ES2437093T3 - Composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de unirse e inhibir la actividad del polipéptido relacionado con la lisis oxidasa 1 (LOR-1) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 2 y b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis

CAMPO Y ANTECENDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis.

[0002] En un adulto, la formación de nuevos vasos sanguíneos en tejidos normales o enfermos está regulada por dos procesos, resumidos en la vasculogénesis (la transformación de arteriolas preexistentes en pequeñas arterias musculares) y la angiogénesis o la germinación de vasos sanguíneos existentes (que se produce tanto en el embrión como en el adulto).

[0003] El proceso de angiogénesis está regulado por estímulos biomecánicos y bioquímicos. Los factores angiogénicos, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), son liberados por células vasculares, macrófagos y células que rodean a los vasos sanguíneos. Estos factores angiogénicos activan proteasas específicas que están implicados en la degradación de la membrana basal. Como resultado de esta degradación, las células vasculares migran y proliferan dando lugar a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Se reclutan células periendoteliales, como los pericitos en los capilares, las células de músculo liso en los vasos más grandes y los miocitos cardíacos en el corazón, para proporcionar funciones de mantenimiento y modulación a los vasos en formación.

[0004] El establecimiento y remodelación de vasos sanguíneos están controlados por señales paracrinas, muchas de las cuales están mediadas por ligandos proteicos que modulan la actividad de los receptores tirosina quinasa transmembrana. Entre estas moléculas están el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus familias de receptores (VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1 y neuropilina-2), angiopoyetinas 1-4 (Ang-1, Ang-2, etc.) y sus respectivos receptores (Tie-1 y Tie-2), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento transformante β (TGF-β).

[0005] El crecimiento de tumores sólidos está limitado por la disponibilidad de nutrientes y de oxígeno. Cuando las células dentro de los tumores sólidos empiezan a sintetizar factores angiogénicos o cuando disminuyen los niveles de inhibidores de la angiogénesis, se altera el equilibrio entre las influencias antiangiogénicas y angiogénicas, iniciándose el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir del lecho vascular existente en el tumor. Este acontecimiento en la progresión del tumor se conoce como el interruptor angiogénico (1,2). Se ha demostrado que los inhibidores de la angiogénesis tumoral son capaces de inhibir por completo el crecimiento tumoral en ratones (3,4) así como inhibir las metástasis tumorales, un proceso que depende del contacto estrecho entre la vasculatura y las células tumorales (5). También se ha demostrado que la angiogénesis tiene una función importante en la progresión del cáncer de mama (6-9).

[0006] Estos datos han impulsado el uso de factores antiangiogénicos conocidos en el tratamiento del cáncer de mama (10-12) y la búsqueda de nuevos inhibidores de la angiogénesis.

[0007] Durante la pasada década se han aislado varios inhibidores nuevos de la angiogénesis incluyendo inhibidores de la señalización de VEGF (13) e inhibidores de procesos que llevan a la maduración y estabilización de nuevos vasos sanguíneos. Se han utilizado anticuerpos anti-integrina como inhibidores de la maduración de los vasos sanguíneos (14,15).

[0008] Aunque actualmente hay disponibles en el mercado varios fármacos antiangiogénicos, los mecanismos antiangiogénicos de la mayoría de estos fármacos (p. ej., angiostatina y endostatina) siguen sin estar claros (16,17).

[0009] Puesto que muchos factores angiogénicos (posiblemente compensatorios) pueden iniciar la angiogénesis, esto lleva a pensar que los factores antiangiogénicos que tienen como objetivo procesos más tardíos en la respuesta angiogénica como la maduración de vasos o una combinación de factores antiangiogénicos podrían ser más eficaces para detener la formación de los vasos.

[0010] El factor de plaquetas 4 (PF4) es una proteína antiangiogénica que está normalmente secuestrada en plaquetas (18-20). PF4 inhibe la angiogénesis usando mecanismos mal definidos (21-24). Se ha especulado previamente que PF4 se une a proteoglicanos de heparán sulfato de la superficie celular y de esta forma inhibe la actividad de los factores de crecimiento angiogénicos como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (24).

[0011] S. Hein y col., (Lysyl oxidases: Expression in the Fetal Membrane and Placenta, Placenta (2001), 22: pág. 49-57) describen la expresión de LOR1 en membranas fetales y en la placenta. Se produjo un suero policlonal frente a LOR1.

[0012] Durante la reducción de la presente invención a la práctica y durante la búsqueda de factores o dianas antiangiogénicas alternativas, los presentes inventores han descubierto una nueva proteína de unión a PF4 que participa en la modulación de la angiogénesis.

[0013] Como se demuestra en el presente estudio, esta proteína, que se denomina en este documento LOR1, tiene una elevada expresión en células endoteliales en cultivo, así como en otras células de vasos sanguíneos. Además, los niveles de expresión de LOR-1 puede correlacionarse con las propiedades metastásicas de las líneas celulares derivadas de cáncer de mama, lo que indica que LOR-1 puede tener funciones adicionales en la progresión tumoral, además de su función en la angiogénesis.

[0014] La presente invención es una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0015] Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un procedimiento para modular la angiogénesis en un tejido de mamífero, comprendiendo el procedimiento la administración dentro del tejido de mamífero de una molécula capaz de modificar el nivel y/o actividad tisular de al menos un tipo de lisil oxidasa para modular de este modo la angiogénesis en el tejido de mamífero.

[0016] Según otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un procedimiento para modular la angiogénesis en un tejido de mamífero, comprendiendo el procedimiento la administración dentro del tejido de mamífero de una construcción de ácido nucleico que es capaz de expresar un polipéptido que tiene actividad lisil oxidasa para modular de este modo la angiogénesis en el tejido de mamífero.

[0017] Según incluso otro aspecto de la presente descripción se proporciona una composición farmacéutica útil para modular la angiogénesis en un tejido de mamífero, comprendiendo la composición en cuestión, como principio activo, una molécula capaz de modificar el nivel y/o actividad de al menos un tipo de lisil oxidasa del tejido de mamífero y una vehículo farmacéuticamente eficaz.

[0018] La composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse con, y al menos inhibir parcialmente la actividad de al menos un polipéptido.

[0019] El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está dirigido frente a al menos una porción del polipéptido mostrada en las SEC ID N.º 2, 3, 6, 8 o 9.

[0020] Según incluso otro aspecto de la descripción se proporciona un procedimiento de identificación de moléculas capaces de modular la angiogénesis, comprendiendo el procedimiento: a) aislar moléculas que muestran reactividad específica con al menos un tipo de lisil oxidasa y b) probar las moléculas en el tejido de mamífero de modo que se determine la actividad de modulación de la angiogénesis de dichas moléculas.

[0021] Según otras características adicionales en la descripción el paso a) se lleva a cabo mediante ensayos de unión y/o ensayos de actividad lisil oxidasa.

[0022] Según un aspecto adicional de la presente descripción se proporciona un procedimiento de determinación de la malignidad del tejido canceroso, comprendiendo el procedimiento a) determinar un nivel de expresión y/o actividad lisil oxidasa del tejido canceroso y b) comparar el nivel de expresión y/o la actividad lisil oxidasa con el determinado en el tejido control para determinar de este modo la malignidad del tejido canceroso.

[0023] La presente invención aborda con éxito los inconvenientes de las configuraciones actualmente conocidas proporcionando composiciones farmacéuticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0024] En los dibujos:

En la figura 1 se muestra el análisis por PAGE-SDS de los extractos de células aórticas endoteliales porcinas (células PAE) que se transfectaron con el vector solo (carril 1) o con el vector que contenía el ADNc de LOR-1 (carril 3) y marcado metabólicamente con 35S-metionina. Los extractos de las células transfectadas con el vector (carril 2), de las células transfectadas con el vector que contenía el ADNc de LOR-1 (carril 4) o de las células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC) marcadas con 35S-metionina (carril 5) se purificaron en una columna de afinidad de PF4. Es evidente una banda que se corresponde en tamaño con la banda original observada en las HUVEC (comparación de los carriles 4 y 5); esta banda no se observa en los extractos de las células transfectadas con el vector.

En la figura 2 se muestra la expresión diferencial de LOR-1 en células derivadas de cáncer de mama de diferente potencial metastásico. El potencial metastásico de las células aumenta de izquierda a derecha y se correlaciona con el aumento de la expresión de ARNm de LOR-1. Los resultados se corresponden con los análisis de transferencia de ARN de la expresión del ARNm de LOR-1. Los datos correspondientes al potencial metastásico relativo de las líneas celulares se obtuvieron de la literatura.

En la figura 3 se muestra la expresión de LOR-1 recombinante en las células de cáncer de mama MCF-7 (carril 1). Las células MCF-7 transfectadas con el vector (carril 2) y dos clones de MCF-7 que expresan LOR-1 recombinante (carril 3, clon 12, carril 4, clon 22) se crecieron durante dos días en medio sin suero. Se recogió el medio de un número de células equivalente, se concentró 30 veces usando el sistema CentriconTM y se tomaron alícuotas de 10 µl que se sometieron a electroforesis usando un gel PAGE-SDS. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se identificó la proteína LOR-1 usando un anticuerpo dirigido frente al extremo C-terminal de LOR-1. Se usó un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina y se tiñó con NBT-BICP para determinar el anticuerpo primario unido.

En la figura 4 se muestra el tamaño tumoral correlacionado con la expresión de LOR-1. Las células MCF-7 parentales (par), células MCF-7 transfectadas solo con el vector pCDNA3 (vec) y dos células MCF-7 que expresan LOR-1 recombinante (clones 12 y 24) se depositaron bajo la piel de ratones inmunodeprimidos (107/sitio de inyección) junto con una pastilla de liberación lenta de estrógenos. Se usaron seis animales para cada tipo de célula implantado. El área de los tumores se midió cada pocos días. Las barras representan la desviación típica de la media.

En las figuras 5a-b se muestran la inmuntinciones anti-factor 8 de los tumores generados por las células MCF-7 transfectadas con el vector de expresión solo (figura 5a) o con un vector de expresión que contenía el ADNc de LOR-1 (figura 5b). El recuento de la tinción se realizó con hematoxilina-eosina (color azul). La invasión de los vasos sanguíneos en la masa tumoral es más abundante en los tumores que expresan LOR-1 (figura 5b) en comparación con los tumores generados por las células control que no expresan LOR-1 (figura 5a).

En las figuras 6a-d se muestran cortes de hígado de pacientes con enfermedad de Wilson (figuras 6c-d) y pacientes normales (figuras 6a-b) incubados con una sonda sentido de LOR-1 (figuras 6a, 6c) y una sonda complementaria (figuras 6b, 6d).

La figura 7 muestra resultados de un montaje de una hibridación in situ completa usando una sonda de ADNc de LOR-1 y un embrión de pollo de 4 días. Se observa una fuerte expresión del ARNm de LOR-1 en los vasos sanguíneos amnióticos (flecha).

En la figura 8 se muestra el alineamiento de la secuencia de varias lisil oxidasas incluyendo LOR-1.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

[0025] La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas.

[0026] Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones que la acompañan.

[0027] Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de la construcción y la disposición de los componentes mostrados en la siguiente descripción o ilustradas en los dibujos descritos en la sección de ejemplos.

[0028] Como se describe en la sección de ejemplos que aparece a continuación, los presentes inventores han descubierto una nueva proteínas constituyente del proceso angiogénico.

[0029] Esta proteína, denominada en este documento LOR-1 (SEC ID N.º 2) pertenece a la familia de enzimas lisil oxidasas que catalizan la formación de entrecruzamientos covalentes entre restos de lisina en las fibrillas de colágeno o elastina adyacentes. La familia de las lisil oxidasas incluye cuatro genes (27, 28, 32, 33), cuyas secuencias proteicas se presentan en las SEC ID N.º 3, 6, 8 y 9. En la figura 8 se presenta una comparación de homología entre varios miembros de la familia de las lisil oxidasas que se describen en más detalles en la sección de ejemplos a continuación.

[0030] Cada miembro de la familia de enzimas lisil oxidasas incluye un dominio lisil oxidasa muy conservado, cuya actividad depende en gran medida de la presencia de cobre.

[0031] Se apreciará que estudios previos en la materia han mostrado que la eliminación del cobre de los tejidos tumorales lleva a la inhibición de la angiogénesis (30, 34). Esto confirma adicionalmente el papel de la familia de enzimas lisil oxidasas en la angiogénesis ya que presumiblemente, la eliminación del cobre lleva a la inhibición de las lisil oxidasas.

[0032] Los ensayos de unión PF4-LOR-1 presentados en este documento respaldan adicionalmente la actividad angiogénica de las lisil oxidasas. Como se mencionó en este documento anteriormente, PF4 es un inhibidor de la angiogénesis. De este modo, la actividad antioangiogénica mostrada por PF4 puede verse afectada por la inhibición de LOR-1, lo que, como se muestra en la sección de ejemplos a continuación, se expresa abundantemente en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos.

[0033] Por tanto, según un aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para modular la angiogénesis.

[0034] El procedimiento se lleva a cabo mediante la administración dentro del tejido de mamífero de una molécula capaz de modificar el nivel tisular y/o la actividad de al menos un tipo de lisil oxidasa para modular de este modo la angiogénesis en el tejido de mamífero.

[0035] Según se usa en este documento, la expresión «nivel tisular» se refiere al nivel de proteínas lisil oxidasa presente en forma activa en el tejido en un punto temporal determinado. Los niveles de proteína se determinan en función de factores como la tasa de transcripción y/o traducción, recambio de ARN o proteínas y/o localización de la proteína dentro de la célula. Cualquier molécula que tenga efecto sobre cualquiera de estos factores puede modificar el nivel tisular de la lisil oxidasa.

[0036] Según se usa en este documento, el término «actividad» se refiere a una actividad enzimática de la lisil oxidasa. Una molécula que pueda modificar la actividad enzimática puede alterar directa o indirectamente la especificidad por el sustrato de la enzima o la actividad del sitio catalítico de la misma.

[0037] Existen muchos ejemplos de moléculas que pueden modificar especialmente el nivel tisular y/o la actividad de una lisil oxidasa. Estas moléculas puede clasificarse en lisil oxidasas «reguladoras por incremento» o «reguladores por disminución».

Reguladores por disminución

[0038] Un anticuerpo (policlonal, monoclonal o monoespecífico) o una porción de anticuerpo (p. ej., fragmento Fab) dirigido frente a al menos una porción de una lisil oxidasa (p. ej., la región que abarca el sitio catalítico) puede usarse para inhibir específicamente la actividad lisil oxidasa cuando se introduce en el tejido de mamífero. De este modo puede usarse un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido frente a una lisil oxidasa para suprimir o detener la formación de vasos sanguíneos.

[0039] En la materia se conocen muchos ejemplos de anticuerpos inhibidores, como inhibidores de la angiogénesis dirigidos frente a factores angiogénicos (14, 15).

[0040] Como se describe a continuación, pueden usarse varias técnicas con moléculas complementarias o ribozimas para reducir o eliminar la transcripción o traducción de una lisil oxidasa.

[0041] Una molécula complementaria que puede utilizarse en la presente invención incluye un polinucleótido

o un análogo de polinucleótido de al menos 10 bases, preferiblemente entre 10 y 15, más preferiblemente entre 50 y 20 bases, más preferiblemente, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 22, al menos 25, al menos 30 o al menos 40 bases que pueden hibridar in vivo, en condiciones fisiológicas, con una porción de una cadena de polinucleótidos que codifica un polipéptido con una homología de al menos el 50% con la SEC ID N.º 1, 4, 5 o 7, o con una homología de al menos el 75% con una porción N-terminal de las mismas determinado usando el programa de software BesFit del paquete de análisis de secuencia de Wisconsin con el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de huecos es igual a 8 y la penalización por extensión de huecos es igual a 2.

[0042] Los oligonucleótidos complementarios pueden expresarse a partir de construcciones de ácido nucleico administrados al tejido, en cuyo caso los promotores inducibles se usan preferiblemente de modo que la expresión de la molécula complementaria puede activarse o desactivarse o, alternativamente, dichos oligonucleótidos pueden sinterizarse químicamente y administrarse directamente al tejido, como parte, por ejemplo, de una composición farmacéutica.

[0043] La capacidad de sintetizar químicamente oligonucleótidos y análogos de los mismos que tengan una secuencia predeterminada seleccionada ofrece medios para regular por disminución la expresión génica. Pueden considerarse tres tipos de técnicas de modulación de la expresión génica.

[0044] A nivel de transcripción, los oligonucleótidos complementarios o sentido o los análogos de los mismos que se unen al ADN genómico mediante desplazamiento de hebra o formación de una triple hélice puede impedir la transcripción. A nivel de transcritos, los oligonucleótidos o los análogos complementarios de los mismos que se unen a moléculas de ARNm diana llevan a la escisión enzimática del híbrido mediante la ARNasa H intracelular. En este caso, mediante hibridación con el ARNm diana, los oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos proporcionan un híbrido doble reconocido y destruido por la enzima ARNasa H. Alternativamente, esta formación híbrida puede interferir con el ayuste correcto. Como resultado, en ambos casos, se reduce o elimina el número de transcritos intactos de ARNm diana listo para la traducción. A nivel de traducción, los oligonucleótidos o análogos complementarios que se unen a las moléculas de ARNm diana previenen, mediante impedimento estérico, la unión de los factores de traducción esenciales (ribosomas), al ARNm diana, un fenómeno conocido en el técnica como detención de la hibridación, impidiendo la traducción de esos ARNm.

[0045] Varios estudios previos en la materia han mostrado que los oligonucleótidos complementarios pueden ser eficaces in vivo. Por ejemplo, se han usado moléculas complementarias para detener la proliferación (58), crecimiento (59) o entrada en la fase S del ciclo celular (60) de las células hematopoyéticas y para prevenir las respuestas mediadas por el receptor (61).

[0046] Pueden tenerse en cuenta varias consideraciones cuando se diseñan oligonucleótidos complementarios. Para una inhibición in vivo eficaz de la expresión génica usando oligonucleótidos complementarios

o sus análogos, los oligonucleótidos o sus análogos deben cumplir los siguientes requisitos: i) especificidad de unión suficiente por la secuencia diana; ii) solubilidad en agua; iii) estabilidad frente a nucleasas intra y extracelulares; iv) capacidad de penetración dentro de la membrana celular y v) cuando se utilizan para tratar a un organismo, baja toxicidad.

[0047] Los oligonucleótidos no modificados son normalmente poco prácticos cuando se usan como secuencias complementarias ya que tienen semividas cortas in vivo, durante las cuales son degradadas rápidamente por las nucleasas. Asimismo, existen dificultades para prepararlos en cantidades mayores a miligramos. Además, estos oligonucleótidos tienen poca capacidad para penetrar a través de la membrana celular.

[0048] Por tanto, resulta aparente que para cumplir todos los requisitos mencionados anteriormente, es necesario que los análogos de oligonucleótidos se diseñen de una manera adecuada.

[0049] Por ejemplo, los problemas surgidos en relación con el reconocimiento del ADN bicatenario (ADNbc) a través de la formación de una triple hélice se han reducido mediante un enlace químico de «reversión» inteligente en el que se reconoce una secuencia de polipurina en una cadena y mediante «reversión» puede reconocerse una secuencia de homopurina sobre la otra cadena. También se ha obtenido una buena formación de la hélice usando bases artificiales mejorando de esta forma las condiciones de unión con respecto a la fuerza iónica y el pH.

[0050] Además, para mejorar la semivida así como la penetración en la membrana, se han realizado gran número de cambios en las estructuras moleculares polinucleotídicas, aunque con poco éxito.

[0051] Los oligonucleótidos pueden modificarse en la base, en el azúcar o en el resto fosfato. Entre estas modificaciones se incluyen, por ejemplo, el uso de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, fosforotioatos entrecruzados, fosforamidatos entrecruzados, metilenfosfonatos entrecruzados, análogos de internucleótidos defosfo con puentes siloxano, puentes carbonato, puentes carboximetiléster, puentes carbonato, puentes carboximetiléster, puentes acetamida, puentes carbamato, puentes tioéter, puentes sulfoxi, puentes sulfono, diversos ADN «plásticos», puentes anoméricos y derivados borano (62).

[0052] En la solicitud de patente internacional WO 89/12060 se describen diversas unidades para la síntesis de análogos de oligonucleótidos, así como análogos de oligonucleótidos formados mediante la unión de dicha unidades en una secuencia definida. Las unidades pueden ser «rígidas» (es decir, contiene una estructura en anillo)

o «flexibles» (es decir carece de estructura en anillo). En ambos casos, las unidades que contiene un grupo hidroxi y un grupo mercapto, a través de los cuales se considera que las unidades se unen para formar análogos de oligonucleótidos. El resto unido en los análogos de oligonucleótidos se selecciona a partir del grupo compuesto por sulfuro (-S-), sulfóxido (-SO-) y sulfona (-SO2).

[0053] En la solicitud de patente internacional WO 92/20702 se describe un oligonucleótido acíclico que incluye una estructura peptídica en la que cualquier nucleobase química o análogo seleccionado se extienden en línea y sirve como carácter codificando como en el ADN o ARN natural. Estos nuevos compuestos, conocidos como ácidos nucleicos peptídicos (ANP), no son solo más estables en las células que sus homólogos naturales, sino que también se unen al ADN y ARN naturales de 50 a 100 veces más estrechamente que los ácido nucleicos naturales sin separarse entre sí. Los oligómeros ANP pueden sintetizarse a partir de los cuatro monómeros protegidos que contienen timina, citosina, adenina y guanina mediante síntesis peptídica en fase sólida de Merrifield. Para aumentar la solubilidad en agua y para prevenir la agregación, se coloca un grupo amida de lisina en la región C-terminal.

[0054] Por tanto, la tecnología con moléculas complementarias requiere el apareamiento del ARN mensajero con un oligonucleótido para formar una doble hélice que inhiba la traducción. El concepto de terapia génica mediada por moléculas complementarias se introdujo ya en 1978 para tratamiento del cáncer. Esta técnica se basó en determinados genes que son cruciales para la división celular y para el crecimiento de las células cancerosas. Los fragmentos sintéticos de ADN de naturaleza genética pueden conseguir este objetivo. Estas moléculas se unen a las moléculas génicas diana en el ARN de células tumorales, inhibiendo de este modo la traducción de los genes y dando lugar a un crecimiento disfuncional de estas células. También se han propuestos otros mecanismos. Estas técnicas se han usado con cierto éxito en el tratamiento de cánceres, así como otras enfermedades, incluyendo infecciones víricas y otras enfermedades infecciosas.

[0055] Los oligonucleótidos complementarios se sintetizan normalmente con una longitud de 13-30 nucleótidos. La vida útil de las moléculas de oligonucleótidos en sangre es más bien corta. Por tanto, tienen que modificarse químicamente para evitar su destrucción por nucleasas ubicuas presentes en el organismo. Los fosforotioatos son una modificación ampliamente utilizada en los ensayos clínicos en curso de oligonucleótidos complementarios. Una nueva generación de moléculas complementarias consiste en oligonucleótidos complementarios híbridos con una porción central de ADN sintético, mientras que en cada extremo se han modificado cuatro bases con 2'O-metil ribosa para que se parezca al ARN. En los estudios preclínicos en animales experimentales, estos compuestos han mostrado mayor estabilidad al metabolismo en los tejidos del organismo y una mejora en el perfil de seguridad en comparación con fosforotioatos no modificados de primera generación. También se han probado docenas de análogos de nucleótidos distintos en la tecnología con moléculas complementarias.

[0056] Los oligonucleótidos de ARN también pueden usarse para inhibición complementaria ya que forman un dúplex ARN-ARN estable con la diana, lo que sugiere una inhibición eficaz. Sin embargo, debido a su baja estabilidad, los oligonucleótidos de ARN se expresan normalmente dentro de las células usando vectores diseñados para este fin. Esta técnica está favorecida cuando se pretende dirigirla a una ARNm que codifica una proteína abundante y de larga duración.

[0057] Los oligonucleótidos de ARN también pueden diseñarse de modo que el ARN activo interfiera con mecanismos dentro de la célula (ARNi). Los oligonucleótidos adecuados para este objetivo deben ser de una longitud y área de complementariedad definidas (63).

[0058] Las publicaciones científicas recientes han validado la eficacia de compuestos complementarios en modelos animales de hepatitis, cánceres, restenosis coronaria y otras enfermedades. El primer fármaco complementario fue aprobado recientemente por la FDA. El fármaco, Fomivirsen, se desarrolló mediante lisis y está indicado para el tratamiento local del citomegalovirus en pacientes con SIDA que son intolerantes o presentan una contraindicación a otros tratamientos para la retinitis por CMV o que respondían de forma insuficiente a tratamientos previos para la retinitis por CMV (Pharmacotherapy News Network).

[0059] En la actualidad varios compuestos complementarios están en ensayos clínicos en Estados Unidos. Entre estos se incluyen antivirales administrados a nivel local o terapias sistémicas frente al cáncer. Los agentes terapéuticos complementarios pueden en potencia tratar muchas enfermedades potencialmente mortales con varias ventajas sobre fármacos tradicionales. Los fármacos tradicionales intervienen después de que se forme la proteína causante de la enfermedad. Los fármacos complementarios, sin embargo, bloquean la transcripción/traducción del ARNm e intervienen antes de que se forme la proteína y, puesto que los fármacos complementarios se dirigen solo hacia ARNm específico, deben ser más eficaces con menos efectos secundarios que los tratamientos inhibidores de la proteína actuales.

[0060] Una segunda opción para alterar la expresión génica a nivel de transcripción utiliza los oligonucleótidos sintéticos capaces de hibridar con ADN bicatenario. Se forma una triple hélice. Estos oligonucleótidos pueden prevenir la unión de los factores de transcripción al promotor del gen y, por tanto, inhibir la transcripción. Alternativamente, pueden prevenir que se desenrolle la doble hélice y, por tanto, que se produzca la transcripción de los genes dentro de la estructura de la triple hélice.

[0061] También pueden usarse ribozimas como reguladores por disminución. Las ribozimas se están utilizando cada vez más para la inhibición específica de secuencia de la expresión génica mediante la escisión de los ARNm que codifican las proteínas de interés. La posibilidad de diseñar ribozimas para escindir cualquier ARN diana específico las ha convertido en herramientas valiosas tanto en aplicaciones de investigación básica como terapéuticas. En el área farmacológica, se han explotado las ribozimas dirigidas frente a ARN víricos en enfermedades infecciosas, oncogenes dominantes en cánceres y mutaciones somáticas específicas en trastornos genéticos. Más notablemente, varios protocolos de terapia génica con ribozimas para pacientes con VIH ya están en ensayos clínicos en fase 1 (67). Más recientemente, se han usado ribozimas para investigación en animales transgénicos, validación de dianas génicas y elucidación de rutas. Varias ribozimas están en ensayos clínicos en diversas etapas. ANGIOZIMA fue la primera ribozima sintetizada químicamente que se estudió en ensayos clínicos en humanos. La ANGIOZIMA inhibe específicamente la formación del VEGF-r (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular), un componente clave en la ruta de la angiogénesis. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. así como otras compañías, han demostrado la importancia de los fármacos antiangiogénesis en modelos animales.

HEPTAZIMA, una ribozima diseñada para destruir selectivamente el ARN del virus de la hepatitis C (VHC), se encontró que es eficaz para disminuir el ARN vírico de la hepatitis C en ensayos de cultivo celular (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated).

[0062] Los reguladores por disminución descritos en este documento podrían ser especialmente útiles para inhibir la angiogénesis en el tejido tumoral. Se ha encontrado que PF4, una proteína de unión a lisil oxidasa que inhibe la angiogénesis en el tejido tumoral se acumula específicamente en los vasos sanguíneos recién formados de los tumores (vasos angiogénicos) pero no en los vasos sanguíneos establecidos (31,35).

[0063] Los vasos sanguíneos angiogénicos recién formados son más permeables a proteínas que los vasos sanguíneos establecidos debido a que el principal inductor de angiogénesis en muchas enfermedades angiogénicas es VEGF, un factor de crecimiento que también funciona como un potente factor permeabilizante de vasos sanguíneos (VPF) (13). Por tanto, los vasos sanguíneos asociados a tumores están en un estado permanente de hiperpermeabilidad debido a una sobreexpresión desregulada del VEGF (36,37) y, por tanto, una molécula reguladora por disminución utilizada mediante el procedimiento de la presente invención podría ser capaz de extravasarse de forma eficaz a través de los vasos sanguíneos del tumor, pero de forma mucho menos eficaz a partir de los vasos sanguíneos estabilizados normales.

Reguladores por incremento

[0064] Pueden utilizarse varias técnicas para aumentar los niveles de lisil oxidasa y, de este modo, potenciar la formación de vasos sanguíneos.

[0065] Por ejemplo, puede administrarse a un tejido de mamífero una construcción de ácido nucleico que incluye un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido colocado antes de extremo 5' de un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad lisil oxidasa, como el polipéptido mostrado en SEC ID N.º 2, 3, 6, 8 o 9. La lisil oxidasa expresada a partir de esta construcción podría aumentar sustancialmente los niveles de lisil oxidasa dentro de las células del tejido potenciando de este modo la angiogénesis.

[0066] Los segmentos de polinucleótidos que codifican la lisil oxidasa pueden ligarse en un sistema de vector de expresión disponible en el mercado adecuado para la transformación de células de mamífero y para dirigir la expresión de este enzima dentro de las células transformadas. Se apreciará que dichos sistemas de vector disponibles en el mercado pueden modificarse fácilmente mediante técnicas recombinantes utilizadas frecuentemente para sustituir, duplicar o mutar secuencias promotoras o potenciadoras existentes y/o introducir cualquier secuencia de polinucleótidos adicional.

[0067] Entre los vectores de expresión de mamíferos adecuados se incluyen, pero sin limitaciones, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que están disponibles en Invitrogen, pCI que están disponibles en Promega, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles en Stratagene, pTRES que están disponibles en Clontech y sus derivados.

[0068] También pueden expresarse técnicas de activación de genes para aumentar los niveles de expresión de la lisil oxidasa.

[0069] Los elementos potenciadores pueden activarse de forma adyacente a las secuencias codificadoras de la lisil oxidasa endógenas para aumentar la transcripción de la misma.

[0070] En las referencias 64-66 se proporciona más información relacionada con la construcción y uso de construcciones de inactivación o activación de genes.

[0071] Se apreciará que también puede utilizarse la administración directa de un polipéptido que muestra actividad lisil oxidasa para potenciar la angiogénesis.

[0072] Se apreciará que los ensayos de unión por afinidad y/o ensayos de actividad, cuyos principios son bien conocidos en la técnica, pueden usarse para seleccionar nuevos compuestos (p. ej., análogos de sustrato) que pueden regular específicamente la actividad lisil oxidasa de la invención.

[0073] En un estudio realizado por Bedell-Hogan y col. (68) se ha descrito previamente un ensayo adecuado para el uso con respecto a este aspecto de la presente descripción.

[0074] Para modular la angiogénesis, las moléculas reguladoras por incremento/reguladoras por disminución utilizadas por la presente invención pueden administrarse al individuo per se o en una composición farmacéutica donde se mezcla con vehículos o excipientes adecuados.

[0075] Según se usa en este documento, una «composición farmacéutica» se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en este documento con otros compuestos químicos como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El objetivo de una composición farmacéutica es facilitar la administración/dirección de un compuesto a un mamífero.

[0076] Según se usa en este documento, el término «principios activos» se refiere a la preparación responsable del efecto biológico, es decir, las moléculas reguladoras por incremento/reguladoras por disminución usadas en la presente invención.

[0077] En lo sucesivo en este documento, los términos «vehículo fisiológicamente aceptable» y «vehículo farmacéuticamente aceptable» se usan indistintamente para referirse a un vehículo, como, por ejemplo, un liposoma, un virus, una micela o una proteína, o un diluyente que no causa irritación significativa en el mamífero y no anula la actividad biológica y las propiedades del principio activo. En estas expresiones se incluye un adyuvante.

[0078] En este documento, el término «excipiente» se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Entre los ejemplos, sin limitaciones, de excipientes se incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilénglicoles.

[0079] Las técnicas para la formulación y administración de las composiciones pueden encontrarse en la última edición de «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Publishing Co., Easton, PA, que se incorpora a este documento por referencia.

[0080] Entre las vías de administración adecuadas pueden incluirse, por ejemplo, administración por vía oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventiculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

[0081] Para la inyección, los principios activos pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica tamponada. Para la administración transmucosa se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que se quiere atravesar. Generalmente, estos penetrantes son conocidos en la técnica.

[0082] Para la administración oral, los compuestos puede formularse fácilmente combinando el principio activo con los vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos vehículos permiten que el principio activo de la invención se formule como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas poco espesas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral pueden hacerse usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los compuestos auxiliares adecuados, si se desea, para obtener los núcleos de comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son, en especial, cargas como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/u otros polímeros fisiológicamente aceptables como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes de desintegración, como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, como alginato sódico.

[0083] Se proporcionan núcleos de grageas con los recubrimientos adecuados. Con este fin, pueden usarse soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, lacas en solución y solventes orgánicos o mezclas de solventes adecuados. Pueden añadirse soluciones colorantes o pigmentos a los comprimidos o grageas recubiertas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

[0084] Entre las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral se incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener mezclas de los principios activos con una carga como lactosa, aglutinantes como almidones, lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden estar disueltos o resuspendidos en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral están en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

[0085] Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de la forma convencional.

[0086] Las preparaciones descritas en este documento pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica en dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones puede ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

[0087] Entre las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral se incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma hidrosoluble. Adicionalmente, las suspensiones de los principios activos pueden prepararse como suspensiones oleosas o acuosas apropiadas para inyección. Entre los solventes o vehículos lipófilos adecuados se incluyen ácidos grasos, como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

[0088] Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril apirógena, antes de su uso.

[0089] La preparación también puede formularse en composiciones rectales, como supositorios o enemas de retención, usando por ejemplo, bases de supositorios convencionales como manteca de cacao u otros glicéridos.

[0090] Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención se incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el objetivo pretendido.

[0091] La composición farmacéutica puede forma parte de un artículo de fabricación que también incluya un material de acondicionamiento que contiene la composición farmacéutica y un prospecto en el que se proporcionan indicaciones de uso para la composición farmacéutica.

[0092] Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento y composiciones farmacéuticas útiles para modular la angiogénesis.

[0093] Dicha actividad de modulación puede utilizarse para tratar la artritis (38,39), la retinopatía diabética (40), la psoriasis (41,42) y la vasculitis (43,44).

[0094] Es posible que algunas de estas enfermedades sean el resultado de la reducción o anulación de la actividad lisil oxidasa que induce la síntesis de una matriz extracelular frágil y, en consecuencia, vasos sanguíneos frágiles.

[0095] Por tanto, la administración de secuencias o polipéptidos que codifican la lisil oxidasa puede usarse para corregir alguna de las manifestaciones de estas enfermedades.

[0096] La presente descripción también puede usarse para tratar enfermedades que se caracterizan por cambios en la pared de los vasos sanguíneos. Por ejemplo, las restenosis que es una complicación frecuente tras una terapia con globo, displasia fibromuscular (49) y estenosis aórtica (50) son todas potencialmente tratable por el procedimiento de la presente descripción.

[0097] Además, los resultados presentados en la sección de ejemplos que indican que LOR-1 puede presentar una expresión más elevada en líneas celulares metastásicas que en líneas celulares no metastásicas (figura 3) sugieren que los niveles de expresión de LOR-1 pueden usarse como herramienta diagnóstica para determinar el grado de malignidad de las células cancerosas y, por tanto, determinar qué régimen de tratamiento debería usarse.

[0098] Objetos adicionales, ventajas y características nuevas de la presente descripción serán aparentes a un experto en la materia tras examinar los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Adicionalmente, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente descripción como se apunta anteriormente en este documento y como se reivindica a continuación en la sección de reivindicaciones encuentra apoyo experimental en los ejemplos siguientes.

EJEMPLOS

[0099] Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, «Molecular Cloning: A laboratory Manual» Sambrook y col., (1989); «Current Protocols in Molecular Biology» Volúmenes I-III Ausubel, R.M., editor (1994); Ausubel y col., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley e Hijos, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley e hijos, Nueva York (1988); Watson y col., «Recombinant DNA», Scientific American Books, Nueva York; Birren y col. (editores) «Genome Analysis: A Laboratory Manual Series», volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se explican en las patentes de EE.UU. N.º 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; «Cell Biology: A Laboratory Handbook», Volúmenes I-III Cellis, J. E., editor (1994); «Current Protocols in Immunology» Volúmenes I-III Coligan J. E., editor (1994); Stites y col. (editores), «Basic and Clinical Immunology» (8ª edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (editores), «Selected Methods in Cellular Immunology», W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura de patentes y científica, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.º 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219;

5.011.771 y 5.281.521; «Oligonucleotide Synthesis» Gait, M. J., editor (1984); «Nucleic Acid Hybridization» Hames,

B. D., y Higgins S. J., editores (1985); «Transcription and Translation», Hames, B. D., y Higgins S. J., editores (1984); «Animal Cell Culture» Freshney, R. I., editor (1986); «Immobilized Cells and Enzymes» IRL Press, (1986); «A Practical Guide to Molecular Cloning» Perbal, B., (1984) y «Methods in Enzymology» Vol. 1-317, Academic Press; «PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications», Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., «Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual» CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Los procedimientos que contiene se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.

EJEMPLO 1

Papel de LOR-1 en la angiogénesis

[0100] Se realizó un estudio con la intención de verificar y caracterizar adicionalmente el papel de LOR-1 en la angiogénesis.

Material y procedimientos

[0101] El factor de plaquetas 4 humano recombinante (PF4, número de acceso a GenBank M20901) producido en bacterias y posteriormente replegado fue proporcionado por el Dr. Maione de Repligen Crop. (Boston, EE. UU.). Las pastillas de liberación lenta de estrógenos se obtuvieron de Innovative Research of America, Sarasota, FL, EE. UU.

[0102] Construcción del vector de expresión de LOR-1, transfección en células MCF-7 y expresión: el ADNc de LOR-1 (SEC ID N.º 1) se clonó en un vector de expresión pCDNA3-1-higro (Invitrogen Inc., EE. UU.) controlado por un promotor de CMV. Los clones de células que expresaban LOR-1 se seleccionaron usando higromicina y se analizó la expresión de LOR-1 usando el antisuero policlonal descrito a continuación.

[0103] Construcción de columnas de afinidad de factor 4 de plaquetas y purificación de LOR-1 en dichas columnas: PF4 se conjugó a sefarosa usando una modificación del procedimiento de Miron y Wilchek (51) como se ha descrito previamente para el factor de crecimiento endotelial vascular (52). Se recogió el medio condicionado sin suero de células MCF-7 marcadas con 35S-metionina que sobreexpresaban LOR-1. El medio condicionado se hizo pasar a través de la columna dos veces. La columna se lavó con solución salina tamponada con fosfato (NaCl 300 mM, pH 7,2) y se eluyó con PBS (que contenía NaCl 2 M).

[0104] Experimentos con ratones desnudos: se implantaron células MCF-7 modificadas o parentales (107 células por animal) bajo la piel de ratones desnudos. Se implantó una pastilla de liberación lenta de estrógenos a 1 cm como se ha descrito previamente (53). Los tumores se midieron periódicamente, tras lo cual, se eliminaron aquellos con al menos 1 cm de tamaño y se analizaron inmunohistológicamente usando un anticuerpo comercial dirigido frente a un antígeno similar al factor 8 que sirve como marcador específico para células endoteliales.

[0105] Hibridación in situ: los fragmentos que abarcan los nucleótidos 922-1.564 de LOR-1, los nucleótidos 976-1.391 de LOL, los nucleótidos 400-950 de LO y los nucleótidos 1.061-15.990 de LOR-2 (según la numeración desde el codón ATG de estas secuencias) se subclonaron cada uno independientemente en los vectores Bluescript SK y KS (Stratagene). Se usó un kit de marcaje DIG de ARNc de Boehringer-Manneheim para transcribir las sondas de ARNc marcadas con digoxigenina sentido (s) y complementaria (c) a partir del promotor T7 de las construcciones Bluescript. La hibridación y posterior detección de sondas que hibridan se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito previamente (54).

[0106] Antisueros policlonales anti-LOR-1: los antisueros se generaron mediante inyección de un péptido recombinante que contiene los 200 aminoácidos C-terminales de LOR-1 (aminoácidos 540-744 de la SEC ID N.º 2) en conejos hembra. El suero se recogió 10 días después de cada inyección y se purificó una fracción de inmunoglobulina usando una columna de afinidad de proteína A Sepharosa (Pharmacia).

Resultados

[0107] Purificación de LOR-1: se usó una columna de afinidad de PF4 para detectar proteínas de las células endoteliales que interaccionan específicamente con PF4.

[0108] Se detectaron dos proteínas de unión a PF4 en medio condicionado de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), mientras que las proteínas de unión a PF4 no se detectaron en los extractos con detergente de las células endoteliales.

[0109] Dos litros de medio condicionado permitieron la purificación parcial de una de estas proteínas de unión que eluyó de la columna a concentraciones de sal relativamente altas (NaCl 0,4-0,5 M).

[0110] La purificación adicional de esta proteína se realizó usando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa y cromatografía en PAGE/SDS. La proteína de unión a PF4 no se unía a la heparina ni era un proteoglicano de heparán sulfato ya que la digestión con heparinasa no cambiaba su movilidad en los experimentos de PAGE/SDS.

[0111] La secuenciación parcial y la comparación con la base de datos reveló que la proteína de unión a PF4 de la presente invención (LOR-1) pertenecía a una familia de proteínas que contiene un dominio similar a la lisil oxidasa (28,29). Las lisil oxidasas son enzimas dependientes de cobre que participan en la síntesis de la matriz extracelular catalizando la formación de enlaces covalentes entre lisinas de fibras de colágeno o elastina adyacentes.

[0112] La secuencia de aminoácidos de longitud completa de LOR-1 (según se deduce de la secuencia de ADNc aislada) mostraba un alto grado de identidad con WS9-14, una proteína que se sobreexpresa en fibroblastos senescentes, en diversos tipos de células adherentes (pero no en células no adherentes) y en fibroblastos, en los que se correlacionaba con los niveles de expresión de procolágeno I-aI, y esta inducido por TGF-β e inhibida por ésteres de forbol y ácido retinoico (27).

[0113] Función de LOR-1 en el desarrollo tumoral: LOR-1 recombinante expresada en células PAE se unía específicamente a la columna de afinidad de PF4 (figura 1). Puesto que LOR-1 es un miembro de la familia LO se planteó la hipótesis de que esta proteína participa en la formación de la MEC durante la angiogénesis. Adicionalmente también se planteó la hipótesis de que PF4 suprime o inhibe la actividad proangiogénica de LOR-1 inhibiendo de este modo las etapas posteriores de la formación de vasos sanguíneos y limitando como consecuencia el crecimiento tumoral.

[0114] Expresión de LOR-1: la hibridación in situ demostró que LOR-1 se expresa en una amplia variedad de tejidos y tipos celulares como fibroblastos, adipocitos, células nerviosas, células endoteliales y en diversas células epiteliales. Varios tipos celulares, como los hepatocitos del hígado, no expresaban LOR-1; de los 4 miembros de la familia LO examinados (todos excepto LoxC), LOR-1 fue el único que se expresaba en las células endoteliales de los vasos sanguíneos.

[0115] LOR-1 y cáncer: como se muestra en la figura 2, en este documento se ha demostrado una correlación directa entre los niveles de expresión de LOR-1 y las propiedades metastásicas de las líneas celulares derivadas de cáncer de mama.

[0116] Puesto que las células epiteliales que recubren los conductos lactíferos del tejido mamario normal (a partir de las cuales surgen la mayoría de los tumores de mama) expresan grandes cantidades de LOR-1, es posible que las líneas menos metastásicas pierdan la expresión de LOR-1 en lugar de ganarla.

[0117] Para verificar este papel en las metástasis, se expresó el ADNc de LOR-1 en la línea célula de MCF-7 derivada de cáncer de mama no metastásico que normalmente no expresa LOR-1. La expresión de LOR-1 se examinó usando anticuerpos policlonales de conejo generados como se describe anteriormente (figura 3).

[0118] Se implantaron bajo la piel de ratones inmunodeprimidos una línea celular control que fue transfectada con un vector de expresión vacío y una línea celular MCF-7 que expresaba LOR-1 junto con una pastilla de liberación lenta de estrógenos como se describe anteriormente Se añadieron estrógenos porque el desarrollo de los tumores a partir de esta línea celular no metastásica depende de estrógenos (55).

[0119] La tasa de desarrollo tumoral en los ratones se controló de forma continua (figura 4); los tumores de 1 cm de tamaño se escindieron y se sometieron a análisis histológico como se ha descrito anteriormente. Curiosamente, la tasa de desarrollo tumoral variaba entre las dos líneas celulares, mostrando algunos tumores un crecimiento más lento en la línea MCF-7 que expresaba LOR-1 y mostrando un crecimiento aún más lento en las células control.

[0120] Para superar los problemas de expresión, el ADNc de LOR-1 se colocó bajo el control de un promotor inducido por tetraciclina (el sistema TET-off). Esta construcción permitirá determinar de forma concluyente si la tasa de crecimiento tumoral reducido observado en células que expresan LOR-1 es debido, de hecho, a LOR-1.

[0121] Se hicieron cortes de los tumores que expresaban grandes cantidades de LOR-1 y se tiñeron con un anticuerpo dirigido frente al antígeno similar al factor 8, un marcador específico de células endoteliales. El tejido tumoral control se teñía predominantemente en la cápsula alrededor del tumor mientras que en los tumores que expresaban LOR-1 se observó una tinción pronunciada en las regiones internas del tejido (figura 5a y figura 5b, respectivamente).

[0122] Papel de LOR-1 en la enfermedad de Wilson y en otras enfermedades hepáticas crónicas: los tejidos hepáticos normal y enfermo fueron incubados con sondas sentido (figuras 6a y 6c) y complementaria (figuras 6b y 6d) de LOR-1. Los tejidos hepáticos normales expresan niveles muy bajos de LOR-1 (figura 6b). Sin embargo, los tejidos hepáticos fibróticos como los que se observan en la enfermedad de Wilson, muestran un fuerte aumento de la expresión de LOR-1 en los hepatocitos (figura 6d).

[0123] Expresión de LOR-1 en embriones de pollo: en la figura 7 se muestra la expresión del ARNm de LOR-1 en los vasos sanguíneos de un embrión de pollo en desarrollo. La hibridación in situ de embriones de pollo enteros de 4 días mostró que la expresión del ARNm de LOR-1 en los vasos sanguíneos se localizaba en el amnios (flecha).

[0124] Familia de las lisil oxidasas: una comparación de homología entre los cinco miembros de la familia de lisil oxidasas que incluye la subfamilia de LO y LOL y la subfamilia de LOR-1 y LOR-2 mostró una fuerte homología en la porción C-terminal que incluye el motivo lisil oxidasa conservado. LOR-1 y LOR-2 se caracterizan por extensiones N-terminales largas que no se encuentran en LO y LOL.

[0125] Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que serán aparentes para el experto en la materia muchas alternativas, modificaciones y variaciones.

BIBLIOGRAFÍA CITADA

(en el texto se citan referencias adicionales)

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LISTADO DE SECUENCIAS

[0127]

<110> Neufeld, Gera Gengrinovitch, Stela Akiri , Gal Vadaz, Zehava

<120> COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS ÚTILES PARA MODULAR LA ANGIOGÉNESIS

<130> 01/22064

<150> US 60/223.739

<151> 08/08/2000

<160> 9

<170> PatentIn versión 3,1

<210> 1

<211> 2.325

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 774

<212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 757

<212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 2262

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1.725

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 574

<212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 1.254

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8 5 <211> 417

<212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 752 5 <212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición farmacéutica que comprende: a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de unirse e inhibir la actividad del polipéptido relacionado con la lisis oxidasa 1 (LOR-1) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 2 y b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. 2.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo se genera usando un fragmento del extremo C-terminal de 200 aminoácidos de un polipéptido LOR-1.

3. 3.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición farmacéutica comprende el fragmento del anticuerpo.

4. 4.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.

5. 5.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la composición farmacéutica se formula para inyección.

6. 6.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el vehículo farmacéuticamente eficaz comprende un tampón fisiológicamente compatible.

7. 7.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que además comprende un excipiente.

8. 8.

   La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5-7, en la que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo.