PT2179040E - Composições e métodos para tratamento de tumores, fibrose e proteinose alveolar pulmonar - Google Patents

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Description

ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Composições e métodos para tratamento de tumores, fibrose e proteinose alveolar pulmonar" A presente invenção refere-se a uma composição para utilização na inibição de fibrose num individuo de acordo com a reivindicação 1, a um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 10, a um vector de expressão de acordo com a reivindicação 13 e a uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14. A lisil-oxidase (LO ou LOX) é uma amina-oxidase contendo cobre que oxida substratos de amina primária a aldeídos reactivos. A LOX catalisa a desaminação oxidativa de resíduos de peptidil-lisina e hidroxilisina originando colagénios, e de resíduos de peptidil-lisina originando elastina, e auxilia na formação da matriz extracelular. Os resultantes peptidil-aldeídos tipicamente condensam e sofrem reacções de oxidação para formar as reticulações covalentes derivadas de lisina necessárias para a integridade estrutural normal da matriz extracelular. São usualmente libertados peróxido de hidrogénio (H202) e amónio em quantidades estequiométricas com o produto peptidil-aldeído. A LOX pode oxidar determinados resíduos de lisina em colagénio e elastina fora da célula; contudo, pode também actuar intracelularmente, onde pode regular a expressão génica. Em adição, a LOX pode induzir quimiotaxia de monócitos, fibroblastos e células do músculo liso. A LOX pode, ela própria, ser induzida por vários factores de crescimento e esteróides tais como o TGF-β, o TNF-α e o interferão (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). A LOX foi também implicada em diversas funções biológicas tais como a regulação do desenvolvimento, a supressão tumoral, a mobilidade celular e a senescência celular. O papel diverso da LOX e dos recentemente identificados membros da sua família de amino-oxidases, proteínas relacionadas com lisil-oxidase ou semelhantes a lisil-oxidase (LOR ou LOXL), podem desempenhar importantes papéis em relação à sua localização intracelular e extracelular. 2 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ A expressão ou implicação de LOX e LOXL em doenças pode também variar. Isto pode ser devido a várias razões, tais como a diferença na distribuição pelos tecidos, no processamento, nos domínios, na regulação de actividade, assim como a outras diferenças entre as proteínas. Por exemplo, a LOX e a LOXL estão implicadas em doenças fibróticas pois tanto a LOX como a LOXL são altamente expressas em mio-fibroblastos em torno de áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190:910-919 (1994); Murawaki et al., Hepatology 14:1167-1173 (1991); Siegel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 2945-2949 (1918); Jourdan Le-Saux et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 199:587-592 (1994); Kim et al., J. Cell Biochem. 72:181-188 (1999)) . A LOX e as várias LOXL estão também implicadas em vários cancros. Por exemplo, mostrou-se que a LOXL e a LOXL4 são epigeneticamente silenciadas e podem inibir a via de sinalização de quinases regulada por ras/sinais extracelulares no cancro da bexiga humano (Wu et al., Câncer Res. 67:4123-4129 (2007)). Outros demonstraram uma supra-regulação e amplificação selectivas do gene da LOXL4 no carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (Gorough et al., J. Pathol. 212:74-82 (2007)). A LOX e a LOX2 foram também implicadas em vários tumores, tais como os cancros do cólon e esofágico (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. T0:l-32 (2001)). No cancro da mama, os membros da família da LOX e da LOXL foram ligados ao cancro (Kirschmann et al., Câncer Res. 62:448-4483 (2002)) .
Peinado Hector et al. referem-se a um papel molecular para a enzima semelhante a lisil-oxidase 2 na regulação de snail e progressão tumoral, Emho Journal, Oxford university press Surrey, Gb, vol. 24, n.° 19, 1 de Outubro 2005, páginas 3446-3458. US 2007/021365 divulga métodos de identificação de inibidores de lisil-oxidase e a utilização destes inibidores para prevenir e tratar tumores, particularmente tumores metastáticos, individualmente e em combinação com agentes quimioterapêuticos. É adicionalmente divulgada a utilização dos níveis de lisil-oxidase para medir o potencial metastático e a sobrevivência. 3 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ W0 2007/126457 descreve métodos, composições e kits proporcionados para eficazmente tratar e prevenir a metástase de cancros in vivo e para aumentar a sobrevivência de indivíduos sofredores de tumores metastáticos tendo como alvo uma lisil-oxidase ou um seu modulador, especialmente lisil-oxidase humana. São também proporcionados métodos para a identificação de inibidores de lisil-oxidase e a utilização destes inibidores para prevenir e tratar tumores, particularmente tumores metastáticos, individualmente e em combinação com agentes quimioterapêuticos. É adicionalmente divulgada a utilização dos níveis de lisil-oxidase para medir o potencial metastático e a sobrevivência. A base de dados EMBL (online) de 28 de Outubro de 2008 refere uma sequência 15133 da Patente W02004061423. WO 2004/061423 refere-se a composições, equipamento, e a métodos para o prognóstico, diagnóstico, prevenção ou tratamento do cancro do cólon. São identificados os genes do cancro do cólon que são diferencialmente expressos nos tecidos do cancro do cólon relativamente a tecidos não doentes. Os exemplos destes genes estão ilustrados nas Tabelas 1-5. Os genes do cancro do cólon da presente invenção e seus produtos codificados podem ser utilizados como marcadores ou agentes profilácticos ou terapêuticos para a detecção ou tratamento do cancro do cólon.
Assim, existe uma necessidade de composições e métodos para modular a actividade de LOX e LOXL. Um destes métodos é através da utilização de interferência de ARN (iARN, ou RNAi do inglês) . A iARN refere-se a métodos de silenciamento de genes após a transcrição específico de sequências que é mediado por um ARN de cadeia dupla (ARNcd, ou dsRNA do inglês) denominado um ARN de interferência pequeno (ARNip ou siRNA do inglês) . A iARN é um mecanismo endógeno que utiliza ARN não codificantes pequenos para silenciar a expressão de genes. Quando um ARNip é introduzido numa célula, liga-se à maquinaria endógena da iARN para alterar o nível de sequências complementares contendo ARNm (ou mRNA do inglês) com elevada especificidade. A resposta da iARN envolve um complexo de endonucleases conhecido como o complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC) , que medeia a clivagem de um ARN de 4 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ cadeia simples complementar da cadeia anti-sentido da dúplice de ARNip. A clivagem do ARN alvo ocorre no meio da região complementar da cadeia anti-sentido da dúplice de ARNip (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188-200, (2001)).
Em resultado, há uma necessidade de composições para modular a LOX e a LOXL, tal como através da utilização de iARN. São também necessários métodos para utilização destas composições para tratar e diagnosticar condições. A presente divulgação aborda estas necessidades e proporciona outras vantagens também. A composição para utilização na inibição de fibrose num indivíduo da presente invenção está definida na reivindicação 1, o polinucleótido isolado da presente invenção está definido na reivindicação 10, o vector de expressão da presente invenção está definido na reivindicação 13 e a célula hospedeira da presente invenção está definida na reivindicação 14. A presente divulgação proporciona composições farmacêuticas e métodos úteis para a modulação da angiogénese e da fibrose, e para o tratamento do cancro, por inibição de metástase e tumores num indivíduo, tais como tumores primários. Além disso, a expressão de LOXL2 está correlacionada com a proteinose alveolar pulmonar e como tal pode ser utilizada para o diagnóstico e tratamento precisos da proteinose alveolar pulmonar (PAP).
Num aspecto, a presente divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo uma primeira sequência hibridável com uma sequência polinucleotídica que codifica LOXL2 ou SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência complementar da primeira sequência, e uma sequência de ligação que une a primeira sequência à segunda sequência. A sequência de ligação pode formar uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo". A primeira sequência pode compreender SEQ ID NO: 20 ou 21. É também proporcionado um polinucleótido isolado compreendendo SEQ ID NO: 20 ou 21. O polinucleótido isolado pode ter pelo menos duas vezes o comprimento de SEQ ID NO: 20 ou 21. O polinucleótido isolado compreendendo SEQ ID NO: 20 pode ainda compreender uma segunda sequência sua complementar. 5 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Alternativamente, ο polinucleótido isolado compreendendo SEQ ID NO: 21 pode ainda compreender uma segunda sequência sua complementar. Os polinucleótidos isolados compreendendo SEQ ID NO: 2 0 ou 21 podem também compreender uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo". São ainda proporcionados vectores de expressão compreendendo os polinucleótidos isolados assim como células hospedeiras compreendendo os vectores de expressão.
Noutro aspecto, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um polinucleótido compreendendo uma primeira sequência hibridável com uma sequência polinucleotidica que codifica LOXL2 ou SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência complementar da primeira sequência, e uma sequência de ligação que une a primeira sequência à segunda sequência; e, um excipiente farmacêutico. São também proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um polinucleótido compreendendo SEQ ID NO: 20 ou 21; e, um excipiente farmacêutico. A presente divulgação também proporciona métodos de administração das composições aqui descritas. São também divulgados métodos para a inibição do crescimento de tumores primários, metástase, fibrose ou angiogénese num indivíduo. Os métodos podem compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polinucleótido para inibir crescimento de tumores primários, metástase, fibrose ou angiogénese no indivíduo. O polinucleótido pode compreender uma primeira sequência hibridável com uma sequência polinucleotidica que codifica LOXL2 ou SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência complementar da primeira sequência, e uma sequência de ligação que une a primeira sequência à segunda sequência. O polinucleótido pode compreender uma sequência de ligação que forma uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo". A primeira sequência pode compreender SEQ ID NO: 20 ou 21. Os métodos podem também abranger a administração a um indivíduo de um polinucleótido compreendendo SEQ ID NO: 20 ou 21 para inibir o crescimento de tumores primários, metástase, fibrose, ou angiogénese no indivíduo. São também proporcionados métodos para o tratamento de PAP num indivíduo. A presente divulgação proporciona métodos compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade 6 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ eficaz de um agente para inibir a PAP, em que o agente modula a expressão ou a actividade de uma lisil-oxidase ou de uma proteína semelhante a lisil-oxidase. São também proporcionados métodos para detecção de PAP num indivíduo, em que o indivíduo recebe a administração de um agente que detecta a expressão ou a actividade de uma lisil-oxidase ou de uma proteína semelhante a lisil-oxidase, em que a expressão ou a actividade são utilizadas para diagnosticar PAP no indivíduo. 0 nível ou a actividade de lisil-oxidase podem ser os de L0XL2, L0XL3, ou de ambas, e o agente utilizado para tratar ou diagnosticar PAP pode ser um anticorpo, uma molécula pequena, uma molécula anti-sentido, uma ribozima, ADNzima, oligonucleótidos que formam hélices triplas, ARNip ou ARNgc. 0 agente pode ser um inibidor de lisil-oxidase ou de uma proteína semelhante a lisil-oxidase, tal como L0XL2, L0XL3, ou ambas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Pode ser obtido um melhor entendimento das características e vantagens da presente invenção por referência à seguinte descrição detalhada que estabelece concretizações ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e aos desenhos anexos nos quais: A FIG. 1 ilustra sequências de ARNgc para L0XL2. Cada sequência forma um "gancho de cabelo" pois as sequências sublinhadas em cada são cadeias de sentido directo/anti-sentido. Os ARNgc são expressos utilizando o vector pLKO.l-puro (disponível de Sigma) para permitir a transfecção transiente ou estável do ARNgc assim como a produção de partículas lentivirais. A FIG. 2 é um esquema que ilustra o ensaio de invasão tumoral. A FIG. 3 ilustra a expressão de L0XL2 em (A) células de cancro MDA-MDB 231/LM2-4 e HT1080 e em (B) células de cancro da mama MDA-MB 231 e de melanoma YU/PAC2, infectadas com vectores lentivirais que dirigem a expressão de ARNgc específico de L0XL2 195 ou 197 (também referidos como sh.Loxl2.195 ou sh.Loxl2.197, respectivamente) 7 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ A FIG. 4 é uma microfotografia que ilustra o desvio morfológico em células infectadas com vectores lentivirais que dirigem a expressão de sh.Loxl2.195 ou sh.Loxl2.197 . A FIG. 5 é (A) uma microf otograf ia que ilustra o efeito de vectores lentivirais que dirigem a expressão de sh.Loxl2.195 ou sh.Loxl2.197 em células de cancro da mama MDA-MB-231 e células de fibrossarcoma HT1080 no ensaio de invasão tumoral. (B) é um Western blot que apresenta o silenciamento da expressão de L0XL2 e (C) mostra o número de células invasoras por campo. A FIG. 6 é uma fotomicrografia que ilustra a expressão de L0XL2 e L0XL3 em tecido pulmonar normal e de PAP. A FIG. 7 ilustra a coloração com rodamina faloidina de células MDA-231. (A) As células MDA-231 de tipo selvagem e células MDA-231 estáveis infectadas com lentivírus de controlo com coloração com faloidina de F-actina revelam longas fibrilas tipicas de uma célula que sofreu transição epitelial-mesenquimatosa (EMT). (B) As células MDA-231 infectadas com sh.Loxl2.195 estão desprovidas de L0XL2 e revelaram um efeito de "rim" próximo da membrana celular, mais típico de uma célula epitelial normal. A FIG. 8 ilustra o desenvolvimento de tumor primário em ratinhos injectados com células MDA-231 si-controlo (si-c) ou sh.Loxl2.195 (si-195). As células MDA-231 foram infectadas com lentivírus que codifica ARNgc de controlo ou vector de lentivírus que expressa sh.Loxl2.195. As células foram seleccionadas com puromicina e a expressão de Loxl2 foi determinada antes da injecção nas almofadas de gordura mamária de ratinhos balb/c nu/nu fêmeas. (A) 0 volume tumoral foi medido 6, 11, 14, 18, 22, 25 e 27 dias após a injecção. (B) Ilustra o peso do tumor de ratinhos MDA-231 si-cont vs. sh.Loxl2.195 (si-195), 27 dias após injecção. A FIG. 9 ilustra genes em células cancerosas afectadas por sobre-expressão de L0XL2 ou inibição de expressão de LoxL2. (A) Genes supra-regulados em células MCF-7 sobre-expressam L0XL2 recombinante. A expressão génica foi medida por RT-PCR e Western blotting. As células foram transfectadas 8 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ com uma construção regulada por tetraciclina que expressa L0XL2 (clones 12 e 14), vector lentiviral de controlo contendo um ARNgc (WT) não relacionado, ou um mutante de L0XL2 que é enzimaticamente inactivo devido a uma mutação no seu motivo LTQ (Y689F). (B) A infecção com lentivírus dirigiu a expressão de ARNgc dirigido contra Loxl2. C= ARNgc de controlo, L2 = sh.Loxl2.195 A FIG. 10 ilustra que a expressão de L0XL2 é aumentada por hipoxia. (A) As células foram incubadas numa câmara de hipoxia. 0 controlo foi incubado em condições normóxicas (incubadora regular). 0 ARN foi preparado a partir das células no final da experiência e amplificado por RT-PCR. PC = células que expressam L0XL2 recombinante, NC = PCR sem RT. (B) Os níveis de L0XL2 foram determinados por Western blot. As células foram estimuladas durante os tempos indicados com a concentração indicada de C0CI2. Prepararam-se concentrações iguais de lisados celulares com tampão de lise. Os lisados celulares foram separados num gel SDS/PAGE de gradiente, transferidos e sondados com os nossos anticorpos anti-LOXL2. As membranas foram removidas e novamente sondadas com um anticorpo dirigido contra β-actina para verificar o carregamento igual. A FIG. 11 ilustra a expressão de um receptor de LOXL2 ligado na superfície celular em células endoteliais humanas derivadas da veia umbilical (HUVEC). (A) A LOXL2 foi iodada e quatro diferentes linhas celulares foram testadas quanto à sua ligação especifica a L0XL2. A L0XL2 iodada foi adicionada a cada poço e foi realizada a competição com LOXL2 não marcada. (B) A L0XL2 nao se liga especificamente a gelatina, laminina ou fibronectina. A L0XL2 iodada foi adicionada a cada poço e foi realizada a competição com L0XL2 não marcada. Não houve ligação específica demonstrando que a ligação observada às células não é causada por ligação às componentes fibronectina, laminina ou gelatina de ECM. (C) A L0XL2 iodada foi adicionada a cada poço e foi realizada a competição com L0XL2 não marcada. Na ausência ou com adição de 100 ug/ml de heparina (a heparina não inibe a ligação) ou após digestão prévia com heparinase (não afecta a ligação ao receptor putativo). 9 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ A FIG. 12 ilustra a expressão de L0XL2 e L0XL3 em células neuronais do sistema nervoso central (SNC). A hibridação in-situ em secções de tecido de córtex de cérebro humano normal foi realizada utilizando sondas dirigidas a LOX, L0XL1, L0XL2, ou L0XL3. s = sentido directo, as = anti-sentido.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os princípios e a operação da presente divulgação podem ser mais bem entendidos com referência aos desenhos e descrição anexos. Deve entender-se que esta divulgação não está limitada na sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes estabelecidos na descrição seguinte ou ilustrados nos desenhos descritos na secção de Exemplos. A divulgação é susceptível de outras concretizações ou de ser posta em prática ou realizada de várias maneiras. Também se deve entender que a fraseologia e terminologia aqui empregues têm como fim a descrição e não devem ser consideradas limitantes. A presente divulgação proporciona composições farmacêuticas e métodos que podem ser utilizados para modular a angiogénese e para inibir o crescimento tumoral, a capacidade de invasão tumoral e a fibrose tumoral. Por exemplo, a presente divulgação pode ser utilizada para suprimir o crescimento tumoral e a metástase assim como para tratar e diagnosticar desordens tais como, por exemplo, artrite, retinopatia diabética, psoríase, vasculite e PAP.
Os métodos e as composições descritos incluem a utilização de um inibidor de LOX ou LOXL, tais como agentes que inibem L0XL2. Um exemplo de LOX ou LOXL inclui a enzima possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipéptido expresso ou traduzido a partir de uma das seguintes sequências: acessos no EMBL/GenBank: M94054; AAA59525.1 - ARNm; S45875; AAB23549.1 - ARNm; S78694; AAB21243.1 - ARNm; AF039291; AAD02130.1 - ARNm; BC074820; AAH 7482 0.1 - ARNm; BC074872; AAH74872.1 - ARNm; M84150; AAA59541.1 -ADN Genómico. Exemplos particulares de LOXL estão descritos em Moinar et al., Biochim Biophys Acta. 1647: 220-24 (2003j; Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001j; e em WO 01/83702. (Note-se que nestas 3 publicações, "LOXL1" foi 10 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ referida como "LOXL" enquanto na presente invenção "LOXL" é referida como uma proteína semelhante a lisil-oxidase em geral, e não apenas LOXL1.) Estas enzimas incluem LOXL1, codificada por ARNm depositado no GenBank/EMBL BC015090; AAH15090.1; LOXL2, codificada por ARNm depositado no GenBank/EMBL U89942; LOXL3, codificada por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF282619; AAK51671.1; e LOXL4, codificada por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF338441; AAK71934.1. LOX ou LOXL também abrangem um fragmento ou um derivado funcionais que ainda retenham substancialmente a sua actividade enzimática que catalisa a desaminação de resíduos lisilo. Tipicamente, um fragmento ou derivado funcionais retêm pelo menos 50% da sua actividade de lisil-oxidase. Um fragmento ou derivado funcionais podem reter pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da sua actividade de lisil-oxidase. Uma LOX ou uma LOXL podem incluir substituições de aminoácidos conservativas que não alteram substancialmente a sua actividade. As substituições conservativas adequadas de aminoácidos são conhecidas pelos peritos na especialidade e podem ser realizadas genericamente sem alteração da actividade biológica da molécula resultante. Os peritos na especialidade reconhecem que, em geral, substituições de um único aminoácido em regiões não essenciais de um polipéptido não alteram substancialmente a actividade biológica.
Os inibidores utilizados podem incluir inibidores da família de enzimas da lisil-oxidase que catalisam a formação de reticulações covalentes entre resíduos de lisina em fibrilas de elastina ou colagénio adjacentes. Sabe-se que existem pelo menos cinco diferentes lisil-oxidases tanto em seres humanos como em ratinhos, a LOX e quatro proteínas relacionadas com LOX, ou semelhantes a LOX: LOXL1 (ou LOL) , LOXL2 (ou LOR-1) , LOXL3 (ou LOR-2) e L0XL4 (ou Lox-C) . As cinco formas de lisil-oxidases residem em cinco diferentes cromossomas. Estes membros da família apresentam alguma sobreposição em termos de estrutura e função, mas parecem ter também funções distintas. Por exemplo, a LOX parece ser letal na parturição em ratinhos (Hornstra et al., J. Biol. Chem. 278:14387-14393 (2003)), enquanto a deficiência de LOXL causa um fenótipo de desenvolvimento não grave (Bronson et al., Neurosci. Lett. 390:118-122 (2005)) . A família da lisil- 11 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ oxidase inclui quatro genes, tais como aqueles com SEQ ID NO: 1, 4, 5 ou 7, ou enzimas com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9. A LOX possui domínios da proteína altamente conservados, conservados em várias espécies incluindo o ser humano, o ratinho, o rato, a galinha, o peixe e a Drosophila. A família humana da LOX possui uma região C-terminal altamente conservada contendo o domínio catalítico da LOX de 205 aminoácidos. A região conservada contém o domínio semelhante a receptor de citoquinas (CRL), de ligação a cobre (Cu), e o local do cofactor lisil-tirosilquinona (LTQ). Doze resíduos de cisteína são também similarmente conservados, estando dois presentes na região pré-pró-péptido e dez na forma processada cataliticamente activa de LOX (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). A região pré-pró-péptido de LOX contém um péptido de sinal que é clivado. Prevê-se que o local de clivagem esteja entre Cys21-Ala22, gerando uma sequência de sinal de 16 (ou 21) e uma forma pró-péptido de aminoácidos de 48 kDa de LOX, que é, sem ligação à teoria, ainda inactiva. Sem limitação pela teoria, o pró-péptido é N-glicosilado durante a passagem através do sistema de Golgi originando uma proenzima inactiva de 50 kDa que é segregada para o ambiente extracelular onde a proenzima, ou pró-péptido, é clivada entre Glyl68-Aspl69 por uma metaloendoprotease, uma pró-colagénio C-proteinase, que são produtos dos genes Bmpl, Tlll e T112. A BMP I (proteína morfogenética do osso I) é uma pró-colagénio C-proteinase que processa o pró-péptido para originar uma enzima funcional de 30 kDa e um pró-péptido de 18 kDa. A sequência que codifica para o pró-péptido é tipicamente moderadamente (aproximadamente 60-70%) conservada, enquanto a sequência que codifica para a região C-terminal de 30 kDa da proenzima onde o local activo está localizado, é usualmente altamente conservada (aproximadamente 95%). (Kagan e Li, J. Cell. Biochem. 88:660-672 (2003); Kagan et al., J. Cell Biochem. 59:329-38 (1995)). As unidades N-glicosilo são usualmente subsequentemente removidas.
Foram previstos péptidos de sinal potenciais similares nos terminais amino de LOXL, LOXL2, LOXL3 e LOXL4. Os locais 12 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ de clivagem de sinal previstos são entre Gly25-Gln26 para a LOXL, entre Ala25-Gln26, para a L0XL2, e entre Gly25-Ser26 para a L0XL3. 0 consenso para a clivagem por BMP-1 em pró- colagénios e pró-LOX está entre Ala/Gly-Asp, e é frequentemente seguido por um resíduo ácido ou carregado. Um potencial local de clivagem para gerar LOXL activa é Gly303-Asp304; contudo, este é então seguido por uma Pro atípica. A L0XL3 também possui um potencial local de clivagem em Gly44y-Asp448, que é seguido por uma Asp, podendo o processamento neste local originar um péptido activo de dimensão similar à LOX activa. Um potencial local de clivagem por BMP-1 foi também identificado no interior de L0XL4, nos resíduos Ala569-Asp570 (Kim et ai., J. Biol. Chem. 278:52071-52074 (2003)). A proteína LOXL2 pode também ser processada analogamente nos outros membros da família LOX.
Uma característica que pode diferir entre as lisil-oxidases e proteínas semelhantes a lisil-oxidase são os domínios do receptor sequestrante rico em cisteína (SRCR). A LOX e a LOXL parecem não possuir domínios SRCR, enquanto a L0XL2, a L0XL3 e a LOXL4 possuem, cada uma, quatro domínios SRCR no terminal N. Os domínios SRCR medeiam a ligação de ligandos em várias proteínas segregadas e receptoras (Hoheneste et al.r Nat. Struct. Biol. 6: 228-232 (1999);
Sasaki et ai., EMBO J. 17:1606-1613 (1998)). Outro domínio que parece ser único para LOXL é a presença de um domínio rico em prolina (Moinar et ai., Biochimica Biophsyica Acta 1647: 220-224 (2003)). A distribuição nos tecidos pode também diferir entre a LOX e as várias LOXL. Por exemplo, como mostrado na FIG. 12, a LOXL2 e a LOXL3 são altamente expressas em células neuronais, enquanto a LOX e a LOXLl não o são. Assim, num aspecto, a presente divulgação abrange a modulação da expressão de LOX ou LOXL no SNC, tal como no cérebro, ou mais especificamente em células neuronais.
Cada membro da família LOX de enzimas inclui um domínio de lisil-oxidase altamente conservado, cuja actividade está altamente dependente da presença de cobre. A remoção de cobre dos tecidos tumorais conduz à inibição da angiogénese (Rabinovitz, J. Natl. Câncer Inst. 91:1689-1690 (1999); 13 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Yoshida et al.r Neurocirurgia 37: 287-292 (1995)). Isto substancia adicionalmente o papel da família de enzimas das lisil-oxidases na angiogénese pois, sem ligação à teoria, a remoção de cobre conduz à inibição de lisil-oxidases.
Suporte adicional à actividade angiogénica das lisil-oxidases é proporcionado pelos ensaios de ligação PF4-LOXL2. 0 PF4 é um inibidor da angiogénese. Como tal, a actividade anti-angiogénica exibida por PF4 pode ser, sem ligação à teoria, efectuada através da inibição de L0XL2, que é altamente expressa nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. Assim, de acordo com um aspecto da presente divulgação, são proporcionados métodos de modulação da angiogénese.
Angiogénese
Num adulto, a formação de novos vasos sanguíneos em tecidos normais ou doentes é tipicamente regulada por dois processos, a vasculogénese recapitulada (a transformação de arteríolas preexistentes em artérias musculares pequenas) e a angiogénese, o ramificar de vasos sanguíneos existentes (que ocorre tanto no embrião como no adulto). Adicionalmente, a expressão de L0XL2 é induzida sob condições hipóxicas (FIG. 10) , pois pensa-se que a angiogénese é estimulada nos cancros para ultrapassar as condições hipóxicas. 0 processo de angiogénese é regulado por estímulos biomecânicos e bioquímicos. Factores angiogénicos tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o factor de crescimento de fibroblastos básicos (bFGF), são libertados por células vasculares, macrófagos e células circundantes dos vasos sanguíneos. Estes factores angiogénicos activam proteases específicas que estão envolvidas na degradação da membrana basal. Em resultado desta degradação, as células vasculares migram e proliferam, desse modo conduzindo à formação de novos vasos sanguíneos. Células peri-endoteliais, como os periócitos nos capilares, células do músculo liso em vasos maiores e miócitos cardíacos no coração, são recrutadas para proporcionar funções de manutenção e moduladoras ao vaso em formação. 14 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ Ο estabelecimento e a remodelação de vasos sanguíneos são controlados por sinais parácrinos, muitos deles mediados por ligandos proteínicos que modulam a actividade de receptores tirosina-quinase transmembranares. Entre estas moléculas estão o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e as suas famílias de receptores (VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1 e neuropilina-2), Angiopoietinas 1-4 (Ang-1, Ang-2, etc.) e seus respectivos receptores (Tie-l e Tie-2), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e factor de crescimento de transformação β (TGF-β). 0 crescimento de tumores sólidos é limitado pela disponibilidade de nutrientes e oxigénio. Quando as células no interior de tumores sólidos começam a produzir factores angiogénicos ou quando os níveis de inibidores da angiogénese diminuem, o equilíbrio entre influências anti-angiogénicas e angiogénicas é perturbado, iniciando-se o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir do leito vascular existente no tumor. Este evento na progressão tumoral é conhecido como o "comutador" angiogénico. Os inibidores da angiogénese tumoral são capazes de inibir o crescimento tumoral em ratinhos, em alguns casos, parecem inibir completamente o crescimento tumoral e inibir também a metástase tumoral, um processo que assenta no contacto próximo entre a vasculatura e células tumorais. A angiogénese desempenha um importante papel na progressão do cancro da mama.
Estas constatações incentivaram a utilização de factores anti-angiogénicos conhecidos na terapia do cancro da mama (Klauber et al., Câncer Res. 57: 81-86 (1991); Harris et ai.,
Cancro da mama Res. Treat. 38, 97-108 (1996); Weinstatsaslow et al., Câncer Res. 54;6504-6511 (1994)). Durante A última década foram isolados vários novos inibidores da angiogénese incluindo inibidores da sinalização por VEGF (Neufeld et al., FASEB J. 13:9-22 (1999)) e inibidores de processos que conduzem à maturação e estabilização de novos vasos sanguíneos. Foram utilizados anticorpos anti-integrina como inibidores da maturação de vasos sanguíneos (Brooks et al., Cell 79:1157-1164 (1994J; Brooks et al., Cell 92:391-400 (1998)) . 15 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Embora estejam hoje disponíveis comercialmente vários fármacos anti-angiogénicos, os mecanismos anti-angiogénicos da maioria destes fármacos (e.g., angiostatina e endostatina) permanecem pouco claros (0'Reilly et al., Cell 88: 277-285 (1997); 0'Reilly et al., Nature Med. 2:689-692 (1996)). Como a angiogénese pode ser iniciada por muitos (possivelmente compensatórios) factores angiogénicos, factores anti-angiogénicos que têm como alvo processos mais tardios na resposta angiogénica tais como a maturação dos vasos ou uma combinação de factores anti-angiogénicos são provavelmente eficazes para a paragem da formação de vasos. 0 factor-4 das plaquetas (PF4) é uma proteína anti-angiogénica normalmente sequestrada em plaquetas (Tanaka et al., Nature Med. 3:437-442 (1997); Maione et al., Science 247:77-79 (1990); Neufeld et al., The Cytokine Reference: A compendium of cytokines and other mediators of host defence (Oppenheim, J.J. and Feldmann, M. eds) Academic Press (2000)). O PF4 inibe a angiogénese utilizando mecanismos pouco definidos (Oengrinovitch et al., J. Biol. Chem. 270:15059-15065 (1995); Brown e Parish, Biochemistry 33:13918-13927 (1994); Gupta e Singh, J. Cell Biol. 127:1121-1127 (1994);
Watson et al., J. Clin. Invest. 94: 261-268 (1994)). Foi anteriormente especulado que o PF4 se liga a proteoglicanos de sulfato de heparano da superfície celular e desta maneira inibe a actividade de factores de crescimento angiogénicos tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (Watson et al., J. Clin. Invest. 94: 261-268 (1994)).
Por exemplo, as composições e os métodos descritos na presente divulgação podem ser utilizados para suprimir o crescimento de tumores por inibição da angiogénese, ou por inibição directa do crescimento tumoral (tal como o crescimento de tumores primários), supressão de metástases, assim como para tratar e diagnosticar desordens tais como, por exemplo, artrite, retinopatia diabética, psoríase e vasculite e proteinose alveolar pulmonar primária.
Tumores metastáticos e primários
A prevenção, a redução e o diagnóstico de tumores são importantes na prevenção e no tratamento do cancro. A 16 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ transição de um tumor localizado para um tumor invasivo e metastático representa um marco no desenvolvimento da doença maligna, pois está usualmente associada a um marcado agravamento do prognóstico. 0 entendimento dos processos que governam esta transição é portanto de importância primordial, e os papéis da LOX e da LOXL nestes processos podem ser utilizados não apenas para mais bem entender este processo, mas também podem ser utilizados para tratar, prevenir ou diagnosticar tumores primários e metastáticos.
Por exemplo, a expressão de L0XL2 pode ser diminuída em células de cancro da mama, células de melanoma e células de fibrossarcoma utilizando ARNgc ou ARNip (FI6S. 3, 5B). A administração de ARNgc ou ARNip dirigidos para L0XL2 conduz a uma transição do tipo EMT para MET (FIG. 4, FIG. 7) assim como à diminuição na invasão celular (FIG. 5), adicionalmente suportando o papel de L0XL2 na metástase tumoral, e a modulação da expressão de L0XL2 pode auxiliar na inibição da actividade metastática. A inibição de L0XL2 pode também ser utilizada na inibição do crescimento tumoral e redução de tumores primários. A inibição do crescimento tumoral pode ser preventiva. Alternativamente, a inibição do crescimento de tumores primários pode ser uma redução da massa tumoral, por exemplo, a massa tumoral pode ser reduzida comparativamente com a dimensão ou volume do tumor quando inicialmente detectado. A inibição pode ser na taxa de crescimento do tumor primário, por exemplo, a massa ou volume do tumor primário aumenta a uma taxa mais lenta em comparação com um indivíduo não tratado com composições aqui divulgadas, por exemplo, como mostrado na FIG. 8.
Cancro da Mama
No cancro da mama, a transição de um tumor localizado para um tumor invasivo/metastático está associada em muitos casos com a formação de focos fibróticos e desmoplasia, que é a presença de estroma colagenoso invulgarmente denso, no interior do tumor primário (Colpaert et ai., Am. J. Surg. Pathol. 25, 1557 (2001J; Hasebe et ai., Pathology
International 50: 263-272 (2000)). Pode existir uma correlação similar em outros tipos de cancros tais como os cancros do cólon e pancreático (Nishimura et al., Virchows Arch. 433:517- 17 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ 522 (1998); Ellenrieder et al., Int. J. Câncer 85:14-20 (2000) ) . Estas observações representam aparentes paradoxos à primeira vista, pois a capacidade de invasão há muito foi associada com a destruição da matriz extracelular por enzimas que degradam a matriz extracelular como as metalo-proteases (Stamenkovic, Semin. Câncer Biol. 10:415-433 (2000); Duffy et al., Breast Câncer Res. 2: 252-25 7 (2000)) e a heparanase (Vlodavsky e Friedmann, J. Clin. Invest 108:341-347 (2001) ). Contudo, é possível que a deposição de excesso de matriz extracelular possa estimular por sua vez a expressão de enzimas que degradam a matriz que irão contribuir, sob certas circunstâncias, para a invasão tumoral. De facto, existem evidências de que um aumento na deposição de matriz extracelular pode de facto influenciar a produção de enzimas que degradam a matriz extracelular (Schuppan et al., Semin. Liver Dis. 21:351-372 (2001J; Swada et al., Int. J. Oncol. 19:65-70 (2001)) .
Cancro do Cólon O cancro do tracto gastrointestinal (GI), especialmente o cancro do cólon, é altamente tratável e frequentemente é uma doença curável quando localizado no intestino. A cirurgia é o tratamento primário e resulta na cura em aproximadamente 50% dos pacientes. A recorrência após cirurgia é um problema importante e frequentemente é a causa final de morte. Quase todos os casos de cancro colorrectal surgem a partir de pólipos adenomatosos, alguns dos quais maturam em grandes pólipos, sofrem crescimento e desenvolvimento anómalos, e finalmente progridem para cancro. Esta progressão parece levar pelo menos 10 anos na maioria dos pacientes, o que a torna uma forma prontamente tratável de cancro se diagnosticado precocemente, quando o cancro é localizado.
Os procedimentos padrão correntemente utilizados para estabelecer um diagnóstico definitivo para um cancro do tracto GI incluem estudos com bário, endoscopia, biópsia e tomografia computadorizada (Brennan et al., Câncer: Principies and Practice of Oncology, Fourth Edition, pp. 849-882, Philadelphia, Pa.: J. B. Lippincott Co. (1993)). 18 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ Ο prognóstico do cancro do cólon está tipicamente relacionado com o grau de penetração do tumor na parede do intestino e com a presença ou ausência de envolvimento nodal. Estas duas caracteristicas usualmente formam a base dos sistemas de estadiamento desenvolvidos para esta doença. 0 estadiamento é usualmente realizado por um patologista sobre secções de tecido obtidas através de biópsia e/ou cirurgia e tem como objectivo determinar a extensão anatómica da doença. 0 estadiamento preciso é critico para prever o prognóstico do paciente e proporcionar critérios para o desenho da terapia óptima. Um estadiamento menos preciso pode resultar em pobres decisões terapêuticas e constitui um importante problema clinico no cancro do cólon.
Proteinose Alveolar Primária (ΡΆΡ) A PAP é uma desordem pulmonar rara de etiologia desconhecida caracterizada por enchimento alveolar com material flocular que apresenta coloração positiva com o método do ácido periódico de Schiff (PAS) e é derivada de fosfolípidos tensioactivos e componentes de proteína. A L0XL2 e a L0XL3 têm provavelmente um papel na PAP pois ambas são expressas em tecido de PAP, mas não em tecido pulmonar normal (FIG. 6) São reconhecidas duas formas, (1) primária (idiopática) e (2) secundária (devida a infecções pulmonares; malignidades hematológicas; e inalação de pós minerais tais como sílica, óxido de titânio, alumínio e insecticidas). A incidência de PAP é aumentada em pacientes com malignidades hematológicas e na SIDA, sugerindo uma relação com a disfunção imunitária.
Os alvéolos na PAP estão cheios com material proteináceo, que foi analisado extensivamente e que se determinou ser tensioactivo normal composto por lípidos e proteínas A, B, C, e D associadas a tensioactivos (SP-A, SP-C, SP-D). Existem evidências de um defeito no mecanismo hemostático da produção de tensioactivo ou da depuração por macrófagos alveolares e o elevador mucociliar. Foi demonstrada uma relação clara entre a PAP e a maturação diminuída de macrófagos. 19 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ A PAP tem uma prevalência estimada de 1 caso por população de 100 000, e foram anteriormente reportadas taxas de mortalidade tão elevadas quanto 30% a vários anos do inicio da doença. A taxa de mortalidade actual pode ser inferior a 10%. A incidência no sexo masculino é 4 vezes superior à do sexo feminino. Os pacientes têm tipicamente 20-50 anos de idade na apresentação.
Os pacientes com PAP tipicamente apresentam-se com um inicio gradual de sintomas. Cerca de 30% de pacientes são assintomáticos, mesmo com anomalias difusas na radiografia torácica (CXR). Os sintomas podem incluir os seguintes: tosse seca persistente (ou escassa produção de saliva), dispneia progressiva, fadiga e mal-estar, perda de peso, febre baixa intermitente e/ou suores nocturnos, dor torácica pleuritica, cianose e hemoptise. A etiologia da PAP é desconhecida. As causas podem incluir inalação de pó de silica (silicoproteinose aguda), exposição a insecticidas, pós de alumínio, dióxido de titânio, e outros pós inorgânicos, malignidades hematológicas, desordens mielóides, intolerância a proteína lisinúrica, infecção por HIV (SIDA), relatórios de casos de leflunomida e terapia anti-artrite reumatóide modificadora da doença. As diferenças podem incluir pneumonite de hipersensibilidade, cancro do pulmão, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células em forma de grão de aveia ("oat cell") (Células Pequenas), pneumonia por Pneumocystis carinii , edema pulmonar e sarcoidose cardiogénica. O diagnóstico pode ser efectuado por lavagem, se for necessária coloração de PAS. Portanto, a PAP está provavelmente sub-diagnosticada.
As biópsias pulmonares são classicamente utilizadas no diagnóstico de PAP: os alvéolos estão cheios com material não espumoso. As biópsias transbrônquicas são adequadas e não é necessária a biópsia de pulmão aberto. A gestão da PAP depende da progressão da doença, de infecções coexistentes e do grau de deterioração fisiológica. 0 padrão de cuidados para a PAP é a remoção mecânica do material lipoproteináceo por lavagem do pulmão completo, a 20 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ qual é frequentemente repetida. Historicamente, os pacientes têm sido tratados com esteróides sistémicos, mucolíticos (aerossol) e proteinase (aerossol) sem muito sucesso. Na PAP secundária, o tratamento apropriado da causa subjacente também é garantido. Foi demonstrado que o GM-CSF melhora a PAP em vários pacientes e está a ser investigado. A PAP congénita responde favoravelmente à transplantação pulmonar. A transplantação pulmonar é o tratamento de eleição em pacientes com PAP congénita e em pacientes adultos com fibrose intersticial em fase terminal e Cor Pulmonale. As principais complicações são infecções pulmonares com N. asteroides, Pneumocystis carinii e/ou Mycobacterium avium-intracelulare. A fibrose pulmonar e/ou Cor Pulmonale também podem complicar a PAP.
Assim, para aumentar a precisão da terapia e a taxa de sobrevivência de pacientes de PAP existe a necessidade de desenvolver métodos precisos de diagnóstico e tratamento da PAP, e as composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados no diagnóstico e no tratamento da PAP. Métodos e Composições
Os métodos aqui descritos são efectuados por administração a um indivíduo de composições farmacêuticas compreendendo uma molécula capaz de modificar o nível tissular e/ou a actividade de pelo menos um tipo de LOX para desse modo modular a angiogénese no tecido de mamífero. A administração pode ser num tecido de mamífero. A modificação do nível tissular e/ou da actividade de pelo menos um tipo de LOX ou LOXL pode modular a angiogénese, o desenvolvimento de tumores primários, a metástase tumoral e/ou a PAP. O nível de expressão ou a actividade da LOX ou da LOXL podem também ser detectados e utilizados para diagnosticar uma condição, tal como a PAP.
Como aqui se utiliza, a frase "nível tissular" refere-se ao nível de proteína LOX ou LOXL presente no tecido num determinado ponto temporal. Por vezes pode ser vantajoso medir os níveis tissulares das formas activas de LOX ou LOXL. Os níveis da proteína são determinados por factores tais como, as 21 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ taxas de transcrição e/ou tradução, a renovação ("turnover") de ARN ou proteína e/ou a localização da proteína no interior da célula. Como tal, qualquer molécula que afecte qualquer destes factores pode modificar o nível tissular de LOX ou LOXL .
Como aqui se utiliza, o termo "actividade" refere-se a uma actividade enzimática de LOX ou LOXL. Uma molécula que possa modificar a actividade enzimática pode alterar directa ou indirectamente a especificidade para com o substrato da enzima ou a actividade do seu local catalítico.
Existem numerosos exemplos de composições que podem compreender moléculas que podem especificamente modificar o nível tissular e/ou a actividade de uma lisil-oxidase. Essas moléculas podem ser categorizadas em "infra-reguladores" ou "supra-reguladores" de lisil-oxidase.
Infra-reguladores
Um exemplo de um agente capaz de infra-regular uma proteína lisil-oxidase é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de especificamente se ligar a lisil-oxidase ou a pelo menos parte da proteína lisil-oxidase (e.g., região em que se estende o local catalítico) e inibir a sua actividade quando introduzido no tecido de mamífero. Como tal, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo dirigidos para uma lisil-oxidase podem ser utilizados para suprimir ou parar a formação de vasos sanguíneos, e para inibir a fibrose tumoral e a metástase. 0 anticorpo pode ligar-se especificamente a pelo menos um epítopo de LOX ou LOXL. Como aqui se utiliza, o termo "epítopo" refere-se a qualquer determinante antigénico num antigénio ao qual o parátopo de um anticorpo se liga.
Os determinantes epitópicos usualmente consistem em agrupamentos de moléculas na superfície quimicamente activos tais como cadeias laterais de aminoácidos ou hidratos de carbono e usualmente possuem características estruturais tridimensionais especificas, assim como características de carga específicas. 22 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Como aqui se utiliza, o termo "anticorpo" inclui moléculas intactas assim como seus fragmentos funcionais, tais como Fab, F(ab')2 e Fv, que são capazes de se ligar a macrófagos. Estes fragmentos de anticorpos funcionais são definidos como se segue: (1) o Fab, o fragmento que contém um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão do anticorpo completo com a enzima papaína para originar uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) o Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtido por tratamento do anticorpo completo com pepsina, seguido por redução, para originar uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; são obtidos dois fragmentos Fab' por cada molécula de anticorpo; (3) o (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido por tratamento do anticorpo completo com a enzima pepsina sem subsequente redução; o F(ab')2 é um dimero de dois fragmentos Fab' mantidos unidos por duas ligações dissulfureto; (4) o Fv, definido como um fragmento geneticamente manipulado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas na forma de duas cadeias; e (5) o anticorpo de cadeia única ("SCA"), uma molécula geneticamente manipulada contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligadas por um ligante polipeptídico adequado na forma de uma molécula de cadeia única geneticamente fundida.
Os métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais, assim como de seus fragmentos, são bem conhecidos na especialidade (Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988J.
Os fragmentos de anticorpos de acordo com a presente divulgação podem ser preparados por hidrólise proteolitica do anticorpo ou por expressão em células de E. coli ou de mamífero (tal como em cultura de células de ovário de hamster chinês ou outros sistemas de expressão de proteínas) de ADN que codifica o fragmento. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão com pepsina ou papaína de anticorpos completos por métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem 23 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denotado F(ab')2· Este fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrilo resultantes da clivagem de ligações dissulfureto, para produzir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz directamente dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc. Estes métodos estão descritos, por exemplo, por Porter, Biochem. J. 73:119-126 (1959J, e nas Pat. U.S. 4,036,945 e 4,331,647, e referências ai contidas. Podem também ser utilizados outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
Os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente, como descrito em Inbar et al.r Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69: 2659-62 {1912). Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfureto intermolecular ou reticuladas por compostos químicos tais como gluteraldeído. Os fragmentos Fv podem compreender cadeias VH e VL ligadas por um ligante peptídico. Estas proteínas de ligação ao antigénio de cadeia simples (sFv) podem ser preparadas por construção de um gene estrutural compreendendo sequências de ADN que codificam os domínios VH e VL ligados por um oligonucleótido. O gene estrutural é inserido num vector de expressão, que é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia polipeptídica única com um péptido ligante que faz uma ponte entre os dois domínios V. Os métodos para a produção dos sFv estão descritos, por exemplo, por Whitlow e Filpula, Methods 2:97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bío/Technology 11:1271-77 {1993); e na Patente U.S. 4,946,778.
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido que codifica para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos de CDR ("unidades mínimas 24 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ de reconhecimento") podem ser obtidos por construção de genes que codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Estes genes são preparados, por exemplo, utilizando a reacção em cadeia pela polimerase para sintetizar a região variável de ARN de células produtoras de anticorpo, por exemplo, como descrito em Larrick e Fry, Methods, 2:106-10 (1991).
As formas humanizadas de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são moléculas quiméricas de imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos), que contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpos recebedores) em que resíduos de uma CDR do recebedor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato ou coelho, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de esqueleto de Fv da imunoglobulina humana estão substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recebedor nem na CDR importada ou nas sequências de esqueleto. Em geral, o anticorpo humanizado compreende substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado optimamente pode também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986J; Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988,)/ Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na especialidade. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos provenientes de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos importados, que são tipicamente tomados de um domínio variável importado. A humanização pode 25 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986,)/ Riechmann et ai., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo por CDR ou sequências CDR de roedor as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Desse modo, estes anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. 4,816,567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor.
Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147:86-95 (1991)). Similarmente, podem ser preparados anticorpos humanos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, e.g., ratinhos em que os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inactivados. Por provocação, observa-se produção de anticorpos humanos, que se assemelham proximamente os que são observados em seres humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo de genes, montagem e reportório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). 26 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Como é descrito adiante, podem ser utilizadas várias abordagens para reduzir ou abolir a transcrição ou a tradução de uma lisil-oxidase.
Polinucleótidos
Uma abordagem consiste na utilização de polinucleótidos para infra-regular a expressão ou a actividade de LOX ou LOXL. "Polinucleótido", "nucleótido", "ácido nucleico" e "oligonucleótido", utilizam-se aqui indiferentemente. Referem-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento, sejam desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, ou seus análogos. Os polinucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Seguem-se exemplos não limitantes de polinucleótidos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento génico, loci (locus) definidos por análise de ligação, exões, intrões, ARN mensageiro (ARNm ou mRNA do inglês), ARN de transferência, ARN ribossómico, ribozimas, ADNc (ou cDNA do inglês), polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmídeos, vectores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos. Se presentes, as modificações na estrutura de nucleótidos podem ser conferidas antes ou depois da montagem do polímero. As sequências de nucleótidos podem ser interrompidas por componentes não nucleotidicos. Um polinucleótido pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. Pode ser isolado um oligonucleótido, de modo que o oligonucleótido é separado dos outros constituintes, celulares e outros, que por natureza estão normalmente associados ao polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo ou seus fragmentos.
Podem ser utilizados na presente invenção polinucleótidos modificados. Os polinucleótidos modificados podem ter semivida e/ou penetração na membrana melhoradas. São conhecidas na especialidade um grande número de variações nos esqueletos polinucleotidicos. Os oligonucleótidos podem ser modificados quer na base, no açúcar ou na porção fosfato. Estas 27 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ modificações incluem, por exemplo, a utilização de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, fosforotioatos em ponte, fosforamidatos em ponte, metilenofosfonatos em ponte, análogos desfósforo internucleótidos com pontes de siloxano, pontes de carbonato, pontes de éster carboximetilico, pontes de carbonato, pontes de éster carboximetilico, pontes de acetamida, pontes de carbamato, pontes de tioéter, pontes de sulfoxi, pontes de sulfona, vários ADN "plásticos", pontes anoméricas e derivados de borano, tal como em Cook, Anti-Câncer Drug Design 6: 585 (1991). 0 pedido internacional de patente WO 89/12060 divulga blocos de construção para a síntese de análogos oligonucleotidicos, assim como análogos oligonucleotídicos formados pela união destes blocos de construção numa sequência definida. Os blocos de construção podem ser "rígidos" (i.e., contendo uma estrutura em anel) ou "flexíveis" (i.e., sem uma estrutura em anel). Em ambos os casos, os blocos de construção contêm um grupo hidroxi e um grupo mercapto, através dos quais os blocos de construção se dizem unir para formar análogos oligonucleotídicos. A porção de ligação nos análogos oligonucleotídicos é seleccionada do grupo que consiste em sulfureto (-S-), sulfóxido (-SO-) e sulfona (-S02-). O pedido internacional de patente WO 92/20702 descreve um oligonucleótido acíclico que inclui um esqueleto peptídico no qual quaisquer nucleobases ou análogos químicos seleccionados estão alinhados e servem como caracteres de codificação como fazem no ADN ou ARN naturais. Estes novos compostos, conhecidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNA), não só são mais estáveis em células do que as suas contrapartidas naturais, como também se ligam a ADN e ARN naturais 50 a 100 vezes mais fortemente do que os ácidos nucleicos naturais se ligam uns aos outros. Os oligómeros de PNA podem ser sintetizados a partir dos quatro monómeros protegidos contendo timina, citosina, adenina e guanina por síntese peptídica de Merrifield em fase sólida. De modo a aumentar a solubilidade em água e prevenir a agregação, pode ser colocado um grupo amido de lisina na região C-terminal. 28 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Uma sequência linear ou sequência é uma ordem de nucleótidos num polinucleótido num sentido de 5' para 3' em que os resíduos que se seguem uns aos outros na sequência são contíguos na estrutura primária do polinucleótido. Uma sequência parcial é uma sequência linear de parte de um polinucleótido que se sabe compreender resíduos adicionais em um ou ambos os sentidos.
Uma sequência linear de nucleótidos é idêntica a outra sequência linear, se a ordem dos nucleótidos em cada sequência for a mesma, e ocorrer sem substituição, deleção ou substituição material. Entende-se que as bases azotadas de purina e pirimidina com estruturas similares podem ser funcionalmente equivalentes em termos de emparelhamento de bases de Watson-Crick; e a inter-substituição de bases do tipo azotadas, particularmente uracilo e timina, ou a modificação de bases azotadas, tal como por metilação, não constitui uma substituição material. Um polinucleótido de ARN e um ADN possuem sequências idênticas quando a sequência para o ARN reflecte a ordem de bases azotadas nos polirribonucleótidos, a sequência para o ADN reflecte a ordem de bases azotadas nos polidesoxirribonucleótidos, e as duas sequências satisfazem os outros requisitos desta definição. Quando um ou ambos os polinucleótidos que estão a ser comparados têm cadeia dupla, as sequências são idênticas se uma cadeia do primeiro polinucleótido é idêntica a uma cadeia do segundo polinucleótido.
Um vector pode compreender os polinucleótidos da presente invenção. 0 vector, uma molécula de ácido nucleico que é tipicamente auto-replicante, transfere uma molécula de ácido nucleico inserida para e/ou entre células hospedeiras. Os vectores incluem os que funcionam principalmente para inserção de ADN ou ARN numa célula, replicação de vectores que funcionam principalmente para a replicação de ADN ou ARN, e vectores de expressão que funcionam para a transcrição e/ou tradução do ADN ou do ARN. Também estão incluídos vectores que proporcionam mais do que uma das funções anteriores. Um vector de expressão é um polinucleótido que, quando introduzido numa célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido num polipéptido(s). Um sistema de expressão usualmente conota uma célula hospedeira adequada compreendendo um vector de 29 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ expressão que possa funcionar para originar um produto de expressão desejado.
As células hospedeiras nas quais um vector ou um polinucleótido da invenção, e.g., um vector de expressão, ou uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção, foram introduzidos, referem-se não apenas à célula em particular mas também à progénie ou progénie potencial dessa célula. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariota ou eucariota. Por exemplo, as células hospedeiras podem incluir células bacterianas tais como E. coli, células de insecto, células de levedura ou células de mamífero (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS) . Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos peritos na especialidade. Muitos métodos para introdução de ácidos nucleicos em células hospedeiras, tanto in vivo como in vitro, são bem conhecidos dos peritos na especialidade e incluem, sem limitação, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, choque térmico, lipofecção, micro-injecção e transferência de ácido nucleico mediada por vírus. Estão descritas estratégias de entrega em Luft, J. Mol. Med. 76:75-76 (1998); Kronenwett et ai., Blood 91:852-862 (1998); Rajur et al., Bioconjug.
Chem. 8:935-940 (1997;,· Lavigne et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:566-571 (1997; e Aoki et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 231:540-545 (1997;. A entrega dos polinucleótidos da presente invenção pode também ser efectuada a indivíduos, incluindo mamíferos. Por exemplo, os polinucleótidos da presente invenção podem ser entregues ou administrados a tecidos de mamífero.
Os polinucleótidos da presente invenção incluem oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, ADNzimas, moléculas de ARNip incluindo ARNgc, e oligonucleótidos que formam hélices triplas, para infra-regular a expressão ou a actividade de uma ou mais lisil-oxidases.
Polinucleótidos Anti-sentido
De acordo com um aspecto, a infra-regulação dos níveis da ou actividade de LOX ou de LOXL pode ser efectuada utilizando um polinucleótido anti-sentido capaz de hibridar 30 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ especificamente com um transcrito de ARNm que codifica LOX ou LOXL, tal como LOXL2. A concepção de moléculas anti-sentido que podem ser utilizadas para infra-regular eficientemente a LOX ou a LOXL2 é tipicamente efectuada considerando dois aspectos utilizados na abordagem anti-sentido. O primeiro aspecto é a entrega do oligonucleótido no citoplasma das células apropriadas, enquanto o segundo aspecto é a concepção de um oligonucleótido que se liga especificamente ao ARNm designado no interior das células de uma maneira que iniba a sua tradução. São tomadas em conta tipicamente várias considerações aquando da concepção de oligonucleótidos anti-sentido. Para uma eficiente inibição in vivo da expressão génica utilizando oligonucleótidos anti-sentido ou análogos, os oligonucleótidos ou análogos tipicamente cumprem os seguintes requisitos (i) suficiente especificidade na ligação à sequência alvo; (ii) solubilidade em água; (iii) estabilidade contra nucleases intra- e extracelulares; (iv) capacidade de penetração através da membrana celular; e (v) quando utilizados para tratar um organismo, baixa toxicidade. Estão disponíveis algoritmos para a identificação das sequências com a maior afinidade de ligação prevista para com o seu ARNm alvo com base num ciclo termodinâmico que tem em conta a energia de alterações estruturais tanto no ARNm alvo como no oligonucleótido, por exemplo, como descrito em Walton et al. Biotechnol Bioeng 65:1-9 (1999;.
Estes algoritmos foram utilizados com sucesso para implementar uma abordagem anti-sentido em células. Por exemplo, o algoritmo desenvolvido por Walton et al. permitiu aos cientistas conceber com sucesso oligonucleótidos anti-sentido para transcritos de β-globina de coelho (RBG) e factor de necrose tumoral-α (TNF a) de ratinho. O mesmo grupo de investigadores reportou também que a actividade anti-sentido de oligonucleótidos racionalmente seleccionados contra três ARNm alvo modelos (lactato-desidrogenase A e B humanas e gpl30 de rato) em cultura celular como avaliado por uma técnica de PCR cinética provou-se eficaz em quase todos os casos, incluindo testes contra três diferentes alvos em dois tipos de 31 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ células com químicas de fosfodiéster- e fosforotioato-oligonucleótidos.
Em adição, estão também publicadas várias abordagens para a concepção e previsão da eficiência de oligonucleótidos específicos utilizando um sistema in vitro (Matveeva et al., Nature Biotechnology 16: 1374-1375 (1998)).
Uma molécula anti-sentido que pode ser utilizada com a presente divulgação inclui um polinucleótido ou um análogo polinucleotídico com pelo menos 10 bases, por exemplo, entre 10 e 15, entre 15 e 20 bases, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30, ou mesmo pelo menos 40 bases, que é hibridável in vivo, sob condições fisiológicas, com uma porção de uma cadeia polinucleotídica que codifica um polipéptido pelo menos 50% homólogo de SEQ ID NO: 1, 4, 5 ou 7 ou pelo menos 75% homólogo de uma sua porção N-terminal como determinado utilizando o software BestFit do pacote de análise de sequências Wisconsin, utilizando o algoritmo de Smith e Waterman, onde a penalidade por criação de hiatos é igual a 8 e a penalidade por extensão de hiatos é igual a 2.
Os oligonucleótidos anti-sentido utilizados pela presente divulgação podem ser expressos a partir de uma construção de ácido nucleico administrada no tecido, caso em que podem ser utilizados promotores indutíveis de modo que a expressão anti-sentido possa ser "ligada" e "desligada", ou alternativamente esses oligonucleótidos podem ser quimicamente sintetizados e administrados directamente no tecido, como parte de, por exemplo, uma composição farmacêutica. A capacidade de sintetizar quimicamente oligonucleótidos e seus análogos possuindo uma sequência seleccionada predeterminada oferece meios para infra-modular a expressão génica. Podem ser considerados quatro tipos de estratégias de modulação da expressão génica.
Ao nível da transcrição, oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo ou análogos que se ligam ao ADN genómico por deslocamento de cadeias ou pela formação de uma hélice tripla, podem prevenir a transcrição. Ao nível do transcrito, 32 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ oligonucleótidos anti-sentido ou análogos que se ligam a moléculas de ARNm alvo conduzem à clivagem enzimática do hibrido por ARNase H intracelular. Neste caso, por hibridação com os ARNm alvo, os oligonucleótidos ou análogos oligonucleotidicos proporcionam um hibrido em dúplex reconhecido e destruído pela enzima ARNase H. Alternativamente, esta formação de híbridos pode conduzir a interferência com o splicing correcto. Em resultado, em ambos os casos, o número dos transcritos do ARNm alvo intactos prontos para tradução é reduzido ou eliminado.
Ao nível da tradução, oligonucleótidos anti-sentido ou análogos que se ligam a moléculas de ARNm alvo previnem, por impedimento estereoquímico, a ligação de factores de tradução essenciais (ribossomas) ao ARNm alvo, um fenómeno conhecido na especialidade por paragem da hibridação, que impede a tradução destes ARNm.
Os oligonucleótidos não modificados são tipicamente impraticáveis para utilização como sequências anti-sentido uma vez que possuem curtas semividas in vivo, durante as quais são degradados rapidamente por nucleases. Além disso, são frequentemente difíceis de preparar em quantidades superiores ao miligrama. Em adição, estes oligonucleótidos são usualmente fracos penetrantes na membrana celular. Assim, são usualmente considerados análogos oligonucleotídicos de uma maneira adequada.
Por exemplo, problemas que surgem relativamente ao reconhecimento de ADN de cadeia dupla (ADNcd ou dcDNA do inglês) através da formação de hélices triplas foram diminuídos através de uma inteligente ligação química "de retorno" ("switch back"), pelo que uma sequência de polipurina numa cadeia é reconhecida, e por "retorno", uma sequência de homopurina na outra cadeia pode ser reconhecida. Também, foi obtida uma boa formação de hélices utilizando bases artificiais, desse modo melhorando as condições de ligação em relação à força iónica e ao pH.
Os oligonucleótidos de ARN podem também ser utilizados para inibição anti-sentido uma vez que formam uma dúplex estável ARN-ARN com o alvo, sugerindo uma inibição eficiente. 33 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Contudo, devido á sua fraca estabilidade, os oligonucleótidos de ARN são tipicamente expressos no interior das células utilizando vectores concebidos para este fim. Esta abordagem pode ser utilizada quando se tenta ter como alvo um ARNm que codifica uma proteína abundante e de longa vida.
As terapêuticas anti-sentido podem ser utilizadas para tratar muitas doenças potencialmente fatais com várias vantagens relativamente aos fármacos tradicionais. Os fármacos tradicionais tipicamente intervêm depois de formada uma proteína causadora da doença. As terapêuticas anti-sentido, contudo, podem bloquear a transcrição/tradução de ARNm e intervir antes da proteína estar formada, e como as terapêuticas anti-sentido têm como alvo apenas um ARNm especifico, podem ser mais eficazes com menos efeitos secundários do que a actual terapia de inibição da proteína. Vários ensaios clínicos demonstraram a segurança, a exequibilidade e a actividade de oligonucleótidos anti-sentido. Por exemplo, foram utilizados com sucesso oligonucleótidos anti-sentido adequados para o tratamento de cancro (Holmund et al.r Curr. Opin. Mol. Ther. 1:372-385 (1999)), enquanto o tratamento de malignidades hematológicas através de oligonucleótidos anti-sentido que têm como alvo o gene c-myb, p53 e Bcl-2, entrou em ensaios clínicos e mostrou ser tolerado pelos pacientes (Gerwitz, Curr. Opin. Mol. Ther. 1: 297-306 (1999)) .
Mais recentemente, foi reportado que a supressão mediada por anti-sentido da expressão do gene de heparanase humano inibe a disseminação pleural de células cancerosas humanas num modelo de ratinho (Uno et al., Câncer Res 61: 7855-60 (2001)). 0 primeiro fármaco anti-sentido foi recentemente aprovado pela FDA. O fármaco, Fomivirsen, foi desenvolvido por Isis, e é indicado para tratamento local de citomegalovírus em pacientes com SIDA que são intolerantes, ou têm uma contra-indicação relativamente a outros tratamentos para a retinite por CMV ou que foram insuficientemente responsivos a tratamentos prévios para a retinite por CMV (Pharmacotherapy News Network). 34 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Assim, ο consenso actual é de que os recentes desenvolvimentos no campo da tecnologia anti-sentido que, como descrito acima, conduziram à geração de algoritmos de concepção anti-sentido altamente precisos e a uma ampla variedade de sistemas de entrega de oligonucleótidos, permitem a uma pessoa competente na matéria conceber e implementar abordagens anti-sentido adequadas para a infra-regulação da expressão de sequências conhecidas sem ter que recorrer a experiências indevidas de tentativa e erro.
Ribozima
Outro agente capaz de infra-regular uma lisil-oxidase é uma molécula de ribozima capaz de especificamente clivar um transcrito de ARNm que codifica uma LOX ou uma LOXL. As ribozimas estão a ser cada vez mais utilizadas para a inibição especifica de sequências da expressão génica pela clivagem de ARNm que codificam proteínas de interesse (Welch et ai., Curr. Opin. Biotechnol. 9:486-496 (1998)). A possibilidade de conceber ribozimas para clivar qualquer ARN alvo específico tornou-as ferramentas valiosas tanto na investigação básica como em aplicações terapêuticas. Na área terapêutica, as ribozimas foram exploradas para ter como alvo ARN virai em doenças infecciosas, oncogenes dominantes em cancros e mutações somáticas específicas em desordens genéticas (Welch et ai., Clin. Diagn. Virol. 10:163-171 (1998)). Mais
notavelmente, vários protocolos de terapia com genes de ribozimas para pacientes de HIV estão já em ensaios de Fase 1. Mais recentemente, as ribozimas foram utilizadas para investigação em animais transgénicos, validação de alvos génicos e elucidação de vias. Várias ribozimas estão em vários estágios de ensaios clínicos. A ANGIOZYME foi a primeira ribozima quimicamente sintetizada a ser estudada em ensaios clínicos humanos. A ANGIOZYME inibe especificamente a formação do VEGF-r (receptor do factor de crescimento endotelial vascular), um componente chave na via da angiogénese. A Ribozime Pharmaceuticals, Inc., assim como outras firmas demonstraram a importância de terapêuticas anti-angiogénese em modelos animais. A HEPTAZYME, uma ribozima concebida para destruir selectivamente o ARN do Vírus da Hepatite C (HCV), verificou-se eficaz para diminuir o ARN do vírus da Hepatite C 35 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ em ensaios de cultura celular (Ribozime Pharmaceuticals, Inc.). ADNzima
Outro agente capaz de infra-regular uma lisil-oxidase é uma molécula de ADNzima capaz de clivar especificamente um transcrito de ARNm ou uma sequência de ADN de LOX ou LOXL. As ADNzimas são polinucleótidos de cadeia simples que são capazes de clivar sequências alvo tanto de cadeia simples como de cadeia dupla (Breaker e Joyce, Chemistry and Biology, 2: 655-660 (1995); Santoro e Joyce, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 943:4262-4266 (1997)). Foi proposto um modelo geral (o modelo "10-23") para a ADNzima. As ADNzimas "10-23" possuem um domínio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueado por dois domínios de reconhecimento do substrato de sete a nove desoxirribonucleótidos cada um. Este tipo de ADNzima pode eficazmente clivar o seu ARN substrato em junções purina:pirimidina (Santoro e Joyce, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 943:4262-4266 (1991); Khachigian, Curr. Opin. Mol. Ther. 4:119-121 (2002)) .
Foram divulgados exemplos de construção e amplificação de ADNzimas manipuladas, sintéticas, que reconhecem locais de clivagem alvo de cadeia simples e dupla na Patente U.S. 6,326,174. Foi recentemente observado que ADNzimas de desenho similar dirigidas contra o receptor de Uroquinase humano inibem a expressão do receptor de Uroquinase, e inibem com sucesso a metástase de células de cancro do cólon in vivo (Itoh et al., 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am. Soc. Gen. Ther. www.asgt.orgj. Em outra aplicação, as ADNzimas complementares de oncogenes bcr-abl foram bem-sucedidas na inibição da expressão oncogenes em células de leucemia, e na diminuição das taxas de recidiva no transplante de medula óssea autóloga em casos de LMC (ou CML em inglês) e LLA (ou ALL em inglês). ARNip
Outro mecanismo de infra-regulação de uma lisil-oxidase ao nível do transcrito é a interferência de ARN (iARN, ou RNAi do inglês), uma abordagem que utiliza ARNcd de interferência 36 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ pequenos (ARNip ou siRNA do inglês, ou pequenos ARN em "gancho de cabelo", ARNgc ou hpRNA do inglês), moléculas que são homólogas do ARNm alvo e conduzem à sua degradação (Carthew, Curr. Opin. Cell. Biol. 13: 244-248 (2001)). Por exemplo, a infecção de tipos diversos de células cancerosas com expressão de um ARNgc especifico de LOXL2 é eficaz na alteração tanto da sua morfologia como da sua capacidade de invasão ("invasividade") (Exemplo 1). A interferência de ARN é tipicamente um processo de dois passos. No primeiro passo, que é denominado como o passo de iniciação, ARNcd de entrada é digerido em ARN de interferência pequeno (ARNip) de 21-23 nucleótidos (nt), provavelmente pela acção de Dicer, um membro da família da ARNase III de ribonucleases especificas de ARNcd, que processa (cliva) ARNcd (introduzido directamente ou por via de um transgene ou de um virus) de uma maneira dependente de ATP. Eventos sucessivos de clivagem degradam o ARN em dúplices de 19-21 pb (ARNip), cada uma com protuberâncias de 2 nucleótidos a 3' (Hutvagner e Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232 (2002); Bernstein, Nature 409:363-366 (2001)).
No passo efector, os dúplices de ARNip ligam-se a um complexo de nucleases para formar o complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC). É necessário um desenrolamento dependente de ATP do dúplex de ARNip para a activação do RISC. O RISC activo direcciona-se assim para o transcrito homólogo por interacções de emparelhamento de bases e tipicamente cliva o ARNm em fragmentos de aproximadamente 12 nucleótidos a partir do terminal 3' do ARNip (Hutvagner e Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232 (2002); Hammond et ai., Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001); Sharp, Genes. Dev. 15:485-490 (2001)) . Embora o mecanismo de clivagem esteja ainda por elucidar, a investigação indica que cada RISC contém um único ARNip e uma ARNase (Hutvagner e Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232 (2002))..
Tendo em conta a notável potência da iARN, foi sugerido um passo de amplificação dentro da via da iARN. A amplificação pode ocorrer por cópia dos ARNcd de entrada que iria gerar mais ARNip, ou por replicação dos ARNip formados. Alternativamente, ou adicionalmente, a amplificação pode ser 37 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ efectuada por múltiplos eventos de renovação ("turnover") do RISC (Hutvagner e Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232 (2002); Hammond et al., Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001); Sharp, Genes. Dev. 15:485-490 (2001)). A iARN é também descrita em Tuschl, Chem. Biochem. 2: 239-245 (2001); Cullen, Nat. Immunol. 3:597-599 (2002); e Brantl, Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25 (2002). A síntese de moléculas de iARN adequadas para utilização com a presente divulgação pode ser efectuada como se segue. Primeiro, a sequência de ARNm de LOX ou LOXL é varrida a jusante do codão de início AUG buscando sequências dinucleotídicas AA. A ocorrência de cada AA e os 19 nucleótidos adjacentes a 3' é registada como potenciais locais alvo de ARNip. Os locais alvo de ARNip são seleccionados entre o quadro de leitura aberto, pois regiões não traduzidas (UTR) são mais ricas em locais de ligação para proteínas reguladoras. As proteínas de ligação a UTR e/ou os complexos de iniciação da tradução podem interferir com a ligação do complexo da endonuclease de ARNip ('Tuschl, Chem. Biochem. 2: 239-245 (2001)) . Será no entanto notado que os ARNip dirigidos a regiões não traduzidas podem também ser eficazes, como demonstrado para o GAPDH em que ARNip dirigido ao UTR a 5' mediou cerca de 90% de diminuição no ARNm de GAPDH celular e aboliu completamente o nível de proteínas (www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html). Em segundo lugar, os potenciais locais alvo são comparados com uma base de dados genómica apropriada (e.g., humana, de ratinho, de rato, etc.) utilizando qualquer software de alinhamento de sequências, tal como o software BLAST disponível do servidor do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Os locais alvo putativos que exibem homologia significativa com outras sequências codificantes são filtrados.
As sequências alvo que se qualificam são seleccionadas como molde para a sintese de ARNip. As sequências seleccionadas podem incluir aquelas que possuem um teor baixo de G/C pois demonstrou-se que estas são mais eficazes na mediação do silenciamento de genes em comparação com aquelas com teor de G/C superior a 55%. Podem ser seleccionados vários locais alvo ao longo do comprimento do gene alvo para avaliação. Para uma melhor avaliação dos ARNip seleccionados, 38 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ utiliza-se um controlo negativo em adição. 0 ARNip de controlo negativo pode incluir a mesma composição de nucleótidos que os ARNip mas não possui homologia significativa com o genoma. Assim, pode ser utilizada uma sequência de nucleótidos misturados do ARNip, desde que não apresente homologia significativa com nenhum outro gene.
As moléculas de ARNip da presente divulgação podem ser transcritas a partir de vectores de expressão que podem facilitar a expressão estável dos transcritos de ARNip uma vez introduzidos numa célula hospedeira. Estes vectores são manipulados para expressar ARNgc, que são processados in vivo em moléculas de ARNip capazes de realizar o silenciamento específico de genes (Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002j; Paddison et al., Genes Dev. 16:948-958 (2002); Paul et al., Nature Biotech. 20: 505-508 (2002); Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 6047-6052(2002)).
Os ARNgc são polinucleótidos de cadeia simples com uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo". O polinucleótido de cadeia simples possui um a segmento em laço que liga a extremidade 3' de uma cadeia na região de cadeia dupla e a extremidade 5' da outra cadeia na região de cadeia dupla. A região de cadeia dupla é formada a partir de uma primeira sequência que é hibridável com uma sequência alvo, tal como um polinucleótido que codifica LOXL2, ou um ARNm de LOXL2, e uma segunda sequência que é complementar da primeira sequência, pelo que a primeira e a segunda sequências formam uma região em cadeia dupla à qual a sequência de ligação liga as extremidades para formar a estrutura em laço tipo "gancho de cabelo". A primeira sequência pode ser hibridável com qualquer porção de um polinucleótido que codifica LOXL2. O domínio em haste de cadeia dupla do ARNgc compreende um local para endonuclease de restrição.
Uma estrutura haste-laço de ARNgc pode ter protuberâncias de nucleótidos opcionais, tais como protuberâncias de 2 pb, por exemplo, protuberâncias UU a 3'. Embora possa haver variação, as hastes variam tipicamente de aproximadamente 15 a 49, aproximadamente 15 a 35, aproximadamente 19 a 35, aproximadamente 21 a 31 pb, ou aproximadamente 21 a 29 pb, e 39 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ os laços podem variar de aproximadamente 4 a 30 pb, por exemplo, cerca de 4 a 23 pb.
Para a expressão de ARNgc no interior de células, podem ser empregues vectores plasmídicos contendo o promotor de polimerase III Hl-RNA ou U6, um local de clonagem para a inserção de ARN haste-laço, e um sinal de terminação da transcrição de 5 timidinas. Os promotores de polimerase III geralmente possuem locais de iniciação e de paragem bem definidos e os seus transcritos não possuem caudas poli(A). O sinal de terminação para estes promotores é definido pelo tracto politimidina, e o transcrito é tipicamente clivado após a segunda uridina. A clivagem nesta posição gera uma protuberância UU a 3' no ARNgc expresso, que é similar às protuberâncias a 3' de ARNip sintéticos. Métodos adicionais para a expressão do ARNgc em células de mamífero estão descritos nas referências citadas acima.
Um exemplo de um vector de expressão adequado é o pSUPER™, que inclui o promotor do gene de polimerase-III Hl-RNA com um sinal de início e de terminação da transcrição bem definidos consistindo em cinco timidinas numa linha
(T5) ('Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002)). A clivagem do transcrito no local de terminação é num local que se segue à segunda uridina, desse modo originando um transcrito que se assemelha às extremidades de ARNip sintéticos, que também contêm protuberâncias de nucleótidos. O ARNip é clonado de modo a incluir a sequência de interesse, i.e., LOX ou LOXL separada por um espaçador curto do complemento inverso da mesma sequência. O transcrito resultante dobra-se sobre si mesmo para formar uma estrutura haste-laço, que medeia a iARN de LOX ou LOXL. Por exemplo, as sequências que compreendem uma sequência de ADN que codifica o ARNgc para LOXL2, tal como SEQ ID NO: 20 (sh. L0XL2.19 7 ou si- 197), ou SEQ ID NO:21 (sh.LOXL2.195, ou si-195) podem mediar a iARN de L0XL2. As sequências que medeiam a iARN de LOXL2 podem também compreender SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, ou suas porções.
Outro vector de expressão de ARNip adequado codifica o ARNip de sentido directo e anti-sentido sob a regulação de promotores polIII separados (Miyagishi e Taira, Nature 40 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Biotech. 20:497-500 (2002)). Ο ARNip, gerado por este vector também inclui um sinal de terminação de cinco timidinas (T5).
Como as abordagens para introdução de ARNip sintético nas células por lipofecção podem resultar em baixas eficiências de transfecção em alguns tipos de células e/ou persistência de curto prazo de efeitos de silenciamento, foram desenvolvidos métodos mediados por vectores.
Assim, as moléculas de ARNip utilizadas na presente divulgação podem ser entregues em células utilizando retrovirus. A entrega de ARNip utilizando retrovirus proporciona várias vantagens sobre métodos como a lipofecção, pois a entrega retroviral tipicamente é mais eficiente, uniforme e selecciona imediatamente células ”knock-down” estáveis (Devroe e Silver, BMC Biotechnol. 2:15 (2002)).
Recentes publicações cientificas validaram a eficácia destas moléculas de ARN de cadeia dupla curtas na inibição da expressão de ARNm alvo e assim demonstraram claramente o potencial terapêutico destas moléculas. Por exemplo, a iARN foi utilizada para inibir a expressão de hepatite C (McCaffrey et al., Nature 418:38-39 (2002)), HIV-1 (Jacque et al., Nature 418:435-438 (2002)), células de cancro cervical (Jiang e
Milner, Oncogene 21:6041-6048 (2002)) e células leucémicas (Wilda et al., Oncogene 21, 5716-5724 (2002)).
Oligonucleótidos que formam hélices triplas (TFO)
Um método adicional de regulação da expressão de LOX ou LOXL em células é por via de oligonucleótidos que formam tríplices (TFO). Estudos recentes mostraram que podem ser concebidos TFO que podem reconhecer e ligar-se a regiões de polipurina/polipirimidina em ADN helicoidal de cadeia dupla de uma maneira específica da sequência. Estas regras de reconhecimento são delineadas por Maher III et al., Science 245:725-730 (1989); Moser et al., Science 238: 645-630 (1987); Beal et al., Science 251:1360-1363 (1992); Cooney et al.,
Science 241:456-459 (1988); e Hogan et al., Publicação EP 375408. A modificação dos oligonucleótidos, tal como a introdução de intercaladores e substituições de esqueleto, e a optimização de condições de ligação (pH e concentração 41 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ catiónica) ajudaram a ultrapassar obstáculos inerentes à actividade de TFO tais como a repulsão e instabilidade de cargas, e foi recentemente mostrado que oligonucleótidos sintéticos podem ser direccionados para sequências especificas (veja-se Seidman e Glazer, J. Clin. Invest. 112:487-494 (2003) ) .
Em geral, o oligonucleótido que forma tríplices possui a correspondência de sequências:
oligo 3 ' —A G G T dúplex 5 ' —A G C T dúplex 3'—T C G A
Contudo, foi mostrado que os tripletos A-AT e G-GC possuem a maior estabilidade como hélices triplas (Reither e Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Septl2, Epub). Os mesmos autores demonstraram que os TFO concebidos de acordo com a regra A-AT e G-GC não formam tríplices não específicos, indicando que a formação do triplex é específica da sequência.
Assim, para qualquer determinada sequência na região reguladora de LOX ou LOXL, pode ser concebida uma sequência que forma um triplex. Os oligonucleótidos que formam tríplices podem ter pelo menos 15, 25, 30 ou mais nucleótidos de comprimento. Podem também ter até 50 ou 100 pb. A transfecção de células (por exemplo, por via de lipossomas catiónicos) com TFO, e a formação da estrutura helicoidal tripla com o ADN alvo induz alterações estereoquímicas e funcionais, bloqueando a iniciação e o alongamento da transcrição, permitindo a introdução de alterações desejadas na sequência no ADN endógeno e resultando na infra-regulação especifica da expressão génica. Os exemplos desta supressão de expressão génica em células tratadas com TFO incluem knockout dos genes supFGl epissómico e HPRT endógeno em células de mamífero (Vasquez et al.r Nucl Acids Res. 27:1176-1181 (1999); Puri et al., J Biol. Chem. 276: 28991-28998 (2001)), e a infra-regulação específica da sequência e do alvo da expressão do factor de transcrição 42 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Ets2, importante na etiologia do cancro da próstata (Carbone et al., Nucl. Acid Res. 31:833-843 (2003)), e o gene ICAM-1 pró-inflamatório (Besch et al., J. Biol. Chem. 211:32473-32479 (2002)). Em adição, Vuyisich e Beal mostraram que TFO específicos da sequência podem ligar-se a ARNcd, inibindo a actividade de enzimas dependentes de ARNcd tais como quinases dependentes de ARN (Vuyisich e Beal, Nuc. Acids Res. 28: 2369-2374 (2000)) .
Adicionalmente, os TFO concebidos de acordo com os princípios acima mencionados podem induzir mutagénese dirigida capaz de efectuar reparação de ADN, desse modo proporcionando tanto infra-regulação como supra-regulação da expressão de genes endógenos (Seidman e Glazer, J. Clin. Invest. 112:487-494 (2003)). A descrição detalhada da concepção, síntese e administração de TFO eficazes pode ser encontrada nos pedidos de patente U.S. 2003/017068 e 2003/0096980 de Froehler et al., e 2002/0128218 e 2002/0123476 de Emanuele et al., e na Patente U.S. 5,721,138 de Lawn.
Os infra-reguladores aqui descritos acima são úteis para a inibição da angiogénese em tecido tumoral. Foi mostrado que o PF 4, uma proteína de ligação a lisil-oxidase que inibe a angiogénese em tecido tumoral, se acumula especificamente em vasos sanguíneos recém-formados de tumores (vasos angiogénicos) mas não em vasos sanguíneos estabelecidos (Hansell et al., Amer. J. Physiol-Heart. Circ. Phy. 38: H829-H836 (1995); Reiser et al., FASEB J. 6: 2439-2449 (1992)).
Os vasos sanguíneos angiogénicos recém-formados são tipicamente mais permeáveis a proteínas do que os vasos sanguíneos estabelecidos porque o principal indutor da angiogénese em muitas doenças angiogénicas é o VEGF, um factor de crescimento que também funciona como um potente factor permeabilizante de vasos sanguíneos (VPF) (Neufeld et al., FASEB J. 13:9-22 (1999)). Os vasos sanguíneos associados a tumores estão portanto tipicamente num estado permanente de hiperpermeabilidade devido à sobre-expressão desregulada de VEGF e como tal, uma molécula infra-reguladora utilizada pelo método da presente divulgação pode ser capaz de extravasar eficientemente dos vasos sanguíneos tumorais mas muito menos eficientemente de vasos sanguíneos estabilizados normais. 43 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Supra-reguladores
Podem ser utilizadas várias abordagens para aumentar os níveis de LOX ou LOXL e como tal para aumentar a formação de vasos sanguíneos.
Por exemplo, uma construção de ácido nucleico incluindo um promotor constitutivo, indutível ou específico do tecido, posicionado a montante de um polinucleótido que codifica um polipéptido possuindo actividade de LOX ou LOXL, tal como o polipéptido estabelecido em SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9, pode ser administrada a um tecido de mamífero. A LOX ou a LOXL expressas a partir desta construção podem aumentar substancialmente os níveis de LOX ou LOXL no interior das células do tecido e assim aumentar a angiogénese.
Os segmentos de polinucleótidos que codificam a LOX ou a LOXL podem ser ligados a um vector de expressão comercialmente disponível. Estes vectores de expressão incluem uma sequência promotora para dirigir a transcrição da sequência polinucleótídica na célula de uma maneira constitutiva ou indutível. Um promotor adequado pode ser, por exemplo, um promotor Tie-2 que é capaz de dirigir a expressão do gene específico da lisil-oxidase em células endoteliais (veja-se Schlaeger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U S.A. 94, 3058-3063 (1997)). O vector de expressão da presente divulgação pode ainda incluir sequências polinucleotídicas adicionais tais como, por exemplo, sequências que codificam marcadores de selecção ou polipéptidos repórter, sequências que codificam a origem de replicação em bactérias, sequências que permitem a tradução de várias proteínas a partir de um único ARNm tal como um local de entrada no ribossoma interno (IRES), sequências para a integração genómica da região de codificação do promotor-polipéptido quimérico e/ou sequências geralmente incluídas em vectores de expressão de mamífero tais como PCDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que estão disponíveis de Invitrogen, pCI que está disponível de Promega, pBK-RSV e pBK-CMV que estão disponíveis de Strategene, pTRES que está disponível de Clontech, e seus derivados. 44 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Notar-se-á que estes sistemas de vector comercialmente disponíveis podem facilmente ser modificados através de técnicas recombinantes vulgarmente utilizadas para substituir, duplicar ou mutar sequências promotoras ou potenciadoras existentes e/ou introduzir quaisquer sequências polinucleotídicas adicionais.
Um agente capaz de supra-regular uma LOX ou uma LOXL pode também ser qualquer composto que seja capaz de aumentar a transcrição e/ou a tradução de um ADN endógeno ou ARNm que codificam uma LOX ou uma LOXL utilizando por exemplo técnicas de "knock in" de genes.
Elementos potenciadores podem sofrer "knock-in" adjacentes a sequências de codificação de lisil-oxidases endógenas para desse modo aumentar a sua transcrição.
Outros detalhes relacionados com a construção e utilização de construções knockout e knock-in são proporcionados noutros documentos (Fukushige e Ikeda, DNA Res. 3:73-80 (1996); Bedell et al., Genes Dev. 11:1-11 (1997);
Bermingham et al., Genes Dev. 10:1751-1762 (1996)).
Notar-se-á que a administração directa de um polipéptido que exibe uma actividade de LOX ou de LOXL pode também ser utilizada para aumentar a angiogénese.
Assim, ensaios de ligação de afinidade e/ou ensaios de actividade, cujos princípios são bem conhecidos na especialidade, podem ser utilizados para o rastreio de novos compostos (e.g., análogos de substrato) que podem regular especificamente a actividade de uma lisil-oxidase e como tal podem ser utilizados com a presente invenção.
Um ensaio adequado para utilização relativamente a este aspecto da presente divulgação foi previamente descrito num estudo conduzido por Bedell-Hogan et al., J Biol Chem. 268:10345-10350 (1993).
Administração
Estudos prévios correlacionaram os níveis de expressão de LOXL2 com as propriedades metastáticas de linhas celulares 45 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ derivadas de cancro da mama, indicando que a L0XL2 pode desempenhar papéis adicionais na capacidade de invasão tumoral em adição ao seu papel na angiogénese.
Assim, a presente divulgação proporciona um método de inibição da metástase e/ou da fibrose num tecido de mamífero utilizando composições aqui descritas. 0 método é realizado por administração ao tecido de mamífero de uma molécula capaz de infra-regular um nível tissular e/ou uma actividade de pelo menos um tipo de uma lisil-oxidase, tal como ARNgc aqui divulgado. 0 método da presente divulgação pode ser utilizado para tratar pacientes humanos que foram diagnosticados com tumores cancerosos, por administração de qualquer das moléculas infra-reguladoras aqui descritas acima, de modo a reduzir o nível tissular e/ou a actividade de pelo menos um tipo de uma lisil-oxidase .
Como aqui se utiliza, a frase "tumor canceroso" refere-se a qualquer tumor maligno num corpo humano incluindo, mas não se lhes limitando, tumores com metástases. Em adição, e sem vínculo a nenhum tipo particular de tumor canceroso, a presente divulgação é útil para tratar tumores de cancro da mama, com ou sem metástases. uma
Como aqui se utiliza, o termo "administração" refere-se a todos os modos de administração aqui descritos adiante em relação às composições farmacêuticas da presente invenção. Administração refere-se também a todos os modos de administração aqui descritos adiante em relação a qualquer agente, incluindo polinucleótidos da presente invenção, para obter um efeito terapêutico. A administração pode ser de uma quantidade eficaz para ter um efeito terapêutico. 0 efeito terapêutico pode ser para tratamento ou inibição de uma condição ou desordem, tais como tumores cancerosos, primários ou metastáticos, PAP, assim como desordens ou condições associadas a fibrose, e/ou angiogénese. Uma quantidade eficaz, como aqui se utiliza, refere-se à quantidade ou dosagem dessa composição, tal como um agente, incluindo polinucleótidos da presente invenção que é necessária para induzir um efeito desejado. Uma quantidade eficaz de uma composição 46 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ farmacêutica, ou de um agente, tal como um polinucleótido, significa ser uma quantidade não tóxica mas suficiente do agente ou da composição, para proporcionar o efeito desejado, i.e., inibição, prevenção ou reversão, do inicio ou do decorrer progressivo de um cancro, primário ou metastático, PAP, inflamação, e/ou condições ou desordens relacionadas com fibrose ou angiogénese. A administração inclui, mas não se lhes limita, administração local no tecido tumoral, num órgão em que o tumor canceroso foi diagnosticado e/ou tecidos relacionados que tipicamente formam metástases (Hortobagyi, Semin. Oncol. 29: 134-144 (2002); Morrow e Gradishar, BMJ 324:410-414 (2002)). Os exemplos de tecidos relacionados incluem nódulos linfáticos adjacentes a, por exemplo, tecido da mama e ossos. A administração pode também ser efectuada de uma maneira sistémica de modo a tratar o tecido afectado, i.e., o tecido onde o tumor canceroso se formou e onde as metástases estão presentes ou provavelmente se formem com a progressão do tumor. Pode ser administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições aqui descritas, em que a quantidade não é tóxica mas é suficiente para proporcionar o efeito desejado, i.e., inibição, prevenção ou reversão do inicio ou decorrer progressivo de uma condição aqui descrita, incluindo formação de tumores primários ou crescimento, metástase, fibrose, angiogénese e PAP.
Como pode ser utilizada qualquer molécula capaz de infra-regular a actividade de uma lisil-oxidase pelos métodos aqui descritos acima, a presente divulgação também proporciona um método de identificação de moléculas capazes de inibir a metástase e/ou a fibrose.
Este método é efectuado por rastreio e identificação de moléculas que exibem reactividade especifica com pelo menos um tipo de lisil-oxidase e teste de um potencial inibitório de metástases e/ou de fibrose destas moléculas.
Podem ser rastreadas numerosos tipos de moléculas quanto à reactividade com pelo menos um tipo de lisil-oxidase, e os exemplos incluem, mas não se lhes limitando, moléculas tais 47 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ como oligonucleótidos anti-sentido, ARNip, ADNzimas, ribozimas e oligonucleótidos que formam hélices triplas (TFO) que interactuam com um polinucleótido que expressa actividade de lisil-oxidase ou moléculas tais como anticorpos que interactuam com polipéptidos possuindo uma actividade de lisil-oxidase. Em adição, péptidos curtos e outras moléculas pequenas podem também ser rastreados por este método e utilizadas nas composições e métodos de tratamentos aqui divulgados. 0 rastreio de reactividade cruzada pode ser efectuado por ensaios enzimáticos da actividade de lisil-oxidase, por ensaios de ligação e similares. Exemplos de ensaios adequados são proporcionados em Rodriguez et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22:1409-1414 (2002;,· Wilson e Nock, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:81-85 (2002;,· Uetz, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 57-62 (2002;,· Stoll et al., Front Biosci. 7 : cl3-32 (2002) ) . O teste de um fenótipo metastático de células tumorais transformadas pode ser realizado in vitro uma vez que quase todos os passos do processo metastático, incluindo fixação, degradação da matriz e migração, podem ser modelados experimentalmente in vitro através da medição da invasão de uma membrana basal reconstituída (RBM). A capacidade de invasão metastática de uma célula tumoral pode ser modelada por migração das células tumorais para a membrana basal reconstituída (RBM) na presença e na ausência de um quimioatractor, tal como meio condicionado por fibroblastos (FCM). 0 ensaio determina células que se fixaram na RBM, degradaram a RBM enzimaticamente e, finalmente, células que penetraram o lado FCM da membrana.
Como os eventos de metástase in vitro correspondem a passos observados na disseminação metastática de células tumorais através da membrana basal in vivo, a capacidade de invasão in vitro de células pode ser ensaiada pelos métodos descritos em Albini et al., Câncer Res. 47:3239-3245 (1987j. Ensaios da capacidade de invasão e outros métodos para determinar os efeitos metastáticos, estão descritos em Leyton et al., Câncer Res. 54:3696-3699 (1994;. Preparações de membrana basal reconstituída para utilização de acordo com os ensaios aqui descritos acima estão prontamente disponíveis em 48 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ numerosos fornecedores comerciais. Um exemplo destas membranas a este respeito é a "MATRIGEL" disponível de Collaborative Biomedical Products of Bedford, MA. A avaliação in vitro do fenótipo metastático de células tumorais pode também ser efectuada por determinação do nível e do padrão de expressão de um ou mais marcadores associados a metástase tais como marcadores de protease, que são considerados uma parte integral da metástase tumoral (veja-se a Patente U.S. 6,303,318). Um exemplo é o ácido araquidónico, cuja libertação nas células pode servir para indicar o potencial metastático de um tumor (Patente U.S. 6,316,416). A este respeito, a determinação da actividade de fosfolipase A-2 (PLA2), e da actividade ou abundância de factores que afectam a actividade de PLA2, tais como a proteína uteroglobina (Patente U.S. 6,316,416) pode servir como uma indicação do potencial metastático. A determinação do padrão e do nível de expressão de marcadores associados à metástase pode ser efectuada por um dos vários métodos conhecidos na especialidade. A presença ou o nível de proteínas indicativas de potencial metastático de tumores podem determinados em células por métodos convencionais bem conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, as técnicas para preparação e utilização de anticorpos e outros reagentes imunológicos e para a detecção de proteínas particulares em amostras utilizando estes reagentes estão descritos em Coligan et al. (Eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (1995), pertinentes para a preparação e utilização de reagentes úteis para a determinação de proteínas específicas em amostras. Como outro exemplo, métodos imuno-histoquímicos para a determinação de proteínas em células em tecidos estão descritos em Ausubel et ai., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Chapter 14, John Wiley & Sons, Inc. (1994), pertinente para a realização destas determinações. Finalmente, Linnoila et al., A.J.C.P. 97: 235-243 (1992) e Peri et al., J. Clin. Invest. 92: 2099-2109 (1992), descrevem técnicas que podem ser utilizadas. 49 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ Ο potencial metastático pode também ser determinado in vivo ao nível do ARNm. A presença e/ou o nível de transcritos de ARNm podem ser determinados por uma variedade de métodos conhecidos dos peritos na especialidade. Um determinado ARNm pode ser detectado em células por hibridação com uma sonda específica. Estas sondas podem ser ADN clonados ou seus fragmentos, ARN, tipicamente feitas por transcrição in vitro, ou sondas oligonucleotidicas, usualmente geradas por síntese em fase sólida. Os métodos para geração e utilização de sondas adequadas para hibridação específica são bem conhecidos e utilizados na especialidade.
Podem ser empregues com utilidade uma variedade de controlos para melhorar a precisão dos ensaios de detecção de ARNm. Por exemplo, as amostras podem ser hibridadas com uma sonda irrelevante e tratadas com ARNase A antes da hibridação, para determinar a hibridação falsa.
De modo a modular a angiogénese ou inibir a metástase ou a fibrose tumoral, as moléculas utilizadas pela presente divulgação podem ser administradas ao indivíduo per se, ou numa composição farmacêutica onde estão misturadas com transportadores ou excipientes adequados.
Como aqui se utiliza, uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes activos aqui descritos com outros componentes químicos tais como transportadores e excipientes fisiologicamente adequados. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitar a administração/direccionamento de um composto para um mamífero.
Como aqui se utilize, a expressão "ingredientes activos" refere-se à preparação responsável pelo efeito biológico, i.e., as moléculas supra-reguladoras/infra-reguladoras utilizadas pela presente divulgação para modular a angiogénese e as moléculas infra-reguladoras utilizadas pela presente divulgação para inibir a metástase e a fibrose tumoral.
As frases "transportador fisiologicamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável" são utilizadas indiferentemente para referir um transportador, tal como, por 50 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ exemplo, um lipossoma, um vírus, uma micela ou uma proteína, ou um diluente, que não causam irritação significativa ao mamífero e não ab-rogam a actividade biológica e as propriedades do ingrediente activo. Um adjuvante está incluído nestas frases. 0 termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para adicionalmente facilitar a administração de um ingrediente activo. Os exemplos de excipientes incluem, sem limitação, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis. Técnicas para a formulação e administração de composições podem ser encontradas em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição.
As vias de administração adequadas podem incluir, por exemplo, entrega oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal ou parentérica, incluindo injecções intramuscular, subcutânea e intramedular assim como injecções intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal ou intra-ocular.
Para a injecção, os ingredientes activos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, são utilizados na formulação penetrantes apropriados para a barreira ser permeada. Estes penetrantes são genericamente conhecidos na especialidade.
Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente por combinação do ingrediente activo com transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na especialidade. Estes transportadores permitem que o ingrediente activo da invenção seja formulado sob a forma de comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, e similares, para ingestão oral por um paciente. As preparações farmacológicas para utilização oral podem ser preparadas utilizando um excipiente 51 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageia. Os excipientes adequados são, em particular, enchimentos tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma adragante, metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio.
Os núcleos de drageia são proporcionados com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar que podem opcionalmente conter goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio, soluções laqueantes e solventes ou misturas de solventes orgânicos adequados. Corantes ou pigmentos, podem ser adicionados aos comprimidos ou aos revestimentos de drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos activos.
As composições farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente, incluem cápsulas de encaixe ("push-fit") feitas de gelatina, assim como cápsulas moles, seladas, feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas "push-fit" podem conter os ingredientes activos em mistura com um enchimento tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os ingredientes activos podem estar dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos. Em adição, podem ser adicionados estabilizantes. Todas as formulações para administração oral deverão estar em dosagens adequadas para a via de administração escolhida. 52 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas (losangos) formulados da maneira convencional.
As preparações aqui descritas podem ser formuladas para administração parentérica, e.g., por injecção de bolus ou infusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas com, opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.
As composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas da preparação activa em forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos ingredientes activos podem ser preparadas sob a forma de suspensões para injecção apropriadas à base de óleo ou água. Os solventes ou veículos lipófilos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos tais como oleato de etilo, triglicéridos ou lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias, que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos ingredientes activos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Alternativamente, o ingrediente activo pode estar sob a forma de um pó para reconstituição com um veículo adequado, e.g., solução à base de água estéril, isenta de pirogénios, antes da utilização. A preparação da presente divulgação pode também ser formulada em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, e.g., bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos. 53 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
As composições farmacêuticas adequadas para utilização no contexto da presente divulgação incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para atingir a finalidade pretendida. A composição farmacêutica pode formar uma parte de um artigo de fabrico que também inclui um material de embalagem para conter a composição farmacêutica e uma bula que proporciona indicações de utilização para a composição farmacêutica.
Assim, a presente divulgação proporciona métodos e composições farmacêuticas úteis para modulação da angiogénese.
Esta actividade de modulação pode ser utilizada para tratar artrite (Koch, Arthritis Rheum. 41:951-962 (1998J;
Paleolog e Fava, Springer Semin. Immunopathol. 20:73-94 (1998)), retinopatia diabética (Miller et al., Diabetes Metab. Rev. 13:37-50 (1997)), psoriase, (Detmar et al., J. Exp. Med. 180:1141-1146 (1994); Creamer et al., Br. J Dermatol. 136, 859-865(1997)) ou vasculite (Lie, Curr. Opin. Rheumatol. 4:47-55 (1992); Klipple e Riordan, Rheum. Dis. Clin. North Am. 15:383-398 (1989)) .
Em adição, a presente divulgação também proporciona métodos para tratar uma doença caracterizada por vasos sanguíneos frágeis, incluindo sindrome de Marfans, Kawasaki, Ehlers-Danlos, cutis-laxa, e takysu (Lie, Curr. Opin.
Rheumatol. 4:47-55 (1992); Klipple e Riordan, Rheum. Dis.
Clin. North Am. 15:383-398 (1989); Brahn et al., Clin.
Immunol. Immunopathol. 90:147-151 (1999); Cid et al., J. Clin. Invest. 91:977-985 (1993); Hoffman et al., Arthritis Rheum. 34:1466-1475 (1991)). É possível que algumas destas doenças resultem de actividade de lisil-oxidase reduzida ou abolida que conduz à síntese de uma matriz extracelular frágil, e consequentemente, a vasos sanguíneos frágeis. Como tal, a administração de sequências que codificam LOX ou LOXL, ou de polipéptidos, pode ser utilizada para corrigir algumas das manifestações destas doenças. A presente divulgação também proporciona métodos para tratar doenças que são caracterizadas por alterações na parede 54 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ de vasos sanguíneos. Por exemplo, a restenose, que é uma complicação comum consequente de terapia com balões, a displasia fibromuscular (Begelman e Olin, Curr. Opin.
Rheumatol. 12:41-47 (2000)) e a estenose aórtica (Palta et al., Circulation 101: 2497-2502 (2000)), são todas potencialmente tratáveis pelas composições e métodos aqui descritos.
Diagnósticos
Em adição, a LOXL2 é mais altamente expressa em tumores e linhas celulares metastáticos do que em tumores e linhas celulares não metastáticos. Isto sugere que os níveis de expressão de LOXL2 podem ser utilizados como ferramenta de diagnóstico para determinar a malignidade de células cancerosas, assim como, para determinar e implementar regimes de tratamento adequados. A LOXL2 e a LOXL3 são também mais altamente expressas em PAP, e assim, os níveis de LOXL2, LOXL3, ou de ambas, podem ser utilizados como ferramenta de diagnóstico para determinar PAP e implementar regimes de tratamento adequados. Podem ser utilizados agentes de detecção, tais como um anticorpo, uma molécula pequena, uma molécula anti-sentido, uma ribozima, uma ADNzima, oligonucleótidos que formam hélices triplas, ARNip ou ARNgc, para determinar o nível ou a actividade de LOXL2, LOXL3, ou de ambas, em indivíduos. O cancro do cólon é uma doença altamente tratável e frequentemente curável quando localizado no intestino. Contudo, em muitos casos, devido a um diagnóstico errado, uma hiperplasia pré-maligna do cólon progride para adenoma do cólon que adicionalmente se desenvolve em formas mais malignas de adenocarcinoma do cólon de baixo grau e alto grau. Uma vez um indivíduo diagnosticado com cancro do cólon, a malignidade do tumor precisa de ser determinada para seleccionar os regimes de tratamento adequados. A prática corrente para determinação da malignidade de um tumor do cólon baseia-se no sistema de estadiamento de tumor-nódulo-metástase (TNM) desenvolvido pelo American Joint Committee on Câncer (AJCC). De acordo com este método o estadiamento baseia-se numa pontuação quanto à presença ou ausência de células cancerosas no próprio tumor, na submucosa da parede intestinal, na camada 55 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ muscular da parede intestinal (muscularis própria), e/ou nos tecidos subserosos, pericólicos ou perirrectais, assim como em nódulos linfáticos regionais e metástases à distância. Assim, o estadiamento dos tumores do colon envolve múltiplas biópsias de tecido e complexas avaliações patológicas que são demoradas e podem resultar em diagnósticos errados. A expressão de L0XL2 em células de tecido epitelial e/ou conectivo num tecido do cólon é indicativa de um cancro do cólon maligno e assim proporciona um novo método de determinação de uma malignidade de tumores de cancro do cólon desprovido das limitações anteriores. A expressão de L0XL2 está correlacionada com a formação de tumores benignos do cólon e está aumentada em formas mais malignas de tumores de cancro do cólon, sugerindo assim a utilização de L0XL2 na determinação do estádio de tumores de cancro do cólon.
Assim, de acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionado um método de determinação de uma malignidade de um tumor do cólon. 0 método é efectuado determinando um nível tissular e/ou um nível de actividade de um polipéptido pelo menos 75% homólogo do polipéptido estabelecido em SEQ ID NO:2 ou 9 no tecido do tumor do cólon, desse modo determinando a malignidade do tumor do cólon.
Tal como aqui se utiliza, a frase "determinação de uma malignidade de um tumor do cólon" refere-se à determinação do estádio do tumor do cólon, i.e., a progressão do tumor do cólon desde um tumor benigno do cólon até um cancro do cólon altamente maligno que invade o tecido circundante. 0 polipéptido detectado pela presente divulgação pode ser pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% homólogo de SEQ ID NO:2 ou 9, como determinado utilizando o software BestFit do pacote de análise de sequências Wisconsin, utilizando o algoritmo de Smith e Waterman, onde a penalidade por criação de hiatos é igual a 8 e a penalidade por extensão de hiatos é igual a 2. 56 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Em algumas concretizações, o polipéptido é L0XL2 (SEQ ID NO:2), um membro da família de lisil-oxidases que são aqui completamente descritas.
De acordo com os métodos aqui descritos, um tecido de tumor do cólon é obtido utilizando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon utilizando métodos conhecidos na especialidade. Uma vez obtido, o nível tissular e/ou nível de actividade do polipéptido da presente divulgação é determinado no tecido do tumor do cólon.
Similarmente, para o diagnóstico de PAP, uma amostra de tecido pulmonar pode ser obtida por biópsia pulmonar e outros métodos conhecidos na especialidade. 0 polipéptido detectado pela presente divulgação pode ser pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% homólogo de SEQ ID NO: 2 ou 9, como determinado utilizando o software BestFit do pacote de análise de sequências Wisconsin, utilizando o algoritmo de Smith e Waterman, onde a penalidade por criação de hiatos é igual a 8 e a penalidade por extensão de hiatos é igual a 2. O polipéptido da presente divulgação pode ser L0XL2 (SEQ ID NO:2) ou LOXL3 (SEQ ID NO: 9), membros da família de lisil-oxidases que são aqui completamente descritos. A expressão de ARNm pode também ser detectada e utilizada para diagnóstico. Além disso, tanto a LOXL2 como a LOXL3 podem ser detectadas, utilizando quer o mesmo agente de detecção (por exemplo um anticorpo que detecta ambas as proteínas), quer diferentes agentes de detecção (por exemplo um anticorpo que é especifico para LOXL2 e outro anticorpo específico para LOXL3; ou diferentes sondas de Northern). A determinação do nível tissular dos polipéptidos aqui descritos pode ser realizada directamente utilizando métodos imunológicos.
Os métodos imunológicos de detecção utilizados no contexto da presente divulgação estão completamente explicados, por exemplo, em Lane (Ed.), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999,) e as pessoas familiares com a especialidade serão capazes de implementar as várias técnicas aqui adiante resumidas como parte da presente invenção. Todas as técnicas 57 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ imunológicas requerem anticorpos específicos para pelo menos um epítopo do polipéptido da presente invenção. Os métodos imunológicos de detecção adequados para utilização como parte da presente divulgação incluem, mas não se lhes limitando, radio-imunoensaio (RIA), ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA), Western blot, análise imuno-histoquímica.
Radio-imunoensaio (RIA): Numa versão, este método envolve a precipitação do substrato desejado, e.g., L0XL2, com um anticorpo específico e proteína de ligação ao anticorpo radiomarcada (e.g., proteína A marcada com I125) imobilizada num transportador precipitável tal como contas de agarose. 0 número de contagens na pelete precipitada é proporcional à quantidade de substrato.
Numa versão alternativa do RIA, são empregues um substrato marcado e uma proteína de ligação ao anticorpo não marcada. Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de substrato é adicionada em várias quantidades. A diminuição na contagens precipitadas do substrato marcado é proporcional à quantidade de substrato na amostra adicionada.
Ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA): Este método envolve a fixação de uma amostra {e.g., células fixadas ou uma solução proteinácea) contendo uma proteína substrato {e.g., L0XL2) numa superfície tal como um poço de uma placa de microtítulo. Um anticorpo específico para o substrato acoplado a uma enzima é aplicado e deixado ligar ao substrato. A presença do anticorpo é depois detectada e quantificada por uma reacção colorimétrica empregando a enzima acoplada ao anticorpo. As enzimas vulgarmente empregues neste método incluem peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. Se bem calibrado e dentro da gama linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. É geralmente empregue um padrão de substrato para melhorar a precisão quantitativa.
Análise Western blot: Este método envolve a separação de um substrato {e.g., L0XL2) de outras proteínas por meio de um gel de acrilamida seguida por transferência do substrato para uma membrana (e.g., nylon ou PVDF). A presença do substrato é depois detectada por anticorpos específicos para o substrato, 58 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ que são por sua vez detectados por reagentes de ligação ao anticorpo. Os reagentes de ligação ao anticorpo podem ser, por exemplo, proteina A, ou outros anticorpos. Os reagentes de ligação ao anticorpo podem ser radiomarcados ou ligados a enzimas como descrito acima. A detecção pode ser por autorradiografia, reacção colorimétrica ou quimioluminescência. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de substrato como a determinação da sua identidade através de uma posição relativa na membrana que é indicativa de uma distância de migração no gel de acrilamida durante a electroforese.
Análise imuno-histoquímica: Este método envolve a detecção de um substrato in situ em tecido fixado por anticorpos específicos para o substrato. Os anticorpos específicos para o substrato podem ser ligados a enzimas ou ligados a fluoróforos e detectados por microscopia e avaliação subjectiva. Se forem empregues anticorpos ligados a enzimas, pode ser empregue uma reacção colorimétrica.
Como os níveis tissulares de um polipéptido podem ser inferidos a partir dos niveis de ARNm que codifica esse polipéptido, o método de acordo com este aspecto da presente divulgação pode também empregar várias abordagens de detecção de polinucleótidos para determinação do nível tissular do polipéptido da presente invenção.
As moléculas de ARN podem ser detectadas utilizando métodos conhecidos na especialidade incluindo por exemplo, análise Northern blot, análises por RT-PCR, coloração por hibridação in situ de ARN e coloração in situ por RT-PCR.
Análise Northern Blot: Este método envolve a detecção de um ARN particular (e.g., a molécula de ARN que codifica L0XL2) numa mistura de ARN. Uma amostra de ARN é desnaturada por tratamento com um agente (e.g., formaldeido) que impede as ligações de hidrogénio entre pares de bases, assegurando que todas as moléculas de ARN possuem uma conformação linear, não dobrada. As moléculas de ARN individuais são então separadas de acordo com a dimensão por electrof orese em gel e transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou à base de nylon a que os ARN desnaturados aderem. A membrana é depois 59 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ exposta a sondas de ADN marcadas. As sondas podem ser marcadas utilizando radioisótopos ou nucleótidos ligados a enzimas. A detecção pode ser realizada utilizando autorradiografia, reacção colorimétrica ou quimioluminescência, como aqui descrito acima. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de moléculas de ARN particulares como a determinação da sua identidade através de uma posição relativa na membrana que é indicativa de uma distância de migração no gel durante a electroforese.
Análise por RT-PCR: Este método utiliza amplificação por PCR de moléculas de ARN relativamente raras. Primeiro, moléculas de ARN de um tecido particular (e.g., um tecido de tumor do cólon) são purificadas e convertidas em ADN complementar (ADNc ou cDNA do inglês) utilizando uma enzima transcritase inversa (tal como uma MMLV-RT) e iniciadores tais como, oligo dT, hexâmeros aleatórios ou iniciadores específicos de genes, todos disponíveis de Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, EUA. Depois, por aplicação de iniciadores específicos dos genes e ADN-polimerase Taq, é realizada uma reacção de amplificação por PCR numa máquina de PCR. Os peritos na especialidade são capazes de seleccionar o comprimento e a sequência dos iniciadores específicos dos genes e as condições da PCR (i.e., temperaturas de hibridação, número de ciclos e similares) que são adequados para a detecção de moléculas de ARN específicas.
Coloração por hibridação in situ de ARN: Neste método, sondas de ADN ou de ARN são ligadas às moléculas de ARN presentes no tecido. Geralmente, uma amostra de tecido (e.g., um tecido do cólon) é fixada para preservar a sua estrutura e para impedir o ARN de ser degradado, e depois é seccionada para microscopia e colocada numa lâmina. Alternativamente, amostras de tecido congeladas podem ser primeiro seccionadas e colocadas numa lâmina e depois submetidas a fixação antes da hibridação. As condições de hibridação incluem reagentes tais como formamida e sais (e.g., cloreto de sódio e citrato de sódio) que permitem a hibridação específica das sondas de ADN ou de ARN com as suas moléculas de ARNm alvo in situ enquanto evitando a ligação não específica da sonda. Os peritos na especialidade são capazes de ajustar as condições de hibridação (i.e., temperatura, concentração de sais e 60 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ formamida, e similares) às sondas e tipos de células específicos. Após a hibridação, qualquer sonda não ligada é removida por lavagem e a lâmina é submetida a uma emulsão fotográfica que revela sinais gerados utilizando sondas radiomarcadas, ou a uma reacção colorimétrica que revela sinais gerados utilizando sondas marcadas com enzima ligada como aqui descrito acima.
Coloração por RT-PCR in situ: Este método está descrito em Nuovo et al., Am. J. Surg. Pathol. 17: 683-690 (1993) e Komminoth et al. , Pathol. Res. Pract. 190:1017-1025 (1994,). Resumidamente, a reacção RT-PCR é realizada em secções de tecido fixado por incorporação de nucleótidos marcados na reacção PCR. A reacção é realizada utilizando um aparelho de RT-PCR in situ especifico tal como o sistema de microdissecção de captura por laser PixCell I LCM disponível de Arcturus Engineering (Mountainview, CA). A determinação de um nível de actividade do polipéptido da presente divulgação (e.g., LOXL2) num tecido de tumor do cólon pode ser efectuada utilizando substratos adequados em ensaios de coloração citoquimica e/ou actividade in vitro.
Coloração citoquimica: De acordo com este método, um substrato cromogénico é aplicado no tecido de tumor do cólon contendo uma enzima activa (e.g., LOXL2). A enzima catalisa uma reacção em que o substrato é decomposto para produzir um produto cromogénico visível com um microscópio óptico ou de fluorescência.
Ensaios de actividade in vitro: Nestes métodos a actividade de uma enzima particular é medida numa mistura de proteínas extraída do tecido de interesse (e.g., um tecido de tumor do cólon) . A actividade pode ser medida no poço de um espectrofotómetro utilizando métodos colorimétricos (veja-se, por exemplo, Wande et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA. 1997, 94: 12817-12822 (1997)) ou pode ser medida num gel de acrilamida não desnaturante (i.e., gel de actividade). Após a electroforese o gel é embebido numa solução contendo um substrato e reagentes colorimétricos. A banda corada resultante corresponde à actividade enzimática do polipéptido de interesse (e.g., LOXL2). Se bem calibrado e dentro da gama 61 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ linear de resposta, a quantidade de enzima presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. É geralmente empregue um padrão da enzima para melhorar a precisão quantitativa.
Uma vez determinado o nivel tissular e/ou o nivel de actividade do polipéptido (ou do ARNm) da presente divulgação (e.g., L0XL2) no tecido de tumor do cólon, a malignidade do tumor é determinada por comparação do nivel expressão e/ou de actividade no tecido de tumor do cólon com a de um tecido do cólon normal.
Será notado que o tecido do cólon normal pode ser obtido a partir de uma biópsia e/ou de uma cirurgia de um tecido do cólon obtido de um indivíduo saudável. Alternativamente, o tecido do cólon normal pode ser obtido a partir de um segmento do cólon não afectado do mesmo indivíduo. Os métodos de determinação do estado de um tecido do cólon normal são conhecidos dos peritos na especialidade e incluem, por exemplo, uma avaliação morfológica de secções de tecido.
Uma vez determinada a malignidade do cancro do cólon como descrito acima, o nível tissular e/ou o nível de actividade do polipéptido (ou do seu ARNm) da presente divulgação podem também ser utilizados para o estadiamento do tumor do cólon e para assim prever o prognóstico de um indivíduo diagnosticado com cancro do cólon.
Este estadiamento pode ser efectuado determinando o nível tissular e/ou o nível de actividade do polipéptido e correlacionando-os com os resultados obtidos a partir do tecido de cancro do cólon em vários estádios (obtenível através de avaliação patológica de tumores do cólon). Será notado que este estadiamento preciso e rápido irá permitir o prognóstico preciso e rápido de um indivíduo afectado com cancro do cólon e a administração atempada de um regime de tratamento adequado.
Objectos adicionais, vantagens, e novas características da presente divulgação serão evidentes para um perito na especialidade. Note-se que certas características da divulgação, que são, por clareza, descritas no contexto de 62 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ concretizações separadas, podem também ser proporcionadas em combinação numa única concretização. Inversamente, várias caracteristicas da divulgação, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única concretização, podem também ser proporcionadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Adicionalmente, cada uma das várias concretizações e aspectos da presente divulgação como aqui delineado acima e como reivindicado nas secção de reivindicações adiante, tem suporte experimental nos exemplos que se seguem.
EXEMPLOS
Genericamente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente divulgação incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de ADN recombinante. Estas técnicas estão completamente explicadas na literatura. Veja-se, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (19Q9); Ausubel (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I-III John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1994,); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al. (Eds.), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (19981; metodologias como estabelecido nas Patentes U.S. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; Cellis (Ed.), Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volumes I-III, (1994); Coligan (Ed.), Current Protocols in Immunology, Volumes I-III (1994); Stites et al. (Eds.), Basic and Clinicai Immunology (8th Edition),
Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W: H. Freeman e Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis estão extensivamente descritos na literatura de patentes e científica, vejam-se, por exemplo, as Patentes U.S. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; Gait (Ed.), Oligonucleotide Synthesis, (1984); Hames and Higgins (Eds.), Nucleic Acid Hybridization, (1985); Hames and Higgins (Eds.), Transcription and Translation, (1984); Freshney (Ed.), Animal Cell Culture, (1986); Immobilized Cells and Enzymes, 63 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ IRL Press (1986J; e Methods in Enzymology, Vol. 1-317, Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et ai., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual, CSHL Press (1996). EXEMPLO 1 O ARNgc contra L0XL2 Inibe a Capacidade de Invasão das Células Tumorais
Materiais e Métodos
Plasmídeos de expressão em lentivírus contendo várias sequências de ADN candidatas que codificam espécies de ARNgc candidatas dirigidas contra L0XL2 e um ADN que codifica um gene que confere resistência ao agente selectivo puromicina foram comprados por nós a Sigma (St. Louis, MI) (FIG. 1) . Lentivirus contendo estes ADNc candidatos foram produzidos na linha celular de empacotamento HEK293-T por transfecção dos plasmideos nas células juntamente com o vector de empacotamento pCMVdR8.91, e um plasmideo que codifica o envelope de revestimento do vírus da estomatite vesicular pMD2-VSVG (5 pg) . Recolheram-se os lentivírus recombinantes defectivos para replicação a partir do meio condicionado das células de empacotamento e utilizaram-se para infectar células tumorais alvo. 0 ensaio de invasão tumoral está ilustrado na FIG. 2. Semearam-se as células tumorais entre duas camadas de colagénio, numa monocamada, que representa a massa tumoral. As células invadem ao longo do tempo as camadas adjacentes de colagénio. 0 número de células invasoras a várias profundidades em campos microscópicos é contado automaticamente utilizando o software de análise morfométrica Image-Pro.
Resultados
Os diferentes lentivírus portadores das diferentes espécies de ADN candidatas que codificam os diferentes ARNgc foram rastreados quanto à sua capacidade para inibir a expressão de L0XL2. Nenhuma destas espécies de ADNc possui qualquer homologia com as sequências de outros membros da família de genes de lisil-oxidases. Verificou-se que duas 64 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
destas espécies de ADNc codificam espécies de ARNgc que inibem a expressão de L0XL2 ao nível do ARNm e da proteína. A sequência de ADN que codifica o primeiro ARNgc é
GAAGGAGACATCCAGAAGAAT (sh.L0XL2.19 7 ou si-19 7; SEQ ID NO:20) e a segunda possui a sequência CGATTACTCCAACAACATCAT (sh.LOXL2.195 ou si-195; SEQ ID NO:21). Destas duas, crê-se que a si-195 é um inibidor ligeiramente mais potente (FIG. 3A). O fenótipo invasivo/metastático está associado em muitos casos à transição de uma morfologia epitelial para uma mesenquimatosa (EMT). A expressão das espécies de ARNgc nas linhas celulares tumorigénicas derivadas de humanas induziu um drástico desvio na morfologia de uma morfologia mesenquimatosa para uma morfologia epitelial (FIG. 4).
De modo a determinar os efeitos das espécies de ARNgc sobre a capacidade de invasão das células, células tumorais infectadas com lentivírus de controlo ou células tumorais infectadas com os lentivírus que codificam o ARNgc si-195 foram semeadas entre duas camadas de colagénio e foi determinada a sua capacidade para invadir o colagénio acima e abaixo da monocamada de células. Pode-se observar que a expressão do ARNgc si-195 inibiu substancialmente a capacidade de invasão das células para as camadas de colagénio acima e abaixo da monocamada original de células (FIG. 5). EXEMPLO 2 A L0XL2 está Sobre-expressa na Proteinose Alveolar Primária A proteinose alveolar primária (PAP) é caracterizada por sobre-secreção de tensioactivo pulmonar, e é uma condição problemática de etiologia desconhecida, que apresenta dificuldades tanto para o diagnóstico como para um tratamento eficaz. A expressão de LOXL2 e LOXL3 foi determinada nos pulmões de pessoas normais e pacientes de PAP. A FIG. 6 mostra sobre-expressão de LOXL2 em células endoteliais pulmonares na PAP, enquanto a LOXL3 é expressa no músculo liso. 65 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ EXEMPLO 3 Ο ARNgc para LOXL2 Promove MET em Células Humanas Malignas A L0XL2 induziu MET em três tipos de células humanas malignas, 10HT1080, MDA-MB-231 ou Yu/PAC2. Semearam-se 2xl05 células, em placas de 35 mm. Infectaram-se as células com lentivirus que dirigem a expressão de ARNgc para L0XL2, ARNgc.Loxl2.195 ou ARNgc de controlo (FIG. 7) de acordo com o protocolo do vendedor (Sigma). Realizou-se uma coloração com faloidina das células por fixação das células em paraformaldeido a 4%. As células foram então permeabilizadas com saponina a 0,05% antes de serem coradas com rodamina-faloidina (Molecular Probes, Eugene, OR) (FIG. 7). As células tratadas com ARNgc.Loxl2.195 pareceram estar em estados de transição mesenquitosa-epitelial (MET).
Transfecções com fosfato de cálcio:
Realizaram-se transfecções com fosfato de cálcio para a produção retroviral. Genericamente, as placas foram pré-revestidas com Gelatina esterilizada a 0,2% para assegurar uma melhor aderência das células durante todas as fases do protocolo. Nas placas de 100 mm semearam-se -2,5-3,0 x 106 células para células 293, 293T e 3,2- 3,5 x 106 células para células ΦΝΧ-Α, 18-24 h antes da transfecção. Nas placas de 150 mm semearam-se ~6,0 x 106 células 293, 293T ou ΦΝΧ-Α.
As células estavam -60% confluentes no momento da transfecção. Nas placas de 100 mm, misturaram-se -10 pg de ADN, -438 μΐ de H2O (dependendo do volume de ADN) , 61 μΐ de
CaCl2 2M (volume total de mistura H20/ADN/CaCl2 : 500 μΐ) num tubo de microcentrifuga. O CaCl2 não foi adicionado até os precipitados estarem prontos para serem preparados. Nas placas de 150 mm, utilizaram-se 30 pg de ADN, -878 μΐ de H2O (dependendo do volume de ADN), 122 μΐ de CaCl2 2M (volume total de mistura H20/ADN/CaCl2 : 1000 μΐ). 66 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Produção lentiviral
Para a produção lentiviral em células 293 ou 293T por co-transfecção de ADN Triplo ou para vírus de moloney de revestimento VSVg, utilizando placas de 100 mm, utilizaram-se ~ 10 pg de três ADN consistindo em 5 pg de vector de transferência, 3-4 pg de vector de proteína estrutural e 1-2 pg de vector de envelope pCI (VSVg) . Nas placas de 150 mm, ~30 pg de três ADN (16 pg de vector de lenti-transferência, 12 pg de vector estrutural Δ8.2 e 3 pg de vector de envelope pCI (VSVg) ) . Se o vector de transferência não possuía um gene de GFP, era usualmente incluído um vector de expressão de GFP como ~5% do ADN total, para saber que a eficiência relativa da transfecção (no momento da colheita virai).
Adicionaram-se 500 pl de 2xHBS (Hepes 50 mM, KC1 10 mM, Dextrose 12 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04x7H20 1,5 mM) às misturas H20/ADN/CaCl2 (placas de 100 mm) ou 1000 pl (para placas de 150 mm) com borbulhamento constante destas últimas misturas em tubos de microcentrífuga (se os precipitados eram de 0,5 ml ou menos) ou em tubos de 14 ml de polipropileno (se os precipitados eram de 1-3 ml cada um) ou em tubos de polipropileno de 15 ml. Depois, adicionou-se o CaCl2 às misturas H20/ADN mas não mais do que a quatro tubos de cada vez. Os precipitados foram então deixados à temperatura ambiente durante 0-10 min.
As células estavam em 9 ml de meio (placas de 100 mm) ou 18 ml de meio (placas de 150 mm). Removeu-se o meio em excesso deixando os volumes apropriados para cada dimensão de placa. Adicionou-se cloroquina a cada placa até uma concentração final de 25 pM.
Os 1 ml de precipitados de H20/ADN/CaCl2/2xHBS foram cuidadosamente adicionados às células. O exame microscópico deverá revelar partículas pretas muito finas.
Colocaram-se as placas numa incubadora a 37°C, 5% de CO2. Para assegurar que os precipitados estavam uniformemente distribuídos, as placas foram cuidadosamente agitadas circularmente à mão -duas vezes ao longo dos primeiros 20-30 min de incubação. 67 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ 5-8 h após a transfecção os meios foram trocados por 10 ml de GM fresco (DMEM, 1% de Pen/Estrep, 1% de glutamina, 10% de FBS) para as placas de 100 mm e 22 ml para as placas de 150 mm. As células 293 são mais sensíveis à cloroquina do que as células ΦΝΧ de modo que os meios foram trocados não mais do que 5-7 h após a transfecção. 24 h após a transfecção, a GM foi mudada para 6,5-7 ml para a colheita virai (placas de 100 mm) ou 16-17 ml (placas de 150 mm) . 6 horas antes da colheita moveram-se as placas para uma incubadora a 32°C, 5% de CO2 · Os sobrenadantes foram centrifugados a 2000 RPM durante 5 minutos para remover quaisquer detritos celulares ou foram filtrados através de um filtro de 0,45 mícrones.
Infecções de Moloney e Lenti Retrovirais (Protocolo de "Spinoculação")
Para reforçar a infecção virai, células aderentes e em suspensão em transportadores de placas de cultura de tecido podem ser infectadas por centrifugação ("spininoculação centrífuga ou "spinoculação") a 2000-2400 RPM durante 45-60 minutos a 30-32°C. As células foram infectadas a uma MOI elevada com vírus não diluído em placas de 12, 24 ou 6 poços (geralmente não utilizando mais do que 50-100 x 103 células por poço de uma placa de 6 poços) na presença de 8 pg/ml de polibrina. As células foram infectadas com 0,5-1,0 ml de sobrenadante virai por poço de uma placa de 24 poços, 1 ml por poço de uma placa de 12 poços e 2,0 ml/poço de uma placa de 6 poços. Os sobrenadantes virais do congelador a -80°C foram descongelados à temperatura ambiente e depois foram adicionados às células juntamente com a polibrina. Para células em suspensão, ressuspendeu-se um número contado de células directamente no sobrenadante virai não diluído. A placa foi selada com parafilme a toda a volta para evitar a evaporação e alterações de pH nos meios durante a "spinoculação". Após a primeira "spinoculação" o parafilme é removido das placas e os sobrenadantes virais são substituídos por uma alíquota fresca de vírus e polibrina (o vírus descongelado pode ser mantido à temperatura ambiente durante a primeira centrifugação de 45 minutos) para uma segunda centrifugação equivalente ou mesmo uma terceira centrifugação (dependendo da tolerância das células à centrifugação). Para a 68 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ maioria das células, as células foram usualmente centrifugadas duas vezes (45 min cada centrifugação) . Para as células em suspensão, adicionou-se um volume adicional igual de sobrenadante virai fresco a cada poço para uma segunda centrifugação. Removeu-se o parafilme das placas e sem remover o sobrenadante virai, e continuou-se a incubar a 32°C numa incubadora de CO2 durante até um total de 4-6 h desde o momento da primeira "spinoculação" (se forem realizadas três centrifugações de 45 min. cada uma, a incubação com a última alíquota de vírus era realizada durante mais 2-3 h a 32°C). 0 meio de crescimento regular foi trocado e as células foram incubadas a 37°C durante 2 dias antes do exame das células quanto a fluorescência da GFP. Iniciaram-se as selecções com fármacos 48 h após a infecção. Se as células cresciam demasiado antes de se atingirem as 48 h, eram divididas por mais poços com meio de crescimento regular. EXEMPLO 4 O ARNgc para L0XL2 Diminui o Desenvolvimento de Tumores
Primários
Cinco milhões de células MDA-MB-231 foram infectadas com lentivírus que codificam ARNgc de controlo ou com vector lentiviral que expressa o ARNgc 195 dirigido para L0XL2, ARNgc.Loxl2.195 (si-L0XL2). As células infectadas foram seleccionadas antes da injecção com puromicina (2 microgramas/ml). Dois dias antes da injecção, a expressão de L0XL2 foi determinada nas células de controlo vs infectadas com ARNgc.Loxl2.195 e a inibição foi de cerca de 65% com base na densitometria de Western blot (leitura directa de fluorescência a partir das transferências). A taxa de proliferação das células de controlo vs infectadas com ARNgc.Loxl2.195 in vitro foi similar. As células infectadas foram injectadas nas almofadas de gordura mamárias de ratinhos balb/c nu/nu fêmeas. Mediu-se o volume tumoral 6, 11, 14, 18, 22, 25, e 27 dias após a injecção (FIG. 8A). 0 desenvolvimento dos tumores foi diminuído em ratinhos injectados com MDA-231 si-controlo em comparação com ratinhos injectados com células MDA-231 SÍ-Loxl2. (FIG. 8A, B) 69 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ EXEMPLO 5
Genes em Células MCF7 Afectados por Sobre-expressão de L0XL2 ou Inibição Células MCF7 foram transfectadas com vector de expressão para sobre-expressar L0XL2 (clone 12 e 14) , infectadas com vector lentiviral de controlo contendo um ARNgc não relacionado (WT), ou infectadas com um mutante de L0XL2 que é enzimaticamente inactivo devido a uma mutação no seu motivo LTQ (Y689F). A expressão génica foi medida por RT-PCR e
Western blotting. Realizou-se a RT-PCR utilizando protocolos padrão. Foi identificado aumento na expressão em vários genes quando a L0XL2 era sobre-expressa (FIG. 9A).
As células foram infectadas com vector lentiviral de
ARNgc 195. As células foram seleccionadas com puromicina e a expressão de L0XL2 foi monitorizada por Western blot. 0 ARN foi isolado e foi realizada a RT-PCR. As condições da PCR utilizando iniciadores específicos de L0XL2 foram de 30 ciclos de 55, 72, 95°C, 1 min. cada (FIG. 9B). EXEMPLO 6 A Expressão de L0XL2 é Aumentada por Hipoxia
Incubaram-se as células numa câmara de hipoxia a 37°C a 1,5% de O2 durante 24h. Incubou-se um controlo em condições normóxicas (incubadora regular). O ARN foi preparado a partir das células A549 e amplificado por RT-PCR (30 ciclos de 55, 72, 95°C, 1 min. cada) . A expressão de LOXL2 é aumentada sob condições hipóxicas (FIG. 10A).
Os níveis de LOXL2 foram determinados por Western blot. As células foram estimuladas durante os tempos indicados com a concentração indicada de C0CI2 (FIG. 10B). Foram preparadas concentrações iguais de lisado celular com tampão de lise contendo 0,1% de DOC e 1% de NP40 com inibidores de protease e tampão Hepes 10 mM, pH-7,2. Separaram-se os lisados celulares num gradiente de 8%-10% em gel SDS/PAGE, transferiram-se e sondaram-se com anticorpos anti-LOXL2. As membranas foram limpas e novamente sondadas com um anticorpo dirigido contra β-actina para verificar que a carga era igual. 70 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ EXEMPLO 7 Células Endotelials Derivadas de Veia Umbilical Humana Contêm Receptor de L0XL2 Ligado à Superfície Celular
Quatro linhas celulares diferentes, HUVEC, LE2, HMEC e Balb, foram testadas quanto à sua ligação específica a L0XL2 por medição utilizando L0XL2 iodada. A LOXL2 foi iodada e adicionada a cada poço numa concentração final de 0,35 pg/ml. A competição foi realizada com LOXL2 não marcada (3,5 pg/ml) (FIG. 11A) .
Os poços foram revestidos com gelatina, laminina ou fibronectina para testar a sua capacidade de ligar LOXL12. A LOXL2 foi iodada e adicionada a cada poço numa concentração final de 0,35 pg/ml. A competição foi realizada com LOXL2 não marcada (3,5 pg/ml). Não foi determinada ligação específica (FIG. 11B) indicando que a ligação observada na FIG. 11A não foi causada por ligação a estes componentes de ECM.
As mesmas condições de ligação que se descreveram na FIG.11A acima, mas na ausência de, ou com adição de 100 ug/ml de heparina ou após digestão prévia com heparinase. Nem a ausência nem a adição de heparina de ligação afecta a ligação de LOXL2. (FIG.11C). EXEMPLO 8 L0XL2 e LOXL3 são Expressas em Células Neuronais
Secções 5 um embebidas em parafina e fixadas com formalina de córtex de cérebro normal foram examinadas por hibridação in situ. (FIG. 12)
Preparação de sondas de ARN marcadas com DIG
Prepararam-se sondas de ARN marcadas com digoxigenina (DIG-ll-UTP) na orientação de sentido directo ou anti-sentido. As sondas foram sintetizadas por transcrição run-off in vitro utilizando ARN-polimerase de T7 e o kit de marcação de ARN Dig/Genius (Roche Boheringer-Manheim). As sondas foram geradas por reacção PCR a partir dos ADNc de LOX, LOXL1, LOXL2 e LOXL3 humanos correspondentes aos nucleótidos (começando no primeiro 71 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ ATG) 164-560 para LOX, 668-1093 para LOXL1, 403-1102 para LOXL2 e 479-1913 para LOXL3. Os iniciadores eram específicos para cada sonda e portadores de locais para enzimas de restrição para clonagem no vector pBluescript (KS, SK). Os iniciadores eram: hLOX:
5' (EcoRI) CGCCGGAATTCGCTCACAGTACCAGCCTCAG 3' (PstI) CCAAAACTGCAGGTAGTAGTTGTAATAAGGGT hLOXLl:
5' (EcoRI) CGCCGGAATTCGGTCATCTACCCCTACCAGC 3' (Xbal) CTAGTCTAGAACATAGTTGGGGTCTGGGAC hLOXL2: LOXL2/pCDNA3.1 hygro foi digerido com EcoRA-Notl e o fragmento foi clonado hLOXL3: LOXL3/pCDNA3.1 hygro foi digerido com Xho-BglII e o fragmento foi clonado.
Os fragmentos foram clonados em pBluescript em orientação "KS" ou "SK" de modo a gerar sondas de "sentido directo" ou "anti-sentido". A mistura reaccional para marcação de problemas continha: 1 ug de ADN (LOXL2, LOX, LOXL1 ou LOXL3 em pBluescript), tampão de reacção 10X (kit de ARN-polimerase de T7, Boehringer-Manneheim), DTT 100 mM (Sigma), dNTP marcados com Dig 10X (Boehringer-Manneheim, N.° Cat. 1175025), inibidor de ARNase (Promega, 15 unidades por reacção), ARN-polimerase de T 7 10X, e água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietilo) para completar o volume de 20 ul. A reacção durou 2 horas a 3 7 0 C .
A reacção foi parada por adição de 0,8 ul de EDTA. A sonda de ARN marcada com Dig foi então precipitada pela adição de 1 μΐ de glicogénio a 20 mg/ml, 2 ul de LiCl 4M, e 55 ul de etanol arrefecido. A solução foi bem misturada e incubada durante a noite a -70°C. A sonda foi sedimentada por centrifugação durante 15 minutos a 4°C a 13 OOOg. O 72 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ precipitado foi lavado com etanol frio a 70% e novamente centrifugado durante 5 minutos a 4°C a 13 OOOg. A pelete foi seca e ressuspensa em 100 ui de DDW (água destilada desionizada) tratada com DEPC. Separaram-se quatro μΐ de sonda em gel de agarose regulado com 1% de TAE, com brometo de etidio a 0,005% para determinar a formação da sonda de ARN. A concentração final de sonda para hibridação era de 1 ug/ml.
Pré-tratamento de lâminas
Secções de tecido de 5 um embebidas em parafina e fixadas em formalina foram desparafinadas por três lavagens de 5-10 min. cada uma com xileno a 100%. As secções foram reidratadas através de uma série de lavagens com etanol a 100%, 95%, 70% e 30% (5 min. de incubação em cada solução) à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas duas vezes com água tratada com DEPC durante 2 min. e depois foram tratadas com HC1 0,2 M durante 10 min para desnaturar as proteínas. As secções foram então lavadas duas vezes com PBS e foram lavadas duas vezes com água e subsequentemente foram digeridas com Proteinase-K (20 ug/ml em TE, 10 min à temperatura ambiente). A reacção foi parada por duas lavagens com água tratada com DEPC. As lâminas foram depois lavadas duas vezes com PBS durante 2 min.
Hibridação A pré-hibridação foi realizada por incubação das lâminas durante 2 horas a 45°C com solução de hibridação pré-aquecida (a 70 °C) (veja-se adiante). A sonda foi diluída na solução de hibridação pré-aquecida até uma concentração final de 1 pg/ml e desnaturada por incubação a 80°C durante 5 min e foi arrefecida durante 3 min em gelo antes da adição às lâminas. As lâminas foram secas e as sondas foram adicionadas às lâminas. As secções foram cobertas com parafilme e incubadas numa câmara humidificada durante a noite a 45°C.
Lavagens pós-hibridação e incubação com anticorpo anti-DIG
As lâminas foram lavadas brevemente com 2xSSPE à temperatura ambiente durante 5 min. e depois foram incubadas com SSPE 0,2x a 50-55°C durante 1 hora. As lâminas foram então 73 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ lavadas por incubação adicional com SSPE 0,2x a 50-55°C durante 1 hora e arrefecidas à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS durante 5 min. à temperatura ambiente, as lâminas foram incubadas com Tampão 2 (veja-se adiante) durante 45 min. à temperatura ambiente com agitação suave. As lâminas foram lavadas com solução de lavagem com BSA durante 45 min. à temperatura ambiente com agitação suave. 0 anticorpo anti-DIG foi diluído até uma concentração final de 1:1000-1:1500 em Tampão 2 e adicionado às lâminas (-150 ul/lâmina). As lâminas foram cobertas com parafilme e incubadas numa câmara humidificada durante a noite a 4°C.
As lâminas foram então lavadas três vezes com solução de lavagem com BSA, durante 5 min. cada lavagem. As lâminas foram então lavadas com Tampão 2 durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
Detecção de anticorpos anti-DIG ligados
As lâminas foram incubadas em Tampão 3 (veja-se adiante) durante 2 min, à temperatura ambiente, sem agitação. Para detecção colorimétrica, diluíram-se 3 ul de BCIP e 4,2 ul de NBT em 2 ml de Tampão 3. A solução foi adicionada às lâminas e incubada no escuro à temperatura ambiente durante os tempos necessários. A reacção foi parada por adição de Tampão Stop (veja-se adiante). As lâminas foram então lavadas com DDW e contrastadas com Hematoxilina Mayers (1:10 em DDW durante 5-7 s). Finalmente, as lâminas foram lavadas com DDW e montadas com Mount Q e cobertas com lamelas.
Soluções
Todas as soluções foram preparadas em água tratada com DEPC (DEPC a 0,1% em DDW durante 18 horas e depois autoclavado).
Solução de Pré-hibridação: formamida a 50%, Tris 100 mM (pH 7,6), ARNt a 150 ug/ml, ARN total de levedura a 1 mg/ml, Sulfato de dextrano a 10%, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, reagente de bloqueio a 1%) 74 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Solução de Lavagem com BSA: BSA a 1%, Triton X-100 a 0,3%, Tris 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM.
Tampão 1: Tris 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM
Tampão 2: reagente de bloqueio diluído a 2% em Tampão 1
Tampão 3: Tris 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM
Tampão Stop: Tris 100 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM "solução GVA-Mount" de Zymed (N.° Cat. 00-8000) LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Technion Research & Development Foundation Ltd.
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Vera BREKHMAN
<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE TUMORES, FIBROSE E PROTEINOSE ALVEOLAR PULMONAR <130> 41806 <160> 19 <170> Patent In version 3.2
<210> 1 <211> 2325 <212> ADN <213> Homo sapiens 75 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ <400> 1 atggagaggc ctctgtgctc ccacctctgc agctgcctgg ctatgctggc cctcctgtcc 60 cccctgagcc tggcacagta tgacagctgg ccccattacc ccgagtactt ccagcaaccç 120 gctcctgagt atcaccagcc ccaggçcccc gccaacgtgg ccaagattca gctgcgcctg 180 gctgggcaga agaggaagca cagcgagggc cgggtggagg tgtactatga tggccagtgg 240 ggcaccçtgt gcgatgacga cttctccatc cacgctgccc acgtcgtctg ccgggagctg 300 ggcfcatgtgg aggccaagtc ctggactgcc agctcctcct acggcaaggg agaagggccc 360 atctggttag acaatctcca ctgtactggc aacgaggcga cccttgcagc atgcacctcc 420 aatggctggg gcgtcactga ctgcaagcac acggaggatg tcggtgtggt gtgcagcgac 480 aaaaggattc ctgggttcaa atttgacaat tcgttgatca accâgataga gaacctgaât 540 atceaggtgg aggacattcg gattcgagcc atcctctcaa cctaccgcaa gcgcacccca 600 gtgatggagg gctacgtgga ggtgaaggag ggcaagacct ggaagcaçat ctgtgacaag 660 cactggacgg ccâagaattc ccgcgtggtc tgcggcatgt ttggcttccc tggggagagg 720 acatacaata ccaaagtgta caaaatgttt gcctcacgga ggaagcagcg ctactggcca 780 ttctccatgg actgcaccgg cacagaggcc cacatctcca gctgcaagct gggcccccag 840 gtgtcactgg accccatgaa gaatgtcacc tgcgagaatg ggctaccggc cgtggtgggt 900 tgtgtgcctg ggcaggtctt cagccctgac ggaccctcaa gattccggaa agcgtacaag 960 ccagagcsac ccctggtgcg actgagaggc ggtgcctaca tcggggaggg ccgcgtggag 1020 gtgctcaaaa atggagaatg ggggaccgtc tgcgacgaca agtgggacct ggtgtcggcc 1080 agtgtggtct gcagagagct gggctttggg agtgccaaag aggcagtcac tggctcccga 1140 ctggçgcaag ggatcggacc catccacctc aacgagatcc agtgcacagg caatgagaag 1200 “tccattatag actgcaagtt caatgccgag tctcagggct gcaaccacga ggaggatgct 1260 ggtgtgagat gcaacacccc tgccatgggc ttgcagaaga agctgcgccfc gaacggcggc 1320 cgcaatccct acgagggccg agtggaggtg ctggtggaga gaaacgggtc ccttgtgtgg 1380 gggatggtgt gtggccaaaa ctggggcatc gtggaggcca tggtggtctg ccgccagctg 1440 ggcctgggat tcgccagcaa cgccttccag gagacctggt attggcacgg agatgtcaac 1500 agcaacaaag tggtcatgag tggagtgaag tgetegggaa cçgagctgtc cctggcgcac 1560 tgccgccacg acggggagga cgtggcctgc ccceagggcg gagtgcagta 1620 gttgcctgct cagaaaccgc ccctgacctg gtcctcaatg cggagatggt gcagcagacc 1680 acctacctgg aggaccggcc catgttcatg ctgcagtgtg ccatggagga gaactgcctc 1740 tcggcctcag ccgcgcagac cgaccccacc acgggctacc gccggctcct gcgcttctcc 1600 tcccagatec acââcaãtgg Ccagtccgac ttccggccca agaâcggccg Ccacgcgtgg 1860 atctggcacg actgtcacag gcactaccac agcatggagg tgttcaccca ctatgacctg 1920 ctgaacctca atggcaccaa ggtggcagag ggccacaagg ccagcttctg cttggaggac 1980 acagaatgtg aaggagacat ccagaagaat tacgagtgtg ccaacttcgg cgatcagggc 2040 atcaccatgg gctgctggga catgtaccgc catgacatcg actgccagtg ggttgacatc 2100 actgacgtgc cccctggaga ctacctgttc caggttgtta ttaaccccaa cttcgaggtt 2160 gcagaatccg attactccaa caacatcatg aaatgcagga gccgctatga cggccaccgc 2220 atctggatgt acaactgcca cataggtggt tccttcagcg aagagacçga aaaaaagttt 2280 gagcacttca gcgggctctt aaacaaccag ctgtccccgc agtaa 2325
<210> 2 <211> 774 <212> PRT <213> Homo sapiens 76 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ <400> 2
Met Glu Arg Pro Leu Cys Ser His Leu Cys Ser Cys Leu Ala Met Leu 1 5 10 15 Ala Lbu Leu Ser Pro Leu Ser Leu Ala Gin Tyr Asp Ser Trp Pro His 20 25 30 Tyr Pro Glu Tyr Phe Gin Gin Pro Ala Pro GlU Tyr HÍ3 Gin Pro Gin 35 40 45 Ala Pro Ala Asn Val Ala Lys Ile Gin Leu Arg Leu Ala Gly Gin Lys 50 55 60 Arg Lys His Ser Glu Gly Arg Val Glu Val Tyr Tyr Asp Gly Gin Trp 65 70 75 00 Gly Thr val Cys Asp Aãp Asp Phe Ser ile HiS Ala Ala HiS val val - 65 90 95 Cys Arg Glu Leu Gly Tyr Val Glu Ala Lys Ser Trp Thr Ala Ser Ser 100 105 110 Ser Tyr Gly Lys Gly Glu Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asn Leu His Cys 115 120 125 Thr Gly Asn Glu Ala Thr Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asn Gly Trp Gly 130 135 140 Vai Thr Asp Cys Lys His Thr Glu ASp val Gly Val Val Cys Ser Asp 145 150 155 160 Lys Arg Ue Pro Gly Phe Lys Phe Asp Asn Ser Leu Ile Asn Gin Ile 165 170 175 Glu Asn Leu Asn Xle Gin val GlU Asp Ile Arg He Arg Ala Ile Leu 190 1B5 190 Ser Thr Tyr Arg Lys Arg Thr Pro val Met Glu Gly Tyr Val Glu Val 195 200 205 Lys Glu Gly Lys Thr Trp Lys Gin ile Cys Asp Lys His Trp Thr Ala 210 215 220 Lys Asn Ser Arg Val Val Cys Gly Met Phe Gly Phe Pro Gly Glu Arg 225 230 235 240 Thr Tyr Asn Thr Lys val Tyr Lys Met Phe Ala Ser Arg Arg Lys Gin 245 250 255 Arg Tyr Trp Pro Phe Ser Met Asp Cys Thr Gly Thr Glu Ala His Ile 260 265 270 Ser Ser Cys Lys Leu Gly Pro Gin Val Ser Leu Asp Pro Met Lys Asn 275 280 285 Vai Thr Cys Glu Asn Gly Leu Pro Ala val Val Gly Cys Val Pro Gly 290 295 300 Gin Vai Phe Ser Pro Asp Gly Pro Ser Arg Phe Arg Lys Ala Tyr Lys 77 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ 305 310 315 320 Pro Glu Gin Pro Leu Val Arg Leu Arg Gly Gly Ala Tyr Ile Gly Glu 325 330 335 Gly Arg Val Glu Val Leu Lys Asn Gly Glu Trp Gly Thr Val Cys Asp 340 345 350 Asp Lys Trp Asp Leu Val ser Ala Ser val Val Cys Arg Glu Leu Gly 355 360 365 Phe Gly Ser Ala Lys Glu Ala Val Thr Gly Ser Arg Leu Gly Gin Gly 370 375 380 Ile Gly Pro Ile His Leu Asn Glu Ile Gin Cys Thr Gly Asn Glu Lys 3B5 390 395 400 Ser Ile Ile Asp Cys Lys Phe Asn Ala Glu Ser Gin Gly Cys Asn His 405 410 415 Glu Glu Asp Ala Gly Val Arg Cys Asn Thr Pro Ala Met Gly Leu Gin 420 425 430 Lys Lys Leu Arg Leu Asn Gly Gly Arg Asn Pro Tyr Glu Gly Arg val 435 440 445 Glu Val Leu val Glu Arg Asn Gly Ser Leu val Trp Gly Met val Cys 450 455 4 60 Gly Gin Asn Trp Gly Ile Val Glu Ala Met val Val Cys Arg Gin Leu 4 6 5 470 475 480 Gly Leu Gly Phe Ala Ser Asn Ala Phe Gin GlU Thr Trp Tyr Trp His 405 490 495 Gly Asp Val Asn Ser Asn Lys Val Val Met Ser Gly Val Lys cys Ser 500 5D5 510 Gly Thr Glu Leu Ser Leu Ala His Cys Arg His Asp Gly Glu Asp Val 515 520 525 Ala cys Pro Gin Gly Gly Val Gin Tyr Gly Ala Gly Val Ala Cys Ser 530 535 540 Glu Thr Ala Pro Asp Leu Val Leu Asn Ala Glu Met Val Gin Gin Thr 545 550 555 560 Thr Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Met Leu Gin Cys Ala Met Glu 565 570 575 Glu Asn Cys Leu ser Ala Ser Ala Ala Gin Thr Asp Pro Thr Thr Gly 580 585 590 Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe ser Ser Gin Ile His Asn Asn Gly Gin 595 600 605 Ser Asp Phe Arg Pro Lys Asn Gly Arg His Ala Trp lie Trp His Asp 610 615 620 Cys His Arg His Tyr His Ser Met Glu Val Phe Thr His Tyr Asp Leu 625 630 635 640 Léu Asn Leu Asn Gly Thr Lys val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 645 650 655 Cys Leu Glu Asp Thr Glu Cys Glu Gly Asp Ile Gin Lys Asn Tyr Glu 660 665 670 Cys Ala Asn Phe Gly Asp Gin Gly Ile Thr Met Gly Cys Trp Asp Met 675 6Θ0 665 Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp Val Asp Ile Thr A$p vai Pro 690 695 700 Pro Gly Asp Tyr Leu Phe Gin val val Ile Asn Pro Asn Phe Glu Val 705 710 715 720 Ala Glu Ser A$p Tyr Ser Asn Asn Ile Met Lys Cys Arg Ser Arg Tyr 725 730 735 Asp Gly His Arg Ile Trp Met Tyr Asn Cys His Ile Gly Gly Ser Phe 740 745 750 Ser Glu Glu Thr Glu Lys Lys Phe GlU His phe Ser Gly Leu Leu Asn 755 760 765
Asn Gin Leu Ser Pro Gin 770 78 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
<210> 3 <211> 757 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Met Met Trp Pro Gin Pro Pro Thr Phe Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 teu Ser Gin Ala Pro Ser Ser Arg pro Gin Ser 5er Gly Thr Lys Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Val Gly Pro Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly Arg Leu Glu 35 40 45 vai Leu His Gin Gly Gin Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asp Phe Ala 50 55 60 Leu Gin Glu Ala Thr val Ala Cys Arg Gin Leu Gly Phe Glu Ser Ala 65 70 75 BO Leu Thr Trp Ala His Ser Ala Lys Tyr Gly Gin Gly Glu Gly Pro Ile 85 90 95 Trp Lev. Asp Asn Val Arg Cys Leu Gly Thr Glu Lys Thr Leu Asp Gin 100 105 110 Cys Gly Ser Asn Gly Trp Gly Ile Ser Asp Cys Arg His Ser Glu Asp 115 120 125 val Gly Vai Val Cys His Pro Arg Arg Gin His Gly Tyr His Ser Glu 130 135 140 Lys Vai Ser Asn Ala Leu Gly Pro Gin Gly Arg Arg Leu Glu Glu Val 145 150 155 160 Arg Leu Lys Pro Ile Leu Ala Ser Ala Lys Arg His Ser Pro val Thr 165 170 175 Glu Gly Ala Val Glu Val Arg Tyr Asp Gly His Trp Arg Gin Val Cys 180 185 190 Asp Gin Gly Trp Thr Met Asn Asn Ser Arg Val Val Cys Gly Met Leu 195 200 205 Gly Phe pro Ser Gin Thr Ser val Asn Ser His Tyr Tyr Arg Lys Val 210 215 220 Trp Asn Leu Lys Met Lys Asp Pro Lys Ser Arg Leu Asn Ser Leu Thr 225 230 235 240 Lys Lys Asn Ser Phe Trp Ile HiS Arg Val Asp Cys Phe Gly Thr Glu 245 250 255 Pro His Leu Ala Lys Cys Gin Val Gin Val Ala Pro Gly Arg Gly Lys 260 265 270 79 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Leu Arg Pro Ala Cys Pro Gly Gly Met His Ala Val Val Ser Cys Val 275 280 285 Ala Gly Pro His Phe Arg Arg Gin Lys Pro Lys Pro Thr Arg Lys Glu 290 295 300 Ser His Ala Glu Glu Leu Lys Val Arg Leu Arg Ser Gly Ala Gin Val 305 310 315 320 Gly Glu Gly Arg Val Glu val Leu Met Asn Arg Gin Trp Gly Thr Val 325 330 335 Cys Asp HiS Arg Trp Asn Leu lie ser Ala Ser Val Val Cys Arg Gin 340 345 350 Leu Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu Ala Leu Phe Gly Ala Gin Leu Gly 355 360 365 Gin Gly Leu Gly Pro Ile His Leu Ser Glu Val Arg Cys Arg Gly Tyr 370 375 380 Glu Arg Thr Leu Gly Asp Cys Leu Ala Leu Glu Gly Ser Gin Asn Gly 365 390 395 400 Cys Gin His Ala Asn Asp Ala Ala Val Arg Cys Asn Ile Pro Asp Met 405 410 415 Gly Phe Gin Asn Lys Val Arg Leu Ala Gly Gly Arg Asn Ser Glu Glu 420 425 430 Gly val val Glu Val Gin Val Glu Val Asn Gly Gly Pro Arg Trp Gly 435 440 445 Thr Vai Cys Ser ASp HiS Trp Gly Leu Thr GlU Ala Met Val Thr Cys 450 455 460 Arg Gin Leu Gly Leu Gly Phe Ala Asti Phe Ala Leu Lys Asp Thr Trp 4G5 470 475 480 Tyr Trp Gin Gly Thr Pro Glu Ala Lys Glu Val Val Met Ser Gly Val 485 490 495 Arg Cys Ser Gly Thr Glu Met Ala Leu Gin Gin Cys Gin Arg HÍS Gly 500 505 510 Pro Val His Cys Ser His Gly Pro Gly Arg Phe ser Ala Gly Val Ala 515 520 525 Cys Met Asn Ser Ala Pro Asp Leu Val Met Asn Ala Gin Leu Val Gin 530 535 540 Glu Thr Ala Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser Met Leu Tyr Cys Ala 545 550 555 560 His Glu Glu Asn Cys Leu Ser Lys Ser Ala Asp His Met Asp Trp Pro 565 570 575 Tyr Gly Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin Ile Tyr Asn Leu 580 585 590 Gly Arg Ala Asp Phe Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp Ile Trp 595 600 505 His Gin Cys His Arg HÍS Asn His Ser Ile Glu Val Phe Thr His Tyr 610 615 620 Asp Leu Leu Thr Leu Asn Gly Ser Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala 625 630 635 640 Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Asn Cys Pro Ser Gly Val Gin Arg Arg 645 650 655 Tyr Ala Cys Ala Asn Phe Gly Glu Gin Gly Val Ala Val Gly Cys Trp 660 665 670 Asp Thr Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp Val Asp Ile Thr Asp 675 6Θ0 685 Val Gly Pro Gly Asp Tyr Ile Phe Gin Val Val val Asn Pro Thr Asn 690 695 700 Asp val Ala Glu Ser Asp Phe Ser Asn Asn Met Ile Arg Cys Arg Cys 705 710 715 720 80 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Lys Tyr Asp Gly Gin Arg Vai Trp Leu His Asn Cys His Thr Gly Asp 725 730 735
Ser Tyr Arg Ala Asn Ala Glu Leu Ser Leu Glu Gin Glu Gin Arg Leu 740 745 750
Arg Asn Asn Leu Ile 755
<210> 4 <211> 2262 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atgcgacctg tcagtgtctg gcagtggagc ccctgggggc tgctgctgtg cctgctgtgc 60 agttcgtgct tggggtctcc gtccccttcc acgggccctg agaagaaggc cgggagccag 120 gggcttcggt tccggctggc tggcttcccc aggaagccct acgagggccg cgtggagata 180 cagcgagctg gtgaatgggg caccatctgc gatgatgact tcacgctgca ggctgcccae 240 atcctctgcc gggagctggg cttcacagag gccacaggct ggacecacag tgccaaatat 300 ggccctggaa caggccgcat ctggctggac aacttgagct gcagtgggac cgagcagagt 360 gtgactgaat gtgcctcccg gggctggggg aacagtgact gtacgcacga tgaggatgct 420 ggggteatct gcaaagacca gcgcctccct ggcttctcgg actccaatgt cattgaggta 4B0 gagcatcacc tgcaagtgga ggaggtgcga attcgacccg ccgttgggtg gggcagacga 540 cccctgcccg tgacggaggg gctggtggaa gtcaggcttc ctgacggctg gtcgcaagtg 600 tgcgacaaag gctggagcgc ccacaacagc cacgtggtct gcgggatgct gggcttcccc 660 agcgaaaaga gggtcaacgc ggccttctac aggctgctag cccaacggca gcaacactcc 720 tttggtctgc atggggtggc gtgcgtgggc acggaggccc acctctccct ctgttccctg 780 gagttctatc gtgccaatga caccgccagg tgccctgggg ggggccctgc agtggtgagc 840 tgtgtgccag gccctgtcta cgcggcatcc agtggccaga agaagcaaca acagtcgaag 900 cctcaggggg aggcccgtgt ccgtctaaag ggcggcgccc accctggaga gggccgggta 960 gaagtcctga aggccagcac atggggcaca gtctgtgacc gcaagtggga cctgcatgca 1020 gceagcgtgg tgtgtcggga gctgggettc gggagtgctc gagaagctct gagtggcgct 1080 cgcatggggc agggcatggg tgctatccac ctgagtgaag ttcgctgctc tggacaggag 1140 ctctccctct ggaagtgccc ccacaagaac atcacagctg aggattgttc acatagccag 1200 gatgccgggg tccggtgcaa cctaccttac actggggcag agaccaggat ccgactcagt 1260 gggggccgca gccaacatga ggggcgagtc gaggtgcaaa tagggggacc tgggcccctt 1320 cgctggggcc tcatctgtgg ggatgactgg gggaccctgg aggccatggt ggcctgtagg 1380 caactgggte tgggctacgc caaccaegge ctgcaggaga eetggcaccg ggactctggg 1440 aatataacag aggtggtgat gagtggagtg cgctgcacag ggactgagct gtccctggat 1500 cagtgtgccc atcatggcac ccacatcacc tgcaagagga cagggacccg cttcactgct 1560 ggagtcatct gttctgagac tgcatcagat ctgttgctgc actcagcact ggtgcaggag 1620 accgcctaca tcgaagaccg gcccctgcat atgttgtact gtgctgcgga agagaactgc 1680 ctggccagct cagcccgcte agccaactgg ccctatggtc aceggcgtct gctccgattc 1740 tcctcccaga tccacaacct gggacgagct gacttcaggc ccaaggctgg gqgccactcc 1800 tgggtgtggc acgagtgcca tgggcattac cacagcatgg acatcttcac tcactatgat 1860 atcctcaccc caaatggcac caaggtggct gagggccaca aagetagttt ctgtctcgaa 1920 gacactgagt gtcaggagga tgtctccaag cggtatgagt gtgccaactt tggagagcaa 1980 ggcatcactg tgggttgctg ggatctctac cggcatgaca ttgaetgtca gtggattgac 2040 atcacggatg tgaagccagg aaactacatfc cteeaggttg tcateaaccc aaactttgaa 2100 gtagcagaga gtgactttac caacaatgca atgaaatgta actgcaaata tgatggacat 2160 agaatctggg tgcacaactg ccacattggt gatgccttca gtgaagaggc caacaggagg 2220 tttgaacgct accctggcca gaccagcaac cagattatct aa 2262 81 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
<210> 5 <211> 1725 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggctctgg cccgaggcag ccggcagctg ggggccctgg tgtggggcgc ctgcctgtgc 60 gtgctggtçc acgggcagoa ggcgcagccc çggcagggct cggaccccgc ccgctggcgg 120 cagctgatcc agtgggagaa caacgggcag çtgtacagct tgctcaactc gggctcagag 180 tacgtgccgg ccggacctca gcgctccgag agtagctccc gggtgctgct ggccggcgcg 240 ccccaggccc agcagcggcg cagccacggg agcccccggc gtcggcaggc gccgtccctg 300 cccctgccgg ggcgcgtggg ctcggacacc gtgcgcggcc aggcgcggca cccattcggc 360 tttggccagg tgcccgacaa ctggcgcgag gtggccgtcg gggacagc&c gggcatggcc 420 ctggcccgca cctccgtctc ccagcaacgg cacgggggct cegcctcctc ggtctcggct 480 tcggccttcg ccagcaccta ccgccagcag ccctcctacc cgcagcagtt cccctacccg 540 caggcgccct tcgtcagcca gtacgagaac tacgaccccg cgtcgcggac ctacgaccag 600 ggtttcgtgt actaccggcc cgcgggcggc ggcgtgggcg cgggggcggc ggccgtggcc 660 tcggcggggg tcatctaccc ctaccagçcc cgggcgçgct acgaggagta cggcggcggc 720 gaagagctgc ccgagtaccc gcctcagggc ttctacccgg cccccgagag gccctacgtg 780 ccgccçccgc cgccgccccc cgacggcctg gaccgccgct actcgcacag tctgtacagc 840 gagggcaççc ccggçttcga gcaggcctac cctgaccccg gtcccgaggc ggcgcaggcc 900 catggcggag acccacgcut gggctggtac ccgccctacg ccaacccgcc gcccgaggcg 960 tacgggccgc çgcgcgcgct ggagccgccc tacctgccgg tgcgcagctc cgacacgccc 1020 ccgccgggtg gggagcggaa çggcgcgcag cagggccgcc tcagcgtagg cagcgtgtac 10Θ0 cggcccaacc agaacggccg cggtctccct gacttggtcc cagaccccaa ctatgtgcaa 1140 gcatccactt atgtgcagag agcccacctg tactccctgc gctgtgctgc ggaggagaag 1200 tgtctggcca gcacagccta tgcccctgag gccaccgact acgatgtgcg gçtgctactg 1260 cgcttccccc agcgcgtgaa gaaccagggc acagcagact tcctccccaa ccggccacgg 1320 cacacctggg agtggcacag ctgccaccag cattaccaca gcatggacga gttcagccac 1380 tacgacctac tggatgcagc cacaggcaag aaggtggccg agggccacaa ggccagtttc 1440 tgcctggagg acagcacctg tgacttcggc aacctcaagc gctatgcatg cacctctcat 1500 acccagggcc tgagcccagg ctgcfcatgac acctacaatg cggacatcga otgccagtgg 1560 ategâcataa eegaegtgca gcctgggaac tacatcctca aggtgcacgt gaacccaaag 1620 tatattgttt tggagtctga cttcaccaac aacgtggtga gatgcaacat tcactacaca 1680 ggtcgctacg tttctgcaac aaactgcaaa attgtccaat cctga 1725
<210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Ala Arg Gly Sex Arg Gin Leu Gly Ala Leu val Trp Gly 1 5 10 15 Ala Cys Leu Cys Vai Leu Vai His Gly Gin Gin Ala Gin Pro Gly Gin 20 25 30 Gly Ser Asp Pro Ala Arg Trp Arg Gin Leu Ile Gin Trp Glu Asn Asn 35 40 45 Gly Gin val Tyr ser Leu Leu Asn Ser Gly Ser Glu Tyr Val Pro Ala 50 55 60 Gly Pro Gin Arg Ser Glu Ser Ser Ser Arg Vai Leu Leu Ala Gly Ala 65 70 75 Θ0 Pro Gin Ala Gin Gin Arg Arg Ser Ris Gly Ser Pro Arg Arg Arg Gin 85 90 95
Ala Pro Ser Leu Pro Leu Pro Gly Arg Vai Gly Ser Asp Thr Vai Arg 100 105 HO 82 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Gly Gin Ala Arg His PXO Phe Gly Phe Gly Gin Val Pro Asp Asn Trp 115 120 125 Arg Glu Val Ala val Gly Asp Ser Thr Gly Met Ala Leu Ala Acg Thr 130 135 140 Ser Val Ser Gin Gin Arg His Gly Gly Ser Ala Ser Ser Val Ser Ala 145 150 155 160 ser Ala Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Gin Gin Pro Ser Tyr Pro Gin Gin 165 170 175 Phe Pro Tyr Pro Gin Ala Pro Phe Val Ser Gin Tyr Glu Asn Tyr A5p 180 IBS 190 pro Ala Ser Arg Thr Tyr Asp Gin Gly Phe Val Tyr Tyr Arg Pro Ala 195 200 205 Gly Gly Gly val Gly Ala Gly Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Gly Val 210 215 220 Ile Tyr Pro Tyr Gin Pro Arg Ala Arg Tyr Glu Glu Tyr Gly Gly Gly 225 230 235 240 Glu Glu Leu Pro Glu Tyr Pro Pro Gin Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Arg Pro Tyr Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gly Leu Asp Arg 260 265 270 Arg Tyr Ser His Ser Leu Tyr ser Glu Gly Thr Pro Gly Phe Glu Gin 215 280 285 Ala Tyr Pro Asp Pro Gly Pro GlU Ala Ala Gin Ala HiS Gly Gly Asp 290 295 300 Pro Arg Leu Gly Trp Tyr Pro Pro Tyr Ala Asn Pro Pro Pro Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Gly Pro Pro Arg Ala Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Val Arg Ser 325 330 335 Ser Asp Thr Pro Pro Pro Gly Gly Glu Arg Asn Gly Ala Gin Gin Gly 340 345 350 Arg Leu Ser Val Gly Ser Val Tyr Arg Pro Asn Gin Asn Gly Arg Gly 355 3 60 365 Leu Pro Asp Leu val Pro Asp Pro Asn Tyr Val Gin Ala Ser Thr Tyr 370 375 380 val Gin Acg Ala HiS Leu Tyr Ser Leu Arg Cys Ala Ala Glu Glu Lys 385 390 395 400 Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Val 405 410 415 Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg val Lys Asn Gin Gly Thr Ala 420 425 430 Asp Phe Leu Pro Asn Arg Pro Arg His Thr Trp Glu Trp His Ser Cys 435 440 445 His Gin His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Ser HiS Tyr Asp Leu Leu 450 455 460 A$p Ala Ala Thr Gly Lys Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 4 65 470 475 480 Cys Leu Glu Asp Ser Thr Cys Asp Phe Gly Asn Leu Lys Arg Tyr Ala 485 490 495 Cys Thr Ser His Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr Asp Thr Tyr 500 505 510 Asn Ala ASp Ile Asp cys Gin Trp Ile Asp Ile Thr Asp Val Gin Pro 515 520 525 Gly Asn Tyr Ile Leu Lys Val His Val Asn Pro Lys Tyr Ile Val Leu 530 535 540 Glu Ser Asp Phe Thr Asn Asn Val Val Arg Cys Asn Ile His Tyr Thr 545 550 555 5 60 Gly Arg Tyr Val Ser Ala Thr Asn Cys Lys Ile Val Gin Ser 5 65 570 83 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
<210> 7 <211> 1254 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atgcgcttcg cctggaccgt gctcctgctc gggcctttgc agctctgcgc gctagtgcac 60 tgcgcccctc ccgccgccgg ccaacaocag ccoccgcgcg agccgccggc ggctccgggc 120 gCctggcgcc agcagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg 190 ggctcacagt accagcctca gcgccgccgg gacccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc 240 aacgcctccg cccagcagcc ccgcactccg atcctgctga tccgcgacaa ccgcaccgcc 300 çcggcgcgaa cgcggacggc cggctcatct ggagtcaccg ctggccgccc caggcccacc 360 gcccgtcact ggttccaagc tggctactcg acatctagag cccgcgaagc tggcgcctcg 420 cgcgcggaga accagacagc gccgggagaa gttcctgcgc tcagtaacct gcggccgccc 480 agccgcgtgg acggcatggt gggcgacgac ccttacaacc cctacaagta ctctgacgac S40 aacccttatt acaactacta cgatacttat gaaaggccca gacctggggg esggtaccgg 600 cccggatacg gcactggcta cttccagtac ggtctcccag acctggtggc cgacccctac 660 tacatccagg cgtccacgta cgtgcagaag atgtccatgt acaacctgag atgcgcggcg 720 gaggaaaact gtctggccag tacagcatac agggcagatg tcagagatta tgatcacagg 790 gtgctgctca gatttcccca aagagtgaaa aaccaaggga catcagattt cttacccagc 840 cgaccaagat actcctggga atggcacagt tgtcatcaac attaccacag tatggatgag 900 tttagccact atgacctgct tgatgccaac acccagagga gagtggcfcga aggccacaaa 960 gcaagtttct gtcttgaaga cacatcctgt gactatggct accacaggcg atttgcatgt 1020 actgcacaca cacagggatt gagtcctggc tgttatgafca cctatggtgc agacatagac 1090 tgccagtgga ttgatattac agatgtaaaa cctggaaact atatcctaaa ggtcagtgta 1140 aaccccagcb acctggttcc tgaafcctgac tataccaaca atgttgtgcg ctgtgacatt 1200 cgctacacag gacatcatgc gtatgcctca ggctgcacaa tttcaccgta ttag 1254
<210> 8 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Phe Ala Trp Thr Vai Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gin Leu Cys 1 5 10 15 Ala Leu Vai His Cys Ala Pro Pro Ala Ala Gly Gin Gin Gin pro Pro 20 25 30 Arg Glu Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Trp Arg Gin Gin lie Gin Trp 35 40 45 Glu Asn Asn Gly Gin Vai Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gin Tyr 5° 55 60 Gin Pro Gin Arg Arg Arg Asp Pro Gly Ala Ala vai Pro Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asn Ala Ser Ala Gin Gin Pro Arg Thr Pro Ile Leu Leu Ile Arg ASp 85 90 95 Asn Arg Thr Ala Ala Ala Arg Thr Arg Thr Ala Gly Ser Ser Gly Vai 100 105 110 Thr Ala Gly Arg Pro Arg Pro Thr Ala Arg His Trp Phe Gin Ala Gly 115 120 125 Tyr Ser Thr ser Arg Ala Arg Glu Ala Gly Ala ser Arg Ala GlU Asn 130 135 140 Gin Thr Ala Pro Gly Glu vai Pro Ala Leu Ser Asn Leu Arg Pro Pro 145 150 155 160 84 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Ser Arg vai Asp Gly Met vai Gly Asp Asp Pro Tyr Asn Pro Tyr Lys 165 170 175 Tyr Ser Asp Asp Asn Pro Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Asp Thr Tyr Glu Arg 1Θ0 185 190 Pro Arg Pro Gly Gly Arg Tyr Arg Pro, Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Phe 195 200 205 Gin Tyr Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Asp Pro Tyr Tyr He Gin Ala 210 215 220 Ser The Tyr Val Gin Lys Met Ser Met Tyr Asn Leu Arg cys Ala Ala 225 230 235 240 GlU GlU Asn Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Arg Ala Asp Val Arg Asp 245 250 255 Tyr Asp His Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg Val Lys Asn Gin 260 265 270 >, l—t o Thr Ser Asp Phe Leu pro Ser Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu Trp 275 280 2B5 His Ser Cys His Gin His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Ser His Tyr 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Ala Asn Thr Gin Arg Arg Val Ala Glu Gly His Lys 305 310 315 320 Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His Arg 325 330 335 Arg Phe Ala Cys Thr Ala His Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr 340 345 350 Asp Thr Tyr Gly Ala Asp lie Asp Cys Gin Trp ile Asp Ile Thr Asp 355 360 365 Vai Lys Pro Gly Asn Tyr Ile Leu Lys Val Ser Val Asn Pro Ser Tyr 370 375 380 Leu Vai Pro Glu Ser Asp Tyr Thr Asn Asn Val Val Arg Cys Asp Ile 385 390 395 400 Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Thr Ile Ser Pro 405 410 415 Tyr <210 > 9 <211 > 752 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Pro val Ser Val Trp Gin Trp Ser Pro Trp Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Cys Ser Ser Cys Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gly 20 25 30 pro Glu Lys Lys Ala Gly ser Gin Gly Leu Arg Phe Arg Leu Ala Gly 35 40 45 Phe Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Gly Arg val Glu Ile Gin Arg Ala Gly 50 55 60 Glu Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Asp Phe Thr Leu Gin Ala Ala His 65 70 75 80 Ile Leu Cys Arg Glu Leu Gly Phe Thr Glu Ala Thr Gly Trp Thr His 85 90 95 Ser Ala Lys Tyr Gly Pro Gly Thr Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asn Leu 100 105 110 Ser Cys Ser Gly Thr Glu Gin ser Val Thr Glu Cys Ala Ser Arg Gly 115 120 125 85 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Trp Gly Asn Ser Asp Cys Thr His Asp Glu Asp Ala Gly val Ile Cys 130 135 140 Lys Asp Gin Arg Leu pro Gly Phe Ser Asp Ser Asn Val ile Glu val 145 150 155 160 Glu HÍS His Leu Gin Val Glu Glu val Arg Ile Arg pro Ala Val Gly 165 170 175 Trp Gly Arg Arg Pro Leu Pro Val Thr Glu Gly Leu Val Glu Val Arg 180 185 190 Leu Pro Asp Gly Trp Ser Gin Val Cys Asp Lys Gly Trp Ser Ala His 195 200 205 Asn Ser His Val Val Cys Gly Met Leu Gly Phe Pro Ser Glu Lys Arg 210 215 220 Vai Asn Ala Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Ala Gin Arg Gin Gin His Ser 225 230 235 240 Phe Gly Leu His Gly Val Ala cys Val Gly Thr Glu Ala His Leu Ser 245 250 255 Leu Cys Ser Leu Glu Phe Tyr Arg Ala Asn Asp Thr Ala Arg Cys Pro 260 265 270 Gly Gly Gly Pro Ala Val val ser cys Val Pro Gly Pro val Tyr Ala 275 280 285 Ala Ser Ser Gly Gin Lys Lys Gin Gin Gin Ser Lys Pro Gin Gly Glu 290 295 300 Ala Arg Val Arg Leu Lys Gly Gly Ala HiS Pro Gly Glu Gly Arg Val 305 310 315 320 Glu Val Leu Lys Ala Ser Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Arg Lys Trp 325 330 335 Asp Leu His Ala Ala Ser Val val Cys Arg Glu Leu Gly Phe Gly Ser 340 345 350 Ala Arg Glu Ala Leu Ser Gly Ala Arg Met Gly Gin Gly Met Gly Ala 355 360 365 Ile His Leu Ser Glu Val Arg Cys Ser Gly Gin G1U Leu Ser Leu Trp 370 375 380 Lys Cys Pro His Lys Asn Ile Thr Ala Glu Asp Cys Ser His Ser Gin 385 390 395 400 Asp Ala Gly Val Arg Cys Asn Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Glu Thr Arg 405 410 415 Ile Arg Leu Ser Gly Gly Arg Ser Gin His Glu Gly Arg val Glu Val 420 425 430 Gin Ile Gly Gly Pro Gly Pro Leu Arg Trp Gly Leu Ile Cys Gly Asp 435 440 445 Asp Trp Gly Thr Leu Glu Ala Met Val Ala Cys Arg Gin Leu Gly Leu 450 455 460 Gly Tyr Ala Asn His Gly Leu Gin Glu Thr Trp Tyr Trp' Asp Ser Gly 465 470 475 480 Asn Ile Thr Glu Val Val Met Ser Gly Val Arg Cys Thr Gly Thr Glu 485 490 495 Leu Ser Leu Asp Gin Cys Ala His His Gly Thr His Ile Thr Cys Lys 500 505 510 Arg Thr Gly Thr Arg Phe Thr Ala Gly val ne cys Ser Glu Thr Ala 515 520 525 Ser Asp Leu Leu Leu His Ser Ala Leu Val Gin Glu Thr Ala Tyr Ile 530 535 540 Glu Asp Arg Pro Leu His Met Leu Tyr Cys Ala Ala Glu Glu Asn Cys 545 550 555 560 Leu Ala Ser Ser Ala Arg Ser Ala Asn Trp Pro Tyr Gly His Arg Arg 565 570 575 86 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
Leu Leu Acg Phe Ser Ser Gin lie His Asn Leu Gly Arg Ala Asp Phe 580 585 590 Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp Val Trp His Glu Cys His Gly 595 600 605 His Tyr HÍS Ser Met Asp Ile Phe Thr His Tyr Asp Ile Leu Thr Pro 610 615 620 Asn Gly Thr Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe Cys Leu Glu 625 630 635 640 Asp Thr Glu Cys Gin Glu Asp val Ser Lys Arg Tyr Glu Cys Ala Asn 645 650 655 Phe Gly GlU Gin Gly Ile Thr Val Gly Cys Trp Asp Leu Tyr Arg His 660 665 670 Asp Ile Asp Cys Gin Trp Ile Asp Ile Thr Asp Val Lys Pro Gly Asn 675 680 685 Tyr Ile Leu Gin Vai Val ile Asn Pro Asn Phe Glu Val Ala Glu Ser 690 695 700 Asp Phe Thr Asn Asn Ala Met Lys Cys Asn Cys Lys Tyr Asp Gly His 7 05 710 715 720 Arg Ile Trp Vai His Asn Cys His Ile Gly Asp Ala Phe ser Glu Glu 725 730 735 Ala Asn Arg Arg Phe GlU Arg Tyr Pro Gly Gin Thr Ser Asn Gin Ile 740 745 750
<210 > 10 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 10 cgcaagcttg gatccgggat ggagaggcct ctgtgc 36
<210 > 11 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 11 cgctctagag gatccttact gcggggacag ctggttg 37
<210 > 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 12 gccatgcgac ctgtcagtgt c 21 <210> 13 87 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ <211> 18 <212> ADN Λ OO \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN <400> 13 gggcagtggc acttagat 18 <210 > 14 <211 > 613 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 ccctgacctg gtcctcaatg cggagatggt gcagcagacc catgttcatg ctgcagtgtg ccatggagga gaactgcctc cgaccccacc acgggctacc gccggctcct gcgcttctcc ccagtccgac ttccggccca agaacggccg ccacgcgtgg de cadeia simples gcactaccac ggtggcagag ccagaagaat catgtaccgc ctacctgttc caacatcatg cataggtggt agcatggagg ggccacaagg tacgagtgtg catgacatcg caggttgtta aaatgcagga tcc tgfctcaccca ctatgacctg ccagcttctg cttggaggac ccaacttcgg cgatcagggc actgccagtg ggttgacatc ttaaccccaa cttcgaggtt gcegetatga cggccaccgc acctacctgg aggaccggcc 60 tcggcctcag ccgcgcagac 120 tcccagatcc acaacaatgg 1B0 atctggcacg actgtcacag 240 ctgaacctca atggcaccaa 300 acagaatgtg aaggagacât 360 atcaccatgg çctgctggga 420 actgacgtgc cccctggaga 490 gcagaatccg attactccaa 540 atctggatgt acaactgcca 600 613
<210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 15 acatgcatgc cctgacctgg tcctcaatgc 30
<210 > 16 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 16
cccaagcttg gaaccaccta tgtggcagtt <210 > 17 <211> 210 <212> PRT <213> Sequência Artificial 30 88 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ <2 2 Ο > <223> Sequência de proteína derivada da fusão de fragmento de LOXL2 (1641-2253) com um marcador 6XHis a 5' <400> 17
His His His His His His Pro Asp Leu Val Leu Asn Ala Glu Met Val 1 5 10 15 Gin Gin Thr Thr Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Met Leu Gin Cys 20 25 30 Ala Met Glu Glu Asn Cys Leu Ser Ala Ser Ala Ala Gin Thr Asp Pro 35 40 45 Thr Thr Gly Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin Ile His Asn 50 55 60 A$n Gly Gin Ser Asp Phe Arg Pro Lys asn Gly Arg His Ala Trp Ile 65 70 75 80 Trp His Asp Cys His Arg His Tyr His Ser Met Glu Val Phe Thr His 85 90 95 Tyr Asp Leu Leu Asn Leu Asn Gly Thr Lys Val Ala Glu Gly His Lys 100 105 HO Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Glu Cys Glu Gly Asp Ile Gin Lys 115 120 125 Asn Tyr Glu Cys Ala Asn Phe Gly Asp Gin Gly Ile Thr Met Gly cys 130 135 140 Trp Asp Met Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp Val Asp Ile Thr 145 150 155 160 Asp Vai Pro Pro Gly Asp Tyr Leu Phe Gin Val Val Ile Asn Pro Asn 165 170 175 Phe Glu Vai Ala Glu Ser Asp Tyr Ser Asn Asn Ile Met Lys Cys Arg 180 185 190 Ser Arg Tyr Asp Gly His Arg Ile Trp Met Tyr Asn Cys His Ile Gly 195 200 205
Gly Ser 210
<210 > 18 <211> 660 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de Northern blot consistindo nos nucleótidos 1-660 do ADNc de LOXL2 <400> 18 atggagaggc ctctgtgctc ccâcctctgc agctgcctgg ctatgCtggc cCtCctgtcc 60 cccctgagcc tggcacaçta tgacagctgg ccccattacc ccgagtacfct ccagcaaccç 120 gctcctgagt atcaccagcc ccaggccccc gccaacgtgg ccaagattca gctgcgcctg 180 gctgggcaga agaggaagca cagcgagggc cgggtggagg tgtactatga tggccagtgg 240 ggcaccgtgt gcgatgacga cttctccatc cacgctgccc acgtcgtctg ccgggagctç 300 ggctatgtgg aggccaagtc ctggactgcc agctcctcct acggcaaggg agaagggccc 360 atctggttag acaatctcca ctgtactggc aacgaggcga cccttgcagc atgcacctcc 420 aatggctggg gcgtcactga ctgcaagcac acggaggatg tcggtgtggt gtgcagcgac 480 aaaaggattc ctgggttcaa atttgacaat tcgttgatca accagataga gaacctgaat 540 atccaggtgg aggacattcg gattcgagcc atcctctcaa cctaccgcaa gcgcacccca 600 gtgatggagg gctacgtgga ggtgaaggag ggcaagacct ggaagcagat ctgtgacaag 660 89 ΕΡ 2 179 040/ΡΤ
<210> 19 <211> 530 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de Northern blo do ADNc de LOXL3 <400> 19 gagaagctct gagtggcgct cgcatggggc agggcatggg ttcgctgctc tggacaggag ctctccctct ggaagtgccc aggattgttc acatagccag gatgccgggg tccggtgcaa agaccaggat ccgactcagt gggggccgca gccaacatga tagggggacc tgggcccctt cgctggggcc tcatctgtgg aggccatggt ggcctgtagg caactgggtc tgggctacgc cctggCactg ggactctggg aatataacag aggtggtgat ggactgagct gtccctggat cagtgtgccc atcatggcac cagggacccg cttcactgct ggagtcatct gttctgagac consistindo nos nucleótidos 1061-1590 tgctatccac ctgagtgaag 60 ccacaagaac atcacagctg 120 cctaccttac actggggcag 180 ggggcgagtc gaggtgcaaa 240 ggatgactgg gggaccctgg 300 caaccacggc ctgcaggaga 360 gagtggagtg cgctgcacag 420 ccacatcacc tgcaagagga 480 tgcatcagat 530
SEQ ID NO: 20 GAAGGAGACAT C CAGAAGAAT
SEQ ID NO: 21 CGATTACTCCAACAACATCAT SEQ ID NO: 22
CCGGCCAGATAGAGAACCTGAATATCTCGAGATATTCAGGTTCTCTATCTGGTTTTTG SEQ ID NO: 23
CCGGCCTGGGTTCAAATTTGACAATCTCGAGATTGTCAAATTTGAACCCAGGTTTTTG SEQ ID NO: 24
CCGGCGATTACTCCAACAACATCATCTCGAGATGATGTTGTTGGAGTAATCGTTTTTG SEQ ID NO: 25
CCGGGAGAGGACATACAATACCAAACTCGAGTTTGGTATTGTATGTCCTCTCTTTTTG SEQ ID NO: 26
CCGGGAAGGAGACATCCAGAAGAATCTCGAGATTCTTCTGGATGTCTCCTTCTTTTTG
Lisboa, 2013-09-18

Claims (14)

  1. ΕΡ 2 179 040/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para utilização na inibição de fibrose num indivíduo por administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polinucleótido para inibir a fibrose, em que a composição compreende o polinucleótido, que compreende uma primeira sequência hibridável com uma sequência polinucleotídica que codifica L0XL2, uma segunda sequência complementar da primeira sequência, e uma sequência de ligação que une a primeira sequência à segunda sequência.
  2. 2. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de ligação forma uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo".
  3. 3. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a primeira sequência compreende SEQ ID NO:20 ou 21.
  4. 4. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o polinucleótido tem pelo menos duas vezes o comprimento de SEQ ID NO: 20.
  5. 5. Composição para utilização na inibição de fibrose da reivindicação 1, em que o polinucleótido compreende uma sequência complementar de SEQ ID NO:20.
  6. 6. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o polinucleótido tem pelo menos duas vezes o comprimento de SEQ ID NO:21.
  7. 7. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleótido compreende uma sequência complementar de SEQ ID NO:21.
  8. 8. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o polinucleótido é proporcionado num vector de expressão. ΕΡ 2 179 040/ΡΤ 2/2
  9. 9. Composição para utilização na inibição de fibrose de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a composição compreende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. Polinucleótido isolado compreendendo uma primeira sequência hibridável com uma sequência polinucleotidica que codifica L0XL2, uma segunda sequência complementar da primeira sequência, e uma sequência de ligação que une a primeira sequência à segunda sequência, em que a primeira sequência compreende SEQ ID NO:21.
  11. 11. Polinucleótido isolado da reivindicação 10, em que a sequência de ligação forma uma estrutura em laço tipo "gancho de cabelo".
  12. 12. Polinucleótido isolado da reivindicação 10 ou da reivindicação 11, em que o polinucleótido isolado tem pelo menos duas vezes o comprimento de SEQ ID NO:21.
  13. 13. Vector de expressão compreendendo o polinucleótido da reivindicação 10, 11 ou 12.
  14. 14. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 13. Lisboa, 2013-09-18
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