos C, D y E, se añadieron 0,1, 1 y 10 ng/ml de PMO-7, respectivamente, al medio complementado con NaH2PO4/NaHPO4. Los cultivos finalizaron a los 14 días (A) y a los 21 días (B). Los datos son la media � EEM, n = 7 donantes. La exposición a PMO-7 durante 14 (fig. 4A) o 21 días (fig. 4B) en medio rico en fósforo redujo la mineralizaci�n de la MEC.

Ejemplo 18. Estimulaci�n de la diferenciación osteobl�stica a través de la inducción de osterix. Se us� la RT-PCR para demostrar que los cultivos primarios de hCMLV expresaban osteocalcina, el marcador de los osteoblastos diferenciados (Aubin JE, Liu F: The osteoblast lineage). Los niveles basales de expresión g�nica en hCMLV cultivadas en DMEM como se describe en el ejemplo 6 y detectados por RT-PCR (recuadros) se fijaron como valor de referencia de 1 (barras sin colorear, grupo A). Se determin� la multiplicación de la inducción por medio de cultivo rico en fósforo (NaH2PO4/(Na)2HPO4 2 mM) (barras negras, grupo B) y fósforo 2 mM más 10 ng/ml de PMO-7 (barras sombreadas, grupo C). Se observ� un programa transcripcional osteobl�stico dirigido por PMO-2/MSX2 en los cultivos de hCMLV, como demostr� la presencia de transcripción g�nica de osteocalcina (A), PMO-2 (B), MSX2

(C) y RUNX2 (D). En las condiciones de cultivo basales osterix (E) solo se expresaba débilmente. El fósforo estimulaba la transcripción de osterix (E). La PMO-7 inhibía la expresión de osterix y osteocalcina. Los datos de A-E se normalizaron con el nivel de expresión en las condiciones de cultivo basales y se expresaron como multiplicación de la inducción, la media � EEM, n = 3. En: Principles of Bone Biology, editado por Bilezikian JP et al., Nueva York, Academic Press, 1996, p�gs 51-67; Hoffmann HM et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:12887-12891, 1994)31,32 (fig. 5A), de acuerdo con los estudios inmunohistol�gicos anteriores in vivo (Davies 2003)19 de los autores de la presente invención y sus colegas, se sugiere que la diferenciación osteobl�stica puede ser un mecanismo de mineralizaci�n heterot�pica. La transcripción de PMO-2 y MSX2, inductores de la diferenciación osteobl�stica, (Cheng SL et al., J. Biol. Chem. 278:45969-45977, 2003; Harris SE et al., Mol Cell Different 3:137-155, 1995)33,34 estuvo presente en los cultivos primarios de acuerdo con esta posibilidad (fig. 5B,C), pero sus niveles no estaban inducidos por las condiciones de fósforo elevado. Del mismo modo, RUNX2/Cbfa1, el factor de transcripción específico de tejido osteobl�stico, (Ducy 1997; Komori T et al., Cell 89:755-764,1997)17,35 se expresaba en las células hCMLV sin tratar (fig. 5D) y no estimuladas por fósforo en el medio. Sin embargo, el segundo factor de transcripción específico de tejido osteobl�stico, posterior a PMO-2 y PMO-4, osterix,24,25 se expresaba a niveles bajos hasta su inducción con medios de cultivos ricos en fósforo (fig. 5E). RUNX2 y osterix son factores de transcripción osteobl�sticos (Nakashima 2002; Lee 2003 ; Komori 1997)24,25,35 que pueden guiar a las células de linaje mesenquimal a través del programa osteobl�stico dirigido por los morf�genos osteobl�sticos PMO-2 y 4. (Harris 1995)34 La PMO-7 no consiguió afectar a la expresión de la ruta de la PMO-2 en la parte anterior a osterix (PMO-2 y RUNX2) (fig. 5B,C,D), pero inhibió fuertemente la expresión de osterix (fig. 5E) y la expresión de proteínas que son marcadores del fenotipo osteobl�stico (fig. 5A).

Ejemplo 19. Inhibición de la mineralizaci�n por un inhibidor de PMO-2. Se demostr� el papel esencial de la PMO-2 en la inducción de la diferenciación osteobl�stica y la mineralizaci�n con la eliminación de la mineralizaci�n en medio rico en fósforo al añadir un inhibidor de la PMO-2, la nogina (fig. 6A). El panel A muestra el efecto de la

nogina (10-100 ng/ml), añadida al medio rico en fósforo, barras sombreadas, que inhibe la mineralizaci�n de la matriz estimulada por fósforo. El panel B muestra que la nogina, 100 ng/ml, bloque� la expresión de osterix inducida por fósforo. La adición de la nogina (fig. 6B) también inhibió la expresión de osterix estimulada por medios ricos en fósforo, lo que sugiere que las acciones del fósforo elevado cooperan con la diferenciación osteobl�stica estimulada por PMO-2 y 4. La estimulaci�n del segundo factor de transcripción específico de tejido osteobl�stico del desarrollo terminal, osterix, por fosfato elevado fue la última etapa de la diferenciación osteobl�stica que dio lugar al depósito mineral en la matriz extracelular, como demuestra la inversión de la mineralizaci�n al inhibir osterix con el tratamiento con PMO-7 (fig. 6B, fig. 1).

Ejemplo 20. Mineralizaci�n en células con osterix inactivado. En una línea celular mineralizante sensible al fosfato, SAOS, la expresión inducida por retrovirus del ARNip de osterix, como se describe en el ejemplo 11, bloque� la mineralizaci�n de la matriz estimulada por medios ricos en fosfato, como se esperaba, mientras que el ARNip desorganizado inducido por retrovirus de la secuencia de osterix respondió al medio HL-1 rico en fosfato (fig-7).

Ejemplo 21. Expresión de marcadores de CMLV contráctiles en células humanas. Aunque la PMO-7 presentaba acciones además de la inhibición de osterix, tales como la estimulaci�n del fenotipo contráctil de las hCMLV, el fósforo no afect� a la transcripción de estos biomarcadores (fig. 8), de modo que no es probable que fueran el mecanismo de inhibición por PMO-7 de la acción del fósforo. Como se muestra en la figura 8, la expresión de biomarcadores de CMLV 8 se redujo en estos cultivos derivados de aortas ateroescler�ticas, lo que probablemente refleja el fenotipo anómalo de CMLV en la neo�ntima asociado con las placas ateroescler�ticas. Los niveles de mensajeros de calponina (panel A), actina alfa de músculo liso (SMA alfa) (panel B), miosina de cadena pesada (MHSCM) (panel C) y SM22 alfa (panel D) detectados por RT-PCR eran bajos en las hCMLV en condiciones basales (barras sin colorear, grupo A) y en presencia de medios ricos en fósforo (barras negras, grupo B). La PMO-7 (barras sombreadas, grupo C) inducía la expresión de cada una de las proteínas marcadoras. Los datos de los paneles A-E se normalizaron con el nivel de expresión en las condiciones de cultivo basales y se expresaron como multiplicación de la inducción, la media � EEM, n = 3. Los niveles basales bajos pueden haber sido la base para la ausencia de un efecto de los medios ricos en fósforo para reducir su expresión como demostraron otros investigadores (Jono 2000; Li, X et al., 2007, trabajo no publicado)11,36. Se desarrollaron líneas celulares SAOS que expresaban ARNip para osterix como se describe en el ejemplo 11. Panel A. Los niveles de ARNm para osterix se redujeron en más del 50 % en dos líneas celulares independientes (ARNiposx#1 y ARNiposx#2). Panel B. Los niveles de proteína de osterix disminuyeron notablemente de acuerdo con el análisis Western en ARNiposx#1 y ARNiposx#2. Los niveles de histonas H3 se determinaron como un control de carga en las transferencias de bandas Western. Tinciones de von Kossa (paneles C-E) y de rojo de alizarina (paneles F,G) de cultivos estimulados por condiciones con fósforo alto. Panel C. Nódulos mineralizados en la periferia de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel

D. Nódulos mineralizados en el centro de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel E. Ausencia de mineralizaci�n detectada por tinción de von Kossa en la periferia de pocillos con expresión de ARNiposx#1 después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel F. Nódulos teñidos con rojo de alizarina en la periferia de pocillos que contenían células que expresaban el ARNip desorganizado después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. Panel G. Ausencia de mineralizaci�n detectada por tinción de rojo de alizarina en la periferia de pocillos con expresión de ARNiposx#1 después de siete días en las condiciones mineralizantes con fósforo alto. El naranja es la tinción de fondo en las tinciones de rojo de alizarina negativas. Panel H. Niveles de calcio en las matrices de cultivos de líneas celulares que expresan ARNip para osterix.

El programa dirigido por PMO-2/4 tiene como antagonista a la PMO-7, una PMO estrechamente relacionada que, en general, aunque no siempre, (Asahina I. et al., Exp Cell Res 222:38-47, 1996)37 es complementaria en la función osteobl�stica. Esto es coherente con los fenómenos observados en varias situaciones biológicas, incluido el desarrollo del ri��n cuando la PMO-2 inhibes la morfogénesis de ramificación estimulada por la PMO-7. (Piscione

T.D. et al., Am J Phys (Renal) 273:F961-F975, 1997)38. Se había informado de un fenómeno coherente en la función de los conductos colectores, donde la PMO-2 inhibía la proliferaci�n e inducía la apoptosis, mientras que la PMO-7 a dosis bajas estimulaba la proliferaci�n. (Piscione T.D. et al., Am J Physiol Renal Physiol 280:F19-F33, 2001)39. Sin quedar limitados por la teoría, tales actividades distintas de las PMO relacionadas se deben, probablemente, a la utilización de diferentes receptores (Macias-Silva M. et al., J Biol Chem 273:25628-25636, 1998)40 y a la transducci�n de señales independiente de Smad.

Ejemplo 22. Expresión de genes relacionados con la calcificación. Para relacionar el mecanismo de la acción del fósforo detectada in vitro con este modelo de calcificación vascular inducida por NC e hiperfosfatemia in vivo, los autores de la presente invención analizaron la expresión a�rtica de los genes de linaje osteobl�stico, incluidos los niveles de mensajero de osterix por RT-PCR en tiempo real. Los diversos grupos de ratones fueron: A, operados de forma simulada; B, NC tratada con vehículo; C, NC tratada con PMO-7; D, NC tratada con CaCO3 al 3 %; E, NC tratada con LaCO3 al 3 %. La expresión de MSX2 (A) era baja, no inducida por la NC y se suprimió con cada uno de los tres tratamientos. En el recuadro se muestran datos de la escala de la relación entre 0,0-0,5. La expresión de CBFA1 (B) no estaba estimulada por la NC, pero se inhibió con los tratamientos con PMO-7, CaCO3 al 3 % y LaCO3 al 3 %. La expresión de osterix (C) estaba estimulada por la NC y se inhibió con los tratamientos con PMO-7, CaCO3

o LaCO3. La expresión de la osteocalcina (D) estaba fuertemente inducida por la NC (obsérvese la escala diferente del eje Y) se inhibió con la PMO-7, el CaCO3 o el LaCO3. El número de aortas/animales en cada grupo fue de 4. Los datos se expresan como la media de los niveles de transcrito con relación a la expresión de GAPDH en cada aorta � EEM, N=3. En los ratones testigos quirúrgicos con alimentación rica en grasas, los autores de la presente invención observaron la expresión de PMO-2 (no mostrado), MSX2 (fig. 9A) y RUNX2 (fig. 9B), de acuerdo con datos recientes de Shao et al. 2005,27 pero osterix se solo expresaba débilmente (fig. 9C). Osterix estaba fuertemente inducida por la NC (fig. 9C) y el tratamiento con PMO-7 o CaCO3, mostrado anteriormente (figs. 1 y 2) para invertir parcialmente la calcificación vascular, redujo la expresión de osterix y RUNX2 (fig. 9B y C). La expresión a�rtica de la osteocalcina disminuyó con el tratamiento con PMO-7, CaCO3 o LaCO3 (fig. 9D), lo que es compatible con la inhibición de la actividad de osterix y el programa transcripcional osteobl�stico. (Hoffman 1994;Ducy P. et al., Mol Cell Biol 15:18581869, 1995)32,41.

La invención divulgada en el presente documento extiende estudios anteriores que demostraban que la NC estimula la mineralizaci�n vascular (Davies 2003; Davies 2005; Phan O. et al., Circulation 112:2875-2882, 2005; Tamagaki K. et al., Nephrol Dial Transplant 21:651-659, 2006)19,20,42,43. El modelo animal descrito, el ratón deficiente en receptores de lipoprote�nas de baja densidad alimentado con una dieta rica en grasas, en un modelo animal de ateroesclerosis debida a hiperlipidemia, obesidad, resistencia a la insulina y síndrome metabólico. En este modelo animal, se desarrolla CV en la neo�ntima ateroescler�tica a�rtica (Davies 1003; Shao 2006) 19,26 asociada con la expresión de un programa de diferenciación osteobl�stica dirigido por PMO-2 y MSX2 junto con los efectos transcripcionales del factor de transcripción de osteoblastos RUNX2. (Shao 2005)27,33 Los datos obtenidos demuestran que MSX2 se expresa a niveles bajos en la aorta ateroescler�tica con alimentación grasa, de acuerdo con Cheng et al, (2003)33, que procedieron a sobreexpresar MSX2 para demostrar su papel en la calcificación vascular osteobl�stica. Shao et al, (Shao, J.S. et al. J. Clin. Invest. 115:1210-1220, 2005)27 también demuestran la activación de la actividad de Wnt en la capa adventicia en el modelo de LDLR-/-alimentado con grasas, pero los autores de la presente invención han demostrado que los inhibidores de Wnt perivasculares inducidos por la NC, (Surendran K. et al., J. Am. Soc. Neph. 16:2373-2384, 2005)44 y el papel de la actividad de Wnt en la CV inducida por NC requiere más estudio. Los presentes estudios y los estudios anteriores de los autores de la invención y sus colegas demuestran una intensificación importante de la calcificación de la neo�ntima inducida por la NC en este modelo.(Davies 2003; Davies 2005)19,20. Los resultados también son acordes con un estudio anterior de los autores de la invención y sus colegas en cuanto a la asociación de la inducción de la NC con el desarrollo de hiperfosfatemia y a que el tratamiento con PMO-7 corregía la hiperfosfatemia. (Davies 2005)20 Se ha demostrado que el efecto de la PMO-7 para corregir la hiperfosfatemia se debe a la estimulaci�n de la formación de hueso, (Davies 2005)20 y se ha corregido la hiperfosfatemia de forma preventiva en el desarrollo de la CV estimulada por NC. (Davies 2005; Mathew

2007)20,30

Una invención nueva e inesperada del presente documento es la demostración de que se pueden reducir los niveles de mineralizaci�n vascular establecida con PMO-7 y el control de la hiperfosfatemia. La reducción de los depósitos minerales vasculares existentes con tratamiento farmacol�gico es un paso adelante significativo en el tratamiento de la ateroesclerosis. Refuerza el argumento de que el mecanismo del proceso de mineralizaci�n ateroescler�tica es un mecanismo de remodelación biológica. Un mecanismo de este tipo sería similar a la remodelación esquel�tica donde el depósito mineral (formación de hueso) est� relacionado con la reabsorci�n mineral. La reabsorci�n de depósitos existentes a una velocidad mayor que la de formación por adición o creación de nuevos depósitos es la explicación más razonable de estos resultados. Dado que se ha demostrado la existencia de células de tipo osteoclasto multinucleares positivas para TRAP en la neo�ntima, (Moe 2002; Chen N.X. et al., Sem. Nephrol. 24:61-68, 2004; Doherty T.M. et al. FASEB J. 16:577-582, 2002)14,45,46 los autores de la presente invención interpretaron que la disminución de la mineralizaci�n vascular en los animales tratados con CaCO3 y PMO-7 era compatible con la disminución de la formación de depósitos minerales vasculares y la reabsorci�n continuada.

La reducción de la calcificación vascular inducida por NC en el modelo animal descrito con el control de la hiperfosfatemia es una prueba de la inversión de un efecto estimulado por el fósforo. En los estudios in vitro, el fósforo estimulaba la mineralizaci�n a través de la activación de un programa osteobl�stico vascular dirigido por la PMO-2 a través de las acciones de factores de transcripción específicos de osteoblastos. Se observ� la presencia del programa osteobl�stico en los cultivos de estas células,como demostraba la presencia de la expresión de PMO-2 y MSX2, la presencia de RUNX2 y los objetivos de la actividad transcripcional de RUNX2, tales como la osteocalcina. (Ducy 1997; Ducy 1995)17,41. El descubrimiento de la expresión de PMO-2 y 4 y RUNX2 en hCMLV derivadas de aortas ateroescler�ticas difiere de los resultados de cultivos primarios de aortas sanas sin ateroesclerosis. Sin embargo, no se observ� la presencia de mineralizaci�n debido a una expresión insuficiente de osterix, un factor de transcripción específico de tejido osteobl�stico esencial, (Nakashima 2002; Koga T. et al., Nature Medicine 11:880-885, 2005)24,47 que se estimul� por la adición de fósforo en el medio y es posterior a PMO-2, pero no necesariamente a RUNX2. (Lee 2003)25. El hecho de que ese medio rico en fósforo indujera la mineralizaci�n se debió en realidad a la actividad del programa oste�geno se demostr� por su inhibidor con un antagonista de PMO, la nogina. La interrupción del programa a través del factor de transcripción, osterix, como con el tratamiento con PMO-7 o por ARNip de osterix, era insuficiente en presencia de medio rico en fósforo para eliminar la mineralizaci�n. Por tanto, el fósforo era una molécula de se�alizaci�n activa que dio lugar a un aumento de la expresión de osterix y no solo una fuerza fisicoqu�mica de mineralizaci�n de acuerdo con otros estudios in vitro.

(Steiz 2001;Jono 2000; Li 2006)10,11,22 Estos estudios (Jono 2000; Li 2006)11,22 han determinado que la acción del fósforo est� relacionada con la actividad del transportador dependiente de sodio Pit1 en CMLV, como se sugiere en los osteoblastos. (Beck G.R. et al., Proc Natl Acad Sci 97:8352-8357, 2000)48 Su papel como molécula de se�alizaci�n lo puede realizar a través de la activación inducida por Pit1 de un complejo de se�alizaci�n asociado a la membrana similar al que se sabe que est� asociado con la proteína de transporte dependiente de sodio del t�bulo proximal y los osteoclastos, NaPi2a. (Biber J. et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 287:871-5, 2004)49

Los datos descritos in vivo estaban relacionados directamente con modelos in vitro. De acuerdo con estudios anteriores, (Shao 2005)27 se indujo el programa PMO-2/MSX2 en la aorta con una alimentación rica en grasas análoga a los cultivos de hCMLV en condiciones basales de donantes ateroescler�ticos. Sin embargo, la NC fue el principal estímulo para la CV en este modelo análogo al efecto del fósforo in vitro. La NC indujo la expresión de osterix en la aorta, de modo similar al efecto del fósforo in vitro. El control de la hiperfosfatemia por dos estrategias terapéuticas independientes invirtió la CV y devolvió la expresión a�rtica de osterix y RUNX2 a niveles inferiores a los de las aortas de ratones testigos quirúrgicos con alimentación rica en grasas. Por tanto, los datos del presente documento demuestran que la activación de un programa osteobl�stico en la vasculatura como la patogenia de la NC estimula la calcificación ateroescler�tica de acuerdo con los datos de otros investigadores.(Reynolds 2004; Moe

2003)12,18

En cuanto al papel del fósforo, los datos aplicables concuerdan con las observaciones clónicas en seres humanos de Chertow et al. (Chertow G.M. et al., Kidney Int 62:245-252, 2002)50 y Block (Block G.A. et al., Kidney Int 68:18151824, 2005)51 in vivo y varias pruebas analíticas in vitro. (Tyson 2003; Steitz 2001; Jono 2000)9-11 La presente memoria descriptiva describe por primera vez la demostración clara de que el fósforo provoca CV in vivo y que el mecanismo de la acción del fósforo se produce a través de la estimulaci�n de un programa de diferenciación osteobl�stica heterot�pica. Estos datos concuerdan con los estudios epidemiológicos en seres humanos que relacionan la hiperfosfatemia con la mortalidad cardiovascular en la NC, (Kestenbaum 2006; Slinin 2005)3,4 y ofrecen un mecanismo de acción de la hiperfosfatemia. Los estudios de los que aquí se informa proporcionan un mecanismo de calcificación vascular ateroescler�tica inducida por hiperfosfatemia en la NC. Puede ser que no est�n relacionados con la calcificación de la lámina elástica de la media de la arteria, que también est� estimulada en la NC. Este proceso es distinto de la mineralizaci�n osteobl�stica donde el sustrato de mineralizaci�n de la matriz es col�geno de tipo 1.

Ejemplo 23. Efecto del tratamiento con PMO-7 sobre el efecto de la NC sobre la hiperplasia de la neo�ntima

A. Creación de f�stulas arteriovenosas (AV)

Seis semanas después de la creación de la NC y los ratones testigos quirúrgicos como se describe anteriormente, se sometió a los animales a la creación de una f�stula AV por anastomosis de la arteria carótida izquierda común con la vena yugular del extremo al lateral. En condiciones estériles, se realizó una incisión vertical en la parte izquierda del cuello y se extrajeron con cuidado la arteria carótida izquierda común y la vena yugular externa adyacente. Se dispuso una pinza hemost�tica en la carótida común en la porción proximal con un hilo de nailon de 11-0 y se dividió la arteria carótida común justo al lado de la bifurcación. A continuación, se dispusieron pinzas hemost�ticas en las posiciones proximal y distal de la vena yugular y se realizó una punci�n en la porción central con una jeringuilla de 27 G. Después de rellenar este segmento de vena con solución salina heparinizada, se realizó una venotom�a de 0,7 mm de longitud. Después se crearon anastomosis del extremo al lateral (del extremo de la arteria carótida común al lateral de la vena yugular) usando una sutura vertical continua con nailon de 11-0. Se retiraron las pinzas de los vasos y se comprob� la permeabilidad (fig. 11A, B).

Tres semanas después de la creación de la AV, se sacrificaron los animales y se fijaron por perfusi�n las anastomosis AV a través del ventrículo izquierdo a 100 mm de Hg de presión como se describe anteriormente (Leidenfrost JE, et al., Am J Pathol. 2003;163(2):773-778).53 Antes de la fijación por perfusi�n, se extrajo la sangre del ventrículo izquierdo para el análisis bioquímico. Se midieron el nitrógeno ureico sanguíneo (NUS), el fósforo y el calcio con técnicas de autoanalizador en el Animal Facility Clinical Laboratory en la Universidad del Estado de Washington en San Luis, Misuri.

B. Efecto del tratamiento con PMO sobre lesiones de HC inducidas por NC

Para estudiar la posibilidad de que la NC indujera la desdiferenciaci�n de las CMLV permitiendo tasas mayores de migración, se estudiaron los efectos de un factor de diferenciación de CMLV administrado de forma sist�mica (p. ej., PMO-7, que se ha demostrado anteriormente que estimula la expresión de marcadores del fenotipo contráctil de VSCM in vitro (Mathew, S, et al., J Am Soc Nephrol., 2005 16:52a (resumen))62 en el desarrollo de lesiones de hiperplasia de la neo�ntima (HN). Se sometió a los ratones a la creación de NC y 3 semanas más tarde se les sometió a la creación de una f�stula arteriovenosa (AV). Una semana antes de la creación de la f�stula AV y continuando hasta la recogida de la anastomosis AV, se administr� PMO-7 (100 μg/kg) o su vehículo (solución salina) por vía intraperitoneal dos veces a la semana. En los animales testigos quirúrgicos, no se observaron efectos de la PMO-7 sobre el desarrollo de lesiones de HN (18 animales con PMO-7 frente a 16 animales con vehículo). Sin embargo, la administración de PMO-7 elimin� la estimulaci�n de la formación de lesiones de HN inducida por la NC (16 animales con PMO-7 frente a 19 animales con vehículo). * P<0,01. Figura 12. Estos resultados sugieren que la migración de CMLV estimulada por la NC hacia la lesión de HN la permitieron los efectos de la NC para reducir la diferenciación de VSCM de las células migrantes.

Referencias

5 1. Go AS, Chertow GM, Fan D, McCulloch CE, Hsu Cy: Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. New Engl J Med 351:1296-1305, 2004.

2. Berl T, Henrich W: Kidney-heart interactions: epidemiology, pathogenesis, and treatment. Clin J Am Soc Nephrol 1:8-18, 2006.

3. Kestenbaum B, Sampson JN, Rudser KD, Patterson DJ, Seliger SL, Young B, Sherrard DJ, Andress DL: Serum 10 phosphate levels and mortality risk among people with chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 16:520-528, 2005.

4.

Slinin Y, Foley RN, Collins AJ: Calcium, Phosphorus, Parathyroid Hormone, and Cardiovascular Disease in Hemodialysis Patients: The USRDS Waves 1, 3 y 4 Study. J Am Soc Nephrol 16:1788-1793, 2005.

5.

London GM, Guerin AP, Marchais SJ, Metivier F, Pannier B, Adda H: Arterial media calcification in end-stage renal diseases: impact on all-cause and cardiovascular mortality. Nephrol Dial Transplant 18:1731-1740, 2003.

15 6. Raggi P, Boulay A, Chasan-Taber S, Amin N, Dillon M, Burke SK, Chertow GM: Cardiac calcification in adult hemodialysis patients. A link between end-stage renal disease and cardiovascular disease? J Am Coll Cardiol 39:695-701, 2002.

7. Zile MR, Baicu CF, Gaasch WH: Diastolic heart failure -abnormalities in active relaxation and passive stiffness of the left ventricle. N Eng J Med 350:1953-1959, 2004.

20 8. Ohtake T, Kobayashi S, Moriya H, Negishi K, Okamoto K, Maesato K, Saito S: High Prevalence of Occult Coronary Artery Stenosis in Patients with Chronic Kidney Disease at the Initiation of Renal Replacement Therapy: An Angiographic Examination. J Am Soc Nephrol 16:1141-1148, 2005.

9. Tyson KL, Reynolds JL, McNair R, Zhang Q, Weissberg PL, Shanahan CM: Osteo/chondrocytic transcription

factors and their target genes exhibit distinct patterns of expression in human arterial calcification. Arterioscler 25 Thromb Vase Biol 23:489-494, 2003.

10.

Steitz SA, Speer MY, Curinga G, Yang H-Y, Haynes P, Aebersold R., Schinke T, Karsenty G, Giachelli CM: Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification. Circ Res 89:1147-1154, 2001.

11.

Jono S, McKee MD, Murry CE, Shioi A, Nishizawa Y, Mori K, Morii H, Giachelli CM: Phosphate regulation of vascular smooth muscle cell calcification. Circ Res 87:e10-e17, 2000.

30 12. Reynolds JL, Joannides AJ, Skepper JN, McNair R, Schurgers LJ, Proudfoot D, Jahnen-Dechent W, Weissberg PL, Shanahan CM: Human Vascular Smooth Muscle Cells Undergo Vesicle-Mediated Calcification in Response to Changes in Extracellular Calcium and Phosphate Concentrations: A Potential Mechanism for Accelerated Vascular Calcification in ESRD. J Am Soc Nephrol 15:2857-2867, 2004.

13.

Trion A, van der Laarse A: Vascular smooth muscle cells and calcification in atherosclerosis. Am Heart J 35 147:808-814, 2004.

14. Moe SM, O'Neill KD, Duan D, Ahmed S, Chen NX, Leapman SB, Fineberg N, Kopecky K: Medial artery calcification in ESRD patients is associated with deposition of bone matrix proteins. Kidney International 61:638-647, 2002.

15.

Bostr�m K, Watson KE, Horn S, Worthman C, Herman IM, Demer LL: Bone morphogenetic protein expression in 40 human atherosclerotic lesions. J Clin Invest 91:1800-1809, 1993.

16. Dhore CR, Cleutjens J, Lutgens E, Cleutjens K, Geussens P, Kitslaar P, Tordoir J, Spronk H, Vermeer C, Daemen M: Differential expression of bone matrix regulatory proteins in human atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb Vase Biol 21:1998-2003, 2001.

17. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G: Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast 45 differentiation. Cell 89:747-754,1997.

18.

Moe SM, Duan D, Doehle BP, O'Neill KD, Chen NX: Uremia induces the osteoblast differentiation factor Cbfal in human blood vessels. Kidney Int 63:1003-1011, 2003.

19.

Davies MR, Lund RJ, Hruska KA: BMP-7 is an efficacious treatment of vascular calcification in a murine model of

atherosclerosis and chronic renal failure. J Am Soc Neph 14:1559-1567, 2003.

20.

Davies MR, Lund RJ, Mathew S, Hruska KA: Low turnover osteodystrophy and vascular calcification are amenable to skeletal anabolism in an animal model of chronic kidney disease and the metabolic syndrome. J Am Soc Neph 16:917-928, 2005.

21.

Lund RJ, Davies MR, Brown AJ, Hruska KA: Successful treatment of an adynamic bone disorder with bone morphogenetic protein-7 in a renal ablation model. J Am Soc Neph 15:359-369, 2004.

22.

Li X, Yang HY, Giachelli CM: Role of the Sodium-Dependent Phosphate Cotransporter, Pit-1, in Vascular Smooth Muscle Cell Calcification. Circ Res 98:905-912, 2006.

23.

Lecanda F, Avioli LV, Cheng SL: Regulation of bone matrix protein expression and induction of differentiation of human osteoblasts and human bone marrow stromal cells by bone morphogenetic protein-2. J Cell Biochem 67:386398, 1997.

24.

Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, De Crombrugghe B: The novel zinc fingercontaining transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108:17-29, 2002.

25.

Lee M-H, Kwon T-G, Park H-S, Wozney JM, Ryoo H-M: BMP-2 induced osterix expression is mediated by Dlx5 but is independent of Runx2. Biochem Biophys Res Com 309:689-694, 2003.

26.

Towler DA, Bidder M, Latifi T, Coleman T, Semenkovich CF: Diet-induced diabetes activates an osteogenic gene regulatory program in the aortas of low density lipoprotein receptor-deficient mice. J Biol Chem 273:30427-30434, 1998.

27.

Shao JS, Cheng SL, Pingsterhaus JM, Charlton-Kachigian N, Loewy AP, Towler DA: Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin invest 115:1210-1220, 2005.

28.

Dorai H, Vukicevic S, Sampath TK: Bone morphogenetic protein-7 (osteogenic protein-1) inhibits smooth muscle cell proliferation and stimulates the expression of markers that are characteristic of SMC phenotype in vitro. J Cellular Physiol 184:37-45, 2000.

29.

Dorai H, Sampath TK: Bone Morphogenetic Protein-7 Modulates Genes that Maintain the Vascular Smooth Muscle Cell Phenotype in Culture. J Bone y Joint Surg 83:S70-S78, 2001.

30.

Mathew S, Lund R, Strebeck F, Tustison KS, Geurs T, Hruska KA: Reversal of the adynamic bone disorder and decreased vascular calcification in chronic kidney disease by sevelamer carbonate therapy. J Am Soc Nephrol 18:122-130, 2007.

31.

Aubin JE, Liu F: The osteoblast lineage. En: Principles of Bone Biology, editado por Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA, Nueva York, Academic Press, 1996, p�gs. 51-67.

32.

Hoffmann HM, Catron KM, van Wijnen AJ, McCabe LR, Lian JB, Stein GS, Stein JL: Transcriptional control of the tissue-specific, developmentally regulated osteocalcin gene requires a binding motif for the Msx family of homeodomain proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91:12887-12891, 1994.

33.

Cheng SL, Shao JS, Charlton-Kachigian N, Loewy AP, Towler DA: Msx2 Promotes Osteogenesis and Suppresses Adipogenic Differentiation of Multipotent Mesenchymal Progenitors. J Biol Chem 278:45969-45977, 2003

34.

Harris SE, Feng JQ, Harris MA, Ghosh-Choudhury N, Wozney J, Mundy GR: Recombinant bone morphogenetic protein 2 accelerates the bone cell differentiation program and auto-regulates BMP 2 expression and BMP 2 promoter activity in fetal rat calvariae osteoblast cultures. Mol Cell Different 3:137-155, 1995.

35.

Komori T, Yagi H, Nomura S, Yamaguchi A, Sasaki K, Deguchi K, Shimizu Y, Bronson RT, Gao Y-H, Inada M: Targeted Disruption of Cbfal Results in a Complete Lack of Bone Formation owing to Maturational Arrest of Osteoblasts. Cell 89:755-764, 1997.

36.

Li, X., Yang, H-Y., and Giachelli, C. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification ofvascular smooth muscle cells. 2007. Tipo de ref.: trabajo no publicado.

37.

Asahina I, Sampath TK, Hauschka PV: Human osteogenic protein-1 induces chondroblastic, osteoblastic, and/or adipocytic differentiation of clonal murine target cells. Exp Cell Res 222:38-47, 1996.

38.

Piscione TD, Yager TD, Gupta IR, Grinfeld B, Pei Y, Attisano L, Wrana JL, Rosenblum ND: BMP-2 and OP-1 exert direct and opposite effects on renal branching morphogenesis. Am J Phys (Renal) 273:F961-F975, 1997.

39.

Piscione TD, Phan T, Rosenblum ND: BMP7 controls collecting tubule cell proliferation and apoptosis via Smadldependent and -independent pathways. Am J Physiol Renal Physiol 280:F19-F33, 2001.

40.

Macias-Silva M, Hoodless PA, Tang SJ, Buchwald M, Wrana JL: Specific Activation of Smadl Signaling Pathways by the BMP7 Type I Receptor, ALK2. J Biol Chem 273:25628-25636, 1998.

41.

Ducy P, Karsenty G: Two distinct osteoblast-specific cis acting elements control expression of a mouse osteocalcin gene. Mol Cell Biol 15:1858-1869, 1995.

42.

Phan O, Ivanovski O, Nguyen-Khoa T, Mothu N, Angulo J, Westenfeld R, Ketteler M, Meert N, Maizel J, Nikolov IG, Vanholder R, Lacour B, Drueke TB, Massy ZA: Sevelamer Prevents Uremia-Enhanced Atherosclerosis Progression in Apolipoprotein E-Deficient Mice. Circulation 112:2875-2882, 2005.

43.

Tamagaki K, Yuan Q, Ohkawa H, Imazeki I, Moriguchi Y, Imai N, Sasaki S, Takeda K, Fukagawa M: Severe hyperparathyroidism with bone abnormalities and metastatic calcification in rats with adenine-induced uraemia. Nephrol Dial Transplant 21:651-659, 2006.

44.

Surendran K, Schiavi S, Hruska KA: Wnt-dependent-b-catenin signaling is activated after unilateral ureteral obstruction, and recombinant secreted frizzled-related protein 4 alters the progression of renal fibrosis. J Am Soc Neph 16:2373-2384, 2005.

45.

Chen NX, Moe SM: Vascular calcification in chronic kidney disease. Sem Nephrol 24:61 -68, 2004.

46.

Doherty TM, Uzui H, Fitzpatrick LA, Tripathi PV, Dunstan CR, Asotra K, Rajavashisth TB: Rationale for the role of osteoclast-like cells in arterial calcification. FASEB J 16:577-582, 2002.

47.

Koga T, Matsui Y, Asagiri M, Kodama T, De Crombrugghe B, Nakashima K, Takayanagi H: NFAT and Osterix cooperatively regulate bone formation. Nature Medicine 11:880-885, 2005.

48.

Beck GR, Jr., Zerler B, Moran E: Phosphate is a specific signal for induction of osteopontin gene expression. Proc Natl Acad Sci 97:8352-8357, 2000.

49.

Biber J, Gisler SM, Hernando N, Wagner CA, Murer H: PDZ interactions and proximal tubular phosphate reabsorption. Am J Physiol Renal Physiol 287:871-5, 2004.

50.

Chertow GM, Burke SK, Raggi P: Sevelamer attenuates the progression of coronary and aortic calcification in hemodialysis patients. Kidney Int 62:245-252, 2002.

51.

Block GA, Spiegel DM, Ehrlich J, Mehta R, Lindbergh J, Dreisbach A, Raggi P: Effects of sevelamer and calcium on coronary artery calcification in patients new to hemodialysis. Kidney Int 68:1815-1824, 2005.

52.

Moe SM, Reslerova M, Ketteler M, O’Neill K, Duan D, Koczman J, Westenfeld R, Jahnen-Dechent W, Chen NX: Role of calcification inhibitors in the pathogenesis of vascular calcification in chronic kidney disease (CKD). Kidney Int 67:2295-2304, 2005.

53.

Leidenfrost JE, Khan MF, Boc KP, Villa BR, Collins ET, Parks WC, Abendschein DR, Choi ET. A model of primary atherosclerosis and post-angioplasty restenosis in mice. Am J Pathol. 2003; 163(2):773-778.

54.

Shenoy S, Miller A, Petersen F, Kirsch WM, Konkin T, Kim P, Dickson C, Schild AF, Stewart L, Reyes M, Anton L, Woodward RS. A multicenter study of permanent hemodialysis access patency: beneficial effect of clipped vascular anastomotic technique. J Vase Surg. 2003; 38 (2): 229-235.

55.

Lee H, Manns B, Taub K, Ghali WA, Dean S, Johnson D, Donaldson C. Cost analysis of ongoing care of patients with end-stage renal disease: the impact of dialysis modality and dialysis access. Am J Kidney Dis. 2002;40(3):611

622.

56.

Mattana J, Effiong C, Kapasi A, Singhal PC. Leukocyte-polytetrafluoroethylene interaction enhances proliferation of vascular smooth muscle cells via tumor necrosis factor-alpha secretion. Kidney Int. 1997;52(6):1478-1485.

57.

Ezzahiri R, Lemson MS, Kitslaar PJ, Leunissen KM, Tordoir JH. Haemodialysis vascular access and fistula surveillance methods in The Netherlands. Nephrol. Dial. Transplant. 1999; 14 (9): 2110-2115.

58.

Cinat ME, Hopkins J, Wilson SE. A prospective evaluation of PTFE graft patency and surveillance techniques in hemodialysis access. Ann Vase Surg. 1999; 13(2): 191-198.

59.

Tordoir JH, Hofstra L, Leunissen KM, Kitslaar PJ. Early experience with stretch polytetrafluoroethylene grafts for haemodialysis access surgery: results of a prospective randomised study. Eur J Vase Endovasc Surg. 1995; 9 (3): 305-309.

60.

Roy-Chaudhury P, Sukhatme VP, Cheung AK. Hemodialysis vascular access dysfunction: a cellular and molecular viewpoint. J Am Soc Nephrol. 2006; 17 (4): 1112-1127.

61.

Nikkari ST, Clowes AW. Restenosis after vascular reconstruction. Ann Med. 1994; 26 (2): 95-100.

62.

Mathew, S, Geurs, S y Hruska, KA. Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) inhibits vascular calcification (VC) by

5 stimulating the contractile vascular smooth muscle cell (VSMC) phenotype. J Am Soc Nephrol., 2005 16:52a (Resumen).

Listado de secuencias

<110> STRYKER CORPORATION 10

<120> PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS VASCULAR

<130> Documento 003443.0096.WO1

15 <140>

<141>

<150> 61/028.499

<151> 20

<160> 68

<170> PatentIn versión 3.5

25 <210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 1

<210>2

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

10 <210>3

<211> 139

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 3

<210>4

<211> 430

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 4

<210>5

<211> 139

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

10 <210>6

<211> 139

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 6

5 <210> 7

<211> 588

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

10 <400> 7

<210> 8

<211> 360

<212> PRT

<213> Xenopus sp.

<400> 8

<210> 9

<211> 438

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 9

<210> 10

<211> 396

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 408

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 372

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 455

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

<400> 14

<210> 15

<211> 454

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15 <210> 16

<211> 513

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 1878

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 1872

<212> ADN

<213> Mus sp.

<400> 18

<210> 19

<211> 430

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 19

<210> 20

<211> 1842

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210>21

<211> 402

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 1917

<212> ADN

<213> Mus sp.

<400> 22 <210> 23

<211> 399

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 23

<210> 24

<211> 97

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: p�ptido sintético"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> /reemplazar="Gln"

<220>

<221> caract_misc

<222> (6)..(6)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)..(8)

<223> /reemplazar="Val"

<220>

<221> caract_misc

<222> (8)..(8)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18)..(18)

<223> /reemplazar="Lys"

<220>

<221> caract_misc

<222> (18)..(18)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (23)..(23)

<223> /reemplazar="Asn" o “Phe”

<220>

<221> caract_misc

<222> (23)..(23)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (26)..(26)

<223> /reemplazar="Asp"

<220>

<221> caract_misc

<222> (26)..(26)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (30)..(30)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> caract_misc

<222> (30)..(30)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (31)..(31)

<223> /reemplazar="Leu" o "Tyr"

<220>

<221> caract_misc

<222> (31)..(31)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (33)..(33)

<223> /reemplazar="Val" o "Met"

<220>

<221> caract_misc

<222> (33)..(33)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (34)..(34)

<223> /reemplazar="Asp" o "Ala" o "Thr" o "Pro"

<220> <221> caract_misc

<222> (34)..(34)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (35)..(35)

<223> /reemplazar="Ala"

<220>

<221> caract_misc

<222> (35)..(35)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (36)..(36)

<223> /reemplazar="His"

<220>

<221> caract_misc

<222> (36)..(36)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (51)..(51)

<223> /reemplazar="Leu" o "Val"

<220>

<221> caract_misc

<222> (51)..(51)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (52)..(52)

<223> /reemplazar="Met"

<220>

<221> caract_misc

<222> (52)..(52)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (53)..(53)

<223> /reemplazar="Phe"

<220>

<221> caract_misc

<222> (53)..(53)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (55)..(55)

<223> /reemplazar="Asp"

<220>

<221> caract_misc

<222> (55)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (56)..(56)

<223> Cualquier amino�cido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (66)..(66)

<223> /reemplazar="Lys"

<220>

<221> caract_misc

<222> (66)..(66)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (67)..(67)

<223> /reemplazar="Val"

<220>

<221> caract_misc

<222> (67)..(67)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (78)..(78)

<223> Cualquier amino�cido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (88)..(88)

<223> /reemplazar="Trp"

<220>

<221> caract_misc

<222> (88)..(88)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (90)..(90)

<223> /reemplazar="Thr" o “Ala” o “Ile” <220>

<221> caract_misc

<222> (90)..(90)

5 <223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221>

VARIANTE 10 <222> (92)..(92)

<223> /reemplazar="Lys" o "Val" o "Asp" o "Gln" o "Glu"

<220>

<221>

caract_misc 15 <222> (92)..(92)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

20 <221> VARIANTE

<222> (93)..(93)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

25 <221> caract_misc

<222> (93)..(93)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

30 <400> 24

<210> 25 35 <211> 101

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: polip�ptido sintético"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> /reemplazar="Arg"

<220>

<221> caract_misc

<222> (2)..(2)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3)

<223> /reemplazar="Arg"

<220>

<221> caract_misc

<222> (3)..(3)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> /reemplazar="Gln"

<220>

<221> caract_misc

<222> (11)..(11)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (16)..(16)

<223> /reemplazar="Leu"

<220>

<221> caract_misc

<222> (16)..(16)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> /reemplazar="Val"

<220>

<221> caract_misc

<222> (19)..(19)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (23)..(23)

<223> /reemplazar="Gln"

<220>

<221> caract_misc

<222> (23)..(23)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (26)..(26)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> caract_misc

<222> (26)..(26)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (35)..(35)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> caract_misc

<222> (35)..(35)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (39)..(39)

<223> /reemplazar="Asp"

<220>

<221> caract_misc

<222> (39)..(39)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (41)..(41)

<223> /reemplazar="Cys"

<220>

<221> caract_misc

<222> (41)..(41)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220> <221> VARIANTE

<222> (50)..(50)

<223> /reemplazar="Leu"

<220>

<221> caract_misc

<222> (50)..(50)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (52)..(52)

<223> /reemplazar="Thr"

<220>

<221> caract_misc

<222> (52)..(52)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (56)..(56)

<223> /reemplazar="Leu"

<220>

<221> caract_misc

<222> (56)..(56)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (57)..(57)

<223> /reemplazar="Met"

<220>

<221> caract_misc

<222> (57)..(57)

<223> /nota=" El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (58)..(58)

<223> /reemplazar="Lys"

<220>

<221> caract_misc

<222> (58)..(58)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (60)..(60)

<223> /reemplazar="Asp" o "Asn" <220>

<221> caract_misc

<222> (60)..(60)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (61)..(61)

<223> /reemplazar="Ala" o "Val"

<220>

<221> caract_misc

<222> (61)..(61)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto a los de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (65)..(65)

<223> /reemplazar="Ala"

<220>

<221> caract_misc

<222> (65)..(65)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (71)..(71)

<223> /reemplazar="Lys"

<220>

<221> caract_misc

<222> (71)..(71)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (73)..(73)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> caract_misc

<222> (73)..(73)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (75)..(75)

<223> /reemplazar="Thr"

<220>

<221> caract_misc

<222> (75)..(75)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (80)..(80)

<223> /reemplazar='Tyr"

<220>

<221> caract_misc

<222> (80)..(80)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (82)..(82)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> caract_misc

<222> (82)..(82)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (84)..(84)

<223> /reemplazar="Asn"

<220>

<221> caract_misc

<222> (84)..(84)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (89)..(89)

<223> /reemplazar="Arg"

<220>

<221> caract_misc

<222> (89)..(89)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (91)..(91)

<223> /reemplazar="His"

<220>

<221> caract_misc

<222> (91)..(91)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (96)..(96)

<223> /reemplazar="Lys"

<220> 5 <221> caract_misc

<222> (96)..(96)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia con respecto al residuo de la anotación para dicha posición"

10 <400> 25

<210> 26

<211> 30 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen 20 <223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 26 gagaggtcca ttccaactgc tcagatgaag 30

25 <210> 27

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético" <400> 27 gtcttcactt cgagtctgat ccggagaaag 30

<210> 28

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 28 agcatgtcct ctgctcactt caacc 25

<210> 29

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 29 cgtccatgaa gttgttgccg at 22

<210> 30 <211>21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 30 tgggtggtga tccactggat c 21

<210>31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 31 ttgccttgag tcagtgcgcc 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético" <400> 32 agcccagcca agcactgtca 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 33 gagcatcgtc cccagcaaag 20

<210> 34

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 34 gaagatcgtc gacatgtaca aggg 24

<210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 35 tgcatagaat ggactggtcc tcc 23

<210> 36

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 36 gctacacaag accctgagac tgacc 25

<210> 37

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen <223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 37 tctccatctc tgctgagggg at 22

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 38 cacgacaacc gcaccatggt 20

<210> 39

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 39 tgacagtaac cacagtccca tctg 24

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 40 gctggtgaag cccttcgaga 20

<210>41

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 41 atgtggtaaa gggcgtgcg 19

<210> 42

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212> <221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 42 agttcatggc tccagtcccc 20

<210> 43

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 43 tggaggctga aaggtcactg c 21

<210> 44

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 44 agccaacact gtgcgcagct 20

<210> 45

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 45 cctgaagctc tgctgaggtg ataa 24

<210> 46

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 46 atgagagccc tcacactcct c 21

<210> 47

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 47 gccgtagaag cgccgatagg c 21

<210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 48 tcctgttcga cagtcagccg 20

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 49 tggtgaccag gcgcccaata 20

<210> 50

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 50 tcccttctca agcaccaatg gact 24

<210> 51

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 51 agctgtgaat gggcttcttc ctca 24

<210> 52

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <212>

<221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético" 5

<400> 52 tgttccagta tgactccact cacg 24

<210> 53 10 <211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<212> 15 <221> origen

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 53

gaagacacca gtagactcca cgaca 25 20

<210> 54

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <400> 54

<210> 55

<211> 102 30 <212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 55

<210> 56

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 102

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 58

<210> 59

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

10 <210> 60

<211> 102

<212> PRT

<213> Mus sp.

15 <400> 60

<210>61

<211> 102

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

<400> 61

Val Gly Cys Gly Cys Arg 100

<210> 62

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

10 <210> 63

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 63

<210> 64

<211> 103

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 102

<212> PRT

<213>Xenopus sp. 15

<400> 65

<210> 66

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 66

<210> 67

<211> 102

<212> PRT

<213> Drosophila sp. 15

<400> 67 <210> 68

<211>4 5 <212> PRT <213> Mus sp.

<400> 68 Gly Gly Pro Pro 1

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende el morf�geno PMO-7 para su uso en el tratamiento, la prevención

   o la reducción de la hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto.
2. 2. Uso del morf�geno PMO-7 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, evitar o reducir la 5 hiperplasia de la neo�ntima en un sujeto.

3. 3.

   La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en la que la hiperplasia de la neo�ntima est� asociada con anastomosis.

4. 4.

   La composición farmacéutica para el uso o el uso de la reivindicación 3, en la que la hiperplasia de la neo�ntima est� inducida por una nefropat�a crónica.

   10 5. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que el PMO-7 es PMO-7 humano que comprende la secuencia de amino�cidos de la SEC ID N.�: 2.

   *p < 0,001 frente B

   % de similitud de secuencia con el dominio de siete ciste�nas de la PO-1 humana

   Secuencia

   % de similitud % no conservativo

   hPO-1 mPO-1 hPO-2 mPO-2 PMO-5 PMO-6 Vgr-1(PT) PO-3 60A PMO-4 PMO-2 dpp UNIVINA dpp (PT) Vg-1 CDMP-1 CDMP-3 GDF-3 CDMP-2 DORSALINA GDF-1(PT) GDF-10 PMO-3b PMO-10 PMO-3 SCREW ADMP TGF-β2 GDF-1 PMO-9 NODAL Inhibina βA PMO-15

   100 100 97 97 97 66 94 91 80 90 89 87 87 86 88 85 83 83 82 79 78 78 78 78 78 77 77 73 73 73 71 71 71 0 0 3 3 3 4 6 9 10 10 11 13 13 14 14 16 17 17 18 21 22 22 22 23 23 23 24 27 28 28 29 29 29

   TGF-β3 Inhibina βB Inhibina βC TGF-β5 TGF-β1 GDF-12 GDF-11 TGF-β4 GDF-9 GDF-8 PMO-11 GDNF

   69 69 69 67 67 67 68 66 68 64 60 49 31 31 31 33 33 33 34 34 34 36 40 51

   Fig. 10

   SEC ID N.�: 1 Secuencia de amino�cidos de la PO-1 humana

   Figure 13

   SEC ID N.�: 2 Secuencia de amino�cidos del esqueleto de 6 ciste�nas conservadas de la PO-1 humana

   SEC ID N.�: 3 Secuencia de amino�cidos de la PO-1 humana de longitud completa morfog�nicamente activa

   SEC ID N.�: 4 Secuencia de amino�cidos de la PO-1 de ratón madura

   SEC ID N.�: 5 Secuencia de amino�cidos de la PO-2 humana madura SEC ID N.�: 6 Secuencia de amino�cidos de la PO-2 de ratón madura SEC ID N.�: 7 Secuencia de amino�cidos de la DPP de Drosophila

   SEC ID N.�: 8 Secuencia de amino�cidos de la VG1 de Xenopus

   SEC ID N.�: 9 Secuencia de amino�cidos de la Vgr-1 de ratón

   SEC ID N.�: 10 Secuencia de amino�cidos de la CPMO2A humana CPMO2A(fx)

   SEC ID N.�: 11 Secuencia de amino�cidos de la CPMO2B humana CPMOB(fx)

   SEC ID N.�: 12 Secuencia de amino�cidos de la PMO3 humana

   SEC ID N.�: 13 Secuencia de amino�cidos de la GDF-1 humana

   SEC ID N.�: 14 Secuencia de amino�cidos de la 60A de Drosophila

   SEC ID N.�: 15 Secuencia de amino�cidos de la PMO5 humana

   SEC ID N.�: 16 Secuencia de amino�cidos de la PMO6 humana

   SEC ID N.�: 17 Secuencia de ADNc de la PO-1 humana de longitud completa

   SEC ID N.�: 18 Secuencia de ADNc de la PO-1 de ratón de longitud completa

   SEC ID N.�: 19 Secuencia de amino�cidos de la PO-1 de ratón de longitud completa

   SEC ID N.�: 20 Secuencia de ADNc de la PO-2 humana de longitud completa

   SEC ID N.�: 21 Secuencia de amino�cidos de la PO-2 humana de longitud completa

   SEC ID N.�: 22 Secuencia de ADNc de la PO-2 de ratón de longitud completa

   SEC ID N.�: 23 Secuencia de amino�cidos de la PO-2 de ratón de longitud completa

   SEC ID N.�: 24 Secuencia genérica N.� 1