ES2465190T3

ES2465190T3 - Secuencia polinucleotídica para la inhibición de la síntesis de fosfolambano

Info

Publication number: ES2465190T3
Application number: ES07858225.1T
Authority: ES
Inventors: Henry Fechner; Jens Kurreck; Simone Prömel
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2014-06-05
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: US20100310521A1; EP1939289A1; EP2126084B1; WO2008080985A1; EP2126084A1

Abstract

Secuencia polinucletídica de ADN que comprende a. un primer elemento de secuencia que, cuando se transcribe por una ARN polimerasa, conduce a la transcripción de un ARNip basado en microARN (miARNip) y da lugar a un transcrito capaz de formar una estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por una célula de mamífero hasta un producto de ARNip capaz de degradar un ARNm en dicha célula, en el que el ARNm degradado por el producto de ARNip codifica fosfolambano, b. una secuencia promotora ligada operativamente al primer elemento de secuencia, siendo operativa dicha secuencia promotora por una ARN polimerasa de origen natural en una célula de mamífero, en la que la secuencia promotora es un promotor específico de célula de cardiomiocito, y c. una secuencia de empaquetamiento polinucleotídico de ADN derivado de virus; caracterizada porque el miARNip comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 o SEQ ID NO 003.

Description

Secuencia polinucleotídica para la inhibición de la síntesis de fosfolambano

La presente invención se refiere a reactivos que facilitan la inhibición de fosfolambano en tejido cardíaco de animales superiores. Más específicamente, la invención se refiere a secuencias polinucleotídicas capaces de regular 5 negativamente la expresión de fosfolambano en una célula de paciente, como se especifica en las reivindicaciones independientes.

La insuficiencia cardíaca y la insuficiencia cardíaca congestiva son patologías de gran importancia. Están asociadas a deficiencias en la contractilidad cardíaca y anormalidades en el tráfico de calcio intracelular.

El fosfolambano (PLB) es una proteína de membrana integral de 52 aminoácidos que forma parte en la regulación

10 de la bomba de ión de calcio en células musculares. En células musculares cardíacas, el PLB controla la bomba de ATPasa de Ca2+ del retículo sarcoendoplásmico (SERCA). La relación de PLB/SERCA influye en la contractilidad cardíaca. La expresión aumentada de SERCA y la inhibición de PLB funcionan ambas hacia una contractilidad mejorada en cardiomiocitos deteriorados. El ARNm (cds) del fosfolambano está publicado en la base de datos nucleotídica del National Center of Biotechnology Information (NCBI) como NM_002667.2.

15 Se ha mostrado que la sobreexpresión de SERCA puede restaurar la contractilidad, el tráfico de calcio y la respuesta de frecuencia en cardiomiocitos aislados (Del Monte et al., Circulation 1999, 100: 2308-2311).

Son posibles diferentes enfoques para la regulación negativa de la actividad de PLB en una célula. El documento US2004121942A1, por ejemplo, emplea la expresión de proteína PLB mutada exógena para alcanzar este efecto.

Es otro enfoque el uso de ácido ribonucleico (ARN) tal como anticodificante o ARNip para suprimir la expresión 20 génica al nivel de control de ARNm.

Esto se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/080985, que da a conocer varias moléculas de ARNip correspondientes a una porción de la secuencia de ácido nucleico de fosfolambano, que son capaces de inhibir la expresión de fosfolambano en una célula. Este documento menciona también que podría ser posible usar un vector de expresión que comprende ADN que codifica dicho ARNip, en el que el vector puede ser un vector adenovírico.

25 Puesto que el ARN no es una molécula estable que se preste fácilmente a formulación y uso farmacéutico, la aplicación directa de moléculas de ARN no es necesariamente el enfoque clínico más prometedor para aplicar ARN a la gestión de enfermedades humanas. Es un enfoque que elude la inestabilidad del ARN el uso de ribonucleótidos químicamente modificados, tales como moléculas de esqueleto de tiofosfato o restos de 2’-desoxipurina o 2’-Ometilpirimidina. Enfoques comparables durante la época anticodificante han padecido problemas de toxicidad

30 causados por las moléculas y sus productos de degradación.

Es un enfoque alternativo que evita la aplicación de moléculas de ARN transcribir el ARN en la célula del paciente a partir de módulos de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN). El ADN es más estable en muchas condiciones encontradas en el suministro de fármacos, y son conocidas diferentes tecnologías para suministrar módulos de expresión de ADN a las células de pacientes. Estas incluyen transferencia vírica, bombardeo de células mediado por

35 partículas, inyección de ADN desnudo o ADN complejado con policationes o liposomas en el tejido, y otros procedimientos conocidos en el contexto de la denominada “terapia génica”.

Se ha intentado restaurar la contractilidad de células de músculo cardíaco deterioradas in vitro mediante la inhibición de la expresión de PLB con moléculas de ARN anticodificantes expresadas a partir de vectores adenovíricos en cardiomiocitos cultivados (Eizema et al., Circulation 2000; 101; 2193-2199; y Del Monte et al., Circulation 2002; 105;

40 904-907).

Diferentes enzimas transcriben ARN a partir de ADN en una célula eucariótica, específicamente la ARN polimerasa I, II y III. La transcripción de cada polimerasa está controlada por diferentes elementos reguladores que regulan la expresión del gen asociado. Tradicionalmente, la expresión de moléculas cortas no de ARNm a partir de módulos de expresión introducidos artificialmente en células ha hecho uso de la ARN polimerasa III (Pol-III). La Pol-III sintetiza

45 ARN ribosómico de 5S y ARNt. La actividad de ARN Pol-III no está controlada de forma específica de célula. El documento US2005064489 describe promotores de Pol-III regulados por el sistema transactivador de tetraciclina. Dichos promotores condicionalmente activos ofrecen la ventaja de ser capaces de controlar el estado de actividad del transgén introducido artificialmente en un paciente; sin embargo, no ofrecen especificidad celular si se aplican al cuerpo entero de un paciente por suministro sistémico.

50 En cualquier enfoque clínico que intente regular la expresión génica, la especificidad celular o tisular es un elemento altamente deseable de control y seguridad. Por ello, serían ventajosos medios para facilitar la expresión de ARN orientado a PLB a partir de promotores específicos de célula tales como promotores de ARN polimerasa II para el control de la expresión de fosfolambano en células cardíacas.

Se ha intentado la regulación anticodificante de PLB por promotores de Pol-II expresando ARN anticodificante bajo el control del promotor de CMV o del factor natriurético auricular inducible (ANF) (Eizema et al., Circulation 2000; 101; 2193-2199).

Los intentos de regular negativamente la expresión de proteínas intracelulares mediante enfoques anticodificantes

5 no han conseguido generalmente el éxito clínico esperado por la tecnología en el momento de su implantación. Es un nuevo enfoque para regular negativamente la expresión génica intracelular el uso de las denominadas moléculas de ARN interferente pequeño (ARNip). Estas son pares de moléculas de ARN bicatenario pequeñas de típicamente 19-29 pares de bases de longitud, una de cuyas hebras es complementaria de una sección del ARNm. El ARNm diana se degrada por el complejo RISC. Las moléculas de ARNip se descubrieron originalmente en plantas

10 (Hamilton y Baulcombe, Science. 29 de oct. de 1999; 286(5441): 886), y después en células de mamífero (Elbashir et al., Nature. 24 de mayo de 2001; 411 (6836): 428-9, WO0244321).

Está estrechamente relacionado el descubrimiento de microARN o miARN. Estas son moléculas de ARN sintetizadas naturalmente a partir de genes codificados genómicamente que, tras procesamiento por actividades modificadoras del ARN celular, dan lugar a estructuras de horquilla de ARN corta con estructuras de tallo de 11 pb

15 (pares de bases). El miARN se orienta también a ARNm para degradación y es probablemente un mecanismo de control de la expresión génica en la célula.

El documento US26198825A1 muestra secuencias de ARNip que se sugiere que se orientan a la síntesis de fosfolambano.

Es un enfoque de la generación de ARNip in vivo la generación del denominado ARN de horquilla pequeño (ARNhp),

20 que es un precursor natural del ARNip. Dichas moléculas de ARNhp pueden generarse mediante la expresión de una molécula de ARN parcialmente autocomplementaria a partir de un módulo de expresión introducido en una célula eucariótica. La tecnología se revisa por McIntyre y Fanning (BMC Biotechnol. 2006; 6: 1).

Los inventores han publicado recientemente los resultados de un experimento in vitro en los que se reducen ARNm de PLB y proteína, y se aumenta la captación de Ca, en cardiomiocitos de rata recién nacida primarios cultivados por

25 ARNhp expresado a partir de constructos adenovíricos activados por promotor de polimerasa III (Fechner et al., Gene Therapy 2007, 14, 211-218).

Existen obstáculos técnicos adicionales para expresar ARNhp a partir de promotores de Pol-II. Este problema ha conducido recientemente al desarrollo de los denominados vectores generadores de miARNip (ARNip basados en microARN) que pueden usarse para activar la generación de ARNip a partir de un promotor de Pol-II (Shin et al., 30 Proc. Nat. Acad. USA 103, 13759-13764). El miARNip puede describirse como una secuencia de ARNhp embebida entre secuencias flanqueantes de microARN particulares. Esta tecnología se ha puesto recientemente a disposición por Invitrogen Inc. como el plásmido pcDNA6.2-GW/miR. Este plásmido comprende el promotor de CMV (promotor temprano inmediato de citomegalovirus) como elemento de expresión de Pol-II. El promotor de CMV activa la transcripción de polimerasa II de forma constitutiva no específica de tejido. La generación de secuencias de

35 miARNip a partir de secuencias de ARNhp no es.

Pueden emplearse diferentes vectores víricos para transferencia génica en las células de un paciente. Se han empleado retrovirus, especialmente lentivirus. La transferencia génica mediada por lentivirus puede conducir a la integración estable de un transgén en una célula no en división. Los miembros de la familia de los herpesvirus se han empleado también para transferencia génica.

40 Como se expone anteriormente, con fines de suministro sistémico a un agente que induce la expresión transgénica en un paciente, la especificidad de tejido de la expresión es altamente deseable. Son conocidos promotores de Pol-II específicos de tipo celular o tejido para diferentes tejidos. Sin embargo, es una desventaja de la amplia mayoría de estas secuencias promotoras su longitud. Las secuencias de ADN de más de cierto tamaño son difíciles o imposibles de usar para enfoques de terapia génica que hacen uso de vectores transgénicos plasmídicos o víricos,

45 ya que los últimos tienden a tolerar solo un intervalo de tamaño limitado para secuencias transgénicas.

Además, el suministro in vivo de ARNhp a partir de un promotor de polimerasa III constitutivo de un vector de AAV puede conducir a la muerte de los animales experimentales por toxicidad hepática aguda. Una evaluación de 49 vectores de AAV/ARNhp distintos, únicos en longitud y secuencia y dirigidos hacia 6 dianas, mostró que 36 dieron como resultado lesión hepática dependiente de la dosis, causando 23 en última instancia la muerte (Grimm et al.,

50 Nature, 441, 537-541).

Por tanto, sería deseable un sistema de expresión para la expresión de una molécula de ARN que pueda conducir a la regulación negativa de la expresión de fosfolambano en una célula del corazón, de manera específica de tipo celular.

Es un objetivo de la invención proporcionar un reactivo que pueda aplicarse a un paciente que padezca una afección

55 asociada a la actividad del fosfolambano, o una afección que podría beneficiarse de la reducción de la expresión de fosfolambano, en que el reactivo, tras la aplicación a un paciente, conduce a la regulación negativa de la síntesis de fosfolambano en células cardiacas del paciente de manera específica del tipo celular.

Es otro objetivo proporcionar una molécula de ARN novedosa que pueda conducir a la regulación negativa de la expresión de fosfolambano en una célula del corazón.

Estos objetivos se alcanzan por la invención como se especifica en las reivindicaciones independientes.

Según un aspecto de la invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica de ADN que comprende:

5 a. un primer elemento de secuencia que, cuando se transcribe por una ARN polimerasa, conduce a la transcripción de un ARNip basado en microARN (miARNip) y da lugar a un transcrito capaz de formar una estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por una célula de mamífero hasta un producto de ARNip capaz de degradar un ARNm en dicha célula, en el que el ARNm degradado por el producto de ARNip codifica fosfolambano,

10 b. una secuencia promotora ligada operativamente al primer elemento de secuencia, siendo operativa dicha secuencia promotora por una ARN polimerasa de origen natural en una célula de mamífero, en la que la secuencia promotora es un promotor específico de célula de cardiomiocito, y

c. una secuencia de empaquetamiento polinucleotídico de ADN derivado de virus;

en la que el miARNip comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 o SEQ ID NO 15 003.

“Autocomplementario” en el contexto de este documento significa que la molécula de ARN tiene dos tramos de secuencia que permiten el apareamiento canónico de bases en dirección 5' a 3' de un tramo de secuencia con el otro en orientación inversa, de modo que el polímero lineal de ARN puede replegarse sobre sí mismo produciendo una estructura de ARN de doble hélice. Dicha molécula de ARN de horquilla, formada por ejemplo transcribiendo

20 una secuencia de ADN transgénica con una ARN polimerasa dependiente de ADN en una célula, puede procesarse por actividades procesadoras de ARN intracelular, proporcionando una molécula de ARNip funcional capaz de regular negativamente la expresión del ARNm al que está orientada, que en caso de la presente invención es ARNm de fosfolambano.

Sorprendentemente, se ha encontrado que las secuencias de miARNip de la presente invención orientadas a

25 fosfolambano eran aproximadamente dos órdenes de magnitud más eficaces en la supresión de la expresión de PLB que los ARNhp del estado de la técnica mostrados en Fechner et al. (Gene Therapy 2007, 14, 211-218).

La estructura de horquilla de las moléculas de miARNip de la presente invención puede definirse también como que una de sus hebras hibridantes es altamente similar a una secuencia comprendida en la secuencia de ARNm de fosfolambano, cuya referencia de GeneBank se da anteriormente. La cuantificación de la similitud de secuencia es

30 bien conocida en la técnica de la biología molecular; se encuentran herramientas informáticas para la cuantificación de la similitud de secuencias, entre otros sitios, en el sitio web de EMBL-EBI en http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html. Según la invención, las secuencias hibridantes de la molécula de ARN pueden ser un 80, 85, 90, 95, 97 o 100 % similares a un tramo de secuencia en ARNm de fosfolambano, por ejemplo la secuencia de codificación de ARNm de fosfolambano, la región 5' no traducida o la región 3' no traducida.

35 Según otro aspecto de la invención, se proporciona un módulo de expresión para la expresión intracelular de un ARN inhibidor específico de fosfolambano, que puede procesarse por la célula en que se expresa, para regular negativamente la expresión de la síntesis de fosfolambano por esa célula. Dicho módulo de expresión comprende una secuencia promotora operativa en una célula de mamífero por una ARN polimerasa de mamífero y una secuencia transcrita, a la que se hace referencia también como el primer elemento de secuencia.

40 Se prefiere un módulo de expresión en que la secuencia promotora operativa en una célula de mamífero sea un promotor de ARN polimerasa II dependiente de ADN específico de tejido. Son ejemplos de dichos promotores preferidos las secuencias SEQ ID 7, 8 y 9. Para uso del módulo de expresión en sistemas de transferencia transgénica de capacidad limitada, tales como vectores plasmídicos y vectores de AAV, se prefieren secuencias cortas. Se prefiere especialmente el elemento promotor MLC 260, que comprende el potenciador de CMV y una

45 secuencia central específica de tejido cardíaco del promotor MLC y es solo de 850 pares de bases de largo (aprox. 600 del potenciador de CMV y aproximadamente 260 del promotor central).

La secuencia transcrita del primer elemento de secuencia comprende una secuencia de ADN que, cuando se transcribe por una ARN polimerasa en una célula, da lugar a un transcrito capaz de formar una estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por la célula, proporcionando un producto de

50 ARNip. Dicho producto de ARNip es típicamente un ARN bicatenario de 19 a 29 pares de bases de largo con superposiciones cortas en el extremo 3', capaz de degradar un ARNm en dicha célula. Según la invención, la estructura de horquilla y el producto de ARNip resultante son al menos parcialmente complementarios con una sección de la secuencia de ARNm de fosfolambano sintetizado en esa célula.

Específicamente, según un aspecto de la invención, una secuencia transcrita o primer elemento de secuencia conduce a la transcripción de una molécula de ARNip basado en microARN (miARNip) que puede procesarse por la célula, proporcionando una molécula de ARNip orientada a ARNm de PLB.

En el contexto de la presente invención, “un promotor que es operativo por una ARN polimerasa” significa que la

5 presencia de la secuencia promotora caracterizada como “un promotor” es conocido que conduce al agrupamiento de los factores celulares necesarios y al agrupamiento e iniciación de la transcripción de dicha ARN polimerasa. “Ligado operativamente” en el contexto de esta memoria descriptiva significa que la secuencia promotora y la secuencia transcrita están ligadas de tal modo que el promotor, en condiciones fisiológicas, conducirá a la transcripción de la secuencia transcrita. Por ello, un “promotor de Pol-II” en condiciones fisiológicas es capaz de

10 agrupar la ARN polimerasa II en la secuencia transcrita ligada operativamente al mismo, y conduce a la iniciación de la transcripción de esa secuencia transcrita.

Si el promotor es un promotor de Pol-II, la secuencia transcrita comprende preferiblemente elementos de secuencia adicionales que faciliten el procesamiento del transcrito derivado de Pol-II inicial por el aparato de corte y empalme de la célula, proporcionando una molécula de miARNip que es capaz de orientarse a ARNm de PLB y regular

15 negativamente la expresión de PLB en una célula en que se transcriba el módulo de expresión.

Como se ha mencionado, las secuencias de miARNip que se han empleado según la invención son SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 y SEQ ID NO 003. Las bases de nº 6 a 26 de estas secuencias comprenden, cuando se transcriben a ARN, la parte del ARN de horquilla pequeño que formará después el ARNip maduro dirigido contra el ARNm diana. Estas secuencias están subrayadas a continuación, con su parte complementaria respectiva en el extremo 3' en

20 negrita:

Son conocidas secuencias que sirven como señales para dirigir el procesamiento de moléculas de ARN por el

25 aparato de corte y empalme de la célula. El corte y empalme está catalizado por el espliceosoma, que es un gran complejo de ARN-proteína compuesto por 5 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas presentes en células eucarióticas. Son ejemplos de elementos de secuencia adicionales que facilitan el procesamiento del transcrito derivado de Pol-II inicial por el aparato de procesamiento y corte y empalme de la célula, proporcionando una molécula de ARNip madura, los sitios donantes de corte y empalme y aceptores de corte y empalme. Son ejemplos

30 de elementos de secuencia adicionales que facilitan el procesamiento del transcrito derivado de Pol-II inicial, y que se han empleado exitosamente en el contexto de la presente invención, la región flanqueante 5' miR (SEQ ID NO 004) y la región flanqueante 3’ miR (SEQ ID NO 005). Se hace referencia a las secuencias transcritas que comprenden un elemento generador de ARNhp y sitios donantes y aceptores de corte y empalme para la liberación de ese elemento transcrito como miARNip (de micro-ARNip) en el contexto de la presente invención.

35 SEQ ID NO 004: ctggaggctt gctgaaggct gtatgctg

SEQ ID NO 005: aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggccc

Se muestra en la SEQ ID NO 006 una secuencia transcrita que comprende una secuencia de iniciación de la transcripción para Pol-II y la región transcrita (la hebra +), incluyendo sitios donantes y aceptores de corte y empalme y el elemento de ARNhp.

40 Según un aspecto de la invención, la transcripción de la secuencia transcrita puede efectuarse por un promotor de ARN polimerasa II (Pol-II). Es uno de dichos promotores el promotor temprano inmediato de citomegalovirus, al que se hace referencia comúnmente como promotor de CMV. Son otros promotores empleados comúnmente el promotor de virus de simio 40 (SV40), el promotor de virus de sarcoma de Rous (RSV) y el promotor EF1α. Según un aspecto de la invención, se prefiere un promotor de Pol-II que sea específico de cardiomiocitos. “Específico” en el contexto

45 de la presente invención significa que se transcribe en cardiomiocitos un módulo de expresión, que comprende el promotor que es específico de cardiomiocitos y el primer elemento de secuencia ligado operativamente al mismo, a una velocidad significativamente más rápida que en otros tipos celulares. Son un ejemplo de promotor específico de cardiomiocito las secuencias MLC1500 (SEQ ID No 007) MLC800 (SEQ ID No 008) (Muller et al. 2006, Cardiovascular research, 70, 70-78) y MLC260 (SEQ ID No 009).

dicho promotor condicional el sistema transactivador de tetraciclina revisado por Gossen y Bujard (Ann. Rev. Genet. 2002, 36: 153-73). En este sistema de "tet-on", la expresión génica se regula por la presencia de tetraciclina o doxiciclina mediante unión de la proteína transactivadora de tetraciclina a elementos de respuesta de tetraciclina en el ADN. Un promotor condicional en el contexto de la presente memoria descriptiva significará un promotor cuya

5 actividad puede aumentarse significativamente modificando directa o indirectamente un parámetro extrínseco a la célula en que el promotor es activo. Son ejemplos no limitantes de dichos promotores condicionales los promotores con diferentes actividades dependientes de la concentración de un fármaco de molécula pequeña, o dependientes de la temperatura de la célula o de la fuerza iónica de un ión específico en la célula o sus alrededores.

Se muestra en la SEQ ID NO 010 una secuencia que comprende el promotor condicional del sistema tet-on y una

10 secuencia transcrita que proporciona una molécula de miARNiphp de PLB y que comprende el constructo del promotor TRE-tight1 (Sipo et al. 2006, JMM, 84: 215-225). En la misma, las bases 1-252 comprenden el sitio TetO7, las bases 253-314 son la secuencia promotora mínima de CMV, siendo la base 306 (timina) el presunto sitio de inicio de la transcripción, y de la base 394 a 453 el miARNiphph de PLB flanqueado por la región flanqueante 3' miR, la región flanqueante 5' miR y la secuencia de poliadenilación de SV40.

15 De forma similar, puede emplearse un promotor TRE-tight2 como se describe por Sipo et al. (como se cita anteriormente).

Según otro aspecto de la invención, el módulo de expresión se administra a un paciente en forma de un vector vírico. Según un aspecto de la invención, se usa un adenovirus para mediar la transferencia del módulo de expresión para la expresión de una molécula de ARN para regulación negativa de PLB en una célula. Se prefiere un

20 adenovirus de tipo 5. Ciertos subtipos de adenovirus son conocidos por exhibir tropismo por células de músculo cardíaco y pueden emplearse por tanto para transferir el módulo de expresión de la invención a cardiomiocitos. El adenovirus de tipo 5 es un ejemplo de virus que exhibe tropismo a tejido cardíaco.

Son conocidos en la materia los procedimientos y protocolos experimentales para producir viriones adenovíricos que comprenden un módulo de expresión con fines terapéuticos o de vacunación (para una revisión actual, véase 25 Bangari y Mittal, Curr. Gene Ther. abril de 2006; 6(2): 215-26). Los vectores adenovíricos pueden producirse mediante transfección de un ADN adenovírico en una línea celular auxiliar (por ejemplo, HEK 293) que exprese proteínas adenovíricas (por ejemplo, E1A, E1B) que no puedan expresarse a partir del genoma adenovírico, ya que los genes respectivos se eliminaron del genoma. Un vector adenovírico en el contexto de la presente memoria descriptiva significa por tanto una secuencia de ADN que comprende un módulo de expresión como se especifica

30 anteriormente, que comprende los siguientes elementos:

! un promotor operativo en una célula de miocardio de mamífero,

! un primer elemento de secuencia transcrito que comprende una secuencia generadora de un miARNip que, tras transcripción, dará lugar a un transcrito de ARN que puede procesarse por el aparato de procesamiento de ARN celular hasta un ARNip dirigido contra ARNm de PLB, y

35 ! las secuencias derivadas de virus necesarias para efectuar el empaquetamiento de la secuencia de ADN en partículas de virión por una línea celular de empaquetamiento adecuada para la producción de viriones adenovíricos defectivos de replicación que contienen el módulo de expresión.

Según otro aspecto de la invención, se usa un virus adenoasociado (AAV) para mediar la transferencia del módulo de expresión para la expresión de una molécula de ARN para regulación negativa de PLB en una célula. Los AAV

40 son no patogénicos y conducen a pocas o ninguna reacción inmunitaria contra ellos. La expresión de transgenes de expresión portados por AAV es estable durante un largo periodo de tiempo.

Ciertos subtipos de AAV son conocidos por exhibir tropismo por células de músculo cardíaco y pueden emplearse por tanto para transferir el módulo de expresión de la invención a cardiomiocitos. AAV9 es un ejemplo de un virus que exhibe tropismo a tejido cardíaco.

45 Los vectores AAV9 se producen mediante procedimientos de cotransfección. El genoma vectorial comprende las secuencias de ITR (repetición terminal inversa) de AAV2 o secuencias de ITR de otros AAV adyacentes al módulo de expresión para la expresión de los transgenes (plásmido: UFCMV-MLC800-Intron-misiPLBh-pA). El genoma de AAV se empaqueta en una cápsida de AAV9 (plásmido: p5E18-VD2/9; contiene el gen AAV-Rep2 + el gen CAP9 de AAV, un amable obsequio del Dr. Wilson, University of Pennsylvania, EE.UU.). Las proteínas adicionales esenciales

50 para el empaquetamiento derivan del plásmido 3 (por ejemplo, E1A, ARN-AV de adenovirus). Las partículas vectoriales de AAV se producen en células de cultivo y se liberan del cultivo celular mediante tres ciclos de congelación/descongelación y centrifugación en gradiente de cesio (Grimm: Methods (2002), 28, 146-157). Se muestra un ejemplo de genoma vectorial de AAV que contiene el módulo de expresión de miARNiphp de PLB regulado por tetraciclina en la SEQ ID NO 011 (para el diagrama vectorial, véase la Fig. 1).

55 Pueden producirse AAV como vectores de AAV monocatenarios o autocomplementarios (ac). Un vector de AAVac contiene una pequeña mutación en un sitio de resolución terminal, haciendo posible empaquetar un genoma

vectorial dimérico. Se muestra un ejemplo de un vector de AAVac que comprende un constructo de miARNip de la invención capaz de regular negativamente el ARNm de fosfolambano en la SEQ ID NO 012 (AAVac-CMV800 misiPLBh)

Según una realización preferida, se muestra en la SEQ ID NO 011 un módulo de expresión que comprende un

5 miARNip para la generación de una molécula de ARNip orientada a la expresión de PLB, bajo el control de un sistema promotor condicional tet-on y que comprende elementos de secuencia de empaquetamiento para empaquetar el módulo de expresión en un vector de AAV.

Según aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un virión de virus adenoasociado que comprende el módulo de expresión del párrafo anterior. Preferiblemente, este virión es un virión de AAV de tipo 9 (AAV9). De 10 forma similar, se proporciona una composición para el tratamiento de cardiomiopatía que comprende un módulo de expresión como se da a conocer en el párrafo anterior, o un virión como se da a conocer en este párrafo. Dicho virión puede obtenerse cotransfectando un módulo de expresión adecuado como el módulo de expresión del párrafo anterior o, específicamente, un módulo de expresión como se ejemplifica por la SEQ ID NO 011, en una línea celular adecuada, junto con un plásmido que contiene los elementos para empaquetar el módulo de expresión en viriones

15 de AAV9.

Son conocidos en la materia los procedimientos y protocolos experimentales para producir viriones de virus adenoasociados que comprenden un módulo de expresión con fines terapéuticos o de vacunación (Grimm, Methods, 28, 146-157). Un vector de AAV en el contexto de la presente memoria descriptiva significa por tanto una secuencia de ADN que comprende un módulo de expresión como se especifica anteriormente, que comprende un promotor

20 operativo en una célula de miocardio de mamífero, una secuencia transcrita que comprende un transcrito de ARN generador de miARNip capaz de dar lugar a un ARNip dirigido contra ARNm de PLB, y las secuencias derivadas de virus adenoasociado necesarias para efectuar el empaquetamiento de la secuencia de ADN en una línea celular de empaquetamiento adecuada para la producción de partículas víricas de AAV que contienen el módulo de expresión.

Según aun otro aspecto de la presente invención, se proporciona un promotor condicional mejorado para uso en un

25 módulo de expresión que controla la transcripción de ARN de horquilla pequeño que puede procesarse hasta ARNip en la célula. El sistema tet-on actualmente en uso consiste en un promotor de CMV que activa la expresión de una proteína transactivadora de tetraciclina recombinante (rtTA), que a su vez se une a elementos de respuesta a tetraciclina (TRE) más adelante en la misma hebra de ADN, conduciendo a la expresión de una secuencia transcrita bajo el control de TRE. En teoría, la transcripción de la secuencia transcrita procede solo cuando está presente

30 tetraciclina o doxiciclina. Sin embargo, el sistema padece, por experiencia, de expresión constitutiva en ausencia del fármaco inductor, probablemente debido a que el promotor de CMV muy fuerte “lee” toda la secuencia más adelante y produce un transcrito que incluye la secuencia generadora de miARNip más adelante, conduciendo por tanto a la producción de miARNip a partir del promotor de CMV en lugar de elementos TRE controlados por fármaco. Por otro lado, la inespecificidad del elemento TRE puede inhibirse por el reemplazo del promotor mínimo de CMV (CMVmin)

35 por otro promotor no inespecífico tal como tight2 (véanse anteriormente los detalles de secuencia y datos de secuencia contenidos en la presente memoria), pero también mediante el uso de un silenciador transcripcional controlado por tetraciclina (tTS) que se une a TetO7 y reprime CMVmin (Fechner et al. 2003, Gene Therapy, 2003, 10, 1680-1690).

Según la invención, este problema puede evitarse intercambiando el promotor de CMV que activa la expresión de la 40 proteína rtTA por un promotor menos activo específico de célula tal como MLC260 (SEQ ID NO 009).

Según otra realización preferida, se proporciona un módulo de expresión que comprende un elemento transcrito para la generación de una molécula de miARNip orientada a la expresión de PLB, bajo el control de un promotor especifico de cardiomiocitos en un vector de empaquetamiento de AAV.

Un vector de AAV en el contexto de la presente memoria descriptiva es la realización preferida de la invención.

45 Comprende una secuencia de ADN, una secuencia polinucleotídica como se especifica anteriormente que comprende los siguientes elementos:

! un promotor operativo en una célula de miocardio de mamífero, preferiblemente un promotor específico de miocardio, más preferiblemente un promotor condicional específico de miocardio tal como el sistema tet-on bajo el control del promotor MLC260,

50 ! un primer elemento de secuencia transcrito que comprende una secuencia generadora de miARNip que, tras la transcripción, dará lugar a un transcrito de ARN que puede procesarse por el aparato de procesamiento de ARN celular hasta un ARNip dirigido contra ARNm de PLB, y

! las secuencias derivadas de virus necesarias para efectuar el empaquetamiento de la secuencia de ADN en partículas de virión por una línea celular de empaquetamiento adecuada para la producción de viriones de 55 AAV defectivos de replicación, preferiblemente viriones de AAV9, que contienen el módulo de expresión.

Como alternativa según aún otra realización de la invención, el módulo de expresión para la expresión de una molécula de ARN para regulación negativa de PLB en una célula puede aplicarse al paciente como ADN desnudo o como ADN en asociación con un agente de transferencia no vírico, por ejemplo encapsulado en liposomas o en asociación con reactivos de poliamina tales como polietilenimina. Los módulos de expresión en asociación con un

5 virus, con un agente de transferencia no vírico o como ADN desnudo, pueden aplicarse mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, transferencia génica mediada por partícula o cualquier otro procedimiento de transferencia adecuado.

Según aún otro aspecto de la presente invención, puede combinarse un constructo de expresión que expresa un constructo de ARN inhibidor tal como se describe anteriormente con un constructo de expresión que facilite una

10 expresión aumentada de SERCA. Los procedimientos para expresar polipéptidos en células humanas son bien conocidos en la materia, e incluyen los procedimientos de transferencia vírica, liposómica y de ADN desnudo discutidos anteriormente. El ARNm puede expresarse a partir de secuencias de codificación de SERCA bajo el control de promotores de Pol-II tales como promotores de CMV o inducibles o específicos de célula, como se discute anteriormente. El ARNm de SERCA está publicado como la entrada a GeneBank NM_170665.

15 Según el aspecto anteriormente mencionado de la invención, puede localizarse un constructo de expresión que codifica SERCA en la misma secuencia polinucleotídica que el constructo que conduce a la regulación negativa de fosfolambano. Puede estar también separado del último y empaquetado en el mismo o distintos viriones, o asociado con partículas liposómicas o catiónicas junto con el constructo generador de ARNhp específico de fosfolambano.

Los pacientes en el contexto de esta invención pueden ser seres humanos, sin embargo es evidente que la 20 invención puede aplicarse también a animales superiores tales como perros o caballos, así como primates.

Según otro aspecto de la invención, la secuencia de SEQ ID NO 009 puede usarse para activar la transcripción de cualquier transgén, por ejemplo un gen terapéutico tal como SERCA, un constructo de ARN o cualquier otra secuencia transcrita de forma específica de célula cardíaca.

La Fig. 1 muestra un diagrama vectorial de un vector plasmídico para empaquetamiento en viriones de AAV, que

25 contiene un módulo de expresión que comprende un promotor condicional especifico de célula cardíaca (tet-on) y un constructo de miARNip orientado a ARNm de fosfolambano. La secuencia del vector se da en la SEQ ID NO 011.

La Fig. 2 muestra un diagrama vectorial de un vector plasmídico para empaquetamiento en viriones de AAV, que contiene un módulo de expresión que comprende un promotor específico de célula cardíaca y un constructo de miARNip orientado a ARNm de fosfolambano. La secuencia del vector se da en la SEQ ID NO 012.

30 La Fig. 3 muestra los resultados experimentales de la expresión de ARNhp frente a ARNm de fosfolambano en células que expresan un constructo de fusión de fosfolambano-GFP. Específicamente, las Fig. 3 a y b muestran los resultados de transferencia Western, la Fig. 3c muestra la eficacia de inhibición de la expresión como relaciones de la evaluación densitométrica de las transferencias Western.

La Fig. 4 muestra transferencias Northern con transcritos de ARN radiactivos transferidos frente a ARNm de PLB de

35 células de miocardio (véase el ejemplo 2). Carriles 1-4: control positivo, ARNhp adenovírico anti-PLB transcrito a partir de un promotor U6 como se publicó anteriormente (Fechner et al. 2006 “Gene Therapy. Highly efficient and specific modulation of cardiac calcium homeostastis by adenovector-derived short hairpin RNA targeting PLB”. DEU: 10.1038); carriles 1,2: cardiomiocitos de rata recién nacida infectados con partículas de AdV purificadas por gradiente de cloruro de cesio que expresan ARNhp de PLB de rata a partir de U6 (promotor de polimerasa III);

40 carriles 3, 4: cardiomiocitos de rata recién nacida infectados con un lisado de células HEK 293T que contiene partículas de AdV que expresan ARNhp de PLB de rata a partir de un promotor de polimerasa III; carriles 5-8: cardiomiocitos de rata recién nacida infectados con un lisado de células HEK 293T con partículas de AdV que expresan miARNiphp de PLB de rata con y sin doxiciclina; carriles 9-12: control negativo, cardiomiocitos de rata recién nacida infectados con un lisado de células HEK 293T con partículas de AdV que expresan ARNhp

45 desordenado con y sin doxiciclina; carriles 13, 14: constructo de cardiomiocitos de rata recién nacida (no tratado) con y sin doxiciclina; carriles 9-12: control negativo (vector sin constructo de miARNip).

La Fig. 5 muestra los resultados de un experimento de desactivación génica de la expresión de ARNm de PLB por suministro de miPLBip de rata mediado por AAVac (vector scAAV2.6ac) en miocitos cardíacos de rata recién nacida. El panel superior muestra los resultados 5 días después de la transducción del vector (p.t.), el panel inferior los 50 resultados 10 días p.t. Tres carriles muestran cada uno las transferencias Northern de células no tratadas, células tratadas con scAAV2.6-beta-shPLBr (carriles 4-6), células tratadas con scAAV2.6-CMV-misiPLBr (carriles 7-9) y células tratadas con scAAV2.6-MLC260-misiPLBr (carriles 10-12). Los carriles 1-3 son células de control no tratadas.

Ejemplos

Ejemplo 1: La expresión de miARNip regula negativamente la expresión de PLB humano en células cos7.

55 Se cotransfectaron células cos7 con un plásmido que expresa un transcrito de fusión GFP-PLB humano (Fechner et al. 2006 “Gene Therapy. Highly efficient and specific modulation of cardiac calcium homeostastis by adenovector

derived short hairpin RNA targeting PLB”. DEU: 10.1038). Se recogieron las células 48 h después y se analizó por análisis de transferencia Western la expresión de GFP. Todos los miARNiphp de PLB humanos exhibieron una expresión de GFP regulada negativamente de manera dependiente de la dosis, indicando que la expresión del constructo de fusión se silenciaba por el constructo de miARNiphp de PLB. Véase la Fig. 3.

5 Ejemplo 2: Desactivación génica de PLB mediada por adenovirus mediante la expresión de miARNiphp de PLB

Se transdujeron cardiomiocitos de rata recién nacida con los respectivos vectores adenovíricos o lisado celular de HEK293 que contenía partículas adenovíricas durante 2 h, se reemplazó el medio y se añadió medio reciente. Se aisló el ARN total 4 días después y se investigó la expresión de ARNm de PLB por transferencia Northern. Se dan 10 los resultados (transferencia Northern) en la Fig. 4: los vectores adenovíricos que expresan ARNhp de PLB de rata suprimían fuertemente la expresión de ARNm de PLB. Se encontró una eficacia de silenciamiento similar con el vector de expresión de miARNiphp de PLB R4-misiPLBr-SV40. Sin embargo, se observó silenciamiento de PLB en presencia y ausencia de doxiciclina (Dox), indicando una probable inespecificidad o agotamiento de polimerasa a partir del promotor de CMV previo. Se usaron vectores adenovíricos que expresan un miARNip de control (R4

15 misineg-SV40) como control.

Se observa un experimento similar en la Fig. 5: se produjeron vectores de AAV autocomplementarios (ac) que expresan ARNhp de PLB (acAAV2.6-PLBr) en células 393T mediante cotransfección de plásmidos lanzadera de AAVac derivados de AAV2 y un plásmido de empaquetamiento de AAV6. Se liberaron los vectores recién generados mediante tres ciclos de congelación-descongelación y se limpiaron por centrifugación en gradiente de iodixanol. Se

20 determinó la concentración del vector por transferencia Southern.

En paralelo, se construyeron nuevos vectores scAAV2.6 que expresan miPLBipr. Estos vectores contienen el promotor específico de corazón MLC260 o CMV para la transcripción de miPLBip (scAAV2.6 CMV-misiPLBr y scAAV2.6 MLC-misiPLBr, resp.). Los vectores diferentes de scAAB2.6-shPLBr se liberaron mediante tres ciclos de congelación/descongelación. Después de la sedimentación del lisado celular bruto, se usó directamente el

25 sobrenadante que contenía vector para la transducción de miocitos cardíacos de rata recién nacida.

Se aislaron miocitos cardíacos de rata recién nacida y se cultivaron durante 48 h. Se infectaron las células con 5000 genomas vectoriales por célula (scAAV2.6-shPLBr) y 500 ∀l/pocillo (1,2 millones de células) de scAAV2.6 CMVmisiPLBr y scAAV2.6 MLC-misiPLBr, resp. durante 24 h. Se aisló el ARN 5 y 10 días después y se determinó la expresión de ARNm de PLB por transferencia Northern.

30 Resultados: Los vectores de AAV que expresan miPLBip eran capaces de desactivar génicamente la expresión de ARNm de PLB (hibridación por transferencia Northern, Fig. 5) 5 y 10 días después de la transducción. La eficacia de miPLBipr activado por ambos promotores CMV y MLC era mayor que para PLBhpr activado por el promotor U6 en scAAV2.6-shPLBr (que era capaz de silenciar la expresión de PLB en experimentos publicados, véase Fechner et al., ibid.).

35 Conclusión: Puede expresarse miPLBipr a partir de promotores de polimerasa II (CMV y MLC) de manera específica de tejido (MLC) y es más eficaz que ARNhp de PLB en la desactivación génica de PLB.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Charité Universitätsmedizin Berlin Freie Universität Berlin

<120> Secuencia polipeptídica para la inhibición de la síntesis de fosfolambano

40 <130> IPA135WO

<160> 13

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 64

45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

9 30 <210> 6

<210>: 2

<211>: 64

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<400>: 2

<210>: 3

<211>: 64

10: <212> ADN

<213>: Homo sapiens

<400>: 3

<210>: 4

15: <211> 28

<212>: ADN

<213>: artificial

<220>

<223>: región de consenso flanqueante 5' de la secuencia de microARN en el transcrito del que se libera el miARN

20: <400> 4

<210>: 5

<211>: 45

<212>: ADN

25: <213> artificial

<220>

<223>: región de consenso flanqueante 3' de la secuencia de microARN en el transcrito del que se libera miARN

<400>: 5

<211> 422

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Una secuencia transcrita que comprende una secuencia de iniciación de la transcripción de Pol-II y la región transcrita (la hebra +) incluyendo los sitios donante y aceptores de corte y empalme y el elemento de ARNhp

<400> 6

<210>: 7

<211>: 2093

10: <212> ADN

<213>: Homo sapiens

<400>: 7

<210>: 8

<211>: 1331

5: <212> <213> <400> ADN Homo sapiens 8

12

<210>: 9

<211>: 827

<212>: ADN

5: <213> artificial

<220>

<223>: longitud mínima del promotor específico de tejido cardiaco

<400>: 9

<210> 10

<211> 728 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Constructo del promotor TRE-Tight1 (Sipo et al. 2006, JMM, 84: 215-225) 1-252: TetO7; 253 -314: CMVmin;

(t) 306: presunto sitio de inicio transcripcional; 394 -453: miARNiph de PLB; subrayado, cursiva, 5’ 10 <400> 10

<210>: 11

<211>: 6535

<212>: ADN

5: <213> artificial

<220>

<223>: UFCMV-MLC800-Intron-misiPLBh-pA que comprende el CMV mínimo, micro-ITR de AAV SV40 pA anti-PLB

<400>: 11

<210>: 12

<211>: 4922

<212>: ADN

5: <213> artificial

<220>

<223>: promotor específico de corazón AAV2 MLC 800 SV40 pA

<400>: 12

<210>: 13

<211>: 281

<212>: ADN

5: <213> promotor artificial tight 2

<220>

<223>: secuencia de promotor artificial

<400>: 13

Claims

REIVINDICACIONES

1. Secuencia polinucletídica de ADN que comprende

a. un primer elemento de secuencia que, cuando se transcribe por una ARN polimerasa, conduce a la transcripción de un ARNip basado en microARN (miARNip) y da lugar a un transcrito capaz de formar una

5 estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por una célula de mamífero hasta un producto de ARNip capaz de degradar un ARNm en dicha célula, en el que el ARNm degradado por el producto de ARNip codifica fosfolambano,

b. una secuencia promotora ligada operativamente al primer elemento de secuencia, siendo operativa dicha

secuencia promotora por una ARN polimerasa de origen natural en una célula de mamífero, en la que la 10 secuencia promotora es un promotor específico de célula de cardiomiocito, y

c. una secuencia de empaquetamiento polinucleotídico de ADN derivado de virus;

caracterizada porque el miARNip comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 o SEQ ID NO 003.
2. Secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia promotora 15 específica de célula cardiomiocito es un promotor de ARN polimerasa II.
3.

Secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el promotor específico de célula cardiomiocito es al menos una de las secuencias SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008 o SEQ ID NO 009.
4.

Secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque

el primer elemento de secuencia comprende adicionalmente elementos de secuencia que facilitan el procesamiento 20 del transcrito por el aparato de corte y empalme de la célula.
5.

Secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 004 y SEQ ID NO 005 y al menos una de las secuencias SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008 o SEQ ID NO 009.
6.

Una secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada

25 porque la secuencia polinucleotídica de ADN derivado de virus es una secuencia de empaquetamiento de adenovirus.
7. Una secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia polinucleotídica de ADN derivado de virus deriva de un virus adenoasociado.
8.

Una secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia 30 polinucleotídica de ADN derivado de virus deriva de un virus adenoasociado de tipo 9.
9.

La secuencia polinucleotídica de ADN de SEQ ID NO 010 o SEQ ID NO 011 o SEQ ID NO 012.
10.

Una partícula vírica que contiene una secuencia polinucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
11.

Una célula eucariótica aislada que contiene una secuencia polinucleotídica según cualquiera de las 35 reivindicaciones 1 a 9.
12.

Una célula eucariótica aislada según la reivindicación 11, en la que la célula es una célula de mamífero.
13.

Una composición para su uso en el tratamiento de cardiomiopatía que comprende:

a. una secuencia polinucleotídica, una partícula vírica y/o una célula de mamífero aislada según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 11 y 40 b. un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición para su uso en el tratamiento de cardiomiopatía que comprende:

c.

una secuencia polinucleotídica o una partícula vírica o una célula de mamífero aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y

d.

una secuencia polinucleotídica de ADN o una partícula vírica que comprende un módulo de expresión que

45 comprende una segunda secuencia promotora operativa en un cardiomiocito y un segundo elemento de secuencia que codifica SERCA (Ca2+ -ATPasa de retículo sarcoendoplásmico) ligado operativamente con dicha segunda secuencia promotora, y

e. un excipiente farmacéuticamente aceptable.