ES2426217T3 - Composiciones y procedimientos para tratar tumores, fibrosis y proteinosis alveolar pulmonar - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en la inhibición de la fibrosis en un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un polinucleótido para inhibir la fibrosis, en la que la composición comprende el polinucleótido, que comprende una primera secuencia hibridable con una secuencia de polinucleótido que codifica para la LOXL2, una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y una secuencia de conexión que une la primera secuencia con la segunda secuencia.

Description

Composiciones y procedimientos para tratar tumores, fibrosis y proteinosis alveolar pulmonar

5 [0001] La presente invención se refiere a una composición para su uso en la inhibición de la fibrosis en un sujeto según la reivindicación 1, a un polinucleótido aislado según la reivindicación 10, a un vector de expresión según la reivindicación 13 y a una célula hospedadora según la reivindicación 14.

[0002] La oxidasa de lisilo (LO o LOX) es una oxidasa de amina que contiene cobre que oxida sustratos de

10 amina primaria a aldehídos reactivos. La LOX cataliza la desaminación oxidativa de residuos de peptidil lisina y de hidroxilisina en colágenos, y de residuos de peptidil lisina en elastina, y ayuda a la formación de la matriz extracelular. Los peptidilaldehídos resultantes típicamente condensan y experimentan reacciones de oxidación para formar las reticulaciones covalentes derivadas de lisina necesarias para la integridad estructural normal de la matriz extracelular. Habitualmente se liberan óxido de hidrógeno (H2O2) y amonio en cantidades estequiométricas con el

15 producto de peptidil aldehído.

[0003] La LOX puede oxidar ciertos residuos de lisina de colágeno y elastina fuera de la célula; sin embargo, también puede actuar intracelularmente, donde puede regular la expresión génica. Además, la LOX puede inducir la quimiotaxia de monocitos, fibroblastos y células del músculo liso. La propia LOX puede ser inducida por varios

20 factores y esteroides tales como TGF-�, TNF-a e interferón (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70: 1 - 32 (2001)). La LOX también se ha implicado en diversas funciones biológicas tales como la regulación del desarrollo, la supresión de tumores, la movilidad celular y la senescencia celular. Los diversos papeles de la LOX y sus recientemente descubiertos miembros de la familia de las amino oxidasas, la oxidasa de lisilo o las proteínas de tipo oxidasas de lisilo (LOR o LOXL), pueden jugar importantes papeles con respecto a su localización intracelular y el extracelular.

25 [0004] La expresión o la implicación de la LOX y las LOXL en enfermedades también puede variar. Esto puede ser debido a varias razones, tales como la diferencia en la distribución tisular, los dominios de procesado, la regulación de la actividad, así como a otras diferencias entre las proteínas Por ejemplo, la LOX y las LOXL están implicadas en enfermedades fibróticas, ya que tanto la LOX como las LOXL son muy expresadas en los

30 miofibroblastos que rodean las áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190: 910 - 919 (1994); Murawaki y col., Hepatology 14: 1167 - 1173 (1991); Siegel y col, Proc. Natl. Acad. Scl. EE.UU. 75: 2945 - 2949 (1978); Jourdan Le-Saux y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 199: 587 - 592 (1994); Kim y col., J. Cell Biochem. 72: 181 -188 (1999)). La LOX y las diversas LOXL también están implicadas en varios cánceres. Por ejemplo, la LOXL y la LOXL4 han mostrado estar silenciadas epigenéticamente y pueden inhibir la vía de señalización de la cinasa regulada por

35 ras/señal extracelular en el cáncer de vejiga en humanos (Wu y col., Cancer Res. 67: 4123 - 4129 (2007)). Otras han mostrado una regulación por incremento selectiva y una amplificación del gen LOXL4 en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello (Gorough y col., J. Pathol. 212: 74 - 82 (2007)). La LOX y la LOX2 también se han implicado en varios tumores, tales como cáncer de colon y de esófago (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. T0: 1 - 32 (2001)). En el cáncer de mama, la LOX y los miembros de la familia de las LOXL se han relacionado con el cáncer (Kirschmann y

40 col., Cancer Res. 62: 448 - 4483 (2002)).

[0005] Peinado Héctor y col. se refieren al papel molecular de la enzima oxidasa de lisilo de tipo 2 en la regulación del snail y la progresión tumoral. Embo Journal, oxford university press surrey, GB, vol. 24, nº 19, 1 de octubre de 2005, páginas 3446 - 3458.

45 [0006] El documento US2007/021365 desvela procedimientos para la identificación de inhibidores de la oxidasa de lisilo y el uso de dichos inhibidores para prevenir y tratar tumores, particularmente tumores metastásicos, individualmente y junto con agentes quimioterapéuticos. Adicionalmente se desvela el uso de los niveles de la oxidasa de lisilo para medir el potencial metastásico y de supervivencia.

50 [0007] El documento WO2007/126457 describe procedimientos, composiciones y kits proporcionados para tratar y prevenir de forma eficaz la metástasis de cánceres in vivo, y para aumentar la supervivencia de los sujetos afectados con tumores metastásicos, dirigiéndose a una oxidasa de lisilo o a su modulador, especialmente la oxidasa de lisilo humana. También se proporcionan procedimientos para identificar inhibidores de la oxidasa de lisilo

55 y el uso de dichos inhibidores para prevenir y tratar tumores, particularmente tumores metastásicos, individualmente y en combinación con agentes quimioterapéuticos. Adicionalmente se describe el uso de los niveles de la oxidasa de lisilo para medir el potencial metastásico y de supervivencia.

[0008] La base de datos EMBL (en línea), 28 de octubre de 2008, se refiere a la secuencia 15133 de la Patente WO2004061423.

[0009] El documento WO2004/061423 se refiere a composiciones, equipo y procedimientos para pronosticar, diagnosticar, prevenir o tratar el cáncer de colon. Se identifican los genes del cáncer de colon que se expresan de

5 forma diferenciada en los tejidos con cáncer de colon con respecto a los tejidos no enfermos. Algunos ejemplos de estos genes están ilustrados en las Tablas 1 - 5. Los genes del cáncer de colon de la presente invención y los productos codificados por los mismos pueden usarse como marcadores o como agentes profilácticos o terapéuticos para la detección o el tratamiento del cáncer de colon.

10 [0010] Por lo tanto, hay una necesidad de composiciones y de procedimientos para modular la actividad de la LOX y de las LOXL. Uno de dichos procedimientos es mediante el uso de ARN interferente (ARNi). El ARNi se refiere a procedimientos para el silenciamiento post-transcripcional de genes específicos de secuencia, que está mediado por un ARN bicatenario (ARNbc) denominado ARN interferente corto (ARNic). El ARNi es un mecanismo endógeno que usa pequeños ARN no codificantes para silenciar la expresión génica. Cuando se introduce un ARNic

15 en una célula, se une a la maquinaria del ARNi endógeno para alterar el nivel del ARNm que contiene las secuencias complementarias con alta especificidad. La respuesta del ARNi implica un complejo de endonucleasa conocido como el complejo silenciador inducido por ARN (RNA-induced silencing complex, RISC), que media en la escisión de un ARN monocatenario complementario de la hebra antisentido del ARNic dúplex. La escisión del ARN objetivo tiene lugar en la región intermedia complementaria de la hebra antisentido del ARNic dúplex (Elbashir y col.,

20 Genes Dev. 15: 188 - 200, (2001)).

[0011] Como resultado, hay una necesidad de composiciones que modulen la LOX y las LOXL, tal como mediante el uso de ARNi. También son necesarios procedimientos para usar dichas composiciones para tratar y diagnosticar dolencias. La presente divulgación aborda las necesidades y proporciona también otras ventajas.

25 La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis en un sujeto de la presente invención se define en la reivindicación 1, el polinucleótido aislado de la presente invención se define en la reivindicación 10, el vector de expresión de la presente invención se define en la reivindicación 13 y la célula hospedadora de la presente invención se define en la reivindicación 14.

30 [0012] La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis y la fibrosis, y para tratar el cáncer, mediante la inhibición de la metástasis de los tumores en un sujeto, tales como tumores primarios. Además, la expresión de la LOXL2 está correlacionada con la proteinosis alveolar pulmonar, y como tal puede usarse para un diagnóstico y un tratamiento precisos de la

35 proteinosis alveolar pulmonar (PAP).

[0013] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende una primera secuencia hibridable con una secuencia de polinucleótidos que codifica para la LOXL2 o la SEQ ID NO 2, una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y una secuencia de conexión que une la primera

40 secuencia con la segunda secuencia. La secuencia de conexión puede formar una estructura de bucle en horquilla. La primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO 20 o la 21. También se proporciona un polinucleótido aislado que comprende la SEQ ID NO 20 o la 21. El polinucleótido aislado puede tener al menos el doble de la longitud de la SEQ ID NO 20 o de la 21.

45 El polinucleótido aislado que comprende la SEQ ID NO 20 puede comprender adicionalmente una segunda secuencia complementaria a ella. Alternativamente, el polinucleótido aislado que comprende la SEQ ID NO 21 puede comprender adicionalmente una segunda secuencia complementaria a ella. Los polinucleótidos aislados que comprenden la SEQ ID NO 20 o la 21 también pueden comprender una estructura de bucle en horquilla. Adicionalmente se proporcionan vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos aislados, así como

50 células hospedadoras que comprenden los vectores de expresión.

[0014] En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido que comprende una primera secuencia hibridable con una secuencia de polinucleótidos que codifica para la LOXL2 o la SEQ ID NO 2, una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y una secuencia de conexión que

55 une la primera secuencia y la segunda secuencia; y un excipiente farmacéutico. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO 20 o la 21; y un excipiente farmacéutico.

[0015] La presente divulgación también proporciona procedimientos para la administración de las

composiciones descritas en este documento. También se desvelan procedimientos para inhibir el crecimiento tumoral primario, la metástasis, la fibrosis o la angiogénesis en un sujeto. Los procedimientos pueden comprender la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un polinucleótido para inhibir el crecimiento tumoral primario, la metástasis, la fibrosis o la angiogénesis en el sujeto. El polinucleótido puede comprender una primera secuencia 5 hibridable con una secuencia de polinucleótidos que codifica para la LOXL2 o la SEQ ID NO 2, una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y una secuencia de conexión que une la primera secuencia y la segunda secuencia. El polinucleótido puede comprender una secuencia de conexión que forma una estructura de bucle en horquilla. La primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO 20 o la 21. Los procedimientos también engloban la administración a un sujeto de un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO 20 o la 21 para inhibir el

10 crecimiento tumoral primario, la metástasis, la fibrosis o la angiogénesis en el sujeto.

[0016] También se proporcionan procedimientos para tratar la PAP en un sujeto. La presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un agente para inhibir la PAP, donde el agente modula la expresión o la actividad de una oxidasa de lisilo o de una proteína de tipo

15 oxidasa de lisilo. También se proporcionan procedimientos para detectar la PAP en un sujeto, donde al sujeto se le administra un agente que detecta la expresión o la actividad de una oxidasa de lisilo o de una proteína de tipo oxidasa de lisilo, donde la expresión o la actividad se usan para diagnosticar la PAP en el sujeto. El nivel o la actividad de la oxidasa de lisilo puede ser el de la LOXL2, el de la LOXL3 o ambos, y el agente usado para tratar o diagnosticar la PAP puede ser un anticuerpo, una molécula pequeña, una molécula antisentido, una ribozima, una

20 ADNzima, oligonucleótidos formadores de triple hélice, ARNic o ARNph. El agente puede ser un inhibidor de la oxidasa de lisilo o de la proteína de tipo oxidasa de lisilo, tal como la LOXL2, la LOXL3 o ambas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

25 [0017] Puede obtenerse una mejor comprensión de las características y las ventajas de la presente invención mediante la referencia a la siguiente descripción detallada, que establece formas de realización ilustrativas en las que se utilizan los principios de la invención, y a los dibujos anexos, en los que:

[0018] La FIG. 1 ilustra las secuencias del ARNph de la LOXL2. Cada secuencia forma una horquilla y las

30 secuencias subrayadas en cada una son hebras sentido/antisentido. Los ARNph son expresados usando el vector pLKO.1-puro (disponible en Sigma) para permitir una transfección transitoria o estable del ARNph, así como la producción de partículas lentivíricas.

[0019] La FIG. 2 es un esquema que ilustra el ensayo de invasión tumoral.

35 [0020] La FIG. 3 ilustra la expresión de la LOXL2 en (A) células cancerosas MDA-MDB 231/LM2-4 y HT1080 y en (B) células de cáncer de mama MDA-MB 231 y de melanoma YU/PAC2, infectadas con vectores lentivíricos que dirigen la expresión del ARNph específico de la LOXL2 195 ó 197 (también denominados sh.Loxl2.195 o sh.Loxl2.197, respectivamente)

40 [0021] La FIG. 4 es una microfotografía que ilustra el cambio morfológico en las células infectadas con vectores lentivíricos que dirigen la expresión de sh.Loxl2.195 o de sh.Loxl2.197.

[0022] La FIG. 5 es (A) una microfotografía que ilustra el efecto de los vectores lentivíricos que dirigen la

45 expresión de sh.Loxl2.195 o de sh.Loxl2.197 en células de cáncer de mama MDA-MB-231 y de fibrosarcoma HT1080 en el ensayo de invasión tumoral. (B) es una inmunotransferencia Western que muestra la interferencia en la expresión de la LOXL2 y (C) que muestra el número de células invasoras por campo.

[0023] La FIG. 6 es una microfotografía que ilustra la expresión de LOXL2 y LOXL3 en tejido de pulmón 50 normal y con PAP.

[0024] La FIG. 7 ilustra la tinción con rodamina faloidina de células MDA-231. (A) La tinción con faloidina de la F-actina de células MDA-231 naturales y de células MDA-231 de control infectadas de forma estable con lentivirus revela largas fibrillas típicas de una célula que ha experimentado una transición epitelial-mesenquimatosa (EMT). (B)

55 Las células MDA-231 infectadas con sh.Loxl2.195 están empobrecidas en LOXL2 y revelaron un efecto "borde" cerca de la membrana celular, más típico de una célula epitelial normal.

[0025] La FIG. 8 ilustra el desarrollo de un tumor primario en ratones inyectados con células MDA-231 sicontrol (si-c) o con sh.Loxl2.195 (si-195). Las células MDA-231 se infectaron con un ARNph de control que codifica para lentivirus o para el vector de expresión de lentivirus sh.Loxl2.195. Las células se seleccionaron con puromicina y se determinó la expresión de Loxl2 antes de su inyección en las almohadillas grasas mamarias de ratones hembras balb/c nu/nu. (A) El volumen del tumor se midió 6, 11, 14, 18, 22, 25 y 27 días después de la inyección. (B) Ilustra el peso del tumor de ratones MDA-231 si-control frente a sh.Loxl2.195 (si-195) 27 días después de la

5 inyección.

[0026] La FIG. 9 ilustra los genes de células cancerosas afectadas por las sobreexpresión de la LOXL2 o por la inhibición de la expresión de Loxl2. (A) Genes regulados por incremento en células MCF-7 que sobreexpresan la LOXL2 recombinante. La expresión génica se midió mediante RT-PCR e inmunotransferencia Western. Las células

10 se transfectaron con un constructo regulado por tetraciclina que expresa la LOXL2 (clones 12 y 14), el vector lentivírico de control que contiene un ARNph (WT) no relacionado o un mutante de la LOXL2 que es enzimáticamente inactivo debido a una mutación en su motivo LTQ (Y689F). (B) Infección con la expresión dirigida de lentivirus de ARNph dirigida contra Loxl2. C = ARNph de control, L2 = sh.Loxl2.195

15 [0027] La FIG. 10 ilustra que la expresión de la LOXL2 mejora con la hipoxia. (A) Las células se incubaron en una cámara de hipoxia. El control se incubó en condiciones normóxicas (estufa de incubación normal). El ARN se preparó a partir de las células al final del experimento, y se amplificó mediante RT-PCR. PC = células que expresan la LOXL2 recombinante, NC = PCR sin RT. (B) Se evaluaron los niveles de la LOXL2 mediante una inmunotransferencia Western. Las células se estimularon durante los tiempos indicados con la concentración

20 indicaba de CoCl2. Se prepararon concentraciones iguales de lisados celulares con tampón de lisis. Los lisados celulares se separaron con una SDS/PAGE gel, se inmunotransfirieron y se sondearon con nuestros anticuerpos anti-LOXL2. Se rasparon las membranas y se volvieron a sondear con un anticuerpo dirigido contra la actina para verificar que la carga era igual.

25 [0028] La FIG. 11 ilustra la expresión de un receptor de la LOXL2 unido a la superficie celular en células endoteliales humanas derivadas de umbilicalveina (human umbilicalvein derived endothelial cells, HUVEC). (A) La LOXL2 se yodó y se ensayaron 4 líneas celulares diferentes para comprobar su unión específica a la LOXL2. Se añadió LOXL2 yodada a cada pocillo y se realizaron ensayos de competición con LOXL2 no marcada. (B) La LOXL2 no se une específicamente a gelatina, laminina ni fibronectina. Se añadió LOXL2 yodada a cada pocillo y se

30 realizaron ensayos de competición con LOXL2 no marcada. No había una unión específica que demostrara que la unión observada a las células no está causada por la unión a los componentes de la ECM fibronectina, laminina o gelatina. (C) Se añadió LOXL2 yodada a cada pocillo y se realizaron ensayos de competición con LOXL2 no marcada. En ausencia, o con la adición de 100 ug/ ml de heparina (la heparina no inhibe la unión) o tras una digestión previa con heparinasa (no afecta a la unión al posible receptor).

35 [0029] La FIG. 12 ilustra la expresión de LOXL2 y LOXL3 en células neuronales del sistema nervioso central (SNC). La hibridación in situ de secciones de tejido procedentes de corteza cerebral humana normal se realizó usando sonda dirigidas a LOX, LOXL1, LOXL2, o LOXL3. S = sentido, as = antisentido.

40 DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0030] Los principios y la operación de la presente divulgación pueden comprenderse mejor con referencia a los dibujos y a la descripción anexos. Debe apreciarse que la divulgación no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y de disposición de los componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados

45 en los dibujos descritos en la sección de Ejemplos. La divulgación es susceptible de otras formas de realización o de ser llevada a la práctica o a cabo de diversas formas. También, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleada en este documento es con fines descriptivos, y no debería interpretarse como limitante.

[0031] La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas y procedimientos que pueden

50 usarse para modular la angiogénesis y para inhibir el crecimiento tumoral, la invasividad tumoral y la fibrosis tumoral. Por ejemplo, la presente divulgación puede usarse para suprimir el crecimiento tumoral y la metástasis, así como para tratar y diagnosticar trastornos tales como por ejemplo, artritis, retinopatía diabética, psoriasis, vasculitis y PAP.

[0032] Los procedimientos y las composiciones descritas incluyen el uso de un inhibidor de la LOX o de las

55 LOXL, tales como agentes que inhiben la LOXL2. Un ejemplo de LOX o de LOXL incluye la enzima con una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a un polipéptido expresado o a partir de una de las siguientes secuencias: EMBL/números de acceso del GenBank: M94054; AAA59525.1 - ARNm; S45875; AAB23549.1 - ARNm; S78694; AAB21243.1 - ARNm; AF039291; AAD02130.1 - ARNm; BC074820; AAH74820.1 - ARNm; BC074872; AAH74872.1 - ARNm; M84150; AAA59541.1 - ADN Genómico. Algunos ejemplos particulares de LOXL se describen en Molnar y col., Biochim Biophys Acta. 1647: 220 - 24 (2003); Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70: 1 - 32 (2001); y en el documento WO01/83702. (Se menciona que en estas 3 publicaciones, "LOXL1" hacía referencia a "LOXL", mientras que en la presente invención "LOXL" se refiere a una proteína de tipo oxidasas de lisina en general, no sólo a la LOXL1.) Estas enzimas incluyen la LOXL1, codificada por el ARNm depositado en el GenBank/EMBL

5 BC015090; AAH15090.1; la LOXL2, codificada por el ARNm depositado en el GenBank/EMBL U89942; la LOXL3 codificada por el ARNm depositado en el GenBank/EMBL AF282619; AAK51671.1; y la LOXL4, codificada por el ARNm depositado en el GenBank/EMBL AF338441; AAK71934.1.

[0033] La LOX o las LOXL también incluyen un fragmento funcional o un derivado que aún conserva

10 sustancialmente su actividad enzimática, catalizando la desaminación de residuos de lisilo. Típicamente, un fragmento o un derivado funcional conserva al menos el 50% de su actividad de oxidasa de lisilo. Un fragmento o un derivado funcional puede conservar al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 99% o el 100% de su actividad de oxidasa de lisilo. Una LOX o unas LOXL pueden incluir sustituciones conservativas de aminoácidos que no alteran sustancialmente su actividad. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidas por los

15 expertos en esta técnica y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente su actividad biológica.

[0034] Los inhibidores usados pueden incluir inhibidores de la familia de enzimas de oxidasas de lisilo, que

20 catalizan la formación de reticulaciones covalentes entre residuos de lisina en fibrillas adyacentes de colágeno o de elastina. Se sabe que existen al menos cinco oxidasas de lisilo diferentes tanto en seres humanos como en ratones, la LOX y las cuatro LOX relacionadas, o proteínas de tipo LOX: LOXL1 (o LOL), LOXL2 (o LOR-1), LOXL3 (o LOR-2) y LOXL4 (o Lox-C). Las cinco formas de las oxidasas de lisilo residen en cinco cromosomas diferentes. Los miembros de esta familia muestran un cierto solapamiento en sus estructuras y funciones, pero parecen tener

25 también funciones distintas. Por ejemplo, la LOX parece ser letal en el parto de ratones (Hornstra y col., J. Biol. Chem. 278: 14387 - 14393 (2003)), mientras que una deficiencia en las LOXL no provoca un fenotipo de desarrollo grave (Bronson y col., Neurosci. Lett. 390: 118 - 122 (2005)). La familia de las oxidasas de lisilo incluye cuatro genes, tales como aquellos con las SEC ID Nos 1, 4, 5 ó 7, o enzimas con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nos: 2, 3, 6, 8, o 9.

30 [0035] La LOX tiene unos dominios de proteínas muy conservados, conservados en varias especies que incluyen al ser humano, ratón, rata, pollo, peces y Drosophila. La familia humana de las LOX ha conservado en gran medida la región C terminal que contiene los 205 aminoácidos del dominio catalítico de la LOX. La región conservada contiene la unión al cobre (Cu), el dominio del receptor de tipo citocina (CRL) y el sitio del cofactor de

35 lisilo-tirosilquinona (LTQ). De forma similar, también se han conservado 20 residuos de cisteína, estando dos presentes en la región del prepropéptido y diez en la forma procesada catalíticamente activa de la LOX (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70: 1 - 32 (2001)).

[0036] La región del prepropéptido de la LOX contiene un péptido de señalización que es escindido. Se ha

40 predicho que el sitio de escisión estará entre Cys21 - Ala22, generando una secuencia de señalización de 16 (o 21) y una forma de propéptido de aminoácido de 48 kDa de la LOX, que, sin ceñirnos a ninguna teoría, todavía es inactivo. Sin estar limitados por la teoría, el propéptido es N-glucosilado durante su paso a través del Golgi, produciendo una proenzima inactiva de 50kDa que es secretada al entorno extracelular, donde la proenzima, o el propéptido, es escindido entre Gly168 - Asp169 por una metaloendoproteasa, una proteinasa C de procolágeno, que

45 son productos de los genes Bmp1, Tll1 y Tll2. La BMP I (proteína morfogenética ósea I, bone morfogenetic protein I) es una proteinasa C de procolágeno que procesa el propéptido para producir una enzima funcional de 30 kDa y un propéptido de 18 kDa. La secuencia codificante del propéptido está típicamente moderadamente conservada (aproximadamente el 60 - 70%), mientras que la secuencia codificante de la región C terminal de 30 kDa de la proenzima en la que está localizado el sitio activo está habitualmente muy conservada (aproximadamente 95%).

50 (Kagan y Li, J. Cell. Biochem. 88: 660 - 672 (2003); Kagan y col., J. Cell Biochem. 59: 329 - 38 (1995)). Las unidades de N-glucosilo son habitualmente subsiguientemente eliminadas.

[0037] Se han predicho potenciales péptidos de señalización similares en los amino terminales de las LOXL, LOXL2, LOXL3, y LOXL4. Los sitios predichos de escisión de la señal están entre Gly25 - Gln26 para la LOXL, entre 55 Ala25 - Gln26 para la LOXL2 y entre Gly25 - Ser26 para LOXL3. El consenso para la escisión de la BMP-1 en procolágenos y pro-LOX está entre Ala/Gly - Asp, y a menudo está seguido de un residuo ácido o cargado. Un potencial sitio de escisión para generar la LOXL activa es Gly303 - Asp304, sin embargo, a continuación está seguido por una atípica Pro. La LOXL3 también tiene un potencial sitio de escisión en Gly44y - Asp448, que está seguido por una Asp, el procesado en este sitio puede producir un péptido activo de un tamaño similar a la LOX

activa. También se identificó un potencial sitio de escisión de la BMP-1 en la LOXL4, en los residuos Ala569 -Asp570 (Kim y col., J. Biol. Chem. 278: 52071 - 52074 (2003)). La proteína LOXL2 también puede ser procesada análogamente a los otros miembros de la familia de las LOX.

5 [0038] Una característica que puede diferir entre las oxidasas de lisilo y las proteínas de tipo oxidasas de lisilo son los receptores con dominios ricos en cisteínas de tipo scavenger (scavenger receptor cysteine rich, SRCR). La LOX y las LOXL parecen carecer de los dominios SRCR, mientras que las LOXL2, LOXL3, y LOXL4 tienen en cada una cuatro dominios SRCR en el N terminal. Los dominios SRCR median en la unión del ligando de varias proteínas secretadas y de receptor (Hoheneste y col., Nat. Struct. Biol. 6: 228 - 232 (1999); Sasaki y col., EMBO J.

10 17: 1606 - 1613 (1998)). Otro dominio que parece ser el único de las LOXL es la presencia de un dominio rico en prolina (Molnar y col., Biochimica Biophsyica Acta 1647: 220 - 224 (2003)).

[0039] La distribución tisular también puede diferir entre la LOX de las diversas LOXL. Por ejemplo, según se muestra en la FIG. 12, la LOXL2 y la LOXL3 están muy expresadas en las células neuronales, mientras que la LOX y

15 la LOXL1 no lo están. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación engloba la modulación de la expresión de la LOX o de las LOXL en el SNC, tal como en el cerebro, o más específicamente, en las células neuronales.

[0040] Cada miembro de la familia de enzimas de las LOX incluye un dominio de oxidasa de lisilo muy conservado, cuya actividad es muy dependiente de la presencia de cobre. La eliminación del cobre de los tejidos

20 tumorales conduce a la inhibición de la angiogénesis (Rabinovitz, J. Natl. Cancer Inst. 91: 1689 - 1690 (1999); Yoshida y col., Neurosurgery 37: 287 - 292 (1995)). Esto apoya adicionalmente el papel de la familia de enzimas de las oxidasas de lisilo en la angiogénesis, ya que sin ceñirnos a ninguna teoría, la eliminación del cobre conduce a la inhibición de las oxidasas de lisilo.

25 [0041] Un apoyo adicional a la actividad angiogénica de las oxidasas de lisilo es proporcionado por los ensayos de unión de PF4-LOXL2. El PF4 es un inhibidor de la angiogénesis. Como tal, la actividad antiangiogénica mostrada por el PF4 puede ser, sin ceñirnos a ninguna teoría, efectuada mediante la inhibición de la LOXL2, que es muy expresada en las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos. Por lo tanto, según un aspecto de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos para modular la angiogénesis.

[0042] Angiogénesis

[0043] En un adulto, la formación de nuevos vasos sanguíneos en tejidos normales o enfermos está regulada típicamente por dos procesos, la vasculogénesis recapitulada (la transformación de las arteriolas

35 preexistentes en pequeñas arterias musculares) y la angiogénesis, los brotes de los vasos sanguíneos existentes (que se produce tanto en el embrión como en el adulto). Adicionalmente, la expresión de la LOXL2 es inducida en condiciones hipóxicas (FIG. 10), ya que se cree que la angiogénesis es estimulada en los cánceres para superar las condiciones hipóxicas.

40 [0044] El proceso de la angiogénesis está regulado por estímulos biomecánicos y bioquímicos. Las células vasculares, los macrófagos y las células que rodean a los vasos sanguíneos liberan factores angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (basic fibroblast growth factor, bFGF). Estos factores angiogénicos activan proteasas específicas que están implicadas en la degradación de la membrana basal. Como resultado de esta degradación, las

45 células vasculares migran y proliferan, dando por tanto lugar a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Las células periendoteliales, tales como los pericitos de los capilares, las células musculares lisas de los vasos mayores y los miocitos cardíacos en el corazón, son reclutadas para proporcionar funciones de mantenimiento y de modulación en la formación de los vasos sanguíneos.

50 [0045] El establecimiento y la remodelación de los vasos sanguíneos están controlados por señales paracrinas, muchas de las cuales están mediadas por ligandos de proteínas que modulan la actividad de los receptores de la cinasa de tirosina transmembranales. Entre estas moléculas están el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus familias de receptores (VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1 y neuropilina-2), las angiopoyetinas 1 - 4 (Ang-1, Ang-2 etc.) y sus respectivos receptores (Tie-1 y Tie-2), el factor básico de crecimiento

55 de fibroblastos (bFGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y el factor de crecimiento transformante (TGF-).

[0046] El crecimiento de tumores sólidos está limitado por la disponibilidad de nutrientes y de oxígeno. Cuando las células de los tumores sólidos comienzan a producir factores angiogénicos o cuando disminuyen los niveles de los inhibidores de la angiogénesis, el equilibrio entre las influencias antiangiogénicas y angiogénicas está perturbado, iniciando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir del lecho vascular existente en el tumor. Este acontecimiento en la progresión del tumor se conoce como cambio angiogénico. Los inhibidores de la angiogénesis tumoral son capaces de inhibir el crecimiento tumoral en ratones, en algunos casos, parecen inhibir

5 completamente el crecimiento tumoral e inhibir también la metástasis tumoral, un proceso que se basa en el estrecho contacto entre la vasculatura y las células tumorales. La angiogénesis juega un importante papel en la progresión del cáncer de mama.

[0047] Dichos hallazgos han motivado el uso de factores antiangiogénicos conocidos en la terapia del cáncer

10 de mama (Klauber y col., Cancer Res. 57: 81 - 86 (1997); Harris y col., Breast Cancer Res. Treat. 38, 97 -108 (1996); Weinstatsaslow y col., Cancer Res. 54: 6504 - 6511 (1994)). Durante la pasada década se han aislado varios nuevos inhibidores de la angiogénesis, que incluyen los inhibidores de la señalización por el VEGF (Neufeld y col., FASEB J. 13: 9 - 22 (1999)) e inhibidores de procesos que dan lugar a la maduración y la estabilización de los nuevos vasos sanguíneos. Se han usado anticuerpos anti-integrinas como inhibidores de la maduración de los vasos

15 sanguíneos (Brooks y col., Cell 79: 1157 - 1164 (1994); Brooks y col., Cell 92: 391 - 400 (1998)).

[0048] Aunque ahora hay disponibles comercialmente muchos fármacos antiangiogénicos, los mecanismos antiangiogénicos de la mayoría de estos fármacos (por ejemplo, angiostatina y endostatina) siguen siendo confusos (O’Reilly y col., Cell 88: 277 - 285 (1997); O’Reilly y col., Nature Med. 2: 689 - 692 (1996)). Dado que la angiogénesis

20 puede ser iniciada por muchos factores angiogénicos (posiblemente compensatorios), es probable que los factores antiangiogénicos que se dirigen a estos últimos procesos en la respuesta antiangiogénica, tal como la maduración de los vasos, o una combinación de factores antiangiogénicos, sean eficaces para detener la formación de los vasos.

25 [0049] El factor plaquetar 4 (PF4) es una proteína antiangiogénica normalmente secuestrada en las plaquetas (Tanaka y col., Nature Med. 3: 437 - 442 (1997); Maione y col., Science 247: 77 - 79 (1990); Neufeld y col., The Cytokine Reference: A compendium of cytokines and other mediators of host defence (Oppenheim, J. J. y Feldmann, M. eds) Academic Press (2000)). El PF4 inhibe la angiogénesis usando mecanismos vagamente definidos (Gengrinovitch y col., J. Biol. Chem. 270: 15059 - 15065 (1995); Brown y Parish, Biochemistry 33: 13918 -

30 13927 (1994); Gupta y Singh, J. Cell Biol. 127: 1121 - 1127 (1994); Watson y col., J. Clin. Invest. 94: 261 - 268 (1994)). Previamente se había especulado con que el PF4 se une a los proteoglucanos de sulfato de heparán de la superficie celular, y de esta forma inhiben la actividad de los factores de crecimiento angiogénicos tales el factor básico de crecimiento de fibroblastos (Watson y col., J. Clin. Invest. 94: 261 - 268 (1994)).

35 [0050] Por ejemplo, las composiciones y los procedimientos descritos en la presente divulgación pueden usarse para suprimir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis, o mediante la inhibición directa del crecimiento tumoral (tal como del crecimiento tumoral primario), suprimiendo la metástasis, así como para tratar y diagnosticar trastornos tales como, por ejemplo, artritis, retinopatía diabética, psoriasis y vasculitis, y proteinosis alveolar pulmonar primaria.

[0051] Tumores metastásicos y primarios

[0052] La prevención, la reducción y el diagnóstico de tumores son importantes en la prevención y el tratamiento del cáncer. La transición desde un tumor localizado hasta un tumor invasivo y metastásico representa un

45 punto de referencia en el desarrollo de una enfermedad maligna, dado que habitualmente está asociado con un pronóstico notablemente peor. La comprensión de los procesos que gobiernan esta transición tiene por lo tanto una importancia fundamental, y los papeles de la LOX y de las LOXL en estos procesos pueden usarse no sólo para una comprensión adicional de este proceso, sino usarse también para tratar, prevenir o diagnosticar tumores primarios y metastásicos.

50 Por ejemplo, la expresión de la LOXL2 puede ser disminuida en las células del cáncer de mama, en las células del melanoma y en las células del fibrosarcoma usando ARNph o ARNic (FIGS. 3, 5B). La administración del ARNph o del ARNic que se dirijan a la LOXL2 da lugar a una transición de tipo EMT hacia MET (FIG. 4, FIG. 7), así como a una disminución en la invasión celular (FIG. 5), apoyando además el papel de la LOXL2 en la metástasis tumoral, y

55 la modulación de la expresión de la LOXL2 puede ayudar a inhibir la actividad metastásica. La inhibición de la LOXL2 también puede usarse para inhibir el crecimiento tumoral y para reducir tumores primarios. La inhibición del crecimiento tumoral puede ser preventiva. Alternativamente, la inhibición del crecimiento tumoral primario puede ser una reducción de la masa del tumor, por ejemplo, puede reducirse la masa del tumor en comparación con el tamaño

o el volumen del tumor cuando se detectó inicialmente. La inhibición puede ser en la velocidad de crecimiento del tumor primario, por ejemplo, la masa o el volumen del tumor primario aumenta a una velocidad menor en comparación con un sujeto no tratado con las composiciones desveladas en este documento, por ejemplo, según se muestra en la FIG. 8.

5 [0053] Cáncer de mama

[0054] En el cáncer de mama, la transición desde un tumor localizado hacia un tumor invasivo/metastásico está asociada en algunos casos a la formación de focos fibróticos y desmoplasia, que es la presencia de estroma de colágeno excepcionalmente denso, dentro del tumor primario (Colpaert y col., Am. J. Surg. Pathol. 25, 1557 (2001); 10 Hasebe y col., Pathology International 50: 263 - 272 (2000)). Puede existir una correlación similar en otros tipos de cánceres, tales como los cánceres de colon y de páncreas (Nishimura y col., Virchows Arch. 433: 517 - 522 (1998); Ellenrieder y col., Int. J. Cancer 85: 14 - 20 (2000)). Estas observaciones representan aparentes paradojas a primera vista, dado que la invasividad se ha asociado durante mucho tiempo con la destrucción de la matriz extracelular por enzimas de degradación de la matriz extracelular como las metaloproteasas (Stamenkovic, Semin. Cancer Biol. 10: 15 415 - 433 (2000); Duffy y col., Breast Cancer Res. 2: 252 - 257 (2000)) y la heparanasa (Vlodavsky y Friedmann, J. Clin. Invest 108: 341 - 347 (2001)). Sin embargo, es posible que la deposición de un exceso de matriz extracelular pueda estimular a su vez la expresión de las enzimas de degradación de la matriz extracelular, lo que contribuirá en ciertas circunstancias a la invasión tumoral. De hecho, existen ciertas pruebas de que un aumento en la deposición de matriz extracelular puede efectivamente influir en la producción de enzimas de degradación de la matriz 20 extracelular (Schuppan y col., Semin. Liver Dis. 21: 351 - 372 (2001); Swada y col., Int. J. Oncol. 19: 65 - 70 (2001)).

[0055] Cáncer de colon

[0056] El cáncer del tracto gastrointestinal (GI), especialmente el cáncer de colon, es una enfermedad muy

25 tratable y a menudo curable cuando está localizada en el intestino. La cirugía es el tratamiento primario y da como resultado una curación en aproximadamente el 50% de los pacientes. Las recidivas tras la cirugía es un problema importante y a menudo es la causa final de la muerte. Prácticamente todos los casos de cáncer colorrectal surgen a partir de pólipos adenomatosos, algunos de los cuales maduran hacia pólipos grandes, que experimentan un crecimiento y un desarrollo anormales, y finalmente progresan hasta cáncer. Esta progresión parecería tardar al

30 menos 10 años en la mayoría de los pacientes, convirtiéndola en una forma fácilmente tratable de cáncer que se diagnostica tempranamente, cuando el cáncer está localizado.

[0057] Los procedimientos estándar usados habitualmente para el establecimiento de un diagnóstico definitivo de un cáncer del tracto GI incluyen estudios con bario, endoscopia, biopsia y tomografía computerizada

35 (Brennan y col., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Cuarta Edición, págs. 849 - 882, Filadelfia, Pa.: J. B. Lippincott Co. (1993)).

[0058] El pronóstico del cáncer de colon está relacionado típicamente con el grado de penetración del tumor a través de la pared intestinal y con la presencia o la ausencia de una implicación ganglionar. Estas dos 40 características forman habitualmente la base de los sistemas de estadificación desarrollados para esta enfermedad. La estadificación es realizada habitualmente por un patólogo sobre secciones tisulares obtenidas mediante una biopsia y/o una cirugía y aspira a determinar la extensión anatómica de la enfermedad. Una estadificación precisa es crítica para predecir la respuesta del paciente y para proporcionar criterios para diseñar una terapia óptima. Una estadificación poco precisa puede dar como resultado unas malas decisiones terapéuticas, y es un problema clínico

45 importante en el cáncer de colon.

[0059] Proteinosis alveolar primaria (PAP)

[0060] La PAP es un raro trastorno pulmonar de etiología desconocida caracterizado por unos alveolos

50 llenos de material floculado que se tiñe positivamente usando el método del ácido peryódico-Schiff (PAS) y está derivado de los componentes fosfolípidos tensioactivos y proteicos. Es probable que la LOXL2 y laLOXL3 tengan un papel en la PAP ya que ambas se expresan en el tejido de la PAP, pero no en el tejido pulmonar normal (FIG. 6).

[0061] Hay dos formas reconocidas, (1) la primaria (idiopática) y (2) la secundaria (debida a infecciones

55 pulmonares; a cánceres hematológicos; y a la inhalación de polvo mineral tal como sílice, óxido de titanio, aluminio e insecticidas). La incidencia de la PAP está aumentada en pacientes con cánceres hematológicos y SIDA, lo que sugiere una relación con una disfunción inmunitaria.

[0062] En la PAP los alveolos están llenos de material proteico, que ha sido ampliamente analizado y se ha determinado que es tensioactivo normal formado por lípidos y las proteínas asociadas a tensioactivo A, B, C y D (SP-A, SP-C, SP-D). Existen pruebas de un defecto en el mecanismo homeostático bien de la producción del tensioactivo o bien en su aclaramiento por los macrófagos alveolares y el elevador mucociliar. Se ha demostrado una clara relación entre la PAP y un deterioro en la maduración de los macrófagos.

5 [0063] La PAP tiene una prevalencia estimada de 1 caso por 100.000 de población, y previamente se ha informado de unas tasas de mortalidad tan altas como del 30% durante varios años desde el inicio de la enfermedad. La tasa real de mortalidad puede ser menor del 10%. La incidencia en machos que es 4 veces mayor que en hembras. Los pacientes tienen típicamente 20 - 50 años de edad cuando se presentan.

10 [0064] Los pacientes con PAP se presentan típicamente con un inicio gradual de los síntomas. Tanto como el 30% de los pacientes son asintomáticos, incluso con anomalías difusas en una radiografía de tórax (CXR). Algunos síntomas pueden incluir los siguientes: tos seca persistente (o producción de esputo escaso), disnea progresiva, fatiga y malestar, pérdida de peso, febrícula intermitente y/o sudoración nocturna, dolor pleurítico de pecho, cianosis

15 y hemoptisis.

[0065] La etiología de la PAP es desconocida. Algunas causas pueden incluir la inhalación de polvo de sílice (silicoproteinosis aguda), la exposición a insecticidas, a polvo de aluminio, a dióxido de titanio y a otros polvos inorgánicos, cánceres hematológicos, trastornos mieloides, intolerancia a la proteína lisinúrica, infección por VIH

20 (SIDA), caso clínico de leflunomida y terapia de la artritis reumatoide modificadora de la enfermedad. Algunos diferenciales pueden incluir neumonitis por hipersensibilidad, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcelular (microcítico), neumonía por Pneumocystis carinii, edema pulmonar y sarcoidosis cardiógena. El diagnóstico puede realizarse mediante un lavado si se requiere una tinción de PAS. Por lo tanto, la PAP está probablemente subdiagnosticada.

25 [0066] Clásicamente se usan biopsias pulmonares para el diagnóstico de la PAP: alveolos llenos de un material no espumoso. Las biopsias transbronquiales son adecuadas, y no se requiere una biopsia abierta de pulmón.

30 [0067] El manejo de la PAP depende de la progresión de la enfermedad, de las infecciones coexistentes y del grado de deterioro fisiológico. El cuidado estándar de la PAP es la eliminación mecánica del material lipoproteico mediante un lavado pulmonar completo, que a menudo se repite. Históricamente, los pacientes se han tratado con esteroides sistémicos, mucolíticos (en aerosol) y proteinasa (en aerosol) sin mucho éxito. En la PAP secundaria también se garantiza el apropiado tratamiento de la causa subyacente. Se ha demostrado que el GM-CSF mejora la

35 PAP en muchos pacientes, y se está investigando. La PAP congénita responde favorablemente al trasplante de pulmón.

[0068] El trasplante de pulmón es el tratamiento de elección en pacientes PAP congénita y en pacientes adultos con fibrosis intersticial en estadio terminal y cardiopatía pulmonar. Las principales complicaciones son

40 infecciones de pulmón por N asteroides, Pneumocystis carinii, y/o Mycobacterium avium-intracellulare. La fibrosis pulmonar y/o la cardiopatía pulmonar también pueden complicar la PAP.

[0069] Por lo tanto, para aumentar la precisión de la terapia y la tasa de supervivencia de los pacientes con PAP hay una necesidad de desarrollar procedimientos de diagnóstico y de tratamiento precisos de la PAP, y las

45 composiciones y los procedimientos descritos en este documento pueden usarse en el diagnóstico y en el tratamiento de la PAP.

[0070] Procedimientos y composiciones

50 [0071] Los procedimientos descritos en este documento se efectúan mediante la administración a un sujeto de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula capaz de modificar el nivel y/o la actividad tisular de al menos un tipo de LOX para modular así la angiogénesis en el tejido de un mamífero. La administración puede ser en el tejido de un mamífero. La modificación del nivel y/o de la actividad tisular de al menos un tipo de LOX o de LOXL puede modular la angiogénesis, el desarrollo de un tumor primario, la metástasis tumoral y/o la PAP. También

55 puede detectarse el nivel de expresión o la actividad de la LOX o de las LOXL y usarse para diagnosticar una dolencia, tal como la PAP.

[0072] Según se usa en este documento, la frase "nivel tisular" se refiere al nivel de proteína LOX o LOXL presente en el tejido en un punto temporal dado. A veces puede ser ventajoso medir los niveles tisulares de las formas activas de LOX o de LOXL. Los niveles de proteína se determinan mediante factores tales como las tasas de transcripción y/o de traducción, el recambio de ARN o de proteínas y/o la localización de las proteínas dentro de la célula. Como tal, cualquier molécula que efectúe cualquiera de estos factores pueden modificar el nivel tisular de LOX o de LOXL.

5 [0073] Según se usa en este documento, el término "actividad" se refiere a una actividad enzimática de LOX

o de LOXL. Una molécula que puede modificar la actividad enzimática puede alterar directa o indirectamente la especificidad de sustrato de la enzima o la actividad del sitio catalítico de la misma.

10 [0074] Existen numerosos ejemplos de composiciones que pueden comprender moléculas que pueden modificar específicamente el nivel tisular y/o actividad de una oxidasa de lisilo. Dichas moléculas pueden clasificarse en “reguladores por disminución” o “reguladores por incremento” de la oxidasa de lisilo.

[0075] Reguladores por disminución

15 [0076] Un ejemplo de un agente capaz de regular por disminución una proteína oxidasa de lisilo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente a la oxidasa de lisilo o al menos a parte de la proteína oxidasa de lisilo (por ejemplo, a la región que abarca el sitio catalítico) y de inhibir su actividad cuando se introduce en el tejido de mamífero. Como tal puede usarse un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido a

20 la oxidasa de lisilo para suprimir o detener la formación de vasos sanguíneos y para inhibir la fibrosis y la metástasis tumoral.

[0077] El anticuerpo puede unirse específicamente a al menos un epítopo de la LOX o de las LOXL. Según se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante antigénico sobre un antígeno tal

25 que se une al parátopo de un anticuerpo.

[0078] Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupamientos de moléculas químicamente tensioactivas tales como cadenas laterales de aminoácidos o de carbohidratos, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

30 [0079] Según se usa en este documento, el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas intactas como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab’)2 y Fv, que son capaces de unirse a los macrófagos. Estos fragmentos funcionales de anticuerpos se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión al antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, puede producirse mediante la digestión

35 del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; (2) Fab’, el fragmento de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse mediante el tratamiento del anticuerpo completo con pepsina, seguido de una reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab’ por molécula de anticuerpo; (3) F(ab’)2, el fragmento de anticuerpo que puede obtenerse mediante el tratamiento del anticuerpo completo con la enzima pepsina sin la

40 subsiguiente reducción; F(ab’)2 es un dímero de dos fragmentos Fab’ que se mantienen unidos por dos puentes de disulfuro; (4) Fv, definido como un fragmento modificado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y (5) anticuerpo de cadena individual (single chain antibody, "SCA"), una molécula modificada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un polipéptido conector adecuado como una molécula de

45 cadena individual fusionada genéticamente.

[0080] Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, así como fragmentos de los mismos, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).

50 [0081] Los fragmentos de anticuerpos según la presente divulgación pueden ser preparados mediante la hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli o en células de mamífero (tal como en un cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) del ADN que codifica para el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante una digestión con papaína de los

55 anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse mediante la escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de 5S denominado F(ab’)2. Este fragmento puede ser adicionalmente escindido usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo bloqueante de los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de los puentes de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab’ de 3,5S. Alternativamente, una escisión enzimática usando pepsina produce directamente dos fragmentos Fab’ monovalentes y un fragmento Fc. Estos procedimientos son descritos, por ejemplo, por Porter, en Biochem. J. 73: 119 - 126 (1959), y en las Patentes de EE.UU. Nos 4.036.945 y 4.331.647, y en las referencias contenidas en esos documentos. También pueden usarse otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadenas

5 ligera-pesada monovalentes, la escisión adicional de los fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

[0082] Los fragmentos Fv comprenden una asociación de las cadenas VH y VL. Esta asociación puede no ser covalente, según se describe en Inbar y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 69: 2659 - 62 (1972). 10 Alternativamente, las cadenas variables pueden estar conectadas por un puente de disulfuro intermolecular o reticuladas mediante compuestos químicos tales como gluteraldehído. Los fragmentos Fv pueden comprender las cadenas VH y VL conectadas mediante un péptido conector. Estas proteínas de unión al antígeno de cadena individual (sFv) pueden prepararse construyendo un gen estructural que comprenda secuencias de ADN que codifican para los dominios de VH y VL conectadas por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector

15 de expresión, que subsiguientemente se introduce en una célula hospedadora tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una cadena politécnica polipeptídica individual con un péptido conector uniendo los dos dominios V. Algunos procedimientos para producir sFvs son descritos, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, en Methods 2: 97 - 105 (1991); Bird y col., Science 242: 423 - 426 (1988); Pack y col., Bio/Technology 11: 1271 - 77 (1993); y en la Patente de EE.UU. Nº 4.946.778.

20 [0083] Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una región determinante de complementariedad (complementarity-determining región, CDR) individual. Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse mediante la construcción de genes que codifican para la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la

25 polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras del anticuerpo, por ejemplo, según se describe en Larrick y Fry, Methods, 2: 106 - 10 (1991).

[0084] Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, 30 Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno), que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos que forman una CDR del receptor son sustituidos por residuos que forman una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos en marco de la Fv de la 35 inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la secuencia de la CDR o del marco importados. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente de dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones de la CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las

40 regiones de la FR son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender óptimamente al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., Nature, 321: 522 - 525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323 - 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593 - 596 (1992)).

45 [0085] Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una secuencia que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo residuos importados, que típicamente se toman de un dominio variable importado. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones y col., Nature, 321: 522 - 525 (1986);

50 Riechmann y col., Nature 332: 323 - 327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534 - 1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de CDRs o de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Consecuentemente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. Nº 4.816.567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son

55 típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de los residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedores.

[0086] Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica, que incluyen bibliotecas de expresión en fago (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 - 388 (1991); Marks y

col., J. Mol. Biol., 222: 581 - 597 (1991)).

También están disponibles las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); 5 Boerner y col., J. Immunol., 147: 86 - 95 (1991)). De forma análoga, pueden elaborarse anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo, en ratones en los que los genes de las inmunoglobulinas endógenas han sido parcial o completamente inactivados. Tras la exposición se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reordenación génica, el ensamblaje, y el repertorio de

10 anticuerpos. Esta metodología se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos 5,545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779 - 783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856 - 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812 - 13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845 - 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65 - 93 (1995).

15 [0087] Según se describe a continuación pueden usarse varias metodologías para reducir o anular la transcripción o la traducción de una oxidasa de lisilo.

[0088] Polinucleótidos

20 [0089] Una metodología es el uso de polinucleótidos para regular por disminución la expresión o la actividad de la LOX o de las LOXL. "Polinucleótido", "nucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable en este documento. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier

25 estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son algunos ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o de un fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir de análisis de conexión, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN transferente, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado con cualquier secuencia, ARN aislado con cualquier secuencia, sondas de ácidos

30 nucleicos, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si hay modificaciones presentes, pueden impartirse a la estructura del nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede ser adicionalmente modificado tras la polimerización, tal como mediante la conjugación con un componente marcador. Un oligonucleótido puede estar aislado, de forma que

35 el oligonucleótido se separa de los demás constituyentes, celulares y demás, que normalmente están asociados en la naturaleza con el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos de los mismos.

[0090] En la presente invención pueden usarse polinucleótidos modificados. Los polinucleótidos modificados pueden tener una semivida y/o una penetración en la membrana mejoradas. En las técnicas se conoce un gran

40 número de variaciones en los esqueletos de polinucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser modificados en la base, en el azúcar o en la fracción de fosfato. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, el uso de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, fosforotioatos con puentes, fosforamidatos con puentes, metilenofosfonatos con puentes, análogos de desfosfointernucleótidos con puentes de siloxano, puentes de carbonato, puentes de carboximetil éster, puentes de carbonato, puentes de carboximetil éster, puentes de

45 acetamida, puentes de carbamato, puentes de tioéter, puentes de sulfoxi, puentes de sulfono, varios ADN "plásticos", puentes anoméricos y derivados de borano, tal como en Cook, Anti-Cancer Drug Design 6: 585 (1991).

[0091] La solicitud de Patente Internacional WO89/12060 desvela varios bloques de construcción para sintetizar análogos de oligonucleótidos, así como análogos de oligonucleótidos formados mediante la unión de

50 dichos bloques de construcción en una secuencia definida. Los bloques de unión pueden ser "rígidos" (es decir, que contienen una estructura anular) o "flexibles" (es decir, que carecen de una estructura anular). En ambos casos los bloques de construcción contienen un grupo hidroxi y un grupo mercapto, a través de los que los bloques de unión se dice que se unen para formar análogos de oligonucleótidos. La fracción de conexión de los análogos de oligonucleótidos se elige de entre el grupo que consiste en sulfuro (-S-), sulfóxido (-SO-) y sulfona (-SO2-).

55 [0092] La solicitud de Patente Internacional WO92/20702 describe un oligonucleótido acíclico que incluye un esqueleto peptídico sobre el que están encadenadas cualquiera de las nucleobases o análogos químicos seleccionados y sirve como caracteres de codificación al igual que lo hacen en el ADN o en el ARN natural. Estos nuevos compuestos, conocidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), no sólo son más estables en las células que sus contrapartidas naturales, sino que también se unen al ADN y al ARN natural entre 50 y 100 veces más estrechamente que los ácidos nucleicos naturales se adhieren entre sí. Los oligómeros de PNA pueden sintetizarse a partir de los cuatro monómeros protegidos que contienen timina, citosina, adenina y guanina mediante una síntesis peptídica en fase sólida de Merrifield. Con objeto de aumentar la solubilidad en agua y evitar la agregación, puede

5 colocarse un grupo lisinoamida en la región C terminal.

[0093] Una secuencia lineal, o secuencia, es una ordenación de nucleótidos en un polinucleótido en dirección de 5’ a 3’ en la que los residuos vecinos entre sí en la secuencia están contiguos en la estructura primaria del polinucleótido. Una secuencia parcial es una secuencia lineal de parte de un polinucleótido que se conoce por

10 comprender residuos adicionales en una o en ambas direcciones.

[0094] Una secuencia lineal de nucleótidos es idéntica a otra secuencia lineal si el orden de los nucleótidos de cada secuencia es el mismo, y aparece sin ninguna sustitución, deleción o sustitución de material. Se entiende que las bases nitrogenadas de purina y pirimidina con estructuras similares pueden ser funcionalmente equivalentes 15 en términos de apareamiento de bases de Watson-Crick; y la intersustitución de bases nitrogenadas, particularmente de uracilo y de timina, o la modificación de bases nitrogenadas, tal como mediante metilación, no constituye una sustitución de material. Un polinucleótido de ARN y uno de ADN tienen secuencias idénticas cuando la secuencia del ARN refleja el orden de bases nitrogenadas en los polirribonucleótidos, la secuencia del ADN refleja el orden de bases nitrogenadas en los polidesoxirribonucleótidos, y las dos secuencias satisfacen los demás requisitos de esta

20 definición. Cuando uno o ambos de los polinucleótidos que se están comparando es bicatenario, las secuencias son idénticas si una hebra del primer polinucleótido es idéntica a una hebra del segundo polinucleótido.

[0095] Un vector puede comprender polinucleótidos de la presente invención. El vector, una molécula de ácidos nucleicos que típicamente es autorreplicante, transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre 25 célula hospedadoras. Algunos vectores incluyen aquellos que funcionan principalmente para la inserción de ADN o de ARN en una célula, la replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación ADN o de ARN, y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o la traducción del ADN o del ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriores. Un vector de expresión es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedadora apropiada, puede ser transcrito y traducido en un(os) polipéptido(s).

30 Un sistema de expresión connota habitualmente una célula hospedadora adecuada formada por un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.

[0096] Las células hospedadoras en las que se ha introducido un vector o un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un vector de expresión o una molécula aislada de ácido nucleico de la invención, se refieren no sólo a 35 la célula en particular sino también a la progenie o a la potencial progenie que dicha célula. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, algunas células hospedadoras pueden incluir células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen muchos procedimientos para introducir ácidos nucleicos 40 en células hospedadoras, tanto in vivo como in vitro, e incluyen, sin limitación, precipitación con fosfato cálcico, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácidos nucleicos mediada por virus. Algunas estrategias de administración se describen en Luft, J. Mol. Med. 76: 75 - 76 (1998); Kronenwett y col., Blood

91: 852 - 862 (1998); Rajur y col., Bioconjug. Chem. 8: 935 - 940 (1997); Lavigne y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 566 - 571 (1997) y en Aoki y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 540 -545 (1997). La

45 administración de los polinucleótidos de la presente invención también puede realizarse a sujetos, incluyendo mamíferos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser administrados a tejidos de mamífero.

[0097] Los polinucleótidos de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas,

50 ADNzimas, moléculas de ARNic que incluyen ARNph y oligonucleótidos formadores de hélices triples, para regular por disminución la expresión o la actividad de una o más oxidasas de lisilo.

[0098] Polinucleótidos antisentido

55 [0099] Según un aspecto, la regulación por disminución de los niveles o de la actividad de la LOX o de las LOXL puede efectuarse usando un polinucleótido antisentido capaz de hibridar específicamente con un transcrito de ARNm que codifica para la LOX o las LOXL, tal como la LOXL2.

[0100] El diseño de moléculas antisentido que pueden usarse para regular eficazmente por disminución la LOX o la LOXL2 se realiza típicamente teniendo en consideración dos factores o aspectos usados en la metodología antisentido. El primer aspecto es la administración del oligonucleótido en el citoplasma de las células apropiadas, mientras que el segundo aspecto es el diseño de un oligonucleótido que se una específicamente al ARNm designado dentro de las células de una forma tal que inhiba la traducción del mismo.

5 [0101] Típicamente se tienen en cuenta varias consideraciones cuando se diseñan oligonucleótidos antisentido. Para una inhibición in vivo eficaz de la expresión génica usando oligonucleótidos antisentido o análogos, los oligonucleótidos o los análogos típicamente cumplen los siguientes requisitos (i) especificidad suficiente en la unión a la secuencia objetivo; (ii) solubilidad en agua; (iii) estabilidad frente a las nucleasas intra y extracelulares; (iv)

10 capacidad de penetración a través de la membrana celular; y (v) cuando se usa para tratar un organismo, baja toxicidad. Hay disponibles algoritmos para identificar aquellas secuencias con la mayor afinidad de unión predicha por el ARNm objetivo basándose en un ciclo termodinámico que tiene en cuenta la energía de alteraciones estructurales tanto en el ARNm objetivo como en el oligonucleótido, por ejemplo, según se describe en Walton y col. Biotechnol Bioeng 65: 1 - 9 (1999).

15 [0102] Dichos algoritmos se han usado con éxito para implementar una metodología antisentido en células. Por ejemplo, el algoritmo desarrollado por Walton y col. permitió a los científicos diseñar con éxito oligonucleótidos antisentido para la globina de conejo (RBG) y transcritos del factor de necrosis tumoral a de ratón (TNF a). El mismo grupo de investigación también ha informado de que la actividad antisentido de oligonucleótidos elegidos

20 racionalmente contra tres modelos de ARNm objetivo (deshidrogenasa de lactato humana A y B y gp130 de rata) en un cultivo celular, según se evaluó mediante una técnica de PCR cinética, demostró ser eficaz en prácticamente todos los casos, incluyendo los ensayos frente a tres objetivos diferentes en dos tipos celulares con químicas de oligonucleótidos de fosfodiester y fosforotioato.

25 [0103] Además, también se han publicado varias metodologías para el diseño y la predicción eficientes de oligonucleótido específicos usando un sistema in vitro (Matveeva y col., Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)).

[0104] Una molécula antisentido que puede ser usada con la presente divulgación incluye un polinucleótido o un

30 análogo de polinucleótido con al menos 10 bases, por ejemplo, entre 10 y 15, entre 15 y 20 bases, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 22, al menos 25, al menos 30, o incluso al menos 40 bases, que es hibridable in vivo, en condiciones fisiológicas, con una porción de una hebra de un polinucleótido que codifica para un polipéptido homólogo en al menos el 50% de la SEQ ID NO: 1, 4, 5 ó 7, u homólogo en al menos el 75% de una porción N terminal de las mismas, según se determina mediante el uso del programa informático BestFit del paquete

35 de análisis de secuencias Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, en el que la penalización por la creación de gap es igual a 8 y la penalización por la extensión de gap es igual a 2.

[0105] Los oligonucleótidos antisentido usados por la presente divulgación pueden ser expresados a partir de un constructo de ácido nucleico administrado en el tejido, en cuyo caso pueden usarse promotores inducibles, de forma

40 que la expresión antisentido pueda ser activada y desactivada, o alternativamente, dichos oligonucleótidos pueden ser sintetizados químicamente y administrados directamente en el tejido, por ejemplo, como parte de una composición farmacéutica.

[0106] La capacidad de sintetizar químicamente oligonucleótidos y análogos de los mismos con una secuencia

45 predeterminada seleccionada ofrece un medio para modular por disminución la expresión génica. Pueden considerarse cuatro tipos de estrategias de modulación de la expresión génica.

[0107] Al nivel de la transcripción, los oligonucleótidos antisentido o sentido, o los análogos que se unen al ADN genómico mediante un desplazamiento de hebra o la formación de una hélice triple, pueden evitar la transcripción. Al 50 nivel del transcrito, los oligonucleótidos antisentido o los análogos que se unen a las moléculas de ARNm objetivo, conducen a la escisión enzimática del híbrido mediante una ARNasa H intracelular. En este caso, mediante la hibridación al ARNm objetivo, los oligonucleótidos o los análogos de oligonucleótidos proporcionan un híbrido dúplex reconocido y destruido por la enzima ARNasa H. Alternativamente, dicha formación del híbrido puede conducir a una interferencia en el correcto corte y empalme. Como resultado, en ambos casos, el número de transcritos del ARNm

55 objetivo intactos listos para su traducción se reduce o se elimina.

[0108] Al nivel de la traducción, los oligonucleótidos antisentido o los análogos que se unen a las moléculas de ARNm objetivo evitan, mediante impedimentos estéricos, la unión de factores de traducción esenciales (ribosomas), al ARNm objetivo, un fenómeno conocido en la técnica como detención de la hibridación, inactivando la traducción de dichos ARNm.

[0109] Los oligonucleótidos no modificados no son típicamente prácticos para su uso como secuencias antisentido ya que tienen unas semividas in vivo cortas, durante las que son degradadas rápidamente por las

5 nucleasas. Adicionalmente, a menudo son difíciles de preparar en cantidades mayores de miligramos. Además, dichos oligonucleótidos son habitualmente unos malos penetrantes de la membrana celular. Por lo tanto, habitualmente se conciben análogos de oligonucleótidos de una forma adecuada.

[0110] Por ejemplo, los problemas que surgen en relación con el reconocimiento del ADN bicatenario (ADNbc) a

10 través de la formación de la hélice triple han sido disminuidos mediante una inteligente unión química de "conmutación inversa", mediante lo que es reconocida una secuencia de polipurina en una hebra, y mediante la "conmutación inversa," puede reconocerse una secuencia de homopurina en la otra hebra. También se ha obtenido una buena formación de hélices mediante el uso de bases artificiales, mejorando así las condiciones de unión con respecto a la fuerza iónica y el pH.

15 [0111] También pueden usarse oligonucleótidos de ARN para la inhibición antisentido, ya que forman un dúplex de ARN-ARN estable con el objetivo, lo que sugiere una inhibición eficiente. Sin embargo, debido a su baja estabilidad, los oligonucleótidos de ARN se expresan típicamente dentro de las células usando vectores diseñados para este fin. Esta metodología puede usarse cuando se intenta dirigirse a un ARNm que codifica para una proteína abundante y

20 de vida larga.

[0112] Los terapéuticos antisentido pueden usarse para tratar otras enfermedades potencialmente mortales con varias ventajas sobre los fármacos tradicionales. Típicamente, los fármacos tradicionales intervienen después de la formación de una proteína que provoca la enfermedad. Los terapéuticos antisentido, sin embargo, pueden bloquear

25 la transcripción/traducción del ARNm e intervenir antes de que se forme la proteína, y dado que los terapéuticos antisentido solo se dirigen a un ARNm específico, puede ser más eficaces con menores efectos secundarios que la actual terapia de inhibición de proteínas.

[0113] Numerosos estudios clínicos han demostrado la seguridad, la viabilidad y la actividad de los

30 oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, se han usado con éxito oligonucleótidos antisentido adecuados para el tratamiento del cáncer (Holmund y col., Curr. Opin. Mol. Ther. 1: 372 - 385 (1999)), mientras que el tratamiento de cánceres hematológicos mediante oligonucleótidos antisentido que se dirigen al gen c-myb, p53 y Bcl-2 ha entrado en ensayos clínicos y ha demostrado ser tolerado por los pacientes (Gerwitz, Curr. Opin. Mol. Ther. 1: 297 - 306 (1999)).

35 [0114] Más recientemente se ha informado de que la supresión mediada por antisentido de la expresión génica el gen de la heparanasa humana inhibe la diseminación pleural de las células de cáncer humanas en un modelo de ratón (Uno y col., Cancer Res 61: 7855 - 60 (2001)).

40 [0115] El primer fármaco antisentido ha sido recientemente aprobado por la FDA. El fármaco, Fomivirsen, ha sido desarrollado por Isis, y está indicado para el tratamiento local de citomegalovirus en pacientes con SIDA que son intolerantes o que tienen una contraindicación para otros tratamientos para la retinitis por CMV o que no respondían lo suficiente a tratamientos previos para la retinitis por CMV (Pharmacotherapy News Network).

45 [0116] Por lo tanto, el consenso actual es que los recientes desarrollos en el campo de la tecnología antisentido que, según se ha descrito anteriormente, han conducido a la generación de algoritmos de diseño antisentido muy precisos y de una gran diversidad de sistemas de administración de oligonucleótidos, permiten que un artesano experto diseñe e implemente de forma ordinaria metodologías antisentido adecuadas para la regulación por disminución de la expresión de secuencias conocidas sin tener que recurrir a una experimentación de ensayo y error

50 indebida.

[0117] Ribozima

[0118] Otro agente capaz de regular por disminución la oxidasa de lisilo es una molécula de ribozima capaz de

55 escindir específicamente un transcrito de ARNm que codifica para una LOX o para unas LOXL. Las ribozimas están siendo cada vez más usadas para la inhibición específica de secuencia de la expresión génica mediante la escisión de los ARNm que codifican para las proteínas de interés (Welch y col., Curr. Opin. Biotechnol. 9: 486 - 496 (1998)). La posibilidad de diseñar ribozimas para escindir cualquier ARN objetivo específico las ha convertido en valiosas herramientas tanto en la investigación básica como en aplicaciones terapéuticas. En el área terapéutica, se han

explotado las ribozimas para dirigirlas contra ARN víricos en enfermedades infecciosas, oncogenes dominantes en cánceres y mutaciones somáticas específicas en trastornos genéticos (Welch y col., Clin. Diagn. Virol. 10: 163 - 171 (1998)). Lo más notable es que ya hay varios protocolos de terapia génica con ribozimas para pacientes con VIH en ensayos de Fase 1. Más recientemente se han usado las ribozimas para la investigación con animales transgénicos, 5 la validación de objetivos genéricos y la elucidación de vías. Existen varias ribozimas en diversas etapas de ensayos clínicos. ANGIOZYME fue la primera ribozima sintetizada químicamente que se estudió en ensayos clínicos con seres humanos. ANGIOZYME inhibe específicamente la formación del VEGF-r (receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular), un componente clave en la vía de la angiogénesis. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., así como otras compañías, han demostrado la importancia de la terapéutica antiangiogénesis en modelos animales.

10 HEPTAZYME, una ribozima diseñada para destruir selectivamente el ARN del virus de la Hepatitis C (HCV), se encontró eficaz para disminuir el ARN vírico de la Hepatitis C en ensayos con cultivos celulares (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.).

[0119] ADNzima

15 [0120] Otro agente capaz de regular por disminución una oxidasa de lisilo es una molécula de ADNzima capaz de escindir específicamente un transcrito de ARNm o una secuencia de ADN de la LOX o de una LOXL. Las ADNzimas son polinucleótidos monocatenarios que son capaces de escindir secuencias objetivo tanto monocatenarias como bicatenarias (Breaker y Joyce, Chemistry and Biology, 2: 655 - 660 (1995); Santoro y Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci.

20 EE.UU., 943: 4262 - 4266 (1997)). Se ha propuesto un modelo general (el modelo "10 - 23") para la ADNzima. Las ADNzimas "10 - 23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueado por dos dominios de reconocimiento de sustrato con entre siete y nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de ADNzima puede escindir eficazmente ARN de sustrato en uniones de purina:pirimidina (Santoro y Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 943: 4262 - 4266 (1997); Khachigian, Curr. Opin. Mol. Ther. 4: 119 - 121 (2002)).

25 [0121] Algunos ejemplos de construcción y amplificación de ADNzimas sintéticas diseñadas genéticamente que reconocen sitios de escisión objetivo mono y bicatenarios se han desvelado en la Patente de EE.UU. Nº 6.326.174. Recientemente se observó que las ADNzimas con un diseño similar dirigidas contra el receptor de la Urocinasa humano inhiben la expresión del receptor de la Urocinasa, e inhiben con éxito la metástasis de células de cáncer de

30 colon in vivo (Itoh y col., 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am. Soc. Gen. Ther. www.as-gt.org). En otra aplicación, las ADNzimas complementarias de los oncogenes bcr-ab1 tuvieron éxito en la inhibición de la expresión de los oncogenes en células de leucemia, y en la disminución de las tasas de recaídas en trasplantes autólogos de médula ósea en casos de CML y ALL.

35 [0122] ARNic

[0123] Otro mecanismo de regulación por disminución de una oxidasa de lisilo al nivel del transcrito es la interferencia del ARN (ARNi), una metodología que utiliza pequeñas moléculas de ARNbc interferentes (ARNic o ARN pequeño en horquilla, ARNph) que son homólogas del ARNm objetivo y conducen a su degradación (Carthew,

40 Curr. Opin. Cell. Biol. 13: 244 - 248 (2001)). Por ejemplo, la infección de diversos tipos de células cancerosas con la expresión de un ARNph específico para una LOXL2 es eficaz para alterar tanto su morfología como su invasividad (Ejemplo 1).

[0124] La interferencia con ARN es típicamente un proceso en dos etapas. En la primera etapa, que se denomina

45 etapa de inicio, se digiere el ARNbc introducido en pequeños ARN interferentes (ARNic) de 21 - 23 nucleótidos (nt), probablemente mediante la acción de Dicer, un miembro de la familia de la ARNasa III de ribonucleasas específicas de ARNbc, que procesa (escinde) el ARNbc (introducido directamente o a través de un transgen o un virus) de una forma dependiente del ATP. Sucesivos episodios de escisión degradan el ARN a dúplex de 19 - 21 pb (ARNic), cada uno con salientes de 2 nucleótidos en 3’ (Hutvagner y Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225 - 232 (2002);

50 Bernstein, Nature 409: 363 - 366 (2001)).

[0125] En la etapa efectora, los dúplex de ARNic se unen a un complejo de nucleasa para formar el complejo silenciador inducido por complejo ARN (RISC). Se requiere desenrollar el dúplex de ARNic dependiente de ATP para la activación del RISC. Entonces el RISC activo se dirige al transcrito homólogo mediante las interacciones de

55 apareamiento de bases y típicamente escinde el ARNm en aproximadamente 12 fragmentos de nucleótidos desde el 3’ terminal del ARNic (Hutvagner y Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225 - 232 (2002); Hammond y col., Nat. Rev. Gen. 2: 110 - 119 (2001); Sharp, Genes. Dev. 15: 485 - 490 (2001)). Aunque el mecanismo de escisión todavía está por elucidar, la investigación indica que cada RISC contiene un ARNic individual y una ARNasa (Hutvagner y Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225 - 232 (2002)).

[0126] Debido a la notable potencia del ARNi, se ha sugerido una etapa de amplificación en la vía del ARNi. La amplificación podría producirse mediante el copiado de los ARNbc introducidos, que generarían más ARNic, o mediante la replicación de los ARNic formados. Alternativamente o adicionalmente, la amplificación podría realizarse

5 mediante múltiples episodios de recambio del RISC (Hutvagner y Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225 - 232 (2002); Hammond y col., Nat. Rev. Gen. 2: 110 - 119 (2001); Sharp, Genes. Dev. 15: 485 - 490 (2001)). El ARNi también se describe en Tuschl, Chem. Biochem. 2: 239 - 245 (2001); Cullen, Nat. Immunol. 3: 597 - 599 (2002); y en Brantl, Biochem. Biophys. Act. 1575: 15 - 25 (2002).

10 [0127] La síntesis de moléculas de ARNi adecuadas para su uso con la presente divulgación puede efectuarse como sigue. En primer lugar se escanea la secuencia del ARNm de la LOX o de las LOXL secuencia abajo del codón de inicio AUG de las secuencias de dinucleótidos AA. La aparición de cada AA y de los 19 nucleótidos en 3’ adyacentes se registra como potenciales sitios objetivo del ARNic. Los sitios objetivo del ARNic se eligen de entre el marco abierto de lectura, ya que las regiones no traducidas (UTRs) son más ricas en sitios de unión de la proteína

15 reguladora. Las proteínas de unión a las UTR y/o los complejos de inicio de la traducción pueden interferir con la unión del complejo ARNic-endonucleasa (Tuschl, Chem. Biochem. 2: 239 - 245 (2001)). Se apreciará por tanto que los ARNic dirigidos a regiones no traducidas también pueden ser eficaces, como se demostró para la GAPDH, en el que el ARNic dirigido al UTR en 5’ medió en una disminución de aproximadamente el 90% del ARNm de la GAPDH celular y abolió completamente el nivel de la proteína (www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html). En segundo lugar,

20 los potenciales sitios objetivo se comparan con una base de datos genómica apropiada (por ejemplo, humana, de ratón, de rata, etc.) usando cualquier programa informático de alineación de secuencia, tal como el programa informático BLAST disponible en el servidor del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Se filtran los posibles sitios objetivo que muestran una homología significativa con otras secuencias codificantes.

25 [0128] Las secuencias objetivo admisibles se eligen como molde para la síntesis del ARNic. Las secuencias elegidas pueden incluir aquellas con un bajo contenido en G/C, ya que éstas han mostrado ser más eficaces en la mediación del silenciamiento génico en comparación con aquellas con un contenido de G/C mayor del 55%. Pueden elegirse varios sitios objetivo a lo largo de la longitud del gen objetivo para su evaluación. Para una mejor evaluación de los ARNic elegidos, se usa conjuntamente un control negativo. Los ARNic de control negativo pueden incluir la

30 misma composición de nucleótidos que los ARNic pero carecen de una homología significativa con el genoma. Por lo tanto, puede usarse una secuencia de nucleótidos desordenados del ARNic, siempre que no muestre ninguna homología significativa con cualquier otro gen.

[0129] Las moléculas de ARNic de la presente divulgación pueden ser transcritas a partir de vectores de

35 expresión que puedan facilitar la expresión estable de los transcritos del ARNic una vez introducidos en una célula hospedadora. Estas vectores están diseñados para expresar ARNph, que son procesados in vivo en moléculas de ARNic capaces de llevar a cabo el silenciamiento específico de genes (Brummelkamp y col., Science 296: 550 - 553 (2002); Paddison y col., Genes Dev. 16: 948 - 958 (2002); Paul y col., Nature Biotech. 20: 505 - 508 (2002); Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 99: 6047 - 6052(2002)).

40 [0130] Los ARNph son polinucleótidos monocatenarios con una estructura de bucle en horquilla. El polinucleótido monocatenario tiene un segmento de bucle que une el extremo 3’ de una hebra de la región bicatenaria y el extremo 5’ de la otra hebra de la región bicatenaria. La región bicatenaria está formada por una primera secuencia que es hibridable con una secuencia objetivo, tal como un polinucleótido que codifica para la LOXL2, o un ARNm de la

45 LOXL2, y una segunda secuencia que es complementaria de la primera secuencia, por lo que la primera y la segunda secuencia forman una región bicatenaria en la que la secuencia de conexión conecta los extremos para formar una estructura de bucle en horquilla. La primera secuencia puede ser hibridable con cualquier porción de un polinucleótido que codifica para la LOXL2. El dominio bicatenario del tallo del ARNph comprende un sitio de una endonucleasa de restricción.

50 [0131] La estructura en horquilla de los ARNph puede tener salientes de nucleótidos opcionales, tales como salientes de 2 pb, por ejemplo, salientes en 3’ de UU. Aunque puede haber variaciones, los tallos típicamente varían desde aproximadamente 15 hasta 49, aproximadamente 15 hasta 35, aproximadamente 19 hasta 35, aproximadamente 21 hasta 31 pb, o aproximadamente 21 hasta 29 pb, y los bucles pueden variar desde

55 aproximadamente 4 hasta 3 0 pb, por ejemplo, aproximadamente 4 hasta 23 pb.

[0132] Para la expresión de los ARMph dentro de las células pueden emplearse vectores de plásmidos que contienen el ARN de la polimerasa III H1 o del promotor U6, un sitio de clonación para el inserto de ARN en horquilla, y una región de terminación de la transcripción de 4 5 - timidina. Los promotores de la Polimerasa III tienen generalmente unos sitios de inicio y de detención bien definidos, y sus transcritos carecen de colas poli(A). La señal de terminación para estos promotores está definida por un cordón de politimidina, y los transcritos son escindidos típicamente después de la segunda uridina. La escisión en esta posición genera un saliente en 3’ de UU en el ARNph expresado, que es similar a los salientes en 3’ de los ARNic sintéticos. Algunos procedimientos adicionales

5 para expresar el ARNph en células de mamífero se describen en las referencias citadas anteriormente.

[0133] Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es el pSUPER™, que incluye el gen promotor del H1-ARN de la polimerasa III con un inicio de la transcripción y una señal de terminación bien definidos, que consisten en cinco timidinas en una fila (T5) (Brummelkamp y col., Science 296: 550 - 553 (2002)). La escisión del transcrito en el 10 sitio de terminación es en un sitio que sigue a la segunda uridina, produciendo así un transcrito que se parece a los extremos de los ARNic sintéticos, que también contienen salientes de nucleótidos. El ARNic se clona de forma que incluya la secuencia de interés, es decir, LOX o LOXL, separada por un corto separador a partir del complemento inverso de la misma secuencia. El transcrito resultante se pliega sobre sí mismo hasta formar una estructura en horquilla, que media en el ARNi de la LOX o de las LOXL. Por ejemplo, las secuencias que comprenden una 15 secuencia de ADN que codifica para el ARNph de la LOXL2, tal como la SEQ ID NO: 20, (sh.LOXL2.197 o si - 197),

o la SEQ ID NO: 21(sh.LOXL2.195, o si - 195) puede mediar en el ARNi de la LOXL2. Las secuencias que median en el ARNi de LOXL2 también pueden comprender las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, o porciones de las mismas.

[0134] Otro vector de expresión adecuado para el ARNic codifica el ARNic sentido y antisentido bajo la regulación

20 de promotores polIII individuales (Miyagishi y Taira, Nature Biotech. 20: 497 - 500 (2002)). El ARNic generado por este vector también incluye una señal de terminación de cinco timidinas (T5).

[0135] Dado que las metodologías para introducir ARNic sintético en células mediante lipofección pueden dar como resultado una baja eficacia de transfección en algunos tipos celulares y/o una persistencia a corto plazo de los

25 efectos del silenciamiento, se han desarrollado procedimientos mediados por vectores.

[0136] Por lo tanto, las moléculas de ARNic utilizadas por la presente divulgación pueden ser administradas a células usando retrovirus. La administración de ARNic usando retrovirus proporciona numerosas ventajas sobre procedimientos tales como la lipofección, dado que la administración mediante retrovirus es típicamente más eficaz,

30 uniforme y selecciona inmediatamente las células "bloqueadas (knock-down)" estables (Devroe y Silver, BMC Biotechnol. 2: 15 (2002)).

[0137] Publicaciones científicas recientes han validado la eficacia de dichas moléculas bicatenarias cortas de ARN para inhibir la expresión del ARNm objetivo, y por lo tanto han demostrado claramente el potencial terapéutico de

35 dichas moléculas. Por ejemplo, se ha utilizado el ARNi para inhibir la expresión de células de hepatitis C (McCaffrey y col., Nature 418: 38 - 39 (2002)), de VIH - 1 (Jacque y col., Nature 418: 435 - 438 (2002)), de células de cáncer de cuello de útero (Jiang y Milner, Oncogene 21: 6041 - 6048 (2002)) y de células de leucemia (Wilda y col., Oncogene 21, 5716 - 5724 (2002)).

40 [0138] Oligonucleótidos formadores de hélices triples (TFO)

[0139] Un procedimiento adicional para regular la expresión de la LOX o de las LOXL en células es a través de oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO). Estudios recientes han demostrado que los TFO pueden ser diseñados para que reconozcan y se unan a regiones de polipurina/polipirimidina en la hélice de ADN bicatenario de una forma 45 específica de secuencia. Estas normas de reconocimiento son esquematizadas por Maher III y col., Science 245:

725: 730 (1989); Moser y col., Science 238: 645: 630 (1987); Beal y col., Science 251: 1360: 1363 (1992); Cooney y col., Science 241: 456: 459 (1988); y Hogan y col., Publicación EP375408. La modificación de los oligonucleótidos, tal como la introducción de intercalantes y sustituciones de esqueleto, y la optimización de las condiciones de unión (pH y concentración de cationes) han ayudado a superar los obstáculos inherentes a la actividad de los TFO tales

50 como la repulsión de cargas y la inestabilidad, y recientemente se demostró que los oligonucleótidos sintéticos pueden ser dirigidos a secuencias específicas (Seidman y Glazer, J. Clin. Invest. 112: 487: 494 (2003)).

[0140] En general, el oligonucleótido formador de tríplex tiene la correspondencia de secuencia: [0141] Sin embargo, se ha demostrado que los tripletes A-AT y G-GC tienen la mayor estabilidad en triple hélice (Reither y Jeltsch, BMC Biochem, 12 de setiembre de 2002, Epub). Los mismos autores demostraron que los TFO diseñados según la norma A-AT y G-GC no forman tríplex no específicos, lo que indica que la formación de tríplex es

oligo

3’--A G G T

dúplex

5’--A G C T

dúplex

3’--T C G A

5 específica de secuencia.

[0142] Por lo tanto, para cualquier secuencia dada en la región reguladora de la LOX o de las LOXL, puede contemplarse una secuencia formadora de tríplex. Los oligonucleótidos formadores de tríplex puedan tener al menos 15, 25, 30 o más nucleótidos de longitud. También pueden tener hasta 50 ó 100 pb.

10 [0143] La transfección de células (por ejemplo, a través de liposomas catiónicos) con TFO, y la formación de la estructura en triple hélice con el ADN objetivo, induce cambios estéricos y funcionales, bloqueando el inicio de la transcripción y la elongación, permitiendo la introducción de los cambios de secuencia deseados en el ADN endógeno y dando como resultado la regulación específica por disminución de la expresión génica. Algunos

15 ejemplos de dicha supresión de la expresión génica en las células tratadas con TFO incluyen la inactivación de los genes supFG1 episomales y HPRT endógenos en células de mamífero (Vasquez y col., Nucl Acids Res. 27: 1176 1181 (1999); Puri y col., J Biol. Chem. 276: 28991 -28998 (2001)), y la regulación por disminución específica de secuencia y de objetivo de la expresión del factor de transcripción Ets2, importante en la etiología del cáncer de próstata (Carbone y col., Nucl. Acid Res. 31: 833 - 843 (2003)), y del gen proinflamatorio ICAM-1 (Besch y col., J.

20 Biol. Chem. 277: 32473 - 32479 (2002)). Además, Vuyisich y Beal han demostrado que las TFO específicas de secuencia pueden unirse al ARNbc, inhibiendo la actividad de las enzimas dependientes del ARNbc, tales como las cinasas dependientes de ARN (Vuyisich y Beal, Nuc. Acids Res. 28: 2369 - 2374 (2000)).

[0144] Adicionalmente, los TFO diseñados según los principios mencionados anteriormente pueden incluir una

25 mutagénesis dirigida capaz de efectuar la reparación del ADN, proporcionando así tanto una regulación por disminución como una regulación por incremento de la expresión de los genes endógenos (Seidman y Glazer, J. Clin. Invest. 112: 487 - 494 (2003)). Puede encontrarse una descripción detallada del diseño, la síntesis y la administración de TFO eficaces en las Solicitudes de Patente de EE.UU. Nos 2003/017068 y 2003/0096980 a favor de Froehler y col, y 2002 0128218 y 2002 0123476 a favor de Emanuele y col., y en la patente de EE.UU. Nº

30 5.721.138 a favor de Lawn.

[0145] Los reguladores por disminución descritos anteriormente son útiles para inhibir la angiogénesis en tejido tumoral. Se ha demostrado que la PF4, una proteína de unión a la oxidasa de lisilo que inhibe la angiogénesis en tejido tumoral, se acumula específicamente en los vasos sanguíneos recién formados de los tumores (vasos 35 angiogénicos) pero no en los vasos sanguíneos ya establecidos (Hansell y col., Amer. J. Physiol-Heart. Circ. Phy.

38: H829 - H836 (1995); Reiser y col., FASEB J. 6: 2439 - 2449 (1992)).

[0146] Los vasos sanguíneos angiogénicos recién formados son típicamente más permeables a las proteínas que los vasos sanguíneos ya establecidos, porque el principal inductor de la angiogénesis en muchas enfermedades 40 angiogénicas es el VEGF, un factor de crecimiento que también funciona como un potente factor permeabilizante de los vasos sanguíneos (VPF) (Neufeld y col., FASEB J. 13: 9 - 22 (1999)). Los vasos sanguíneos asociados al tumor están por lo tanto típicamente en un estado permanente de hiperpermeabilidad debido a la desregulación de la sobreexpresión del VEGF, y como tales, una molécula reguladora por disminución usada mediante el procedimiento de la presente divulgación, podría extravasarse eficazmente de los vasos sanguíneos tumorales pero mucho menos

45 eficazmente de los vasos sanguíneos estabilizados normales.

[0147] Reguladores por incremento

[0148] Pueden utilizarse numerosas metodologías para aumentar los niveles de la LOX o de las LOXL, y mejorar 50 por tanto la formación de los vasos sanguíneos.

[0149] Por ejemplo, puede administrarse un constructo de un ácido nucleico que incluya un promotor constitutivo e inducible, o específico del tejido, posicionado secuencia arriba de un polinucleótido que codifica para un polipéptido con actividad de LOX o de LOXL, tal como el polipéptido establecido en las SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ó 9, en un tejido

55 de mamífero. La LOX o las LOXL expresadas a partir de este constructo podrían aumentar sustancialmente los niveles de la LOX o de las LOXL dentro de las células del tejido, y por lo tanto mejorar la angiogénesis.

[0150] Los segmentos del polinucleótido que codifican para la LOX o las LOXL pueden ligarse en un vector de expresión disponible comercialmente. Dicho vector de expresión incluye una secuencia promotora para dirigir la

transcripción de la secuencia del polinucleótido en la célula de una forma constitutiva o inducible. Un promotor adecuado puede ser, por ejemplo, un promotor Tie-2, que es capaz de dirigir la expresión génica específica de la oxidasa de lisilo en células endoteliales (véase Schlaeger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 3058 - 3063 (1997)). El vector de expresión de la presente divulgación puede incluir además secuencias de polinucleótidos 5 adicionales tales como, por ejemplo, secuencias que codifican para marcadores de selección o polipéptidos indicadores, para secuencias que codifican orígenes de replicación en bacterias, para secuencias que permiten la traducción de varias proteínas a partir de un único ARNm, tal como un sitio de entrada ribosomal interna (IRES), para secuencias para la interacción genómica del polipéptido quimérico promotor que codifica para la región y/o las secuencias incluidas generalmente en un vector de expresión de mamífero, tales como pADNc3, pADNc3.1(+/-),

10 pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que están disponibles en Invitrogen, pCI que está disponible en Promega, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles en Strategene, pTRES que está disponible en Clontech, y sus derivados.

[0151] Se apreciará que dichos sistemas de vector disponibles comercialmente pueden ser fácilmente modificados 15 a través de las técnicas recombinantes usadas habitualmente con objeto de sustituir, duplicar o mutar secuencias promotoras o potenciadoras y/o de introducir cualquier secuencia de polinucleótidos adicional.

[0152] Un agente capaz de regular por incremento una LOX o unas LOXL también puede ser cualquier compuesto que sea capaz de aumentar la transcripción y/o la traducción de un ADN o de un ARNm endógeno que codifica para 20 una LOX o unas LOXL usando, por ejemplo, técnicas de "inserción (knock-in)"de genes.

[0153] Los elementos potenciadores pueden ser "insertados" adyacentes a las secuencias codificantes de la oxidasa de lisilo endógena para aumentar así la transcripción a partir de las mismas.

25 [0154] Los detalles adicionales relativos a la construcción y el uso de constructos bloqueados(knock-out) e insertados (knock-in) se proporcionan en otro lugar (Fukushige y Ikeda, ADN Res. 3: 73 - 80 (1996); Bedell y col., Genes Dev. 11: 1 - 11 (1997); Bermingham y col., Genes Dev. 10: 1751 - 1762 (1996)).

[0155] Se apreciará que la administración directa de un polipéptido que muestra una actividad de LOX o de LOXL 30 también puede utilizarse para mejorar la angiogénesis.

[0156] Por lo tanto, pueden usarse ensayos de afinidad de unión y/o ensayos de actividad, cuyos principios son bien conocidos en la técnica, para cribar nuevos compuestos (por ejemplo, análogos de sustrato) que puedan regular específicamente la actividad de una oxidasa de lisilo, y como tales, puedan ser usados con la presente

35 invención.

[0157] Un ensayo adecuado para el uso con este aspecto de la presente divulgación se ha descrito previamente en un estudio realizado por Bedell-Hogan y col., J Biol Chem. 268: 10345 - 10350 (1993).

40 [0158] Administración

[0159] Estudios previos correlacionaron los niveles de expresión de la LOXL2 con las propiedades metástasicas de las líneas celulares derivadas del cáncer de mama, indicando que la LOXL2 puede jugar papeles adicionales en la invasividad tumoral, además su papel en la angiogénesis.

45 [0160] Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la metástasis y/o la fibrosis en un tejido de mamífero usando las composiciones descritas en este documento. El procedimiento se efectúa mediante la administración al tejido de mamífero de una molécula capaz de regular por disminución del nivel tisular y/o la actividad de al menos un tipo de una oxidasa de lisilo, tal como el ARNph desvelado en este documento.

50 [0161] El procedimiento de la presente divulgación puede usarse para tratar pacientes humanos que han sido diagnosticados de tumores cancerosos, mediante la administración de cualquiera de las moléculas reguladoras por disminución descritas en este documento anteriormente, con objeto de reducir el nivel tisular y/o la actividad de al menos un tipo de una oxidasa de lisilo.

55 [0162] Según se usa en este documento, la frase "tumor canceroso" se refiere a cualquier tumor maligno dentro del cuerpo humano, incluyendo, pero no limitándose a, tumores con metástasis. Además, y sin querer ceñirnos a ningún tipo de tumor canceroso en particular, la presente divulgación es útil para tratar tumores de cáncer de mama, con o sin metástasis.

[0163] Según se usa en este documento, la frase "administrar" se refiere a todos los modo de administración descritos en este documento a continuación con respecto a las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La administración también se refiere a todos los modos de administración descritos en este documento a 5 continuación con respecto a cualquier agente, incluyendo los polinucleótidos de la presente invención, para un efecto terapéutico. La administración puede ser de una cantidad eficaz para que tenga un efecto terapéutico. El efecto terapéutico puede ser tratar o inhibir una dolencia o un trastorno, tal como tumores cancerosos, primarios o metastásicos, PAP, así como trastornos o dolencias asociadas con fibrosis, y/o angiogénesis. Una cantidad adecuada según se usa en este documento se refiere a la cantidad o dosis de esa composición, tal como un agente,

10 incluyendo los polinucleótidos de la presente invención, que se requiere para inducir un efecto deseado. Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica, o de un agente, tal como un polinucleótido, se entiende que es una cantidad no tóxica pero suficiente del agente o de la composición, para proporcionar el efecto deseado, es decir, inhibir, prevenir o revertir el inicio o el curso progresivo de un cáncer, primario o metastásico, de la PAP, de una inflamación y/o de dolencias o trastornos relacionados con la fibrosis o la angiogénesis.

15 [0164] La administración incluye, pero no se limita a, la administración local en el tejido tumoral, en un órgano en el que se ha diagnosticado el tumor canceroso y/o en tejido relacionados que típicamente forman metástasis (Hortobagyi, Semin. Oncol. 29: 134 - 144 (2002); Morrow y Gradishar, BMJ324: 410 - 414 (2002)). Algunos ejemplos de tejido relacionado incluyen los nódulos linfáticos adyacentes, por ejemplo, al tejido mamario y a los huesos.

20 [0165] La administración también puede efectuarse de una forma sistémica con objeto de tratar el tejido afectado, es decir, el tejido en el que se ha formado el tumor canceroso y en el que hay presentes metástasis o es probable que se formen con la progresión del tumor. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones descritas en este documento, en las que la cantidad no es tóxica pero es suficiente para proporcionar

25 el efecto deseado, es decir, inhibir, prevenir o revertir el inicio o el curso progresivo de una dolencia aquí descrita, incluyendo la formación o el crecimiento de tumores primarios, de metástasis, de fibrosis, de angiogénesis y de PAP.

[0166] Dado que cualquier molécula capaz de regular por disminución la actividad de una oxidasa de lisilo puede ser utilizada por los procedimientos descritos anteriormente, la presente divulgación también proporciona un 30 procedimiento para identificar moléculas capaces de inhibir la metástasis y/o la fibrosis.

[0167] Este procedimiento se efectúa mediante el cribado y la identificación de moléculas que muestran una reactividad específica con al menos un tipo de oxidasa de lisilo y el ensayo del potencial inhibidor de la metástasis y/o de la fibrosis de estas moléculas.

35 [0168] Pueden cribarse numerosos tipos de moléculas para comprobar su reactividad con al menos un tipo de oxidasa de lisilo, algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como oligonucleótidos antisentido, ARNic, ADNzimas, ribozimas y oligonucleótidos formadores de hélice triple (TFO) que interactúan con un polinucleótido que expresa una actividad de oxidasa de lisilo, o moléculas tales como anticuerpos que interactúan

40 con polipéptidos con una actividad de oxidasa de lisilo. Además, también pueden cribarse péptidos cortos y otras moléculas pequeñas mediante este procedimiento, y usarse en las composiciones y en los procedimientos de tratamiento desvelados en este documento.

[0169] El cribado de reactividad cruzada puede efectuarse mediante ensayos de la actividad enzimática de la 45 oxidasa de lisilo, mediante ensayos de unión, y similares. Algunos ejemplos de ensayos adecuados se proporcionan en Rodríguez y col., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22: 1409 - 1414 (2002); Wilson y Nock, Curr. Opin. Chem. Biol.

6: 81 - 85 (2002); Uetz, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 57 - 62 (2002); Stoll y col., Front Biosci. 7: c13 - 32 (2002)).

[0170] El ensayo de un fenotipo metastásico de células tumorales transformadas puede realizarse in vitro dado

50 que prácticamente todas las etapas del proceso metastásico, incluyendo la unión, la degradación y la migración de la matriz, pueden modelarse in vitro mediante la medición de la invasión de una membrana basal reconstituida (reconstituted basement membrane, RBM). La invasividad metastásica de la célula tumoral puede ser modelada mediante la migración de las células tumorales en membrana basal reconstituida (RBM) en presencia y en ausencia de un factor quimiotáctico, tal como un medio de fibroblastos condicionado (fibroblast conditioned medium, FCM). El

55 ensayo determina las células que se han unido a la RBM, que han degradado enzimáticamente la RBM y finalmente, las células que han atravesado el lado del FCM de la membrana.

[0171] Dado que los acontecimientos metastásicos in vitro se corresponden con las etapas observadas en la diseminación metastásica de células tumorales a través de la membrana basal in vivo, la invasividad de las células in vitro puede ensayarse mediante los procedimientos descritos en Albini y col., Cancer Res. 47: 3239 - 3245 (1987). Los ensayos de invasividad y otros procedimientos para evaluar las influencias metastásicas, se describen en Leyton y col., Cancer Res. 54: 3696 - 3699 (1994). Las preparaciones de membrana basal reconstituida para su uso según los ensayos descritos anteriormente están fácilmente disponibles en numerosos proveedores comerciales. Un

5 ejemplo de dicha membrana a este respecto es "MATRIGEL" disponible en Collaborative Biomedical Products de Bedford, MA.

[0172] La evaluación in vitro del genotipo metastásico de las células tumorales también puede efectuarse mediante la determinación del nivel y del patrón de expresión de uno o más marcadores metastásicos asociados con 10 dichos marcadores de proteasa, que se consideran una parte integrante de la metástasis tumoral (véase la Patente de EE.UU. Nº 6.303.318). Un ejemplo es el ácido araquidónico, cuya liberación en las células puede servir para indicar el potencial metastásico de un tumor (Patente de EE.UU. Nº 6.316.416). A este respecto, la determinación de la actividad de la fosfolipasa A-2 (PLA2), y la actividad o la abundancia de factores que afectan a la actividad de la PLA2, tal como la proteína uteroglobina (Patente de EE.UU. Nº 6.316.416), puede servir como una indicación del

15 potencial metastásico.

[0173] La determinación del patrón y del nivel de expresión de los marcadores asociados con metástasis puede efectuarse mediante uno o varios procedimientos conocidos en la técnica.

20 [0174] La presencia o el nivel de proteínas indicativas del potencial metastásico de los tumores puede determinarse en células mediante procedimientos convencionales bien conocidos con los expertos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para crear y usar anticuerpos y otros reactivos inmunológicos y para detectar proteínas en particular en muestras usando dichos reactivos, se describen en Coligan y col. (Eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York (1995), relativo a la elaboración y el uso de reactivos útiles para la

25 determinación de proteínas específicas en muestras. Como otro ejemplo, se describen procedimientos inmunohistoquímicos para la determinación de proteínas en células y en tejidos en Ausubel y col., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, Capítulo 14, John Wiley & Sons, Inc. (1994), relativo a la realización de dichas determinaciones. Finalmente, Linnoila y col., A. J. C. P. 97: 235 - 243 (1992) y Peri y col., J. Clin. Invest. 92: 2099 - 2109 (1992), describen técnicas que pueden usarse.

30 [0175] El potencial metastásico también puede ser determinado in vivo a nivel del ARNm. La presencia y/o el nivel de transcritos de ARNm puede determinarse mediante varios procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Puede detectarse un ARNm dado en células mediante la hibridación con una sonda específica. Dichas sondas pueden ser ADN clonados o fragmentos de los mismos, ARN, típicamente creados mediante transcripción in

35 vitro, o sondas de oligonucleótidos, generadas habitualmente mediante síntesis en fase sólida. Los procedimientos para la generación y el uso de sondas adecuadas para una hibridación específica son bien conocidos y usados en la técnica.

[0176] Pueden usarse provechosamente varios controles para mejorar la precisión en los ensayos de detección

40 ARNm. Por ejemplo, pueden hibridarse muestras con una sonda irrelevante y tratarse con ARNasa antes de la hibridación, para valorar una falsa hibridación.

[0177] Con objeto de modular la angiogénesis o de inhibir la metástasis o la fibrosis tumoral, las moléculas usadas por la presente divulgación pueden ser administradas al individuo per se, o en una composición farmacéutica, donde

45 se mezclan con portadores o excipientes adecuados.

[0178] Según se usa en este documento, una "composición farmacéutica " se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en este documento con otros componentes químicos, tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la

50 administración/llegada de un compuesto a un mamífero.

[0179] Según se usa en este documento, el término “principios activos" se refiere a la preparación responsable del efecto biológico, es decir, a las moléculas reguladoras por incremento/reguladoras por disminución usadas por la presente divulgación para modular la angiogénesis, y a las moléculas reguladoras por disminución usadas por la

55 presente divulgación para inhibir la metástasis y la fibrosis tumoral.

[0180] Las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" se usan de forma intercambiable para referirse a un portador, tal como, por ejemplo, un liposoma, un virus, una micela o una proteína, o un diluyente que no provoque una irritación significativa al mamífero y que no anule la actividad biológica

y las propiedades del principio activo. En las siguientes frases se incluye un coadyuvante.

[0181] El término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Algunos ejemplos de excipientes incluyen, sin 5 limitación, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

[0182] Las técnicas para la formulación y la administración de composiciones pueden encontrarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

10 [0183] Las vías de administración adecuada pueden incluir, por ejemplo, la administración por vía oral, rectal, transmucosal, transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo las inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como las inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

15 [0184] Para su inyección, los principios activos de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón de disolución salina fisiológica. Para su administración transmucosal, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se debe atravesar. Dichas penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

20 [0185] Para su administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente mediante la combinación del principio activo con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos portadores permiten que el principio activo de la invención pueden ser formulado como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para su ingestión oral por parte de un paciente. Las

25 preparaciones farmacológicas para uso oral pueden elaborarse usando un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir sustancias auxiliares adecuadas si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Algunos excipientes adecuados son, en particular, agentes de relleno tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata,

30 gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carbometilcelulosa sódica; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, goma de agar o ácido algínico, o una sal de los mismos, tal como alginato sódico.

35 [0186] Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito pueden usarse disoluciones azucaradas concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, disoluciones de laqueado y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o a los recubrimientos de las grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de

40 compuesto activo.

[0187] Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas push-fit hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y de un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas push-fit pueden contener los principios activos mezclados con agentes de relleno tales como lactosa,

45 aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato magnésico, y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como ácidos grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

50 [0188] Para su administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de la forma convencional.

[0189] Las preparaciones descritas en este documento pueden formularse para su administración parenteral, por

55 ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas, o en recipientes multidosis opcionalmente con conservantes añadidos. Las composiciones pueden ser suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.

[0190] Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas del principio activo en una forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los principios activos pueden prepararse como suspensiones para inyección apropiadas basadas en aceite o en agua. Algunos disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos 5 grasos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol

o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de disoluciones muy concentradas.

10 [0191] Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de un polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una disolución basada en agua estéril y exenta de pirógenos, antes de su uso.

[0192] La preparación de la presente divulgación también puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como

15 manteca de cacao u otros glicéridos.

[0193] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente divulgación incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito pretendido.

20 [0194] La composición farmacéutica puede formar una parte de un artículo de elaboración que también incluye un material de envasado para contener la composición farmacéutica y un prospecto que proporciona indicaciones de uso de la composición farmacéutica.

25 [0195] Por lo tanto, la presente divulgación proporciona procedimientos y composiciones farmacéuticas útiles para modular la angiogénesis.

[0196] Dicha actividad de modulación puede usarse para tratar la artritis (Koch, Arthritis Rheum. 41: 951 - 962 (1998); Paleolog y Fava, Springer Semin. Immunopathol. 20: 73 - 94 (1998)), la retinopatía diabética (Miller y col.,

30 Diabetes Metab. Rev. 13: 37 - 50 (1997)), la psoriasis, (Detmar y col., J. Exp. Med. 180: 1141 - 1146 (1994); Creamer y col., Br. J Dermatol. 136, 859 - 865 (1997)) o la vasculitis (Lie, Curr. Opin. Rheumatol. 4: 47 - 55 (1992); Klipple y Riordan, Rheum. Dis. Clin. North Am. 15: 383 - 398 (1989)).

[0197] Además, la presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar una enfermedad

35 caracterizada por una fragilidad vascular, incluyendo el síndrome de Marfans, de Kawasaki, de Ehlers-Danlos, cutis laxa y de takysu (Lie, Curr. Opin. Rheumatol. 4: 47 - 55 (1992); Klipple y Riordan, Rheum. Dis. Clin. North Am. 15: 383 - 398 (1989); Brahn y col., Clin. Immunol. Immunopathol. 90: 147 - 151 (1999); Cid y col., J. Clin. Invest. 91: 977

-

985 (1993); Hoffman y col., Arthritis Rheum. 34: 1466 - 1475 (1991)). Es posible que algunas de estas enfermedades sean al resultado de una actividad reducida o anulada de la oxidasa de lisilo, lo que conduce a la

40 síntesis de una matriz extracelular frágil, y consecuentemente, de vasos sanguíneos frágiles. Como tal, puede usarse la administración de secuencias o de polipéptidos que codifican para la LOX o las LOXL para corregir algunas de las manifestaciones de estas enfermedades.

[0198] La presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar enfermedades que se caracterizan

45 por cambios en la pared vascular. Por ejemplo, la reestenosis, que es una complicación común subsiguiente a la terapia de globo, la displasia fibromuscular (Begelman y Olin, Curr. Opin. Rheumatol. 12: 41 - 47 (2000)) y la estenosis aórtica (Palta y col., Circulation 101: 2497 - 2502 (2000)), son todas potencialmente tratables con las composiciones y los procedimientos descritos en este documento.

50 [0199] Diagnóstico

[0200] Además, la LOXL2 se expresa más en tumores y líneas celulares metastásicas que en tumores y líneas celulares no metastásicas. Esto sugiere que los niveles de expresión de la LOXL2 pueden usarse como herramienta diagnóstica para determinar la malignidad de células cancerosas, así como para determinar e implementar 55 regímenes de tratamiento adecuados. La LOXL2 y la LOXL3 también se expresan más en la PAP, y por lo tanto pueden usarse los niveles de la LOXL2, de la LOXL3, o de ambas, como herramienta diagnóstica para determinar la PAP e implementar regímenes de tratamiento adecuados. Pueden usarse agentes de detección, tales como un anticuerpo, una molécula pequeña, una molécula antisentido, una ribozima, una ADNzima, oligonucleótidos formadores de hélice triple, ARNic, o ARNph para evaluar el nivel o la actividad de la LOXL2, de la LOXL3, o de

ambas, en sujetos.

[0201] El cáncer de colon es una enfermedad muy tratable y a menudo curable cuando está localizada en el intestino. Sin embargo, en muchos casos, debido a diagnósticos erróneos, una hiperplasia de colon premaligna 5 progresa a un adenoma de colon, que se desarrolla adicionalmente en más formas malignas de adenocarcinoma de colon de grado bajo y de grado alto. Una vez que a un individuo se le ha diagnosticado cáncer de colon, la malignidad del tumor necesita ser evaluada con objeto de seleccionar los regímenes de tratamiento adecuados. La práctica actual para evaluar la malignidad de un tumor de colon se basa en el sistema de estadificación de la metástasis tumoral a los nódulos (TNM) desarrollado por el American Joint Committee on Cancer (AJCC). Según

10 este método, la estadificación se basa en la puntuación de la presencia o ausencia de células cancerosas en el propio tumor, en la submucosa de la pared intestinal, en la capa muscular de la pared intestinal (muscularis propria), y/o en los tejidos subserosos, pericólicos o perirrectales, así como en los nódulos linfáticos regionales y en metástasis distantes. Por lo tanto, la estadificación de los tumores de colon implica múltiples biopsias de tejido y complejas evaluaciones patológicas que requieren mucho tiempo y dan como resultado un diagnóstico erróneo.

15 [0202] La expresión de la LOXL2 en células de tejido epitelial y/o conectivo en un tejido de colon es indicativa de un cáncer de colon maligno, y por lo tanto proporciona un nuevo procedimiento para evaluar la malignidad de tumores de cáncer de colon, desprovisto de las limitaciones anteriores.

20 [0203] La expresión de la LOXL2 está correlacionada con la formación de tumores benignos de colon, y está aumentada en más formas malignas de tumores de cáncer de colon, sugiriendo por lo tanto el uso de LOXL2 en la determinación del estadio de los tumores de cáncer de colon.

[0204] Por lo tanto, según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para evaluar

25 la malignidad de un tumor de colon. El procedimiento se efectúa determinando la actividad a nivel tisular y/o un nivel de actividad de un polipéptido homólogo en al menos el 75% con el polipéptido establecido en las SEQ ID NO: 2 ó 9, en el tejido del tumor de colon, evaluando así la malignidad del tumor de colon.

[0205] Según se usa en este documento, la frase “evaluar la malignidad de un tumor de colon" se refiere a la

30 determinación del estadio del tumor de colon, es decir, el progreso del tumor de colon a partir de un tumor de colon benigno hacia un cáncer de colon muy maligno que invade el tejido circundante.

[0206] El polipéptido detectado por la presente divulgación puede ser homólogo en al menos el 75%, en al menos el 80%, en al menos el 85%, en al menos el 90%, o en al menos el 95%, de la SEQ ID NO: 2 ó 9, según se

35 determina mediante el uso del programa informático BestFit del paquete de análisis de secuencias Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por la creación de gap es igual a 8 y la penalización por la extensión de gap es igual a 2.

[0207] En algunas formas de realización, el polipéptido es la LOXL2 (SEQ ID NO: 2), un miembro de la familia de 40 la oxidasa de lisilo, que se han descrito completamente en este documento.

[0208] Según los procedimientos descritos en este documento, se obtiene con tejido tumoral de colon usando una biopsia de colon y/o una cirugía de colon usando procedimientos conocidos en la técnica. Una vez obtenido, se determina el nivel tisular y/o el nivel de actividad del polipéptido de la presente divulgación en el tejido tumoral de

45 colon.

[0209] De forma análoga, para el diagnóstico de la PAP, puede obtenerse una muestra de tejido pulmonar mediante una biopsia pulmonar y otros procedimientos conocidos en la técnica. El polipéptido detectado por la presente divulgación puede tener una homología de al menos el 75%, de al menos el 80%, de al menos el 85%, de 50 al menos el 90%, o de al menos el 95% con la SEQ ID NO: 2 ó 9, según se determina mediante el uso del programa informático BestFit del paquete de análisis de secuencias Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por la creación de gap es igual a 8 y la penalización por la extensión de gap es igual a 2. El polipéptido de la presente divulgación puede ser la LOXL2 (SEQ ID NO: 2) o la LOXL3 (SEQ ID NO 9), miembros de la familia de las oxidasas de lisilo, que se describen completamente en este documento. La expresión del ARNm

55 también puede detectarse y usarse para el diagnóstico. Adicionalmente, también pueden detectarse tanto la LOXL2 como la LOXL3, bien mediante el uso del mismo agente de detección (por ejemplo, un anticuerpo que detecta ambas proteínas), o bien mediante agentes de detección diferentes (por ejemplo, un anticuerpo que es específico para la LOXL2 y otro anticuerpo específico para la LOXL3; o diferentes sondas Northern).

[0210] La determinación del nivel tisular de los polipéptidos descritos en este documento puede realizarse directamente usando procedimientos inmunológicos.

[0211] Los procedimientos inmunológicos de detección en el contexto de la presente divulgación se explican

5 completamente, por ejemplo, en Lane (Ed.), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), y aquellos familiarizados con las técnicas serán capaces de implementar las diversas técnicas resumidas a continuación como parte de la presente invención. Todas las técnicas inmunológicas requieren anticuerpos específicos para al menos un epítopo del polipéptido de la presente invención. Los procedimientos de detección inmunológica adecuados para su uso como parte de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a,

10 radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunotransferencia western, análisis inmunohistoquímico.

[0212] Radioinmunoensayo (RIA): en una versión, este procedimiento implica la precipitación del sustrato deseado, por ejemplo, la LOXL2, con un anticuerpo específico, y una proteína de unión al anticuerpo radiomarcada

15 (por ejemplo, proteína A marcada con I125) inmovilizada sobre un portador precipitable, tal como microesferas de agarosa. El número de recuento en el precipitado es proporcional a la cantidad de sustrato.

[0213] En una versión alternativa del RIA, se emplean un sustrato marcado y una proteína de unión al anticuerpo no marcada. Se añade una muestra que contiene una cantidad conocida de sustrato en cantidades variables. La

20 disminución en el recuento de precipitado procedente del sustrato marcado es proporcional a la cantidad de sustrato en la muestra añadida.

[0214] Enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA): este procedimiento implica la fijación de una muestra (por ejemplo, células fijadas o una disolución proteica) que contiene un sustrato proteico (por ejemplo, la LOXL2) a una 25 superficie, tal como un pocillo de una placa de microtitulación. Se aplica un anticuerpo específico de sustrato acoplado a una enzima y se deja unir al sustrato. Entonces la presencia del anticuerpo se detecta y se cuantifica mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas empleadas habitualmente en este procedimiento incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si está bien calibrado y dentro del intervalo lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a

30 la cantidad de color producida. Generalmente se emplea un sustrato estándar para mejorar la precisión cuantitativa.

[0215] Análisis por inmunotransferencia Western: este procedimiento implica la separación de un sustrato (por ejemplo, la LOXL2) de otras proteínas mediante un gel de acrilamida, seguido de la transferencia del sustrato a una membrana (por ejemplo, de nailon o de PVDF). La presencia del sustrato se detecta entonces mediante anticuerpos 35 específicos para el sustrato, que a su vez son detectados por los reactivos de unión al anticuerpo. Los reactivos de unión al anticuerpo pueden ser, por ejemplo, proteína A u otros anticuerpos. Los reactivos de unión al anticuerpo pueden estar radiomarcados o unidos a enzimas, según se describió anteriormente. La detección puede ser mediante una autorradiografía, una reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este procedimiento permite tanto la cuantificación de una cantidad de sustrato como la determinación de su identidad mediante su posición relativa en la

40 membrana, que es indicativa de una distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis.

[0216] Análisis inmunohistoquímico: este procedimiento implica la detección de un sustrato in situ en tejido fijado mediante anticuerpos específicos de sustrato. Los anticuerpos específicos de sustrato pueden estar unidos a una enzima o unidos a fluoróforos, y detectarse mediante microscopía y una evaluación subjetiva. Si se emplean

45 anticuerpos unidos a una enzima, puede emplearse una reacción colorimétrica.

[0217] Dado que los niveles tisulares de un polipéptido pueden inferirse a partir de los niveles del ARNm que codifica para dicho polipéptido, el procedimiento según este aspecto de la presente divulgación también puede emplear varias metodologías de detección de polinucleótidos para determinar el nivel tisular del polipéptido de la

50 presente invención.

[0218] Las moléculas de ARN pueden detectarse usando procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, análisis por inmunotransferencia Northern, análisis mediante RT-PCR, tinción de la hibridación in situ de ARN y tinción de la RT-PCR in situ.

55 [0219] Análisis por inmunotransferencia Northern: este procedimiento implica la detección de un ARN en particular (por ejemplo, la molécula de ARN que codifica para la LOXL2) en una mezcla de ARN. Se desnaturaliza una muestra de ARN mediante el tratamiento con un agente (por ejemplo, formaldehído) que impide los puentes de hidrógeno entre los pares de bases, asegurando que todas las moléculas de ARN tienen en una conformación no plegada y lineal. Entonces se separan las moléculas individuales de ARN según su tamaño mediante una electroforesis en gel y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o basada en nailon, a la que se adquieren los ARN desnaturalizados. Entonces la membrana se expone a sondas de ADN marcadas. Las sondas pueden marcarse mediante el uso de radioisótopos o de nucleótidos unidos a enzimas. La detección puede realizarse

5 usando una autorradiografía, una reacción colorimétrica o quimioluminiscencia, según se describió anteriormente. Este procedimiento permite tanto la cuantificación de una cantidad de moléculas de ARN en particular como la determinación de su identidad mediante la posición relativa sobre la membrana, que es indicativa de una distancia de migración en el gel durante la electroforesis.

10 [0220] Análisis mediante RT-PCR: este procedimiento usa la amplificación mediante PCR de moléculas de ARN relativamente raras. En primer lugar, las moléculas de ARN procedentes de un tejido en particular (por ejemplo, un tejido de un tumor de colon) se purifican y se convierten en ADN complementario (ADNc) usando una enzima transcriptasa inversa (tal como una MMLV-RT) y cebadores tales como, oligo dT, hexámeros aleatorios o cebadores específicos de genes, todos los cuales están disponibles en Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, EE.UU.

15 Entonces, mediante la aplicación de los cebadores específicos de genes y de la polimerasa Taq de ADN, se realiza una amplificación mediante PCR en una máquina de PCR. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar la longitud y la secuencia de los cebadores específicos de genes, y las condiciones de la PCR (es decir, las temperaturas de hibridación, el número de ciclos y similares), que son adecuados para la detección de moléculas específicas de ARN.

20 [0221] Tinción de la hibridación in situ de ARN: en este procedimiento se unen sondas de ADN o de ARN a las moléculas de ARN presentes en el tejido. Generalmente, se fija una muestra de tejido (por ejemplo, un tejido de colon) para preservar su estructura y para evitar que el ARN se degrade, y después se secciona mediante microscopía y se coloca sobre un portaobjetos. Alternativamente, pueden seccionarse en primer lugar muestras de

25 tejido congelado y ponerse en un portaobjetos, y después someterse a una fijación previa a la hibridación. Las condiciones de hibridación incluyen reactivos tales como formamida y sales (por ejemplo, cloruro sódico y citrato sódico) que permiten la hibridación específica de las sondas de ADN o de ARN con sus moléculas de ARNm objetivo in situ, evitando la unión no específica de la sonda. Los expertos en la materia son capaces de ajustar las condiciones de hibridación (es decir, la temperatura, la concentración de sales y de formamida, y similares) a las

30 sondas y los tipos celulares específicos. Después de la hibridación, se elimina cualquier sonda no unida y el portaobjetos se somete bien a una emulsión fotográfica que revela las señales generadas mediante el uso de sondas radiomarcadas, o bien a una reacción colorimétrica que revela las señales generadas mediante el uso de sondas marcadas unidas a enzimas, según se describió anteriormente.

35 [0222] Tinción de la RT-PCR in situ: este procedimiento se describe en Nuovo y col., Am. J. Surg. Pathol. 17: 683 - 690 (1993) y en Komminoth y col., Pathol. Res. Pract. 190: 1017 - 1025 (1994). En resumen, la reacción de RT-PCR se realiza sobre secciones de tejido fijadas mediante la incorporación de nucleótidos marcados a la reacción PCR. La reacción se lleva a cabo usando un aparato específico de RT-PCR in situ tal como el sistema de microdisección por captura de laser PixCell I LCM disponible en Arcturus Engineering (Mountainview, CA).

40 [0223] La determinación de un nivel de actividad del polipéptido de la presente divulgación (por ejemplo, de la LOXL2) en un tejido tumoral de colon puede efectuarse mediante el uso de los sustratos adecuados en una tinción citoquímica y/o de ensayos de actividad in vitro.

45 [0224] Tinción citoquímica: según este procedimiento se aplica un sustrato cromogénico sobre el tejido del tumor de colon que contiene una enzima activa (por ejemplo, la LOXL2). La enzima cataliza una reacción en la que el sustrato es descompuesto para producir un producto cromogénico visible mediante un microscopio óptico o un microscopio fluorescente.

50 [0225] Ensayos de actividad in vitro: en estos procedimientos se mide la actividad de una enzima en particular en una mezcla proteica extraída de un tejido de interés (por ejemplo, un tejido tumoral de colon). La actividad puede medirse con un espectrofotómetro, bien mediante el uso de procedimientos colorimétricos (véase, por ejemplo, Wande y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 1997, 94: 12817 - 12822 (1997)) o bien puede medirse en un gel de acrilamida no desnaturalizante (es decir, un gel de actividad). Después de la electroforesis, el gel se empapa con

55 una disolución que contiene un sustrato y reactivos colorimétricos. La banda teñida resultante se corresponde con la actividad enzimática del polipéptido de interés (por ejemplo, la LOXL2). Si está bien calibrado y dentro de un intervalo de respuesta lineal, la cantidad de enzima presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producida. Generalmente se emplea una enzima estándar para mejorar la precisión cuantitativa.

[0226] Una vez que se ha determinado el nivel tisular y/o el nivel de actividad del polipéptido (o del ARNm) de la presente divulgación (por ejemplo, la LOXL2) en el tejido tumoral de colon, se evalúa la malignidad del tumor mediante la comparación del nivel de expresión y/o la actividad en el tejido tumoral de colon con la de un tejido de colon normal.

5 [0227] Se apreciará que el tejido normal de colon puede obtenerse mediante una biopsia y/o una cirugía de un tejido de colon obtenido a partir de un individuo sano. Alternativamente, el tejido normal de colon puede obtenerse a partir de un segmento no afectado del colon del mismo individuo. Los procedimientos para determinar el estado de un tejido normal de colon son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen por ejemplo, una evaluación

10 morfológica de las secciones de tejido.

[0228] Una vez determinada la malignidad del cáncer de colon según se ha descrito anteriormente, también puede utilizarse el nivel tisular y/o el nivel de actividad del polipéptido (o del ARNm del mismo) de la presente divulgación para estadificar el tumor de colon y para predecir así el pronóstico de un individuo diagnosticado de cáncer de colon.

15 [0229] Dicha estadificación puede efectuarse mediante la evaluación del nivel tisular y/o del nivel de actividad del polipéptido y su correlación con los resultados obtenidos del tejido del cáncer de colon en diversos estadios (obtenibles a través de la evaluación patológica de los tumores de colon). Se apreciará que dicha estadificación precisa y rápida permitirá un pronóstico preciso y rápido de un individuo afectado de cáncer de colon y la

20 administración oportuna de un régimen de tratamiento adecuado.

[0230] Otros objetos y ventajas adicionales, y nuevas características de la presente divulgación serán apreciables por el experto en la técnica. Se aprecia que ciertas características de la divulgación, que con claridad, se describen en el contexto de formas de realización individuales, también pueden proporcionarse en combinación con una única

25 forma de realización. Por el contrario, las diversas características de la divulgación, que por brevedad, se describen en el contexto de una única forma de realización error, también pueden proporcionarse individualmente o en cualquier subcombinación adecuada. Adicionalmente, cada una de las diversas formas de realización y aspectos de la presente divulgación según se describió anteriormente y según se reivindica en las sección de reivindicaciones, a continuación, encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

[0231] Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y en los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente divulgación incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante.

35 Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989); Ausubel (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I - III John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1994); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., Recombinant ADN, Scientific American Books, Nueva York; Birren y col. (Eds.), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1 - 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York

40 (1998); metodologías según se establece en las patentes de EE.UU. Nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; Cellis (Ed.), Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volúmenes I - III, (1994); Coligan (Ed.), Current Protocols in Immunology, Volúmenes I - III (1994); Stites y col. (Eds.), Basic and Clinical Immunology (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W: H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía

45 científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; Gait (Ed.), Oligonucleotide Synthesis, (1984); Hames y Higgins (Eds.), Nucleic Acid Hybridization, (1985); Hames y Higgins (Eds.), Transcription and Translation, (1984); Freshney (Ed.), Animal Cell Culture, (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); y Methods in Enzymology, Vol. 1 - 317,

50 Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual, CSHL Press (1996).

EJEMPLO 1

El ARNph contra la LOXL2 inhibe la invasividad de las células tumorales

[0232] Materiales y procedimientos

[0233] Hemos adquirido plásmidos de expresión lentivíricos que contienen varias secuencias de ADN candidatas que codifican para especies de ARNph candidatas dirigidas contra la LOXL2, y un ADN que codifica para un gen que confiere resistencia al agente selectivo puromicina, en Sigma (St. Louis, MI) (FIG. 1). Los lentivirus que contienen estos ADNc candidatos fueron producidos en la línea celular de empaquetamiento HEK293-T mediante la 5 transfección de los plásmidos en las células junto con el vector de empaquetamiento pCMVdR8.91, y un plásmido que codifica para la cubierta de recubrimiento del virus de la estomatitis vesicular pMD2-VSVG (5 mg). Se recogieron lentivirus de replicación recombinante defectuosa a partir del medio condicionado de las células de empaquetamiento y se usaron para infectar células tumorales objetivo. El ensayo de invasión tumoral se ilustra en la FIG. 2. Las células tumorales se siembran entre dos capas de colágeno en una monocapa, que representa la masa

10 tumoral. Las células invaden con el tiempo las capas adyacentes de colágeno. Se cuenta automáticamente el número de células invasoras a diversas profundidades en campos microscópicos usando el programa informático de análisis morfométrico Image-Pro.

[0234] Resultados

15 [0235] Se cribaron los diferentes lentivirus portadores de las diferentes especies candidatas de ADN que codifican para los diferentes ARNph para comprobar su capacidad de inhibir la expresión de la LOXL2. Ninguna de esta especies de ADNc tiene ninguna homología con las secuencias de los otros miembros de la familia de genes de las oxidasas de lisilo. Se encontró que dos de estas especies de ADNc codifican para una especie de ARNph que inhibe

20 la expresión de la LOXL2 a nivel del ARNm y de la proteína. La secuencia de ADN que codifica para el primer ARNph es GAAGGAGACATCCAGAAGAAT (sh.LOXL2.197 o si-197; SEQ ID NO: 20) y la segunda tiene la secuencia CGATTACTCCAACAACATCAT (sh.LOXL2.195, o si-195; SEQ ID NO: 21). De estas dos, se cree que la si-195 es un inhibidor ligeramente más potente (FIG. 3A).

25 [0236] El fenotipo invasivo/metastásico está asociado en muchos casos con una transición desde una morfología epitelial a una mesenquimatosa (EMT). La expresión de la especie de ARNph en las líneas celulares tumorales derivadas de seres humanos indujo un cambio drástico en la morfología desde una morfología mesenquimatosa a una epitelial (FIG. 4).

30 [0237] Con objeto de evaluar los efectos de la especie de ARNph sobre la invasividad de las células, se sembraron células tumorales infectadas con lentivirus de control o células tumorales infectadas con el lentivirus que codifica para el ARNph de si-195, entre dos capas de colágeno, y se evaluó su capacidad de invadir el colágeno por encima y por debajo de la monocapa de células. Puede observarse que la expresión del ARNph de si-195 inhibe sustancialmente la invasividad de las células en las capas de colágeno por encima y por debajo de la monocapa de

35 células original (FIG. 5).

EJEMPLO 2

La LOXL2 está sobreexpresada en la Proteinosis Alveolar Primaria

40 [0238] La proteinosis alveolar primaria (PAP) está caracterizada por una hipersecreción del tensioactivo pulmonar, y es una dolencia problemática de etiología desconocida, que presenta dificultades tanto para el diagnóstico como para un tratamiento eficaz.

45 [0239] Se evaluó la expresión de la LOXL2 y de la LOXL3 en pulmones de pacientes normales y con PAP. La FIG. 6 muestra las sobreexpresión de la LOXL2 en células endoteliales pulmonares de la PAP, mientras que la LOXL3 se expresa en el músculo liso.

EJEMPLO 3

El ARNph de la LOXL2 promueve la MET en células malignas humanas

[0240] Se indujo una MET por LOXL2 en tres tipos de células malignas humanas, células 10HT1080, MDA-MB231 o Yu/PAC2. Se sembraron 2 x 105 células en platos de 35 mm. Las células se infectaron con lentivirus que

55 dirigen la expresión del ARNph de LOXL2, del ARNph.Lox12.195 o del ARNph de control (FIG. 7) según el protocolo del vendedor (Sigma). La tinción de las células con faloidina se realiza mediante la fijación de las células en paraformaldehído al 4%. Después las células se permeabilizaron con saponina al 0,05% antes de teñirlas con rodamina-faloidina (Molecular Probes, Eugene, OR) (FIG. 7). Las células tratadas con ARNph.Lox12.195 parecían estar en estados de transición mesenquimatosa-epitelial (MET).

[0241] Transfecciones con fosfato cálcico:

[0242] Se realizaron transfecciones con fosfato cálcico para la producción de retrovirus. Generalmente, las placas

5 se prerrecubrieron con gelatina esterilizada al 0,2% para asegurar una mejor adherencia de las células durante todas las fases del protocolo. Para una placa de 100 mm se sembraron ~2,5 - 3,0 x 106 células para las células 293, 293T y 3,2 - 3,5 x 106 células para las células cNX-A 18 - 24 h antes de la transfección. Para las placas de 150 mm se sembraron ~6,0 x 106 células 293, 293T o cNX-A.

10 [0243] Las células eran confluyentes al -60% en el momento de la transfección. Para placas de 100 mm, se mezclaron -10 µg de ADN, -438 µl de H2O (dependiendo del volumen de ADN), 61 µl de CaCl2 2 M (volumen total de la mezcla de H2O/ADN/CaCl2: 500 µl) en un tubo de microfuga. El CaCl2 no se añadió hasta que los precipitados estaban listos para ser preparados. Para placas de 150 mm, se usaron 30 µg de ADN, -878 µl de H2O (dependiendo del volumen de ADN), 122 µl de CaCl2 2 M (volumen total de la mezcla de H2O/ADN/CaCl2: 1000 µl).

15 [0244] Producción lentivírica

[0245] Para la producción lentivírica en células en 293 o 293T mediante cotransfección de ADN triple o en VSVg de cubierta de virus de moloney, usando placas de 100 mm, se usaron -10 µg de tres ADN que consisten en 5 mg

20 de vector de transferencia, 3 - 4 µg de vector de la proteína estructural y 1 - 2 µg de vector de la cubierta pCI(VSVg). Para placas de 150 mm, -30 µg de tres ADN (16 µg de vector lenti-transfer, 12 µg de vector estructural L8.2 y 3 µg de vector de la cubierta CI(VSVg)). Si el vector de transferencia no tiene un gen de la GFP, habitualmente se incluía un vector de expresión de la GFP como un -5% del ADN total, para conocer la eficacia relativa de la transfección (en el momento de la recogida de virus).

25 [0246] Se añadieron 500 ml de 2 x HBS (Hepes 50 mM, KCl 10 mM, glucosa 12 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 x 7 H2O 1,5 mM) a las mezclas de H2O/ADN/CaCl2 (placas de 100 mm) o 1000 µl (para placas de 150 mm) con burbujeo constante de las últimas mezclas en tubos de microcentrífuga (si los precipitados son de 0,5 ml o menos) o tubos de polipropileno de 14 ml (si los precipitados son de 1 - 3 ml cada uno) o en tubos de polipropileno de 15 ml. Entonces

30 se añadieron las mezclas de CaCl2 al H2O/ADN pero no más de cuatro tubos a la vez. Entonces los precipitados se dejaron a temperatura ambiente durante 0 - 10 min.

[0247] Las células estaban en 9 ml de medio (placas de 100 mm) o en 18 ml de medio (placas de 150 mm). El exceso de medio se eliminó dejando los volúmenes apropiados en cada tamaño de placa. Se añadió cloroquina a

35 cada placa hasta una concentración final de 25 µM.

[0248] Los precipitados de 1 ml de H2O/ADN/CaCl2/2 x HBS se añadieron suavemente a las células. El examen microscópico debería revelar partículas negras muy finas.

40 [0249] Las placas se colocaron en una estufa de incubación a 37°C, un 5% de CO2. Para asegurar que los precipitados estaban distribuidos uniformemente, las placas se giraron suavemente a mano -dos veces durante los primeros 20 - 30 min de incubación.

[0250] Los medios se cambiaron 5 - 8 h después de la transfección por 10 ml de GM reciente (DMEM, 1% de

45 Pen/Estrep, 1% de glutamina, 10% de FBS) para las placas 100 mm y 22 ml para las placas de 150 mm. Las células 293 son más sensibles a la cloroquina que las células cNX, por lo que el medio se cambió no más 5 - 7 h después de la transfección.

[0251] El GM se cambió 24 h después de la transfección por 6,5 - 7 ml para recoger los virus (placas de 100 mm)

50 o 16 - 17 ml (placas de 150 mm). Las placas se llevaron, 6 horas antes de recogerlas, a una estufa de incubación a 32°C, un 5% de CO 2. Los sobrenadantes se centrifugaron a 2000 RPM durante 5 minutos para eliminar cualquier desecho celular, o se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros.

[0252] Infecciones retroviríricas de Moloney y Lenti (Protocolo de inoculación por rotación)

55 [0253] Para reforzar la infección vírica, las células adherentes y en suspensión de los portadores de las placas de cultivo tisular pueden ser infectadas por rotación a 2000 - 2400 RPM durante 45 - 60 minutos a 30 - 32ºC. Las células se infectaron con una elevada MOI con virus no diluido virus en placas de 12, 24 ó 6 pocillos (usando

generalmente no más de 50 - 100 x 103 células por pocillo de una placa de 6 pocillos) en presencia de 8 µg/ml de polibrina. Las células se infectaron con 0,5 - 1,0 ml de sobrenadante vírico por pocillo de una placa de 24 pocillos, 1 ml por pocillo de una de 12 pocillos y 2,0 ml/pocillo de una de 6 pocillos. Los sobrenadantes víricos del congelador a -80ºC se descongelaron a temperatura ambiente y después se añadieron a las células junto con la polibrina. Para las 5 células en suspensión se resuspendieron directamente un número contado de células en el sobrenadante vírico sin diluir. La placa se cerró herméticamente con parafilm en todo su contorno para evitar la evaporación y cambios en el pH del medio durante la inoculación por rotación. Después de la primera inoculación por rotación se retira el parafilm de las placas y los sobrenadantes víricos se sustituyan por una alícuota reciente de virus y polibrina (el virus descongelado puede mantenerse a temperatura ambiente durante los primeros 45 minutos de rotación) para una 10 segunda rotación equivalente o incluso una tercera rotación (dependiendo de la tolerancia de las células a la centrifugación). Para la mayoría de las células, las células normalmente se rotaron dos veces (45 min cada rotación). Para las células en suspensión se añadió un volumen adicional igual de sobrenadante vírico reciente a cada pocillo para una segunda rotación. El parafilm se retiró de las placas y sin extraer el sobrenadantevírico, y se continuó con la incubación a 32°C en una estufa de incubación de CO2 durante hasta un total de 4 - 6 h desde el momento de la

15 primera inoculación por rotación (si se han realizado tres rotaciones de 45 min cada una, la incubación con la última alícuota de virus se realiza durante otras 2 - 3 h a 32°C). El medio de crecimiento regular se cambió y las células se incubaron a 37°C durante 2 días antes de examinar l as células para comprobar la fluorescencia de la GFP. Las selecciones farmacológicas comenzaron 48 h después de la infección. Si las células sobrecrecían antes de alcanzar las 48 h, se dividieron en más pocillos con medio de crecimiento regular.

EJEMPLO 4

El ARNph de la LOXL2 disminuye el desarrollo tumoral primario

25 [0254] Se infectaron cinco millones de células MDA-MB-231 con ARNph de control que codifica para lentivirus o para el vector lentivírico que expresa el ARNph dirigido de la 195 LOXL2, el ARNph.Lox12.195 (si-LOXL2). Las células infectadas se seleccionaron antes de la inyección de puromicina (2 microgramos/ml). Dos días antes de la inyección se determinó la expresión de la LOXL2 en células de control frente a las infectadas con ARNmc.Lox12.195, y la inhibición fue de aproximadamente el 65% basada en la densitometría de la

30 inmunotransferencia Western (lectura directa de la fluorescencia del inmunotransferido). La velocidad de proliferación de las células de control frente a las infectadas por ARNph.Lox12.195 in vitro era similar. Las células infectadas fueron inyectadas en las almohadillas grasas de las mamás de ratones hembra balb/c nu/nu. El volumen tumoral se midió 6, 11, 14, 18, 22, 25 y 27 días después de la inyección. (FIG. 8A) El desarrollo del tumor disminuyó en los ratones inyectados con MDA-231 si-control en comparación con los ratones inyectados con las células MDA

35 231 si-Lox12. (FIGS. 8A, B)

EJEMPLO 5

Genes de células MCF7 afectados por las sobreexpresión o la inhibición de la LOXL2

40 [0255] Se transfectaron células MCF7 con vectores de expresión para sobreexpresar la LOXL2 (clones 12 y 14), se infectaron con un vector lentivírico de control que contenía un ARNph no relacionado (WT), o se infectaron con un mutante de la LOXL2 que era enzimáticamente inactivo debido a una mutación en su motivo LTQ (Y689F). La expresión génica se midió mediante RT-PCR e inmunotransferencia Western. La RT-PCR se realizó usando

45 protocolos estándar. Se identificó un aumento de la expresión en varios genes cuando se sobreexpresaba la LOXL2 (FIG. 9A).

[0256] Las células se infectaron con vector lentivírico 195 de ARNph. Las células se seleccionaron con puromicina y la expresión de la LOXL2 fue monitorizada mediante inmunotransferencia Western. El ARN se aisló y se realizó

50 una RT-PCR. Las condiciones de la PCR usando cebadores específicos para la LOXL2 fueron de 30 ciclos de 55, 72, 95°C, de 1 min cada uno ( FIG. 9B)

EJEMPLO 6

55 La expresión de la LOXL2 es aumentada por la hipoxia

[0257] Las células se incubaron en una cámara de hipoxia a 37ºC al 1,5% de O2 durante 24h. Se incubó un control en condiciones normóxicas (estufa de incubación normal). El ARN se preparó a partir de de las células A549 y se amplificó mediante RT-PCR (30 ciclos de 55, 72, 95°C , de 1 min cada uno). La expresión de la LOXL2 está aumentada en condiciones hipóxicas (FIG. 10A)

[0258] Los niveles de la LOXL2 fueron evaluados mediante inmunotransferencia Western. Las células fueron estimuladas durante los tiempos indicados con la concentración de CoCl2 indicada (FIG. 10B). Se preparó un lisado

5 celular de concentraciones iguales con tampón de lisis que contenía un 0,1% de DOC y un 1% de NP40 con inhibidores de la proteasa, y tampón Hepes 10 mM, pH-7,2. Los lisados celulares se separaron con un gradiente del 8% - 10% en gel de SDS/PAGE, se inmunotransfirieron y se sondearon con anticuerpos anti-LOXL2. Las membranas se rasparon y se volvieron a sondear con un anticuerpo dirigido contra la actina para verificar una carga igual.

EJEMPLO 7

Las células endoteliales derivadas de vena umbilical humana contienen receptor de la LOXL2 unido a la superficie celular

15 [0259] Se ensayaron cuatro líneas celulares diferentes, HUVEC, LE2, HMEC y Balb, para comprobar su unión específica a la LOXL2 mediante una medición que usaba LOXL2 yodada. La LOXL2 se yodó y se añadió a cada pocillo a una concentración final de 0,35 µg/ml. La competición se realizó con LOXL2 no marcada (3,5 µg/ml) (FIG. 11A).

20 [0260] Las células se recubrieron con gelatina, laminina o fibronectina para comprobar su capacidad de unión a la LOXL12. La LOXL2 se yodó y se añadió a cada pocillo a una concentración final de 0,35 µg/ml. La competición se realizó con LOXL2 no marcada (3,5 µg/ml). No se determinó una unión específica (FIG. 11B), lo que indicaba que la unión observada en la FIG. 11A no estaba causada por la unión a estos componentes de la ECM.

25 [0261] Las mismas condiciones de unión a las descritas anteriormente en la FIG.11A pero en ausencia o con la adición de 100 µg/ml de heparina o después de una digestión previa con heparinasa. Ni la ausencia ni la adición de heparina afectan a la unión a la LOXL2. (FIG. 11C).

30 EJEMPLO 8 La LOXL2 y la LOXL3 son expresadas en células neuronales

[0262] Se examinaron secciones de 5 µm fijadas en formalina incluidas en parafina de corteza cerebral normal 35 mediante hibridación in situ. (FIG. 12)

[0263] Preparación de sondas de ARN marcadas con DIG

[0264] Se prepararon sondas de ARN marcadas con digoxigenina (DIG-11-UTP) en orientación sentido o

40 antisentido. Las sondas se sintetizaron mediante una prueba de transcripción in vitro usando polimerasa T7 de ARN y el kit de marcado de ARN Dig/Genius (Roche Boheringer-Manheim). Las sondas fueron generadas mediante una reacción de PCR a partir del ADNc de la LOX, de la LOXL1, de la LOXL2 y de la LOXL3 humanas correspondientes a los nucleótidos (partiendo del primer ATG) 164 - 560 para la LOX, 668 - 1093 para la LOXL1, 403 - 1102 para la LOXL2 y 479 - 1913 para la LOXL3. Los cebadores eran específicos para cada sonda, y portaban enzimas de

45 restricción para la clonación en el vector pBluescript (KS, SK). Los cebadores eran:

[0265] hLOX: 5’ (EcoRI)

CGCCGGAATTCGCTCACAGTACCAGCCTCAG 50 [0266] 3’ (PstI)

CCAAAACTGCAGGTAGTAGTTGTAATAAGGGT

55 [0267] hLOXL1: 5’ (EcoRI)

CGCCGGAATTCGGTCATCTACCCCTACCAGC

[0268] 3’ (XbaI) CTAGTCTAGAACATAGTTGGGGTCTGGGAC [0269] hLOXL2: LOXL2/pCADN3.1 hygro se digirió con EcoRA-NotI y el fragmento se clonó

[0270] hLOXL3: LOXL3/pCADN3.1 hygro se digirió con Xho-BglII y el fragmento se clonó.

5 [0271] Los fragmentos se clonaron en pBluescript con orientación "KS" o "SK" con objeto de generar sondas "sentido" o "antisentido".

[0272] La mezcla de reacción para el marcado del problema contenía: 1 µg de ADN (LOXL2, LOX, LOXL1 o

10 LOXL3 en pBluescript), 10X de tampón de reacción (kit de polimerasa T7 de ARN de Boehringer-Manneheim), DTT 100 mM (Sigma), 10X de dNTPs marcados con Dig (Boehringer-Manneheim, Nº de Cat.1175025), inhibidor de la ARNasa (Promega, 15 unidades por reacción), 10X de polimerasa T7 de ARN y agua tratada con DEPC (pirocarbonato de dietilo) para completar un volumen de 20 µl. La reacción fue durante 2 horas a 37°C.

15 [0273] La reacción se detuvo mediante la adición de 0,8 µl de EDTA. La sonda de ARN marcada con Dig se precipitó entonces mediante la adición de 1 ml de 20 mg/ml de glucógeno, 2 µl de LiCl 4 M, y 55 µl de etanol frío. La disolución se mezcló bien y se incubó durante una noche a -70ºC. La sonda se precipitó mediante centrifugación durante 15 minutos a 4°C a 13000 g. El precipitado s e lavó etanol frío al 70% y se rotó de nuevo durante 5 minutos a 4°C a 13000 g. El precipitado se secó y se resuspend ió en 100 µl de DDW tratada con DEPC (agua destilada

20 desionizada). Se separaron cuatro ml de sonda en gel de agarosa TAE al 1% regulado con bromuro de etidio al 0,005% para determinar la formación de la sonda de ARN. La concentración final de la sonda para hibridación era de 1 µg/ml.

[0274] Pretratamiento de los portaobjetos

25 [0275] Se desparafinizaron secciones de tejido de 5 µm fijadas en formalina incluidas en parafina mediante tres lavados de 5 - 10 min cada uno con xileno al 100%. Las secciones se rehidrataron mediante una serie de lavados con etanol al 100%, al 95%, al 70% y al 30% (5 min de incubación en cada disolución) a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron entonces dos veces con agua tratada con DEPC durante 2 min y después se trataron con

30 HCl 0,2 M durante 10 min para desnaturalizar las proteínas. Entonces las secciones se lavaron dos veces con PBS y se lavaron dos veces con agua y subsiguientemente se digirieron con Proteinasa-K (20 µg/ml en TE, 10 min a temperatura ambiente). La reacción se detuvo mediante dos lavados con agua tratada con DEPC. Los portaobjetos se lavaron entonces dos veces con PBS durante 2 min.

35 [0276] Hibridación

[0277] La prehibridación se realizó mediante la incubación de los portaobjetos durante 2 horas a 45°C con disolución de hibridación precalentada (a 70°C) (vé ase a continuación). La sonda se diluyó en la disolución de hibridación precalentada hasta una concentración final de 1 µg/ml y se desnaturalizó mediante una incubación a

40 80°C durante 5 min y se enfrió durante 3 min en hie lo antes de su adición a los portaobjetos. Los portaobjetos se secaron, y se añadieron las sondas a los portaobjetos. Las secciones se cubrieron con parafilm y se incubaron en una cámara humidificada durante una noche a 45°C.

[0278] Lavados después de la hibridación e incubación con anticuerpo anti-DIG

45 [0279] Los portaobjetos se lavaron brevemente con 2 x SSPE a temperatura ambiente durante 5 min y después se incubaron con 0,2 x SSPE a 50 - 55ºC durante 1 hora. Entonces los portaobjetos se lavaron mediante una incubación adicional con 0,2 x SSPE a 50 - 55°C durante 1 hora y se enfriaron hasta la temperatura ambiente. Después de lavar con PBS durante 5 min a temperatura ambiente, los portaobjetos se incubaron con Tampón 2

50 (véase a continuación) durante 45 min a temperatura ambiente con agitación suave. Los portaobjetos se lavaron con una disolución de lavado de BSA durante 45 min a temperatura ambiente con agitación suave.

[0280] El anticuerpo anti-DIG se diluyó hasta una concentración final de 1:1000 - 1:1500 en Tampón 2 y se añadió a los portaobjetos (-150 µl/portaobjeto). Los portaobjetos se recubrieron con parafilm y se incubaron en una cámara

55 humidificada durante una noche a 4ºC.

[0281] Entonces los portaobjetos se lavaron tres veces con disolución de lavado de BSA, durante 5 min cada lavado. Entonces los portaobjetos se lavaron con Tampón 2 durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.

[0282] Detección de los anticuerpos anti-DIG unidos

[0283] Los portaobjetos se incubaron en Tampón 3 (véase a continuación) durante 2 min, a temperatura ambiente

5 sin agitación. Para la detección colorimétrica se diluyeron 3 µl de BCIP y 4,2 µl de NBT se diluyeron en 2 ml de Tampón 3. La disolución se añadió a los portaobjetos y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante el tiempo necesario. La reacción se detuvo mediante la adición de Tampón de Detención (véase a continuación). Entonces los portaobjetos se lavaron con DDW y se contratiñeron con Hematoxilina de Mayers (1:10 en DDW durante 5 - 7 s). Finalmente los portaobjetos se lavaron con DDW y se montaron con Mount Q y se cubrieron con

10 cubreobjetos.

[0284] Disoluciones

[0285] Todas las disoluciones se prepararon en agua tratada con DEPC (DEPC al 0,1% en DDW durante 18 horas 15 y después en autoclave).

[0286] Disolución de prehibridación: formamida al 50%. Tris 100 mM (pH 7,6),150 µg/ml de ARNt, 1 mg/ml de ARN total de levadura, sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, reactivo de bloqueo al 1%)

20 [0287] Disolución de lavado de BSA: BSA al 1%, Triton X-100 al 0,3%, Tris 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM.

[0288] Tampón 1: Tris 100 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM

[0289] Tampón 2: reactivo de bloqueo diluido al 2% en Tampón 1

25 [0290] Tampón 3: Tris 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM

[0291] Tampón de Detención: Tris 100 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM

30 [0292] "GVA-Mount solution" de Zymed (Nº de Cat. 00-8000)

LISTA DE SECUENCIAS

[0293]

<110> Technion Research & Development Foundation Ltd. NEUFELD Gera BREKHMAN Vera

<120> COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR TUMORES, FIBROSIS Y PROTEINOSIS ALVEOLAR PULMONAR

<130> 41806 40 <160> 19

<170> Patent In versión 3.2

<210> 1

<211> 2325

<212> ADN 45 <213> Homo sapiens

<400> 1 <210> 2

<211>

774 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211>

757 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211>

2262 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4 5 <210> 5

<211> 1725

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

5 <210> 6

<211> 574

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 10

<210> 7

<211>

12545 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211>

417 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211>

752 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211>

36 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 10 10

<210> 11

<211> 37 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 11 20

<210> 12

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 12 30

<210> 13

<211>

18 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 13

<210> 14

<211>

613 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14 5 <210> 15

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 15

15 <210> 16

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>20 <223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 16

25 <210> 17

<211> 210

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Secuencia proteica derivada de la fusión del fragmento de la LOXL2 (1641 - 2253) a una etiqueta de 6X His en 5’

<400> 17 5 <210> 18

<211> 660

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> La sonda de inmunotransferencia Northern consistía en los nucleótidos 1 - 660 del ADNc de la LOXL2

<400> 18 <210> 19

<211> 530 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> La sonda de inmunotransferencia Northern consistía en los nucleótidos 1061 - 1590 del ADNc de la LOXL3

<400> 19 10

SEQ ID NO: 20 GAAGGAGACATCCAGAAGAAT

15 SEQ ID NO: 21 CGATTACTCCAACAACATCAT SEQ ID NO: 22 CCGGCCAGATAGAGAACCTGAATATCTCGAGATATTCAGGTTCTCTATCTGGTTTTTG SEQ ID NO: 23

20 CCGGCCTGGGTTCAAATTTGACAATCTCGAGATTGTCAAATTTGAACCCAGGTTTTTG SEQ ID NO: 24 CCGGCGATTACTCCAACAACATCATCTCGAGATGATGTTGTTGGAGTAATCGTTTTTG SEQ ID NO: 25 CCGGGAGAGGACATACAATACCAAACTCGAGTTTGGTATTGTATGTCCTCTCTTTTTG

25 SEQ ID NO: 26 CCGGGAAGGAGACATCCAGAAGAATCTCGAGATTCTTCTGGATGTCTCCTTCTTTTTG

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición para su uso en la inhibición de la fibrosis en un sujeto mediante la administración al

   sujeto de una cantidad eficaz de un polinucleótido para inhibir la fibrosis, en la que la composición comprende el

   5 polinucleótido, que comprende

   una primera secuencia hibridable con una secuencia de polinucleótido que codifica para la LOXL2,

   una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y 10 una secuencia de conexión que une la primera secuencia con la segunda secuencia.
2. 2. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según la reivindicación 1, en la que la

   secuencia de conexión forma una estructura de bucle en horquilla. 15
3. 3. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según la reivindicación 1 ó 2; en la que la primera secuencia comprende la SEQ ID NO. 20 ó 21.
4. 4. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el 20 polinucleótido tiene al menos dos veces la longitud de la SEQ ID NO. 20.
5. 5. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido comprende una secuencia complementaria de la SEQ ID NO. 20.

   25 6. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el polinucleótido tiene al menos dos veces la longitud de la SEQ ID NO. 21.
6. 7. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según la reivindicación 1, en la que el

   polinucleótido comprende una secuencia complementaria de la SEQ ID NO. 21. 30
7. 8. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polinucleótido se proporciona en un vector de expresión.
8. 9. La composición para su uso en la inhibición de la fibrosis según cualquiera de las reivindicaciones 35 precedentes, en la que la composición comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. 10. Un polinucleótido aislado que comprende una primera secuencia hibridable con una secuencia de polinucleótido que codifica para la LOXL2,

   una segunda secuencia complementaria de la primera secuencia, y

   una secuencia de conexión que une la primera secuencia con la segunda secuencia,

   45 en la que la primera secuencia comprende la SEQ ID NO. 21.
10. 11. El polinucleótido aislado de la reivindicación 10, en el que la secuencia de conexión forma una estructura de bucle en horquilla.

    50 12. El polinucleótido aislado de la reivindicación 10 o de la reivindicación 11, en el que el polinucleótido aislado tiene al menos dos veces la longitud de la SEQ ID NO. 21.
11. 13. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10, 11 ó 12. 55 14. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13.