PT1315519E - Composições farmacêuticas e métodos úteis para tratamento de cancro e fibrose hepática - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS ÚTEIS PARA TRATAMENTO DE CANCRO E FIBROSE HEPÁTICA"

ÂMBITO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com composições farmacêuticas e métodos úteis para modular angiogénese.

Num adulto, a formação de novos vasos sanguíneos em tecidos normais ou doentes é regulada por dois processos, vasculogénese recapitulada (a transformação de arteríolas pré-existentes em pequenas artérias musculares) e angiogénese, a criação de vasos sanguíneos existentes (o que ocorre tanto no embrião como no adulto). 0 processo de angiogénese é regulado por estímulos biomecânicos e bioquímicos. Factores angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) são libertados por células vasculares, macrófagos, vasos sanguíneos que circundam as células. Estes factores angiogénicos activam proteases específicas que estão envolvidas na degradação da membrana base. Como resultado desta degradação, as células vasculares migram e proliferam conduzindo assim à formação de novos vasos sanguíneos. Células peri-endoteliais, tais como pericitos nos capilares, células de músculo liso nos vasos mais largos e miócitos cardíacos no coração são recrutados para dar funções de manutenção e modulação ao vaso em formação. 0 estabelecimento e remodelação de vasos sanguíneos é controlado por sinais parácrinos, muitos dos quais são mediados por ligantes da proteína que modulam a actividade 2 dos receptores da tirosina quinase transmembranares. Entre estas moléculas estão factores de crescimento endotelial vascular (VEGF) e as suas famílias de receptores (VEGFR-1, VEGFR -2, neuropilina-1 e neuropilina-2), Angiopoietinas 1-4 (Ang-1, Ang-2 etc.) e seus receptores respectivos (Tie-1 e Tie-2), factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e factor de transformação de crescimento 3(FTC-3). 0 crescimento de tumores sólidos é limitado pela disponibilidade de nutrientes e oxigénio. Quando as células dentro dos tumores sólidos começam a produzir factores angiogénicos ou quando os níveis de inibidores da angiogénese baixam, o balanço entre influências anti-angiogénicas e angiogénicas é perturbado, iniciando o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir do leito vascular existente no tumor. Este evento na progressão tumoral é conhecido como "switch" angiogénico (1,2). Foi demonstrado que os inibidores de angiogénese tumoral são capazes de inibir completamente o crescimento tumoral em ratos (3,4) e de inibir também metástases tumorais, um processo que se baseia no contacto próximo entre a vasculatura e as células tumorais (5) . Foi também demonstrado que a angiogénese desempenha um papel importante na progressão do cancro da mama (6-9) .

Essas constatações impulsionaram o uso de factores anti-angiogénicos conhecidos na terapia do cancro da mama (10— 12) e procura de novos inibidores da angiogénese.

Durante a década passada, vários novos inibidores da angiogénese foram isolados incluindo inibidores de sinalização de VEGF (13) e inibidores de processos que conduzem à maturação e estabilização de novos vasos 3 sanguíneos. Anticorpos anti-integrina têm sido usados como inibidores da maturação de vasos sanguíneos (14, 15).

Embora vários fármacos anti-angiogénicos estejam agora disponíveis comercialmente, os mecanismos anti-angiogénicos da maioria destes fármacos (e.g., angiostatina e endostatina) permanecem obscuros (16, 17).

Uma vez que a angiogénese pode ser iniciada por muitos factores angiogénicos (possivelmente compensatórios), é lógico que factores anti-angiogénicos que têm como alvo processos posteriores da resposta angiogénica tais como maturação dos vasos ou uma combinação de factores anti-angiogénicos seriam mais eficientes no bloqueio da formação de vasos. 0 factor plaquetário 4 (PF4) é uma proteína anti-angiogénica normalmente sequestrada nas plaquetas (18-20) . O PF4 inibe a angiogénese usando mecanismos pouco definidos (21-24) . Foi anteriormente especulado que o PF4 se liga a proteoglicanos heparan-sulfato da superfície celular e deste modo inibe a actividade dos factores de crescimento angiogénicos tais como factor de crescimento de fibroblastos básico (24).

Na redução da presente invenção à prática e na procura de factores anti-angiogénicos ou alvos alternativos, os presentes inventores encontraram uma nova proteína de ligação a PF4 que participa na modulação da angiogénese.

Como demonstrado pelo presente estudo, esta proteína, a qual é aqui designada por LOR-1, é altamente expressada em células endoteliais cultivadas assim como noutras células de vasos sanguíneos. Para além disso, os níveis de 4 expressão da LOR-1 podem ser correlacionados com as propriedades metastáticas das linhas celulares derivadas de cancro da mama, indicando que a LOR-1 pode desempenhar papéis adicionais na progressão do tumor para além de um papel na angiogénese.

RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica como definido nas reivindicações.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de uma molécula capaz de regular negativamente o nível de tecido e/ou actividade de lisil-oxidase LOR-1 (SEQ ID. No. 2) para fabrico de um medicamento para supressão do crescimento tumoral e de metástases, e/ou tratar fibrose hepática, como definido nas reivindicações.

De acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas da invenção descritas abaixo, a molécula é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de se ligar a, e inibindo pelo menos parcialmente a actividade de, pelo menos um polipéptido.

Ainda de acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas descritas, o anticorpo ou o fragmento do anticorpo é dirigido contra pelo menos uma porção do polipéptido indicado na SEQ ID NOs: 2.

Ainda de acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas descritas, a molécula é um polinucleótido capaz de regular negativamente a expressão da LOR-1. 5

Ainda de acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas descritas, o polinucleótido é pelo menos parcialmente complementar com o polinucleótido indicado na SEQ ID NOs: 1.

Ainda de acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas descritas, a molécula é um polipéptido que tem actividade de lisil-oxidase. 0 polipéptido é como indicado nas SEQ ID NOs: 2,3,6,8 ou 9. É fornecido um método de modulação da angiogénese num tecido de mamífero, o método compreendendo administrar ao tecido de mamífero uma construção de ácido nucleico capaz de expressar um polipéptido tendo actividade de lisil-oxidase para assim modular a angiogénese dentro do tecido de mamífero.

Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de identificação de moléculas capazes de modular a angiogénese, o método compreendendo (a) isolar as moléculas que exibem reactividade específica com pelo menos um tipo de lisil-oxidase; e (b) testar as moléculas dentro de tecido de mamífero de modo a determinar a sua actividade de modulação da angiogénese.

Ainda de acordo com outros elementos nas formas de realização preferidas descritas, o passo (a) é efectuado através de ensaios de ligação e/ou ensaios de actividade de lisil-oxidase.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um método de determinação da malignidade de 6 tecido canceroso, o método compreendendo (a) determinar o nivel de expressão e/ou actividade da lisil-oxidase do tecido canceroso; e (b) comparar nivel de expressão e/ou actividade da lisil-oxidase com os determinados para o tecido controlo para assim determinar a malignidade do tecido canceroso. A presente invenção aborda com sucesso as falhas das configurações actualmente conhecidas fornecendo composições farmacêuticas e métodos que podem ser usados para tratar doenças caracterizadas por excessiva ou insuficiente formação de vasos sanguíneos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção é aqui descrita, somente como exemplo, com referência aos desenhos em anexo. Agora com referência específica aos desenhos em pormenor, é realçado que os pormenores mostrados são a título de exemplo e somente para fins de discussão ilustrativa das formas de realização preferidas da presente invenção. A este respeito, não é feita qualquer tentativa de mostrar pormenores estruturais da invenção em maior detalhe do que o necessário para o entendimento fundamental da invenção, a descrição tomada com os desenhos torna evidente para os especialistas na técnica como as várias formas da invenção podem ser realizadas na prática.

Nos desenhos: A FIG. 1 ilustra análise SDS-PAGE de extractos de células endoteliais aórticas Pporcine (Células PAE) que foram transfectadas com vector (pista 1) ou em vector contendo cDNA de LOR-1 (pista 3) e marcadas metabolicamente com 35S-metionina. Extractos de células transfectadas com vectores (pista 2), de células transfectadas com vectores 7 contendo cDNA de LOR-1 (pista 4) ou de células endoteliais da veia umbilical humana marcadas com 35S-metionina (HUVEC) (pista 5) foram purificados numa coluna de afinidade de PF4. Uma banda correspondendo em tamanho à banda original observada em HUVEC é evidente (comparar pista 4 e 5); esta banda está ausente nos extractos de células transfectadas com vectores. A FIG. 2 ilustra a expressão diferencial da LOR-1 em células derivadas de cancro da mama de diferente potencial metastático. 0 potencial metastático das células aumenta da esquerda para a direita, e está correlacionado com o aumento da expressão de mRNA de LOR-1. Os resultados correspondem à análise de "northern blot" da expressão de mRNA da LOR-1. Os dados relativos ao potencial metastático relativo das linhas celulares foram derivados da literatura. A FIG. 3 ilustra a expressão da LOR-1 recombinante em células MCF-7 de cancro da mama (pista 1) . Células MCF-7 transfectadas com vector (pista 2) e dois clones de MCF-7 expressando LOR-1 recombinante (pista 3, clone 12, pista 4, clone 22) foram crescidas durante dois dias em meio sem soro. 0 meio de um número igual de células foi recolhido, concentrado 30 vezes usando Centricon™, e aliquotas de 10 μΐ foram submetidas a electroforese usando um gel SDS/PAGE. As proteínas foram sujeitas a análise "blot" em nitrocelulose, e a proteína LOR-1 foi identificada usando um anticorpo dirigido contra a terminação C da LOR-1. Um anticorpo secundário ligado a fosfatase alcalina e uma coloração NBT-BICP foram usados para detectar o anticorpo primário ligado. A FIG. 4 ilustra o tamanho do tumor correlacionado com a expressão da LOR-1. Células MCF-7 parentais (par), células MCF-7 transfectadas com vector pCDNA3 sozinho (vec) e duas células MCF-7 recombinantes expressando LOR-1 (clones 12 e 24) foram depositadas sob a pele de ratos imunodeficientes (107/local de injecção) conjuntamente com uma pastilha de estrogénio de libertação lenta. Foram usados seis animais para cada tipo de célula implantado. A área dos tumores foi medida de poucos em poucos dias. As barras representam o desvio padrão em relação à média.

As FIGs. 5a-b ilustram imunomarcação do anti-factor-8 dos tumores gerados por células MCF-7 transfectadas com o vector de expressão sozinho (Figura 5a) ou com um vector de expressão contendo o cDNA da LOR-1 (Figura 5b). Foi realizada contra-coloração com hematoxilina-eosina (azul) . A invasão de vasos sanguíneos na massa tumoral é mais abundante em tumores expressando LOR-1 (Figura 5b) quando comparado com tumores gerados pelas células controlo as quais não expressam LOR-1 (Figura 5a).

As FIGs. 6a-d ilustram secções de fígado de pacientes com doença de Wilson (Figuras 6c-d) e pacientes normais (Figuras 6a-b) sondadas com uma sonda sentido de LOR-1 (Figuras 6a, 6c) e sonda antisentido (Figuras 6b, 6d). A FIG. 7 ilustra os resultados de hibridização in-situ completa usando uma sonda de cDNA de LOR-1 e um embrião de galinha com 4 dias. Observa-se forte expressão de mRNA de LOR-1 em vasos sanguíneos amnióticos (seta) . 9 A FIG. 8 ilustra o alinhamento da sequência de várias lisil oxidases incluindo LOR-1.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS A presente invenção pode ser usada para suprimir crescimento tumoral e de metástases, assim como para tratar fibrose hepática.

Os princípios e funcionamento da presente invenção podem ser melhor entendidos com referência aos desenhos e às descrições juntas.

Antes de explicar pelo menos uma forma de realização da invenção em pormenor, deve entender-se que a invenção não é limitada na sua aplicação aos pormenores de funcionamento e ao arranjo dos componentes indicados na descrição seguinte ou ilustrados nos desenhos descritos na secção dos Exemplos.

Como descrito na secção dos Exemplos que se segue, os presentes inventores descobriram uma nova proteína constituinte do processo angiogénico.

Esta proteína, que é aqui designada por LOR-1 (SEQ ID NO:2) pertence à família lisil-oxidase de enzimas que catalisam a formação de ligações cruzadas covalentes entre resíduos de lisina nas fibrilhas de colagénio ou elastina adjacentes. A família lisil oxidase inclui quatro genes (27,28,32,33), cujas sequências de proteínas são apresentadas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 8 e 9. A comparação de homologia entre vários membros da família lisil oxidase é apresentada na Figura 8 que é melhor descrita na secção dos Exemplos que se segue. 10

Cada membro da família de enzimas lisil-oxidase inclui um domínio de lisil-oxidase altamente conservado, cuja actividade é altamente dependente da presença de cobre.

Deve notar-se que estudos da técnica anterior mostraram que a remoção do cobre dos tecidos tumorais conduz à inibição da angiogénese (30,34). Isto substancia ainda mais o papel da família de enzimas lisil-oxidase na angiogénese uma vez que, presumivelmente, a remoção do cobre conduz à inibição das lisil-oxidases.

Um apoio adicional à actividade angiogénica das lisil-oxidases é dado pelos ensaios de ligação PF4-LOR-1 aqui apresentados. Como mencionado aqui acima, PF4 é um inibidor de angiogénese. Como tal, a actividade anti-angiogénica exibida por PF4 pode ser realizada através da inibição da LOR-1, a qual, como demonstrado na secção dos Exemplos que se segue, é altamente expressada nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. O método é realizado administrando ao tecido de mamífero uma molécula capaz de modificar um nível de tecido e/ou actividade de pelo menos um tipo de lisil-oxidase para assim modular a angiogénese no tecido de mamífero.

Como aqui usada, a frase "nível de tecido" refere-se ao nível de proteína lisil-oxidase presente na forma activa num tecido num determinado momento. Os níveis de proteína são determinados por factores tais como, taxas de transcrição e/ou tradução, turnover de proteínas ou RNA e/ou localização da proteína dentro da célula. Como tal, qualquer molécula que afecte qualquer destes factores pode modificar o nível de tecido da lisil-oxidase. 11

Como aqui usado o termo "actividade" refere-se a uma actividade enzimática da lisil-oxidase. Uma molécula que pode modificar a actividade enzimática pode directamente ou indirectamente alterar a especificidade do substrato da enzima ou a actividade do seu sitio catalítico. Há numerosos exemplos de moléculas que podem modificar especificamente o nível de tecido e/ou actividade de uma lisil-oxidase. Tais moléculas podem ser categorizadas em "reguladores positivos" ou "reguladores negativos" da lisil-oxidase.

Reguladores negativos

Um anticorpo (policlonal, monoclonal ou monoespecífico) ou uma porção de anticorpo (e.g., fragmento Fab) dirigido a pelo menos uma porção de uma lisil-oxidase (e.g., região que abrange o sítio catalítico) pode ser usado para inibir especificamente a actividade da lisil-oxidase quando introduzido num tecido de mamífero. Como tal, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo dirigido a uma lisil-oxidase pode ser usado para suprimir ou bloquear a formação de vasos sanguíneos.

Numerosos exemplos de inibidores de anticorpos são conhecidos na técnica, incluindo inibidores da angiogénese que têm como alvo factores angiogénicos (14, 15).

Tal como é descrito abaixo, várias abordagens antisentido ou ribozima podem ser usadas para reduzir ou abolir a transcrição ou tradução de uma lisil oxidase.

Uma molécula antisentido que pode ser usada com a presente invenção inclui um polinucleótido ou um análogo de polinucleótido de pelo menos 10 bases, preferencialmente entre 10 e 15, mais preferencialmente entre 50 e 20 bases, 12 o mais preferencialmente, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 40 bases que é hibridizável in vivo, sob condições fisiológicas, com uma porção de uma cadeia de polinucleótido codificando um polipéptido pelo menos 50% homólogo as SEQ ID NOs: 1, 4, 5 ou 7 ou pelo menos 75% homólogos às suas porções N-terminais como determinado usando o software BestFit do pacote de análise de sequência Wisconsin, utilizando o algoritmo Smith e Waterman, em que a penalização de criação de um espaço ("gap") é igual a 8 e a penalização de extensão do espaço ("gap") é igual a 2.

Os oligonucleótidos antisentido usados pela presente invenção podem ser expressados a partir de construções de ácido nucleico administrados ao tecido, em cujo caso promotores induziveis são preferencialmente usados de modo a que a expressão antisentido possa ser ligada ou desligada, ou alternativamente esses oligonucleótidos possam ser sintetizados quimicamente e administrados directamente no tecido, como parte de, por exemplo, uma composição farmacêutica. A capacidade de sintetizar quimicamente oligonucleótidos e análogos destes tendo uma sequência predeterminada seleccionada oferece meios para modulação negativa da expressão do gene. Três tipos de estratégias de modulação de expressão de genes podem ser considerados.

Ao nivel da transcrição, oligonucleótidos sentido ou antisentido ou análogos que se ligam ao DNA genómico por deslocamento de cadeia ou pela formação de uma hélice tripla, podem prevenir a transcrição. Ao nivel do transcrito, oligonucleótidos antisentido ou análogos que 13 ligam moléculas de mRNA alvo conduzem à clivagem enzimática do híbrido por RNase H intracelular. Neste caso, através da hibridização com o mRNA alvo, os oligonucleótidos ou análogos de oligonucleótidos fornecem um híbrido duplo reconhecido e destruído pela enzima RNase H. Alternativamente, essa formação híbrida pode conduzir a interferência com o processo de excisão ("splicing") correcto. Como resultado, em ambos os casos, o número de transcritos intactos de mRNA alvo prontos para tradução é reduzido ou eliminado. Ao nível da tradução, os oligonucleótidos antisentido ou análogos que ligam moléculas de mRNA alvo impedem, por impedimento estérico, a ligação de factores de tradução essenciais (ribosomas), ao mRNA alvo, um fenómeno conhecido na técnica como bloqueio da hibridização, impossibilitando a tradução desses mRNAs. Vários estudos da técnica anteriores mostraram que os oligonucleótidos antisentido podem ser eficazes in vivo. Por exemplo, moléculas antisentido têm sido usadas para bloquear a proliferação de células hematopoiéticas (58), o crescimento (59), ou a entrada na fase S do ciclo celular (60) e para evitar respostas mediadas por receptores (61). Várias considerações devem ser tidas em conta ao conceber oligonucleótidos antisentido. Para inibição eficiente in vivo da expressão genética usando oligonucleótidos antisentido ou análogos, os oligonucleótidos ou análogos devem preencher os seguintes requisitos (i) suficiente especificidade na ligação à sequência alvo; (ii) solubilidade em água; (iii) estabilidade contra nucleases intra e extracelulares; (iv) capacidade de penetração através da membrana celular; e (v) quando usados para tratar um organismo, baixa toxicidade. 14

Os oligonucleótidos não modificados são normalmente pouco práticos para uso como sequências antisentido dado que têm tempos de semi-vida curtos in vivo, durante os quais são rapidamente degradados por nucleases. Para além disso, são difíceis de preparar em quantidades superiores a miligramas. Para além disso, esses oligonucleótidos são fracos penetradores da membrana celular.

Assim é evidente que para obedecer a todos os requisitos acima listados, os análogos de oligonucleótidos precisam de ser concebidos de forma adequada.

Por exemplo, os problemas que surgem associados ao reconhecimento de DNA de cadeia dupla (dsDNA) através da formação de hélice tripla têm sido diminuídos com uma ligação química inteligente de "inversão" ("switch back"), por meio da qual uma sequência de polipurina numa cadeia é reconhecida, e por "inversão", uma sequência de homopurina na outra cadeia pode ser reconhecida. Igualmente, uma boa formação de hélice foi obtida usando bases artificiais, melhorando deste modo as condições de ligação em relação à força iónica e pH.

Adicionalmente, com vista a melhorar a semi-vida assim como a penetração de membrana, tem sido feito um grande número de variações nas estruturas de polinucleótidos, embora com pouco sucesso.

Os oligonucleótidos podem ser modificados na porção da base, do açúcar ou do fosfato. Estas modificações incluem, por exemplo, o uso de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, fosforotioatos com pontes, fosforamidatos com pontes, metilenofosfonatos com pontes, análogos de internucleótidos 15 defosfo com pontes de siloxano, pontes de carbonato, pontes de éster carboximetílico, pontes de carbonato, pontes de éster carboximetílico, pontes de acetamida, pontes de carbamato, pontes de tioéter, pontes de sulfoxi, pontes de sulfono, vários DNAs "plásticos", pontes anoméricas e derivados de borano (62) . O pedido da patente internacional WO 89/12060 divulga vários blocos de construção para sintetizar análogos de oligonucleótidos, assim como análogos de oligonucleótidos formados juntando esses blocos de construção numa sequência definida. Os blocos de construção podem ser "rígidos" (i.e., conter uma estrutura de anel) ou "flexíveis" (i.e., sem uma estrutura de anel). Em ambos os casos, os blocos de construção contêm um grupo hidroxi e um grupo mercapto, através dos quais se diz que os blocos de construção se juntam para formar análogos de oligonucleótidos. A porção de ligação nos análogos de oligonucleótidos é seleccionada a partir do grupo que consiste em sulfureto (-S-) , sulfóxido (—SO—), e sulfona (-S02-). O pedido de patente internacional WO 92/20702 descreve um oligonucleótido acíclico que inclui uma estrutura peptídica na qual quaisquer nucleobases químicas seleccionadas ou análogos são ligadas e servem como caracteres de codificação como fazem no DNA ou RNA naturais. Estes novos compostos, conhecidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) , são não só mais estáveis nas células que os seus homólogos naturais, mas também se ligam a DNA e RNA naturais 50 até 100 vezes mais firmemente do que os ácidos nucleicos naturais se unem uns aos outros. Os oligómeros de PNA podem ser sintetizados a partir de quatro monómeros protegidos contendo timina, citosina, adenina e guanina por síntese peptídica em fase sólida de Merrifield. Com vista a 16 aumentar a solubilidade em água e para evitar agregação, um grupo lisina amida é colocado na região C terminal.

Portanto, a tecnologia antisentido requer emparelhamento de RNA mensageiro com um oligonucleótido para formar uma hélice dupla que inibe a tradução. 0 conceito de terapia génica mediada antisentido foi já introduzido em 1978 para o tratamento do cancro. Esta abordagem foi baseada em certos genes que são cruciais na divisão e crescimento celular de células cancerígenas. Fragmentos sintéticos de DNA de substância genética podem atingir este objectivo. Tais moléculas ligam-se a moléculas de genes alvo em RNA de células tumorais, inibindo deste modo a tradução dos genes e resultando em crescimento disfuncional destas células. Outros mecanismos foram também propostos. Estas estratégias têm sido usadas, com algum sucesso no tratamento de cancros, assim como de outras doenças, incluindo doenças virais e outras infecciosas.

Os oligonucleótidos antisentido são sintetizados tipicamente com comprimentos de 13-30 nucleótidos. O tempo de vida das moléculas de oligonucleótidos no sangue é muito curto. Portanto, têm que ser modificadas quimicamente para evitar a destruição por nucleases ubíquas presentes no organismo. Os fosforotioatos são uma modificação amplamente usada em oligonucleótidos antisentido em ensaios clínicos em curso. Uma nova geração de moléculas antisentido consiste em oligonucleótidos antisentido híbridos com uma porção central de DNA sintético enquanto que quatro bases em cada extremidade foram modificadas com 2'0-metil ribose para se assemelhar a RNA. Em estudos pré-clínicos em animais de laboratório, esses compostos demonstraram maior estabilidade ao metabolismo nos tecidos corporais e um perfil de segurança melhorado quando comparado com o 17 fosforotioato não modificado de primeira geração. Dezenas de outros análogos de nucleótidos têm também sido testados na tecnologia antisentido.

Os oligonucleótidos de RNA podem também ser usados para inibição antisentido porque formam uma dupla RNA-RNA estável com o alvo, sugerindo inibição eficiente. No entanto, devido à sua baixa estabilidade, oligonucleótidos de RNA são expressos tipicamente dentro das células usando vectores concebidos para este fim. Esta abordagem é favorecida quando se tenta atingir um mRNA que codifica uma proteína abundante e de vida longa.

Os oligonucleótidos de RNA podem também ser concebidos de modo a activar mecanismos de interferência de RNA dentro da célula (RNAi). Oligonucleótidos adequados para tal fim devem ser de um comprimento e área de complementação definidos (63) .

Publicações científicas recentes validaram a eficácia dos compostos antisentido em modelos animais de hepatite, cancros, reestenose da artéria coronária e outras doenças. 0 primeiro fármaco antisentido foi recentemente aprovado pela FDA. 0 fármaco, Fomivirsen, foi desenvolvido por Isis, e está indicado para tratamento local de citomegalovírus em doentes com SIDA que são intolerantes a ou são contra-indicados para outros tratamentos para retinite por CMV ou que não eram suficientemente sensíveis aos tratamentos anteriores para a retinite por CMV (Pharmacotherapy News Network). Vários compostos antisentido estão agora em ensaios clínicos nos Estados Unidos. Estes incluem antivirais administrados localmente, terapêuticos sistémicos para 18 cancro. Os terapêuticos antisentido têm o potencial para tratar muitas doenças potencialmente fatais com várias vantagens sobre os fármacos tradicionais. Os fármacos tradicionais intervêm depois de ser formada uma proteína causadora de doença. Os terapêuticos antisentido, porém, bloqueiam a transcrição/tradução de mRNA e intervêm antes da proteína ser formada, e uma vez que os terapêuticos antisentido se dirigem a um só mRNA específico, eles podem ser mais eficazes com menos efeitos secundários que a terapia actual de inibição de proteína.

Uma segunda opção para perturbar a expressão de genes ao nível da transcrição usa oligonucleótidos sintéticos capazes de hibridizar com DNA de cadeia dupla. É formada uma hélice tripla. Esses oligonucleótidos podem evitar a ligação de factores de transcrição ao promotor de genes e inibir assim a transcrição. Alternativamente, podem evitar o desenrolar da dupla e, consequentemente, a transcrição de genes dentro na estrutura helicoidal tripla.

As ribozimas podem também ser usadas como reguladores negativos. As ribozimas estão a ser cada vez mais usadas para inibição de sequência específica da expressão génica por clivagem de mRNAs codificando proteínas de interesse. A possibilidade de conceber ribozimas para clivar qualquer RNA alvo específico tem-nas tornado ferramentas valiosas em investigação básica e em aplicações terapêuticas. Na área terapêutica, as ribozimas têm sido explorados para atingir RNAs virais em doenças infecciosas, oncogenes dominantes em cancros e mutações somáticas específicas em doenças genéticas. Notavelmente, vários protocolos de terapia génica com ribozima para doentes com HIV estão já nos ensaios de Fase 1 (67) . Mais recentemente, as ribozimas foram usadas para investigação transgénica animal, 19 validação de genes alvo e elucidação das vias. Várias ribozimas estão em vários estádios de ensaios clínicos. A ANGIOZYME foi a primeira ribozima sintetizada quimicamente para ser estudada em ensaios clínicos em humanos. A ANGIOZYME inibe especificamente a formação do VEGF-r (receptor de Factor de Crescimento Endotelial Vascular), um componente chave na via da angiogénese. A Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., assim como outras firmas têm demonstrado a importância dos terapêuticos anti-angiogénese em modelos animais. A HEPTAZYME, uma ribozima concebida para destruir selectivamente RNA do Vírus da Hepatite C (HCV), verificou-se ser eficaz na diminuição do RNA da Hepatite C virai em ensaios de cultura de células (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated).

Os reguladores negativos descritos aqui acima serão particularmente úteis para inibir a angiogénese em tecido tumoral. Tem sido mostrado que a PF4, uma proteína de ligação a lisil oxidase que inibe a angiogénese em tecido tumoral acumula-se especificamente nos vasos sanguíneos recém-formados de tumores (vasos angiogénicos) mas não nos vasos sanguíneos estabelecidos (31,35).

Vasos sanguíneos angiogénicos recém-formados são mais permeáveis às proteínas que os vasos sanguíneos estabelecidos porque o principal indutor da angiogénese em muitas doenças angiogénicas é VEGF, um factor de crescimento que funciona também como um potente factor de permeabilização dos vasos sanguíneos (VPF) (13). Vasos sanguíneos associados a tumores estão assim num estado permanente de hiperpermeabilidade devido a sobre-expressão desregulada de VEGF (36,37) e como tal, uma molécula reguladora negativa usada pelo método da presente invenção deverá ser capaz de extravasar-se eficientemente dos vasos 20 sanguíneos tumorais mas muito menos eficientemente dos vasos sanguíneos normais estabilizados.

Reguladores positivos Várias abordagens podem ser utilizadas para aumentar os níveis de lisil oxidase e como tal para aumentar a formação de vasos sanguíneos.

Por exemplo, uma construção de ácido nucleico incluindo um promotor específico constitutivo, induzível ou de tecido posicionado a montante de um polinucleótido codificando um polipéptido tendo actividade de lisil oxidase, tal como o polipéptido indicado nas SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9 pode ser administrado num tecido de mamífero. A lisil oxidase expressada a partir desta construção deve aumentar substancialmente os níveis de lisil oxidase dentro das células do tecido e, como tal, aumentar a angiogénese.

Os segmentos de polinucleótidos codificando a lisil oxidase podem ser ligados a um sistema de vectores de expressão disponível comercialmente adequado para transformar células de mamífero e para dirigir a expressão desta enzima dentro das células transformadas. Note-se que esses sistemas de vectores disponíveis comercialmente podem facilmente ser modificados por de técnicas recombinantes comummente usadas de modo a substituir, duplicar ou mutar as sequências promotoras ou melhoradoras existentes e/ou introduzir quaisquer sequências de polinucleótidos adicionais.

Vectores de expressão de mamíferos adequados incluem, mas não se limitam a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que estão disponíveis por Invitrogen, pCI que está disponível por Promega, pBK-RSV e pBK-CMV que estão 21 disponíveis por Stratagene, pTRES que está disponível por Clontech, e seus derivados. Técnicas de "knock-in" de genes podem também ser usadas para aumentar os níveis de expressão da lisil oxidase.

Elementos melhoradores podem ser colocados por "knock-in" adjacentes a sequências de codificação de lisil oxidase endógenas para assim aumentar a sua transcrição.

Pormenores adicionais relacionados com a construção e uso de construções "knock-out" e "knock-in" são fornecidos nas referências 64-66.

Deve ser apreciado que a administração directa de um polipéptido exibindo actividade de lisil oxidase pode também ser utilizada para melhorar a angiogénese.

Deve ser apreciado que os ensaios de afinidade de ligação e/ou ensaios de actividade, os princípios dos quais são bem conhecidos na técnica, podem ser usados para triagem de novos compostos (e.g., análogos do substrato) que podem especificamente regular a actividade da lisil oxidase e desse modo serem usados com a presente invenção.

Um ensaio adequado para uso com este aspecto da presente invenção foi anteriormente descrito num estudo conduzido por Bedell-Hogan et al. (68).

Com vista a modular a angiogénese, as moléculas de regulador positivo/regulador negativo usadas pela presente invenção podem ser administradas ao indivíduo, por si só, ou numa composição farmacêutica onde são misturadas com transportadores ou excipientes adequados. 22

Como aqui usado, uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de um ou mais dos componentes activos aqui descritos com outros componentes químicos tais como transportadores e excipientes fisiologicamente adequados. 0 objectivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração/alvo de um composto a um mamífero.

Como aqui usado, o termo "componentes activos", refere-se à preparação responsável pelo efeito biológico, i.e. as moléculas de regulador positivo/regulador negativo usadas pela presente invenção. A seguir, as frases "transportador fisiologicamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável" são usados indiferentemente para referir um transportador, tal como, por exemplo, um liposoma, um vírus, uma micela, ou uma proteína, ou um diluente que não cause irritação significativa ao mamífero e que não anule a actividade e propriedades biológicas do componente activo. Um adjuvante é incluído nestas frases.

Aqui, o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um componente activo. Exemplos, sem limitação, de excipientes, incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amidos, derivados da celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis. Técnicas para formulação e administração de composições podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é aqui incorporado como referência. 23

Vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir aplicação oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal ou parentérica, incluindo injecções intramusculares, subcutâneas e intramedulares assim como injecções intratecais, intraventriculares directas, injecções intravenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intraoculares.

Para injecção, os componentes activos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, são usados na formulação penetrantes adequados à barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados imediatamente por combinação do componente activo com transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Esses transportadores permitem que o componente activo da invenção seja formulado como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões, e afins, para ingestão oral por um doente. Preparações farmacológicas para uso oral podem ser feitas usando um excipiente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, depois de adicionar auxiliares adequados se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou drageias. Excipientes adequados são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carbometilcelulose de sódio; 24 e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes de desintegração, tais como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio.

Os núcleos das drageias são fornecidos com revestimentos adeguados. Para este fim, soluções concentradas de açúcar podem ser usadas as quais podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos dos comprimidos ou drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto activo.

Composições farmacêuticas, que podem ser usadas oralmente, incluem cápsulas duras feitas de gelatina assim como moles, cápsulas seladas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os componentes activos em mistura com enchedores tais como lactose, ligantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os componentes activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Adicionalmente, estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para a via de administração escolhida. 25

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou losangos formulados de modo convencional.

As preparações aqui descritas podem ser formuladas para administração parentérica, e.g., por injecção de bolus ou infusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de unidade de dosagem, e.g., em ampolas ou em embalagens multidose, opcionalmente, com um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas da preparação activa na forma hidrossolúvel. Adicionalmente, suspensões dos componentes activos podem ser preparadas como suspensões de injecção à base de óleo ou água apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos tais como oleato de etilo, triglicéridos ou liposomas. Suspensões de injecção aquosas podem conter substâncias, que aumentem a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos componentes activos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, o componente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, e.g., solução à base de água apirogénica estéril, antes do uso. 26 A preparação da presente invenção pode também ser formulada em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, usando, e.g., bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto da presente invenção incluem composições em que os componentes activos estão contidos numa quantidade eficaz para obter o fim desejado. A composição farmacêutica pode formar uma parte de um artigo de fabrico que inclui também um material de embalagem para conter a composição farmacêutica e um folheto que fornece indicações de uso para a composição farmacêutica. São divulgados um método e composições farmacêuticas úteis na modulação da angiogénese.

Essa actividade de modulação pode ser usada para tratar artrite (38,39), retinopatia diabética (40), psoriase (41,42) e vasculite (43,44).

Para além disso, as composições podem também ser usadas para tratar doenças caracterizadas por vasos sanguíneos frágeis, incluindo síndroma de Marfans, Kawasaki, Ehlers-Danlos, cútis laxa, e takysu (43,45-47). É possível que algumas destas doenças resultem da actividade reduzida ou eliminada da lisil oxidase que conduz à síntese de uma matriz extracelular frágil, e consequentemente, a vasos sanguíneos frágeis. 27

Como tal, a administração de sequências ou polipéptidos que codificam lisil oxidase pode ser usada para corrigir algumas das manifestações dessas doenças. É também divulgado o tratamento de doenças que são caracterizadas por alterações na parede dos vasos sanguíneos. Por exemplo, reestenose que é uma complicação comum depois de terapia do balão, displasia fibromuscular (49) e estenose aórtica (50) são todas potencialmente tratáveis pelo método da presente invenção.

Para além disso, evidência apresentada na secção dos Exemplos que indica que LOR-1 pode ser mais altamente expressada nas linhas de células metastáticas do que nas linhas de células não metastáticas (Figura 3) sugere que os níveis de expressão de LOR-1 podem ser usados como uma ferramenta de diagnóstico para determinar a malignidade das células cancerígenas, e portanto para determinar qual o regime de tratamento que deve ser usado.

Objectivos, vantagens, e novas características adicionais da presente invenção serão evidentes para o comum perito na técnica após verificação dos Exemplos a seguir, os quais não se pretende que sejam limitantes. Adicionalmente, cada uma das várias formas de realização e aspectos da presente invenção como delineado aqui acima e como reivindicado na secção das reivindicações abaixo encontra suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS É agora feita referência aos exemplos seguintes, os quais em conjunto com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitante. 28

Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são pormenorizadamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias como indicado nas Pat. U.S. Nos. 4,666,828; 4,683,202;

4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A

Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e literatura científica, ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide

Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., e Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., e Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, 29 (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic

Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And

Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Acredita-se gue os procedimentos neles são bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. EXEMPLO 1 O papel da LORl na angiogénese

Um estudo foi conduzido para melhor substanciar e caracterizar o papel da LOR-1 na angiogénese.

Materiais e Métodos O factor plaguetário 4 recombinante Humano (PF4, número de acesso no GenBank M20901) gue foi produzido em bactérias e subsequentemente redobrado foi fornecido por Dr. Maione da Repligen Corp. (Boston, USA). Os comprimidos de estrogénio de libertação lenta foram obtidos do Innovative Research of America, Sarasota, FL, USA.

Construção do vector de expressão de LOR-1, transfecção em células MCF—7, e expressão: O cDNA da LOR-1 (SEQ ID NO:l) foi clonado num vector de expressão pCDNA3.1-hygro (Invitrogen Inc., USA) sob controlo de um promotor CMV. Clones das células expressando LOR-1 foram seleccionados usando higromicina e testados para expressão de LOR-1 usando os antisoros policlonais descritos abaixo.

Construção de colunas de afinidade do factor plaquetário 4 e purificação de LOR-1 nessas colunas: PF4 foi acoplado a 30 sefarose usando uma modificação do método de Miron e Wilchek (51) como previamente descrito para o factor de crescimento endotelial vascular (52). Meio condicionado sem soro foi colhido de células MCF-7 marcadas com 35S-metionina que sobrexpressaram LOR-1. O meio condicionado foi passado duas vezes através da coluna. A coluna foi lavada com solução salina tamponada com fosfato (300 mM NaCl, pH-7,2) e eluida com PBS (contendo 2M NaCl).

Experiências com ratos nus: Células MCF-7 modificadas ou parentais (107 células por animal) foram implantadas sob a pele de ratos nus. Um comprimido de estrogénio de libertação lenta foi implantado a 1 cm de distância, como descrito anteriormente (53) . Os tumores foram medidos periodicamente, a seguir ao que, os tumores de pelo menos 1 cm de tamanho foram removidos e analisados imuno-histologicamente usando um anticorpo comercial dirigido contra um antigénio semelhante ao factor 8 o que serviu como um marcador especifico para células endoteliais.

Hibridização in-situ: Fragmentos englobando os nucleótidos 922-1564 de LOR-1, nucleótidos 976-1391 de LOL, nucleótidos 400-950 de LO e nucleótidos 1061-1590 de LOR-2 (como numeradas a partir do codão ATG destas sequências) onde cada um foi subclonado independentemente em vectores Bluescript SK e KS (Stratagene). Um kit de marcação de cRNA DIG da Boehringer-Mannheim foi usado para transcrever sondas de cRNA sentido (s) e antisentido (as) marcadas com digoxigenina a partir do promotor T7 das construções de Bluescript. A hibridização e subsequente detecção das sondas hibridizadas foi realizada essencialmente como previamente descrito (54). 31

Antisoros policlonais anti-LOR-1: Antisoros foram gerados injectando um péptido recombinante contendo os 200 aminoácidos C-terminais de LOR-1 (aminoácidos 540-744 da SEQ ID NO: 2) em fêmeas de coelhos. O soro foi colhido 10 dias a seguir a cada injecção e uma fracção de imunoglobulina foi purificada usando uma coluna de afinidade Sefarose proteína A (Pharmacia).

Resultados

Purificação de LOR-1: Uma coluna de afinidade PF4 foi usada para detectar proteínas de células endoteliais que especificamente interagem com PF4.

Duas proteínas de ligação a PF4 foram detectadas em meio condicionado de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), ao passo que as proteínas de ligação a PF4 não foram detectadas em extractos detergentes de células endoteliais.

Dois litros de meio condicionado permitiram uma purificação parcial dessa tal proteína ligante que eluiu da coluna a concentrações de sal relativamente elevadas (0,4-0,5 M NaCl).

Purificação adicional desta proteína foi realizada usando cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa e cromatografia SDS/PAGE. A proteína de ligação a PF4 não se ligou a heparina nem era um proteoglicano heparan-sulfato uma vez que a digestão da heparinase não conseguiu alterar a sua mobilidade nas experiências SDS/PAGE.

Sequenciação parcial e comparação de base de dados revelaram que a proteína de ligação a PF4 da presente invenção (LOR-1) pertencem a uma família de proteínas 32 contendo um domínio semelhante a lisil-oxidase (28,29). As lisil-oxidases são enzimas dependentes de cobre que participam na síntese da matriz extracelular catalisando a formação de ligações covalentes entre lisinas de fibras de elastina ou colagénio adjacentes. 0 comprimento total da sequência de aminoácidos de LOR-1 (como deduzido a partir da sequência de cDNA isolada) apresentou um alto grau de identidade com WS9-14, uma proteína sobre-expressa em fibroblastos senescentes, em vários tipos de células aderentes (mas não em células não aderentes) e em fibroblastos, onde foi correlacionada com níveis de expressão de pro-colagénio I-al, assim como sendo induzida por TGF-β e inibida por ésteres de forbol e ácido retinóico (27) . O papel de LOR-1 no desenvolvimento do tumor: LOR-1 recombinante expressa em células PAE ligou-se especificamente com a coluna de afinidade PF4 (Figura 1) . Uma vez que LOR-1 é um membro da família LO foi colocada a hipótese da sua participação na formação de ECM durante a angiogénese. Para além disso, pôs-se também a hipótese de que a PF4 suprime ou inibe a actividade pro-angiogénica da LOR-1 inibindo assim as fases posteriores da formação de vasos sanguíneos e, como resultado, limitando o crescimento do tumor.

Expressão de LOR-1: Hibridização in-situ demonstrou que a LOR-1 é expressa numa grande variedade de tipos de tecidos e células incluindo fibroblastos, adipócitos, células nervosas, células endoteliais e uma variedade de células epiteliais. Vários tipos de células, tais como hepatócitos do fígado, não expressaram LOR-1; dos 4 membros da família 33 LO examinados (todos excepto LoxC) a LOR-1 foi a única expressa nas células endoteliais dos vasos sanguíneos. LOR-1 e cancro: Como mostrado na Figura 2, foi aqui demonstrada uma correlação directa entre os níveis de expressão de LOR-1 e as propriedades metastáticas de linhas celulares derivadas do cancro da mama.

Uma vez que as células epiteliais que revestem os duetos do leite do tecido mamário normal (a partir das quais surgem a maioria dos tumores mamários) expressam grandes quantidades de LOR-1, é possível que as linhas menos metastáticas tenham perdido a expressão de LOR-1 em vez de a ganharem.

Para substanciar o seu papel em metástases, o cDNA de LOR-1 foi expressado em linhas celulares MCF-7 derivadas de cancro da mama não metastático as quais normalmente não expressam LOR-1. A expressão de LOR-1 foi examinada usando anticorpos policlonais de coelho gerados como descrito acima (Figura 3) .

Uma linha celular controlo que foi transfectada com um vector de expressão vazio, e uma linha celular MCF-7 expressando LOR-1 foram implantadas sob a pele de ratos imunodeficientes em conjunto com um comprimido de estrogénio de libertação lenta como descrito acima. 0 estrogénio foi adicionado porque o desenvolvimento de tumores a partir desta linha celular não metastática é dependente de estrogénio (55). A taxa de desenvolvimento tumoral nos ratos foi continuamente monitorizada (Figura 4); tumores de 1 cm de tamanho foram excisados e sujeitos a análise histológica como descrito acima. Curiosamente, a taxa de 34 desenvolvimento tumoral variou entre as duas linhas celulares, com alguns tumores apresentando crescimento mais lento na MCF-7 expressando LOR-1 enquanto que outras apresentaram crescimento mais lento nas células controlo.

De modo a ultrapassar os problemas de nivel de expressão, cDNA de LOR-1 foi colocado sob o controlo de um promotor induzido por tetraciclina (o sistema TET-off). Uma tal construção irá permitir determinar conclusivamente se a taxa reduzida de crescimento tumoral observada nas células expressando LOR-1 é de facto causada pela LOR-1.

Os tumores expressando grandes quantidades de LOR-1 foram seccionados e corados com um anticorpo dirigido contra antigénio semelhante a factor 8, um marcador especifico de células endoteliais. 0 tecido tumoral de controlo corou predominantemente na cápsula à volta do tumor enquanto que nos tumores expressando LOR-1 foi observado um corado pronunciado nas regiões interiores do tecido tumoral (Figura 5a e Figura 5b respectivamente). O papel da LOR-1 na doença de Wilson e em outras doenças hepáticas crónicas: Tecidos de figado normal e doente foram sondados com sondas de LOR-1 sentido (Figuras 6a e 6c) e antisentido (Figuras 6b e 6d). Os tecidos de figado normais expressam niveis muito baixos de LOR-1 (Figura 6b). Porém, tecidos de figado fibrótico tais como os observados na doença de Wilson, apresentam um forte aumento na expressão de LOR-1 nos hepatócitos (Figuras 6d).

Expressão de LOR-1 em embriões de galinha: A Figura 7 ilustra a expressão de LOR-1 de mRNA de LOR-1 em vasos sanguíneos de um embrião de galinha em desenvolvimento. Hibridização in sítu completa de embriões de galinha com 4 35 dias revelaram expressão de mRNA de LOR-1 nos vasos sanguíneos localizados no âmnio (seta). A família da Lisil oxidase: Uma comparação de homologia entre cinco membros da família da lisil oxidase que inclui a subfamília LO e LOL e a subfamília LOR-1 e LOR-2 revelou uma forte homologia na porção C-terminal que inclui o motivo conservado da lisil oxidase. As LOR-1 e LOR-2 são caracterizadas por longas porções N-terminais que não são encontradas em LO e LOL.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as suas formas de realização específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações vão ser evidentes para os especialistas na técnica.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Neufeld, Gera Gengrinovitch, Stela akiri, Gal Vadaz, Zehava

<12 0> COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS ÚTEIS PARA MODULAÇÃO DE ANGIOGÉNESE <130> 01/22064 <150> US 60/223,739 <151> 2000-08-08 < 16 0 > 9 <170> Patentln version 3.1 <210 > 1 <211> 2325

<212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1

atggagaggc ctctgtgctc ccacctctgc «qctgcctqg ctatgctggc cctcctgtcc 6C cccetgagce tggcâcagtâ tgacagctgg ccccatcacc ecgagtactt ccagcsaccg 120

gctcctgagt ateaecagce ccaggceecc gccasrr.çjtgg ocaagateca gcnjegcctg ISO getgggcaga sgsggaagça cágcgagggc egggtggagg tgtactatga tggccagtgg 240 ggcaccgtçt gcgatgaega cfctctccatc caegotge.cc acgtcgtctg otjgggagetg 300 ggctatgtgg aggccsagtc ctggactgcc sgctcctcct acggcaaggg agsagggccc 360 atctggttag acaatCtcoa ctgfcsc.tggc aacgaggcga cccttgcagc atgcacctoc 420 aatcgctrggg gcgccacr.ga etgcaageac acggsggatg tcggígtggt gtgcagcgae 4Θ0 aaaaggattc ctgggtteaa atttgscsat tcgttgatca eccagstaga gaaoctgaat 540 46 atccaggtgq sggacsttcg gattcgagcc atcctctcaa çctaccgcaa gcgcacocc gtgatggagg gcfcacgtgga ggfcgaaggag ggeaagacct ggaagcagat ctgtgacaag 660 caetggacgg ccaagaattc ccgcgtggtc tgcggcatgt ttggcttccc tggggagagg 720 acatacaata ccaaagtgta caaaatgttt gcctcacgga ggaagc&gcg ctsctggeca 780 ttctccatgg actgcaccgg cacagaggcc cacatctcca gctgcaagct gggcccccag 840 gtgtcactgg aceccatgaa gaatgtcaec tgcgagaatg ggctgccggc egtggtgagt 900 tgtgtgcetg ggcaggtctt eagccetgae ggaocctega gattccggaa agcatacaag S60 • ccagagcaae ccctggtgcg acfcgaçagçc ggtgcctaca tcggggaggg ccgcgtggag 1020 gtgctcaaaa atggagaatg ggggaccgtc tgcgacgaca agtgggacct ggtgtcggcc 1080 agtgtggtçt gcagagagct gggctttggg agtgccaaag aggcagtcac tggctcccga 1140 . ctggggeaag ggatcggacc catccacctc aacgagatec agtgcacagg caatgagasg 1200

Sccâttatag actgcaagtfc caatgccgag tctcagggct gcaaccacga ggaggatgct 1260 ggtgtgagat gcaaoacccc tgccatgggc ttgcagaaga agçtgegect gaacggcggc 1320

cgcaatccct acgagggccg sgtggaggtg ctggtggaga gaaacgggtc ccttgfcgtgg I38Q gggatggtgt gcggccaaaa ctggggcatc gtggaggcca tggtggtctg ccgecsgctg 1440 ggcctgggat tcgccagcaa cgccttccag gagacctggt attggcacgg agatgtcaac 1500 agcsacaaag tegtcatgag tggagtgaãg tgctegggaa cggagctgtc cctggcgcac 1560 tgeegçcacg aeggggagga cgtggcefcgc ccccagggcg gagtgeagta eggggccgga 1620 gttgectgct cagaaaccgc cccfcgaectg gtcctcaatg cggagatggt gcagcagacc 1680 acctaectgçr aggaecggcc catgttoatg ctgcagtgtg ccatggaggs gaactgcctc 1740 tcggcctcag ccgcgcagac cgaccccacc acgggctacc gccggctcct gcgcttctcc 1800 tcccagatac aoaacaatgg ccagtccgac ttccggccoa agaafcggccg'ecaçgegtgg 1860 atctggçacg acfcgtcacsg gcactaccac agcatggagg tgttcaccca etatgacotg 1020 otgaacot.ca atggcaccas ggtggcagag ggccacaagg ccagcttctg ettçgaggac 1380 acagaatgtg asggagaeat ccagaagaat tacgagtgtg ccaacttcgg cgatcaggge 2040 atcaccatgg gctgctggga catgtaccgc cstgacateg actgccagtg ggttgacatc 2100 actgacgtçc cccctggaga ctaccigtte caggfctgtta ttaaccccaa ectcgaçgtt 2160 gcagaatccg attactccaa caacatcafcg aaatgcagga gccgctatga cggecaeegc 2220 4: atctggatgt acaactgcca eataggtggt tccttcagcg aagagacgga aaeaaagtit 2280 gagcacttca gcgggctctt aaaeaaccag ctçtcccegc agtaa 2325

<210> 2 <211> 774 <212> PRT <213> Homo sapiens 47 <400> 2

Met Glu Arg Pro Leu Cys Ser His Leu Cys Ser Cys Leu Ala Met Leu 1 5 1Q 15 Ala Leu Leu Ser Pro Leu Ser L@U Ala Gin Tyr Asp Ser Trp Pro His 20 25 30 Tyr Pro Glu Tyr Phe Gin Gin Pro Ala Pro Glu Tyr His Gin Pro Gin 35 40 45 Ale Pro Ala Asn vai Ala Lys lie Gin Leu Arg Leu Ala Gly Gin Lys 50 55 60 Arg Lys His Ser Glu Gly Arg Val Glu Val Tyr Tyr Asp Gly Gin Trp 65 70 75 80 Gly Thr Vai Cys Asp Asp Asp Phe Ser Ile His Ala Ala His Val Val 85 90 95 Cys Arg Glu Leu Gly Tyr Val Glu Ala Lys Ser Trp Thr Ala Ser Ser 100 1Ô5 110 Ser Tyr Gly Lys Gly Glu Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asn Leu Bis Cys 115 120 125 Thr Gly Asn Glu Ala Thr Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asn Gly Trp Gly 130 135 140 Vai Thr Asp Cys Lys His Thr Glu Asp Val Gly Val Val Cys Ser Asp 145 150 155 160 Lys Arg IXe pro Gly Phe Lys Phe Asp Asn Ser Leu Ile Asn Gin Ile 155 170 175 Glu Asn Leu Asn Ils Gin Val Glu Asp Ile Arg Ile Arg Ala lie Leu 180 185 190 Ser Thr Tyr Arg Lys Arg Thr Pro Val Met Glu Gly Tyr Val Glu Val 195 200 205 Lys Glu Gly Lys Thr Trp Lys Gin Ile Cys Asp Lys His Trp Thr Ala 210 215 220 48

Lys Asn Ser Arg val Val Cys Gly Met Phe Gly Phe Pro Gly Glu Arg 22$ 230 235 240 Thr Tyr Asn Thr Lys Val Tyr Lys Met Phe Ala Ser Arg Arg Lys Gin 245 250 255 Arg Tyr Trp Pro Phe Ser Met Asp Cys Thr Gly Thr Glu Ala Hís Xle 260 265 270 Ser Ser Cys Lys Leu Gly Pro Gin Val Ser Leu Asp Pro Met Lys Asn 275 260 285 Vai Thr Cys Glu Asn Gly Leu Pro Ala Val Val Ser cys val Pro Gly 290 295 300 Gin Vai Phe Ser Pro Asp Gly Pro Ser Arg Phe Arg Lys Ala Tyr Lys 305 310 315 320 Pro Glu Gin Pro Leu Val Arg Leu Arg Gly Gly Ala Tyr Xle Gly Glu 325 330 335 Gly Arg Val Glu Val Leu Lys Asn Gly Glu Trp ciy Thr Val Cys ASp 340 34 S 350 Asp Lys Trp Asp Leu Val Ser Ale Ser Val Val Cys Arg Glu Leu Gly 355 360 365 Phe Gly Ser Ala lys Glu Ala Val Thr Giy Ser Arg Leu Gly Gin Gly 370 375 380 lie Gly Pro ne His Leu Asn Glu Ile Gin Cys Thr Gly Asn Glu Lys 385 390 395 400 Sar Xle Xle Asp Cys Lys Phe Asn Ala Glu Ser Gin Gly Cys Asn His 405 410 415 Glu Glu Asp Ala Gly val Arg Cys Asn Thr Pro Ala Met Gly Leu Gin 420 425 430 Lys Lys Leu Arg Leu Asn Gly Gly Arg Asn Pro Tyr Glu Gly Arg val 435 440 4 45 Glu Vai Leu Vai Glu Arg Asn Gly Ser Leu Val Trp Gly Met Val Cys 450 455 460 Gly Gin Asn Trp Gly Xle Val Glu Ala Met Val Val Cys Arg Gin Leu 465 470 475 480

Gly Leu Gly Phe Ma Ser Asn Ala Phe Gin Glu Th» Trp Tyr Trp His 49

Gly Leu Gly Phe Ma Ser Asb Ala Phe Gin G.lu Thr Trp Tyr Bis 485 490 495

Gly Asp Vai Asn Ser Asn Lys Vai Vai Met Ser Gly Vâl Lys Cys Ser 500 505 510 Gly Thr Glu Leu Ser Leu Ma His Cys Arg His Asp Gly Glu Asp Vai 515 520 525 Ala Cvs Pro Gin Gly Gly Vai Gin Tyr Gly Ala Gly Vai Ala Cys Ser 530 535 540 Glu Thr Ala Pro Asp Leu Vai Leu Asn Ma Glu Met Vai Gin Gin Thr 545 550 555 S60 Thr fyr Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Met Leu Gin Cys Ala Met Glu 565 570 575 Glu Asn Cys Leu Ser Ma Ser Ala Ala Gin Thr Asp Pro Thr Thr Gly 580 585 590 Tyr Mg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin lie His Asn Asn Gly Gin 595 600 605 Ser Asp Phe Arg Pro Lys Asn Gly Arg His Ala Trp Ile Trp Bis Asp 610 615 620 Cys His Arg His Tyr His Ser Met Glu Vai Phe Thr His Tyr Asp Leu 625 630 635 640 Leu Asn Leu Asn Gly Thr Lys Vai Ala Glu Gly His Lys Ala Sar Phe 645 650 655 Cys Leu Glu Asp Thr Glu Cys Glu Gly Asp Ile Gin Lys Asn Tyr Glu 660 665 670 Cys Ala Mn Phe Gly Asp Gin Gly lie Thr Met Gly Cys Trp Asp Met 675 680 685 Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp vai Asp Ile Thr Asp Vai Pro 6SO 695 700 pro Gly Asp Tyr Leu Phe Gin vai Vai Ile Asn Pro Asn Phe Glu Vai 705 710 715 720 Ma Glu Ser Asp Tyr Ser Asn Asn Ilô Met Lys Cys Arg Ser Arg Tyr 725 730 735 Asp Gly His Arg Ile Trp Met Tyr Asn Cys His Ile Gly Gly Ser Phe 740 745 750 50

Ser 61¾ 61u Thr GXu Lys Lys Phe Glu His Phe Ser Gly Leu Leu Asn 755 760 765

Aan Gin Leu ser Pr© Gin 770

<210> 3 <211> 757 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 3 fíet Het Trp Pro Gin Pro Pro Thr Phe Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Gin Ala Pro Ser Ser Arg Pro Gin Ser Ser Gly Thr Lys Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Vai Gly FxO Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly Arg Leu Glu 35 40 45 Vai Leu His Gin Gly Gin Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asp Phe Ala 50 55 60 Leu Gin GXu Ala Thr Vai Ala Cys Arg Gin Leu Gly Phe Glu Ser Ala 65 70 75 80 Leu Thr Trp Ala His Ser Ala Lys Tyr Gly Gin Gly Glu Gly Pro Xie 85 90 95 Trp Leu Asp Asn Vai Arg Cys Leu Gly Thr Glu Lys Thr Leu Asp Gin 100 105 110 Cys Gly Ser Asn Gly Trp Gly lie Ser ASp Cys Arg Bis Ser Glu Asp 115 120 125 Vai Gly Vai Vai Cys His Pro Arg Arg Gin His Gly Tyr His Ser Glu 130 135 140 Lys Vai Ser Asn Ala Leu Gly Pro Gin Gly Arg Arg Leu Glu Glu Val 145 150 155 160 Arg Leu Lys Pro lie Leu Ale Ser Ala Lys Arg Bis Ser Pro Val Thr 165 170 175 51

Glu Gly Ala Vai Glu Vai Arg Tyr ISO Asp Gin Gly Trp Thr Met Asn Asn 195 200 Gly Phe Pro Ser Gin Thr Ser val 210 215 Trp Asn Leu Lys Met Lys Asp Pro 225 230 Lys Lys Asn Ser Phe Trp Xle His 245 Pro Eis Leu Ala Lys Cys Gin Vai 260 Leu Arg Pro Ala Cys Pro Gly Gly 275- 280 Ala Gly Pro Eis Phe Arg Arg Gin 290 295 Ser Eis Ala Glu Glu Léu Lys Vai 305 310 Gly Glu Gly Arg Vai Glu Vai Leu 325 Cys Asp Kis Arg Trp Asn Leu Ile 340 Leu Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu 355 360 Gin Gly Leu Gly Pro ile HiS leu 370 375 Glu Arg Thr Leu Gly Asp Cys Leu 385 390 Cys Gin Eis Ala Asn Asp Ala Ala 405 Gly Phe Gin Asn Lys Vai Arg Leu 420

Asp Gly His Trp Arg Gin Val Cys 185 190 Ser Arg val Val Cys Gly Met Leu 205 Asn Ser His Tyr Tyr Arg Lys Val 220 Lys Ser Arg Leu Asn Ser Leu Thr 23S 240 Arg Vai Asp Cys Phe Gly Thr Glu 250 255 Gin Vai Ala Pro Gly Arg Gly Lys 265 270 Met His Ala Val Val Ser Cys val 285 Lys Pro Lys Pro Thr Arg Lys Glu 300 Arg Leu Arg Ser Gly Ala Gin Val 315 320 Met Asn Arg Gin Trp Gly Thr Val 330 335 Ser Ala Ser Val Val Cys Arg Gin 345 350 Ala Xieu Phe Gly Ala Gin Leu Gly 365 Ser Glu val Arg Cys Arg Gly Tyr 380 Ala Leu Glu Gly Ser Gin Asn Gly 395 400 Vai Arg Cys Asn Ile Pro Asp Met 410 415 Ala Gly Gly Arg Asn Ser Glu Glu 425 430 52

Gly Val Val Giu Val Gin Val Glu Val Asn Gly Gly Pro Arg Trp Gly 435 440 445 Thr Val Cys Ser Asp Hiâ Trp Gly Leu Thr Glu Ala Ket Val Thr Cys 450 455 460 Arg Gin Leu Gly Leu Gly Phe Ala Asn Phe Ala Leu Lys Asp Thr Trp 465 470 4?5 480 Tyr Trp Gin Gly Thr Pro Glu Ala Lys Glu Val Val Met Ser Gly Val 485 490 495 Arg Cys Ser Gly Thr Glu Met Alá Leu Gin Gin Cys Gin Arg His Gly 500 505 510 Pro Val Ris Cys Ser Ris Gly Pro Gly Arg Phe Ser Ala Gly Val Ala 515 520 525 Cys Met Asn Ser Ala Pro Asp Leu Val Mefc Asn Ala Gin Leu Val Gin 530 535 540 Glu Thr Ala Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser Met Leu Tyr Cys Ala 545 550 555 560 Ris Giu Glu Aso Cys Leu Ser Lys Ser Ala Asp His Met Asp Trp Pro 565 570 575 Tyr Gly Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin lie Tyr Asn Leu 5B0 585 590 Gly Arg Ala Asp Phe Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp lie Trp SSS 600 605 Ris Gin Cys His Arg His Asn HiS Ser lie Glu Val Phe Thr His Tyr S10 615 620 Asp Léu Leu Thr Leu Asn Gly Ser Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala 625 630 635 640 Ser Phe Cys leu Glu Asp Thr Asn Cys Pro Ser Gly Val Gin Arg Arg 645 650 655 Tyr Ala Cys Ala Asn Phe Gly Glu Gin Gly Val Ala Val Gly Cys Trp 660 €65 670 Asp Thr Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp Val Asp Ile Thr Asp 6*75 600 685 Val Gly Pro Gly Asp Tyr Ile Phe Gin val Val Val Asn Pro Thr Asn 53

Val Gly Pro Gly Asp Tyr Ile phe Gin Val Vai Vai Asn Pro Thr Asn 690 695 700

Asp Val Ala Glu Ser Asp Phe Ser Asn Asn Met Ile Arg Cys Arg Cys 705 710 715 720

Lys Tyr Asp Gly Gin Arg Val Trp Leu His Asn Cys fiis Thr Gly Asp 725 730 735

Ser Tyr Arg Ala Asn Ala Glu Leu Ser Leu Glu Gin Glu Gin Arg Leu 740 745 750

Arg Asn Asn Leu Ile 755 <210> 4 <211> 2262 <212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4 stgeçacctg tcagfcgtctg geagtggsgc ccotggggoc tçctgcígtg cctgctgtgc 60 agfetcgtgct tggggtetcc gtceccttcc acgggcectg sgaageaggç cgggagccag 120

gggcttçggt' tceggctggc tggcttccçc aggaagccet acgagggccg cgtggagata ISO cagcgagcfcg gtgaatgggg cacoatctge gateatgact tceogctgca ggctgcccac 240 atcetotgee gggagçtggg cttcaeacag gccacaggct ggacacacag tgccaastat 300 ggccctggaa caggccgcat ctggetggac aacttgagct gcagtgggac cgogcagagt 360 gtgactgaat gtgcctcccg gggetggggg aacagtgsct gtacgoscga tgaggatgct 420 ggggtcatct gcaaagaeca acgcctccct ggcttetcgg aetecaatgt cattgsggta 480 gagcatcaec tgcaagtgga ggaggtgoga actcgacccg ccgttgggtg gggcagâcga 540 cccctgoccf tgacggaggg getggtggaa gtcaggcttc etgacggctg gtcgc&sgtg 600 tgcgacaaag gctggagcgc ccacaacaçc cacgtggtct gcgggatgct gggctteece 6S0 agegaaaaga gggteaacgo ggccttctac aggctgctag cccaacggca gcaacactcc 720

tstggfcctgc afcggggtgge gtgcgtgggc acggaggccc acetctecct ctgtfccoCg 7SQ gagttctatc gtgccaatga cscçgccagg tgccçtgggg ggcgccctgc agtggtgagc 340 tgtgtgccag gccotgtcta cgcggcatcc agtggccsça agasgcaaca acagtcgaag 900 ccteagççgg aggcccgtgt ccgtctaaag agcggcgccc accctggaga gggccgggta 960 gaagtcctga aggccagcac atggggcaoa gtctgfcgaec gcaagtggga cctgcatgcs 1020

gccagcgtgg tgtgtcggga gctgggcttc gçgagtgctc gagaagctct çagtçgcgct 10$O 54 cgcatggçgç agggcatggg tgctatccac etgagtgaag ttcgctgctc tggacaçg; ctctccctct ggaagtgcec ceacaagaac ateacagctg aggattgttc acatagccag 1200 gatgccgggg tccggtgcaa cctaccttac actçgggcag agaccaggat ccgacfccagt 1260 gggggccgca gccaacatga ggggcgagtc gaggtgcaaa taggggçacc tgggeecctt 2320 cgctggggec tcatctgtgg ggatgâctgg gggaccctgg aggccatggt ggçctgtagg 1380 caactgggtc tgggctacgc caaccacggc ctgcaggaga cctggtactg ggactctggg 1440 aatataacsg aggcggtgat gagtggagtg cgctgcacag ggactgaget gtçcstggat 1500 cagtgtgccc atcatggcac ccacatcacc tgcaagagga cagggacccg cttcaotgct 1500 ggagtcatct gttctgagac tgcatcagat ctgttgctge actcagcact ggtgcaggag 1620 accgcctaca tcgaagaccg gcccctgcat atgttgtaet gtgetgcgga agagaactgc 1880 ctggceagct eagceegctc agccaactgg ccctatggtc accggcgtct gctcçgattc 1740 fccctcccaga tccacaacct gggacgagct gacttcaggc ecasggctgg gcgccâctcc 1800 Cgggtgtggc acgagtgcca tgggcattac cacagcatgg acatcttcac tcactatgat 1860 atcctcaccç caâatggcac caaggtggct gagggccaca aagctagttt ctgtetcgaa 1920 gacactgagt gtcaggagga tgtctccaag cggtatgagt gtgccaactt tggagagcaa 1980 ggcatcactg tgggttgctg ggatctctac cggeatgaca ttgactgtca gtggattgag 2040 «tcacggafcg tgaagccagg aaactacatt ctccaggttg tcatcaaccc aaacfctfcgaa 2100 gtagcagaga gtgactfctac caaçaatgca atgaaatgtâ actgcaaata tgatggacat 2160 agaatctggg tgcácaactg ccacattggt gatgçcttca gtgaagaggc caacaggagg 2220 tttgaacgct accetggcca gaccagcaac cagattatct aa 2262 <210> 5 <211> 1725 <212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 5 atggctctgg cccgaggcag ecggcagctg ggggccctgg tgtggggcgc ctgcctgtgc 80 gtgetggfcgc acgggeagca ggcgcagccc gggcagggct cggaccccgc ccgçtggcgg 120 cagctgatcc agtgggagaa caacgggcag gtgtacagct tgctcaactc gggctcagag 180 tacgtgccgg ccggacctca gcgctccg&g agtagctccc gggtgetgct ggceggcgcg 240 ccccsggccc agcagcggcg cagçcacggg agcccceggc gtcggcaggc gecgtccctg 300 ceoctgccgg ggcgcgtggg ctcggacaçe gtgcgcggcc aggcgcggca cccattcggc 360 55 tttggccagg t.gcccgacaa ctggcgcgag gtggccgtcg gggacagcac gggcatgg< ctggcccgca cetccgtctc ccagcaacgg cacgggggct cegccfccctc ggtctcggct 480 tcggeettog céagcaccta ccgccagcag ccctcctacc cgoagcagtt eccctaeecg 540 caggcgccct tcgtcagcca gtacgagaac taegaecccg cgtcgcggac ctacgaecag eoo ggtttcgfcgfc actacçggoe cgcgggcggc ggçgtgggcg ç-gggggcggc ggccgtggcc €60 tcggcggggg tcatctaeen etaccagccc cgggcçcgct aegaggagta cggcggcgçc 720 gaagagçtgc ccgagtaccc gcctcagggc ttctaeccgg cccccgagag gecctacgtg 780 ccgccgccgc cgcçgcccce cgacggcctg gaccgcegct actcgcacag totgtacagc 840 gagggcaccc ccggcttcga geaggcctae ectgaccccg gtcccgaggc ggcgcaggcc 900 catggcggag acccacgcct g«gcfcggtâc cegecetacg ccaacccgcc gcccgaggcg 960 tacgggccgc cgegcgcgct ggsgocgccc tacctgccgg tgcgcagctc cgacácgcCc 1020 ccgccgggtg gggagcggaa cggcgcgcag cãgggccgcc tcagcgtagg cagcgtgtac 1080 eggeccaacc ag&acggacg cggtctccct gacttggtec cagaccccaa ctatgtgcaa 1140 gcatecactt atgtgcagag açcccacctg tactccctgc gctgtgctgc ggaggegaag 1200 tgtctggeea gcacagecta tgcccctgag gccaccgaet acgatgtgeg ggtgctactg 1260 egcttcccec sgegegtgaa gaaccagggc acagaagaet tcctccccaa ccggccacgg 1320 cacacctgçg agtggcaeag ctgccacç&g cattaccaca geatggaege gttcagscac 1380 taegacctae tggatgcagc eaeaggcaag aaggtggecg âgggccacaa ggccagtttc 1440 tgcctggagg acageaectg tgacttcggc aacctcaagc gstatgcatg çaoetetcat 1500 acccagggce tgagcccagg ctgctatgae aectacaatg cggacatcga ctgccagtgg 1560 afcegaeataa cçgacgtgca gcctgggaac tacatectca aggtgcaegt gaacecaaag 1620 tatattgttt tggagtctga cttcaeeaae aacgtggtga gatgca&çat tcactacaca 1680 ggtcgetacg tfctCtgcaac aaactgcaaa attgtccaat cctga 1725

<210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Ala Leu Ala Arg Gly Ser Arg Gin Leu Giy Ala Leu Vai Trp Sly 1 5 10 15

Ala Cys Leu Cys Vai Leu Vai His Gly Gin Gin Ala Gin Pro Gly Gin 20 25 30 56

Gly ser Asp Pro Ala Arg Trp Arg Gin Leu Xle Gin Trp Glu Asn h$n 35 40 45

Gly Gin Vai Tyr Ser Leu Leu Asn Ser Gly Ser Glu Tyr Vai Pro Ala 50 55 50

Gly Pro Gin Arg Ser Glu Ser Ser Ser Arg Vai Leu Leu Ala Gly Ala 65 ?Q “?5 80

Pro Gin Ala Sln Gin Ara Arg Ser His Gly Ser Pro Arg Arg Arg Gin 85 90 95

Ala Pro Ser Leu Pro Leu Pro Gly Arg Vai Gly Ser Asp Thr Vai Arg 100 105 110

Gly Gin Ala Arg Ais Pro Phe Gly Pbe Gly Gin Vai Pro Asp Asn Trp 115 120 125

Arg Glu Vai Ala Vai Gly Asp Ser Thr Gly Met Ala Leu Ala Arg Thr 130 135 140

Ser Vai Ser Gin Gin Arg His Gly Gly Ser Alá Ser Ser Vai Ser Ala 145 150 155 160

Ser Ala Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Gin Gin Pro Ser Tyr Pro Gin Gin 165 170 1?5

Phe Pro Tyr Pro Gin Ala Pro Phe Vai Ser Gin Tyr Glu Asn Tyr Asp 180 185 ISO

Pro Ala Ser Arg Thr Tyr Asp Gin Gly Phe Vai Tyr Tyr Ara Pro Ala 195 200 205

Gly Gly Gly vai Gly Ala Gly Ala Ala Ala vai Ala ser Ala Gly vai 210 215 220

Xle Tyr Pro Tyr Gin Pro Arg Ala Arg Tyr Glu Glu Tyr Gly Gly Gly 225 230 235 240

Glu Glu Leu Pro Glu Tyr Pro Pro Gin Gly Phe Tyr Fro Ala Pro Glu 245 250 255

Arg Fro Tyr Vai Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gly Leu Asp Arg 260 265 270

Arg Tyr Ser His Ser Leu Tyr Sar Glu Gly Thr Pro Gly Phe Glu Gin 275 280 285 57

Ala Tyr Pro Asp Pro Gly Pro Glu Ala Ala Gin Ala His Gly Gly Asp 290 295 300 Pro Arg Leu Gly Trp Tyr Pro Pro Tyr Ala Asn Pro Pro Pro Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Gly Pro Pro Arg Ala Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Vai Arg Ser 325 330 335 Ser Asp Thr Pro Pro Pro Gly Gly Glu Arg Asn Gly Ala Gin Gin Gly 340 345 350 Arg Leu Ser Vai Gly Ser Vai Tyr Arg Pro Asn Gin Asn Gly Arg Gly 355 360 365 Leu Pro Asp Leu Vai Pro Asp Pro Asn Tyr Vai Gin Ala Ser Thr Tyr 370 375 380 vai Gin Arg Ala His Leu Tyr Ser Leu Arg Cys Ala Ala Glu Glu Lvs 385 330 395 400 Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Vai 405 410 415 Arg Vai Leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg Vai Lys Asn Gin Gly Thr Ala 420 425 430 Asp Phe Leu Pro Asn Arg Pro Arg Hís Thr Trp Glu Trp His Ser Cys 435 440 445 Bis Gin Bis Tyr His Ser Met ftsp Glu Phe Ser Bis Tyr Asp Leu Leu 4SÔ 455 460 - Asp Ala Ala Thr Gly Lys Lys .Vai Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 465 470 475 480 Cys Leu Glu Asp Ser Thr Cys Asp Phe Gly Asn Leu Lys Arg Tyr Ala 485 490 495 Cys Thr Ser His Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr Asp Thr Tyr 500 505 510 Asn Ala Asp lie Asp Cys G.l» Trp Ile Asp Ile Thr Asp Vai Gin Pro 515 520 ' 525 Gly Asn Tyr Ile Leu Lys Vai Bis Vai Asn Pro Lys Tyr lie Vai Leu 530 535 540 58

Glu Ser Asp Phe Thr Mo Asm Vai Vai Arg Cys Mn Ils His Tyr Thr 545 550 555 560

Giy Arg tyr Vai Ser Ala thr Aan Cys Lys Ile Vai Gin Ser 565 570 <210> 7 <211> 1254 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgcgcttcg cctggaccçt gotcctgote gggcctttgc agetctgcgc gctagtgcac 60 tgcgeccctc cegccgcccg ccaacãgcag cccccgcgeg agcegecggc ggctccgggc 120 gcctggcgce aocagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg 180 gçrctcacagt accagccfcca gcgccgccgg gaeccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc 240 aaegccfcccg cccagcaçcc ccgcacteeg átcetgcfcg» tcegcgacaa ccgcaccgçe 300 ggcggacggc cçgctcatct ggagtcaecg ctggecgccc caggcccacc 360 gcccgtcaot ggttccaagc tggctactcg acatctagag cccgcgaagc tggçgccteg 420 egcgcggaga accagacagc gccgggagaa gttcctgegc tcagtaacet gcggeogeec 480 agcegcgtgg acggçatggt gggogacgac ccttacaacc cctacasgta ctctgaççjac 540 sacecttatt acaactacta cgatactt-at gaaaggccca gacctggggg caggtaccçg 600 cceggataeg gcactggcts cttccagtac ggtctcccag accfcggtgge çgacccctac 660 tacatecagg egtceacgfca cgtgcagaag atçtccatgt acaacctgag atgcgcggcg 720 gaggaaaact gtetggecag tacageafcac agggcagarg tcagagatta tgatcacagg 180 gtgctgetea cattccccca aagagtgaaa aaccaaggga catcagattt cttaccaagc 840 cgaccaagat attcctggga atggcaeaçt rgícatcaae attaceacag tatggatgag 900 tttsgeeaet ãtgacçtgct tgafcgecaac acccagagga gagtggctga aggccãcaaâ 960 gcaagtttct gtsttgaaga cacaicctgt gactatggct accscaggcg atttgçátgt 1020 actgcacaca cacagggatt gagtcctggc tgttatgata cctatggtgc agacatagac 1080 tgecagtgga ttgatâttac açatgtaasa cctggaaact atateetaaa ggtcagtgta 1140 aaccccdgct aoctggttoc tgsatetgae tataccaaca atgttgfcgcg ctgttgacatrt 1200 cgctacacag gecatcatgc gtatgcctca ggctgcacaa tttcâccgta ttag 1254 <210> 8 <211> 417

<212> PRT <213> Homo sapiens 59 <400> 8

Met Arg Phe Ala Trp Thr Vai 1 5

Leu Leu Gly Pro Leu Gin Leu Cys 10 15

Ala leu Vai fiis Cvs Ala Pro 20

Ala Ala Gly Gin Gin Gin Pro Pro 25 30

Arg Glu Pro Pro Ala Ala Pro 35

Ala Trp Arg Gin Gin Ile Gin Trp 45

Glu Asn Asn Gly Gin Vai Phe 50 . 55

Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gin Tyr 60

Gin Pro Gin Arg Arg Arg Asp 65 70 Asn Ala Ser Ma Gin Gin Pro 85 Asn Arg Thr Ala Ala Ala Arg 100 * Thr Ala Gly Arg Pro Arg Pro ns Tyr Ser Thr Ser Arg Ala Arg 130 135 Gin Thr Ala Pro 01 y Glu vai 145 150 Ser Arg Vai Asp Gly Met vai 165 Tyr Ser Asp Asp Asn Pro Tyr 180 Pro Arg Pro Gly Gly Axg Tyr 195 Gin Tyr Gly Leu Pro Asp Leu 210 215

Gly Ala Ala Vai Pro Gly Ala Ala 75 80

Thr Pro Ile Leu Leu Ile Arg Asp 90 95

Arg Thr Ala Gly Ser Ser Gly Vai 105 110

Ma Arg His Trp Phe Gin Ala Gly 125

Ma Gly Ma Ser Arg Ala Glu hm 140

Ala Leu Ser &$n Leu Arg Pro pro 155 160

Asp Asp Pro Tyr Asn Pro Tyr Lys 170 175

Asn Tyr Tyr Asp Thr Tyr Glu Arg 185 ISO

Pro Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Phe 205

Ala Asp Pro Tyr Tyr Ile Gin Ma 220 60

Ser Thr Tyr Vai Gin Lys Met Ser Met Tyr Asn Leu Arg Cys Ala Ala 225 230 235 240

Glu Glu Asa Cys Leu Ala Ser Thr Ma Tyr Arg Ala Asp Vai Arg Asp 245 250 255

Tyr Asp His Arg Vai Leu Leu Arg £?he Pro Gin Arg Vai Lys Asn Gin 260 265 270

Gly Thr Ser Asp The Leu Pro Ser Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu Trp 275 280 295

His Ser Cys Bis Gin Hís Tyr Bis Ser Met Asp Glu Phe Ser His Tyr 290 295 300

Asp Leu Leu Asp Ala Asn Thr Gin Arg Arg Vai Ala Glu Gly His Lys 305 310 315 320

Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His Arg 325 330 335

Arg Phe Ala Cys Thr Ala Bis Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr 340 345 350

Asp Thr Tyr Gly Ala Asp Ile Asp Cys Gin Trp Ile Asp Ile Thr Asp 355 360 365

Vai Lys Pro Gly Asn Tyr Xle Leu Lys Vai Ser Vai Asn Pro Ser Tyr 370 375 380

Leu Vai Pro Glu Ser Asp Tyr Thr Asn Asn vai Vai Arg Cys Asp Ile 385 330 395 400

Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Thr Ile Ser Pro 405 410 415

Tyr

<210> 9 <211> 752 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 9

Het Arg Pro Vai Ser Vai Trp Gin Trp Ser Pro Trp Gly Leu Leu Leu 61 5 10 15

Cys Leu Leu Cys Ser Ser Cys Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gly 20 25 30

Pro Glu Lys Lys Ma Gly Ser Gin Gly Leu Arg Phe Arg Leu Ala Gly 35 4Ô 45

Phe Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Gly Arg Vai Glu Xle Gin Arg Ala Gly 50 55 60

Glu Trp Gly Thr 11« Cys Asp Asp Asp Phe Thr Leu Glft Ala Ala Bis 65 70 75 80

Xle Leu Cys Arg Glu Leu Gly Phe Thr Glu Ala Thr Gly Trp Thr Bis 85 90 95

Ser Ala Lys Tyr Gly Pro Gly Thr Gly Arg Xle Trp Leu Asp Asn Leu 100 105 110

Ser Cys Ser Gly Thr Glu Gin Ser Vai Thr Glu Cys Ala Ser Arg Gly 115 120 125

Trp Gly Asn Ser Asp Cys Thr His Asp Glu Asp Ala Gly Vai Xle Cys 130 135 140

Lys Asp Gin Arg Leu Pro Gly Phe Ser Asp Ser Asn vai He Glu Vai 145 150 155 160

Glu His His Leu Gin Vai Glu Glu Vai Arg Xle Arg Pro Ala Vai Gly 165 170 175

Trp Gly Arg Arg Pro Leu Pro Vai Thr Glu Gly Leu Vgl Glu Vai Arg 180 185 190

Leu Pro Asp Gly Trp Ser Gin Vai Cys Asp Lys Gly Trp Ser Ala Bis 195 200 205

Asa Ser His Vai Vai Cys Gly Met Leu Gly Phe Pro Ser Glu Lys Arg 210 215 220,

Vai Asn Ala Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Ala Gin Arg Gin Gin His Ser 225 230 235 240

Phe Gly Leu His Gly Vai Ala Cys Vai Gly Thr Glu Ala His Leu Ser 245 250 255

Leu Cys Ser Leu Glu Phe Tyr Arg Ala Asn Asp Thr Ala Arg Cys Pro 260 265 270 62

Gly Gly Gly Pro Ala Val Vai Ser Cys Val Pro Gly Pro Vai Tyr Ma 275 280 285 Ala Ser Ser Gly Gin Lys Lys Gin Gin Sln Ser Lys Pro Gin Gly Glu 290 295 300 Ala Arg Val Arg Leu Lys Gly Gly Ma ais Pro Gly Glu Gly Arg Val 30S 310 315 320 Glu val Leu Lys Ma Ser Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Arg Lys Trp 325 330 335 Asp Leu His Ma Ala Ser vai Val Cya Arg Glu Leu Gly Phe Gly Ser 340 345 350 Ma Arg Glu Ala Xeu Ser Gly Ala Arg Met Gly Gin Gly Met Gly Ala 355 360 365 Ile His Leu Ser Glu Val Arg Cys Ser Gly Gin Glu Leu Ser Leu Trp 370 375 380 Lys Cya Pro His Lys Asn lie Thr Ma Glu Asp Cys Ser His Ser Gin 385 390 395 400 Asp Ala Gly Val Arg Cys Asft Leu Pr o Tyr Thr Gly Ala Gru Thr Arg 405 410 415 Πβ Arg Leu Ser Gly Gly Arg Ser Gin His Glu Gly Arg Val Glu Val 420 4 25 430 61» n« Gly Gly Pro Gly Pro Leu Arg Trp Gly Leu Ile Cys Gly Asp 435 440 445 Asp Trp Gly Thr Leu Glu Ala Met Val Ala Cys Arg Glu Leu Gly Leu 450 455 460 Gly Tyr Ala Asn His Gly Leu Gin Glu Thr Trp Tyr Trp Asp Ser Gly 465 470 475 480 Asn Ile Thr Glu Val Val Met Ser Gly Val Arg Cys Thr Gly Thr Glu 485 490 495 Leu Ser Leu A$p Gin Cys Ma His His Gly Thr His Ile Thr Cys Lys 500 505 510 Arg TltlE Gly Thr Arg Phe Thr Ala Gly Val Ile Cys Ser Glu Thr Ala 515 520 525 63

Ser Asp Leu Leu Leu His Ser Ala Leu Val Gin Glu Thr Ala Tyr Ile 530 535 540 Glu Asp Arg Pro Leu His Met Leu Tyr Cys Ala Ala Glu Glu Asn Cys 545 550 555 560 Leu Ala Sex Ser Ala Arg Sex Ala Asn Trp Pro Tyr Gly His Arg Arg 565 570 575 Leu Leu Axg Phe Ser Ser Gin Ile His Asn Leu Gly Arg Ala Asp Phe 580 585 590 Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp Val Trp His Glu Cys His Giy 535 600 605 His Tyr His Ser Met Asp Ile Phe Thr His Tyr Asp Ile Leu Thr Pro 610 615 620 Asn Gly Thr Lys Vai Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe Cys Leu Glu 625 630 635 640 Asp Thr Glu Cys Gin Glu Asp Vai Ser Lys Arg Tyr Glu Cys Ala Asn 645 650 655 Phe Gly Glu Glft Gly lie Thr Val Gly Cys Trp Asp Leu Tyr Arg HiS 660 665 670 Asp ne Asp Cys Gin Trp Ile Asp lie Thr Asp Val, Lys Pro Gly Asn 675 680 685 Tyr Ile Leu Gin Vai Vai Ile Asn Pro Asn Phe Glu Val Ala Glu Ser 630 695 700 Asp Phe Thr Asn Asn Ala Met Lys Cys Asn Cys Lys Tyr Asp Gly His 705 TiO 715 720 Arg Ile Trp Vai HÍS Asn Cys His Ile Gly Asp Ala Phe Ser Glu Glu 725 730 735 Ala Asn Arg Arg Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Gin Thr Ser Asn Gin Ile 740 745 750 Lisboa, 11 de Março de 20: 11

Claims (3)

00.Φ ÍL H > *4 0«R3«< Qa»a · · £2333. · «eal < mO 0, tu a si o « ta íj <j *T « . · Õs O • · Cl) Ou · «« • -TOO · O <« • · «Λ • ·5Β«4 • - as> A K • ·&« * · »« * . > to « 5«iM bf m es t j"ff S; u M fí S ft H>twB · mp1! ê*S M> 6/7 a sv<S > « fôW WST.. Ί9- νΛ ^ w . s«> ta i.. 10· ÍJ«í>teS3 '.x. Et ís* tt> *“ te {? te te ΓΚΗ3>*. 5*» “.SOU & «Ésísení?!# > a £> fete.J* . & .&* &$ ?***£$!>>< í^srs sr*k wíSí SHHSSíSí «fe « W «V. ©> ' X SM Otí! te> >* ir#srs3r® Sei*» <κ ά «a #4® te «f ft. Μ *4 νΛ δ£ * MS$ - íiltfk ' “ “ - <*% «4 (te«i« ‘5-i., 'S,KS Y \»*S M*w> lS»iSÍ' ® Í.U.Í *0 Uij s\WAVMVMAU\VAy rf S A ^V' 4« *< ««* » íOm^OpC ¢5¾ <SP £3fOí « »ϊ> « c>< ώ» « ® Κ'ΧνΛ\\{a;« ÍUftfM ,vi ία s,íw I*í «a &,$?;* te ff<W •sft«í.ftftS» tx Síi «£t? ® í,.'M «f t#M«H > > v $4$ « * £íK&>-'% * X 4QQ + ^ J^í Sí, f-Y jRS > çs*«®§ * δί»«ϊ κ ÍK * j&sKfc y; te * JWJpSTJÇJJrtep .'jf. fâ te Jj5vt<”¥«5 W: fcsssiB p A í? èm A: ijjt. fa* S* ><*ίβΒ$ι f íft < o·» *s « ss «a í- W fc? & a? ' SfK*:: «te**·*» * ««te*»'****'» * <* * *4 »í SÍ · - ».*i.«t.i»:*Ê.:.-í. * $«* VÍ5;0 $*<£<«4 ST ψ ^Tfj ?5rs* * te !«> &* :ae?s ¢:¾ e<! * >te te te SkfSUí SS it ™ tv ».3; « ^ <(ííSis* Jt t & ίβΑ amí * W&&# &»fes $«*$»; ^'ij.ieí (¾ (i? ft> ^4 #4j © # *$ ftíí!3»fe Ϋί / V As \ S> · W fcw*· *3 rti <** 5 b ^sr^í» !.i?s Cl· $S£ ^8¾ 8 WC ví & tft «Ϊ sj P,&JLS,íSi*: ' J-Vs·· >;· <\.A%. <^'3·*· Ηχ íí ^S,..iU! í-W^wS ÍX H*W;tí} XX S*1Ç, »> fcy χχ! ^ i£í«p jS( u «í aí tes& )*; ís «s <«f ^jk a ss «t a jís? VS> W \.r fites Í>S >'X <-t? t> tx t S íTIv^ ’,í|íw |Ís'mÍ.«K* te íx »* »»te* SRWSS Èrjsteíf·^^ ÍT , ϊ Λ XM %Xm Jte *£jg I *’:^.-17^., ..J, *(4 «s» )ws (Continuação). QD ji·os I i $k >S»Afililli »♦»* + :í 7/7
1. ^........... 1 AO 4 W rl111 I ]; Expressão de RNA (Unidades arbitrárias)

   1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica contendo uma molécula útil para regular negativamente um nivel de tecido e/ou actividade de lisil-oxidase LOR-1 (SEQ ID. NO: 2) para uso num método de supressão de crescimento tumoral e de metástases e/ou tratar fibrose hepática em que a referida molécula é seleccionada a partir de (a) um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de se ligar a, e inibindo pelo menos parcialmente a actividade da LOR-1; (b) um oligonucleótido sintético que hibridiza com DNA de cadeia dupla do gene LOR-1; (c) um oligonucleótido antisentido ou análogo que previne a transcrição de mRNA de LOR-1, previne a tradução de mRNA de LOR-1, conduz à clivagem enzimática de um hibrido com mRNA de LOR-1, ou conduz a interferência com o processo de excisão ("splicing") correcto do mRNA de LOR-1; (d) uma ribozima que inibe a expressão de LOR-1 por clivagem de mRNA de LOR-1; (e) um oligonucleótido de RNA que activa mecanismos de interferência de RNA (RNAi) contra LOR-1; e (f) uma construção de ácido nucleico que expressa o oligonucleótido antisentido de (c).
2. 2/7

   Ar&a do tumor (cm2)

   3/7

   MAU* A ·Μ· riÉÉÉl V tf Fig. 5a Fig. 5b

   Fig. 6c Fig. 6d 4/7

   5/7

   «•fe iJs Í; ’" m asna; Gd som* MKK οίκο iaS O eÇ qa> a «. 1 * 3»

   OOiS · H *3ÈÍ ' ϊβΗ «ióâ > êe ee ' atioj 44Q · IB ιβ & β η OW ώ · a» * ο . * . «ο · · ΧΕ* * * mm * · & Éb * * ftmw &·]£' U'l *U ' · Ψ W*H 0*00 · &< ate >0*4 < uo^ < ama < • ti .4 >a>3 < Au, < •υΑ »4«s < >*3» < »*ϊ£* · feOá β-ϊϊίι - λ raa o tta a> >3 3 · aas ιΐ3 »4> ta cd »4> & & «•ra ei tt *43 A * < -A ' X * Os

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   2. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou o referido fragmento de anticorpo é dirigido contra pelo menos uma parte do polipéptido indicado na SEQ ID NO: 2. 2

   3. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o referido oligonucleótido sintético ou o referido oligonucleótido antisentido é um oligonucleótido de DNA, RNA ou PNA.

   4. Composição farmacêutica da reivindicação 3, em que o referido oligonucleótido é pelo menos parcialmente complementar com o polinucleótido indicado na SEQ ID NO: 1.

   5. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida fibrose hepática está associada à doença de Wilson.

   6. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido tumor é tumor da mama.

   7. Uso de uma molécula capaz de regular negativamente um nivel de tecido e/ou actividade da lisil-oxidase LOR-1 (SEQ ID. NO: 2) para o fabrico de um medicamento para suprimir o crescimento tumoral e de metástases, e/ou tratar fibrose hepática, em que a referida molécula é seleccionada a partir de (a) um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de se ligar a, e inibindo pelo menos parcialmente a actividade da LOR-1; (b) um oligonucleótido sintético que hibridiza com DNA de cadeira dupla do gene LOR-1; (c) um oligonucleótido antisentido ou análogo que previne a transcrição de mRNA de LOR-1, previne a tradução de mRNA de LOR-1, conduz à clivagem enzimática de um hibrido com mRNA de LOR-1, ou conduz a 3 interferência com o processo de excisão ("splicing") correcto do mRNA de LOR-1; (d) uma ribozima que inibe a expressão de LOR-1 por clivagem de mRNA de LOR-1; (e) um oligonucleótido de RNA que activa os mecanismos de interferência de RNA (RNAi) contra LOR-1; e (f) uma construção de ácido nucleico que expressa o oligonucleótido antisentido de (c). 8. 0 uso da reivindicação 7, em que o referido anticorpo ou o referido fragmento de anticorpo é dirigido contra pelo menos uma porção de polipéptido indicado na SEQ ID NO: 2. 9. 0 uso da reivindicação 7, em que o referido oligonucleótido sintético ou o referido oligonucleótido antisentido é um oligonucleótido de DNA, RNA ou PNA.

   10. O uso da reivindicação 9, em que o referido oligonucleótido é pelo menos parcialmente complementar com o polinucleótido indicado na SEQ ID NO: 1. 11. 0 uso de qualquer uma das reivindicações 7-10, em que a referida fibrose hepática está associada à doença de Wilson.

   12. O uso de qualquer uma das reivindicações 7-10, em que o referido tumor é tumor da mama.

   13. Método de identificação de moléculas capazes de modular a angiogénese, o método compreendendo: (a) isolar moléculas que apresentem reactividade especifica com lisil-oxidase LOR-1; e 4 (b) testar as referidas moléculas dentro de tecido de mamífero de modo a determinar a sua actividade de modulação da angiogénese.

   14. Método da reivindicação 13, em que o passo (a) é efectuado por ensaios de ligação e/ou ensaios de actividade da lisil-oxidase.

   15. Método de determinação da malignidade de tecido canceroso, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão e/ou actividade da lisil-oxidase LOR-1 do tecido canceroso, e (b) comparar o referido nível de expressão e/ou actividade da lisil-oxidase LOR-1 com aqueles determinados para tecidos controlo para assim determinar a malignidade do tecido canceroso. Lisboa, 11 de Março de 2011 1/7 1 2' a 4 s
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