ES2407113T3 - Marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de tumores - Google Patents

Marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de tumores Download PDF

Info

Publication number
ES2407113T3
ES2407113T3 ES06829534T ES06829534T ES2407113T3 ES 2407113 T3 ES2407113 T3 ES 2407113T3 ES 06829534 T ES06829534 T ES 06829534T ES 06829534 T ES06829534 T ES 06829534T ES 2407113 T3 ES2407113 T3 ES 2407113T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
endometrial tumor
protein
peptide
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06829534T
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Steiner
Jan Hengstler
Jens SAGEMÜLLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universitaet Mainz filed Critical Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Application granted granted Critical
Publication of ES2407113T3 publication Critical patent/ES2407113T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Procedimiento de diagnóstico y/o monitorización de un tumor endometrial en un paciente, que comprende(i) detectar y/o determinar la cantidad de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo queconsiste en SEQ ID NO: 3, 6 y 7, y una parte de al menos 30 nucleótidos consecutivos de la misma,(b) un ácido nucleico, que se hibrida con el ácido nucleico de (a) en condiciones restrictivas, (c) un ácido nucleico, que es degenerado con respecto al ácido nucleico de (a) o (b), y (d) un ácido nucleico, que es complementario del ácido nucleico de (a), (b) o (c), y/o (ii) detectar y/o determinar la cantidad de una proteína o péptido codificado por el ácido nucleico de (i) o de unaparte del mismo, en una muestra biológica aislada de un paciente, que comprende tejido corporal endometrial, en el que la presencia del ácido nucleico, la proteína o el péptido o la parte del mismo y/o una cantidad aumentadadel ácido nucleico, la proteína o el péptido o la parte del mismo en comparación con un paciente sin un tumorendometrial, sin riesgo de presentar un tumor endometrial, sin metástasis de un tumor endometrial y/o sin riesgo depresentar metástasis de un tumor endometrial, indica la presencia de un tumor endometrial, riesgo de presentar untumor endometrial, metástasis de un tumor endometrial y/o riesgo de presentar metástasis de un tumor endometrial.

Description

Marcadores moleculares para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
5 Los canceres estan todavia entre las causas principales de muerte a pesar de los enfoques interdisciplinares y la utilizacion exhaustiva de modalidades de terapia clasicas. La metastasis es uno de los factores mas criticos responsables del fracaso de una terapia contra el cancer. Aunque la ilustracion de la expresion de proteinas, el analisis de alineamientos genicos y la determinacion de factores criticos en tejido tumoral han mejorado la clasificacion de pronostico de los tumores, todavia es dificil predecir el riesgo de presentar metastasis por medio del estudio del tumor primario resecado (Jacquemier J et al., Cancer Res. 65:767-779, 2005; Garber K, Science 303:1754-5, 2004; Hengstler JG et al., Cancer Res. 59, 3206-3214, 1999; Hengstler JG et al., Int. J. Cancer 84, 388-395, 1999; Hengstler JG et al., Int. J. Cancer, 95, 121-127, 2001).
15 Un ejemplo tipico es el cancer del endometrio, el tumor maligno mas comun del aparato genital femenino. Tras la reseccion total del tumor, la supervivencia depende habitualmente de la aparicion de metastasis. Sitios de recidiva de cancer del endometrio son los ganglios linfaticos paraaorticos, los huesos, el pulmon, la pelvis, el higado y la vagina (Steiner E et al., Int J Gynecol Cancer 13:197-203, 2003). Actualmente es dificil predecir si un tumor primario del endometrio ha metastatizado o no. Los factores que regulan el establecimiento del fenotipo metastasico permanecen sin definir en gran medida. Se sabe que algunos parametros histopatologicos tales como el estadio del tumor y el grado histologico estan asociados con la supervivencia libre de tumor (Steiner E et al., Int J Gynecol Cancer 13:197-203, 2003). Sin embargo, hasta la fecha ha sido imposible predecir el riesgo de presentar metastasis por medio de la cuantificacion
25 de factores criticos en tejido tumoral. El documento WO 00/12758 describe un procedimiento para detectar, diagnosticar, monitorizar, estadificar, pronosticar, obtener imagenes de y tratar tipos de cancer particulares incluyendo tipos de cancer ginecologicos tales como cancer de mama, cancer de ovario, cancer uterino y cancer endometrial y cancer de pulmon. El documento WO 01/70979 describe composiciones, kits y procedimientos para detectar, caracterizar, prevenir y tratar canceres de ovario humanos. El documento WO 01/96388 describe composiciones y procedimientos para la terapia y el diagnostico de cancer de
35 colon. Era el objetivo de la presente invencion proporcionar estructuras seleccionadas como diana para un diagnostico, pronostico y terapia de canceres. En particular, era el objetivo de la presente invencion identificar marcadores moleculares que hagan posible el diagnostico diferencial entre tumores metastasicos y no metastasicos, en particular tumores endometriales. Este objetivo se alcanza segun la invencion mediante el objeto de las reivindicaciones. En esta solicitud de patente, se identifican marcadores geneticos cuya expresion se correlaciona con un
45 comportamiento metastasico del endometrio. Tales marcadores geneticos se refieren a acidos nucleicos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-7, una parte de al menos 30 nucleotidos consecutivos de la misma, (b) un acido nucleico que se hibrida con el acido nucleico de (a) en condiciones restrictivas, (c) un acido nucleico que es degenerado con respecto al acido nucleico de (a) o (b), y (d) un acido nucleico que es complementario al acido nucleico de (a), (b) o (c). La presente invencion se refiere en general al diagnostico, el pronostico y la monitorizacion, es decir la determinacion, de la regresion, la progresion, el desarrollo y/o la aparicion, de enfermedades neoplasicas del endometrio, en particular enfermedades tumorales del endometrio y metastasis de las mismas.
55 En un aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento de diagnostico y/o monitorizacion de un tumor endometrial en un paciente, que comprende (i) detectar y/o determinar la cantidad de un acido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en: (a) un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6 y 7, y una parte de al menos 30 nucleotidos consecutivos de la misma, (b) un acido nucleico que se hibrida con el acido nucleico de (a) en condiciones restrictivas, (c) un acido nucleico que es degenerado con respecto al acido nucleico de (a) o (b), y (d) un acido nucleico que es complementario al acido nucleico de (a), (b) o (c), y/o (ii) detectar y/o determinar la cantidad de una proteina o un peptido codificado por el acido nucleico de (i) o de una parte del mismo, en una muestra biologica que comprende tejido corporal endometrial aislada de un paciente, en el que la presencia del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo y/o
65 una cantidad aumentada del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo en comparacion con un paciente sin un tumor endometrial, sin un riesgo de presentar un tumor endometrial, sin metastasis de un tumor
endometrial y/o sin un riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial, indica la presencia de un tumor endometrial, un riesgo de presentar un tumor endometrial, metastasis de un tumor endometrial y/o un riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial.
En formas de realizacion particulares, el paciente presenta una enfermedad neoplasica, se sospecha que padece o ha contraido una enfermedad neoplasica, o presenta un riesgo de presentar una enfermedad neoplasica. En formas de realizacion adicionales, el paciente presenta metastasis de una enfermedad neoplasica, se sospecha que padece
o ha contraido metastasis de una enfermedad neoplasica o presenta un riesgo de presentar metastasis de una enfermedad neoplasica. En formas de realizacion particulares, el paciente ya se ha sometido o esta previsto que se someta a tratamiento de una enfermedad neoplasica, tal como tratamiento mediante reseccion tumoral, quimioterapia y/o radioterapia.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento de evaluacion y/o pronostico del comportamiento metastasico y/o la recidiva de un tumor endometrial, que comprende (i) detectar y/o determinar la cantidad de un acido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en: (a) un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6 y 7, y una parte de al menos 30 nucleotidos consecutivos de la misma, (b) un acido nucleico que se hibrida con el acido nucleico de (a) en condiciones restrictivas, (c) un acido nucleico que es degenerado con respecto al acido nucleico de (a) o (b), y (d) un acido nucleico que es complementario al acido nucleico de (a), (b) o (c), y/o (ii) detectar y/o determinar la cantidad de una proteina o un peptido codificado por el acido nucleico de (i) o de una parte del mismo, en una muestra biologica que comprende tejido corporal endometrial aislada de un paciente, en el que la presencia del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo y/o una cantidad aumentada del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo en comparacion con un paciente sin un tumor endometrial, sin un riesgo de presentar un tumor endometrial, sin metastasis de un tumor endometrial, sin un riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial, sin una recidiva de un tumor endometrial y/o sin un riesgo de presentar una recidiva de un tumor endometrial, indica la presencia de metastasis o recidiva de un tumor endometrial o un riesgo de presentar metastasis o recidiva de un tumor endometrial.
En formas de realizacion particulares, el paciente presenta una enfermedad neoplasica, se sospecha que padece o ha contraido una enfermedad neoplasica, o presenta un riesgo de presentar una enfermedad neoplasica. En formas de realizacion adicionales, el paciente presenta metastasis de una enfermedad neoplasica, se sospecha que padece
o ha contraido metastasis de una enfermedad neoplasica o presenta un riesgo de presentar metastasis de una enfermedad neoplasica. En formas de realizacion particulares, el paciente ya se ha sometido o esta previsto que se someta a tratamiento de una enfermedad neoplasica, tal como tratamiento mediante reseccion tumoral, quimioterapia y/o radioterapia.
Los procedimientos segun la invencion permiten preferentemente que se realice un pronostico sobre si se ha producido o se producira metastasis de un tumor endometrial. Preferentemente, los procedimientos segun la invencion permiten que se distinga entre alteraciones benignas y malignas y pueden proporcionar informacion sobre el exito del tratamiento de un tumor endometrial que ya se ha llevado a cabo o que va a llevarse a cabo, tal como tratamiento por medio de reseccion tumoral, quimioterapia y/o radioterapia. En particular, los procedimientos segun la invencion pueden proporcionar informacion sobre la probabilidad de una recidiva en un tratamiento de un tumor endometrial que ya se ha llevado a cabo o que va a llevarse a cabo.
El experto en la materia esta familiarizado con las posibilidades para realizar una deteccion y/o determinacion de la cantidad en los procedimientos segun la invencion.
En formas de realizacion particulares, la deteccion y/o determinacion de la cantidad en los procedimientos segun la invencion comprende (i) poner en contacto la muestra biologica con un agente que se une especificamente al acido nucleico, a la proteina o al peptido o a la parte del mismo, y (ii) detectar la formacion de un complejo entre el agente y el acido nucleico o la proteina o el peptido o la parte del mismo.
Puede detectarse un acido nucleico o puede determinarse la cantidad de un acido nucleico segun la invencion con una sonda de oligonucleotido o polinucleotido que se hibrida especificamente con el acido nucleico, o puede amplificarse selectivamente el acido nucleico, preferentemente amplificarse mediante la reaccion en cadena de la polimerasa. En una realizacion, la sonda comprende una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, 15-30 o 20-30, nucleotidos contiguos del acido nucleico que va a detectarse.
Puede detectarse una proteina o un peptido o una parte del mismo o puede determinarse la cantidad de una proteina o un peptido o de una parte del mismo segun la invencion con un anticuerpo que se une especificamente a la proteina o el peptido o a la parte del mismo.
En una realizacion, la proteina o el peptido que va a detectarse o la parte del mismo se encuentra en un complejo con una molecula de CMH.
El agente utilizado para detectar o determinar la cantidad, en particular la sonda de oligonucleotido o polinucleotido,
o el anticuerpo esta preferentemente marcado de manera detectable. En formas de realizacion particulares, el marcador detectable es un marcador radiactivo, marcador fluorescente o marcador enzimatico.
El termino quot;unirquot; se refiere segun la invencion a una union especifica. La expresion quot;union especificaquot; significa que una union a una diana tal como un epitopo, para la que es especifico un agente de union tal como un anticuerpo, es mas fuerte en comparacion con la union a una diana diferente.
Una quot;union mas fuertequot; puede caracterizarse, por ejemplo, por una menor constante de disociacion.
Descripcion�eeeallaea�ee�la�invencion
Segun la invencion, un acido nucleico es preferentemente acido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN). Segun la invencion, los acidos nucleicos comprenden ADN genomico, ADNc, ARNm, moleculas producidas de manera recombinante y sintetizadas quimicamente. Un acido nucleico puede estar presente segun la invencion como una molecula monocatenaria o bicatenaria y lineal o circular cerrada covalentemente.
El termino quot;derivadoquot; de un acido nucleico significa segun la invencion que estan presentes sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleotidos individuales o multiples, preferentemente al menos 2, al menos 4, al menos 6, y preferentemente hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 10, hasta 15 o hasta 20, en el acido nucleico. El termino quot;derivadoquot; de un acido nucleico comprende ademas tambien la derivatizacion quimica de un acido nucleico en una base de nucleotido, en el azucar o en el fosfato, y acidos nucleicos que contienen nucleotidos y analogos de nucleotido que no se producen de manera natural.
Los acidos nucleicos descritos segun la invencion estan preferentemente aislados. El termino quot;acido nucleico aisladoquot; significa segun la invencion que el acido nucleico se ha (i) amplificado in vitro, por ejemplo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido de manera recombinante mediante clonacion, (iii) purificado, por ejemplo mediante escision y fraccionamiento mediante electroforesis en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo mediante sintesis quimica. Un acido nucleico aislado es un acido nucleico disponible para manipulacion mediante tecnicas de ADN recombinante.
Un acido nucleico es entonces quot;complementarioquot; a otro acido nucleico si las dos secuencias pueden hibridarse entre si y formar un duplex estable, llevandose a cabo la hibridacion preferentemente en condiciones que permiten la hibridacion especifica entre polinucleotidos (condiciones restrictivas). Se describen condiciones restrictivas, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., ed., 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, y se refieren, por ejemplo, a la hibridacion a 65°C en tampon de hibridacion (3,5 x SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albumina serica bovina al 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7. Tras la hibridacion, se lava la membrana a la que se ha transferido el ADN, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y luego en 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68°C.
Segun la invencion, los acidos nucleicos complementarios presentan al menos el 40%, en particular al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, y preferentemente al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99%, de identidad de nucleotidos.
El termino quot;% de identidadquot; pretende referirse a un valor porcentual de nucleotidos que son identicos en una alineacion optima entre dos secuencias que van a compararse, siendo dicho valor porcentual puramente estadistico, y las diferencias entre las dos secuencias pueden distribuirse aleatoriamente y a lo largo de toda la longitud de la secuencia y la secuencia que va a compararse puede comprender adiciones o deleciones en comparacion con la secuencia de referencia, con el fin de obtener una alineacion optima entre dos secuencias. Las comparaciones de secuencia entre dos secuencias se llevan a cabo habitualmente comparando dichas secuencias, tras una alineacion optima, con respecto a un segmento o quot;ventana de comparacionquot;, con el fin de identificar regiones locales de coincidencia de secuencia. La alineacion optima para una comparacion puede llevarse a cabo manualmente o con la ayuda del algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, con la ayuda del algoritmo de homologia local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, y con la ayuda del algoritmo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 o con la ayuda de programas informaticos que utilizan dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
Se obtiene el porcentaje de identidad determinando el numero de posiciones identicas en las que coinciden las secuencias que van a compararse, dividiendo este numero entre el numero de posiciones comparadas y multiplicado este resultado por 100.
Por ejemplo, puede utilizarse el programa de BLAST quot;BLAST 2 sequencesquot; que esta disponible en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/wblast2.cgi.
Los acidos nucleicos pueden estar presentes solos o en combinacion con otros acidos nucleicos que pueden ser homologos o heterologos. En formas de realizacion particulares, un acido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresion que pueden ser homologas o heterologas con respecto al acido nucleico, haciendo referencia en este caso el termino quot;homologoquot; al hecho de que un acido nucleico tambien se une funcionalmente de manera natural a la secuencia de control de la expresion, y haciendo referencia el termino quot;heterologoquot; al hecho de que un acido nucleico no se une funcionalmente de manera natural a la secuencia de control de la expresion.
Un acido nucleico, preferentemente un acido nucleico transcribible y en particular un acido nucleico que codifica para un peptido o una proteina, y una secuencia de control de la expresion se unen quot;funcionalmentequot; entre si, si se unen covalentemente entre si de tal manera que la transcripcion o expresion del acido nucleico esta bajo el control o bajo la influencia de la secuencia de control de la expresion. Si el acido nucleico va a traducirse en un peptido o una proteina funcional, la induccion de una secuencia de control de la expresion cuando la secuencia de control de la expresion esta unida funcionalmente a la secuencia codificante da como resultado la transcripcion de la secuencia codificante, sin provocar un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante o sin poder la secuencia codificante traducirse en el peptido o la proteina deseado.
El termino quot;secuencia de control de la expresionquot; comprende promotores, secuencias de union al ribosoma y otros elementos de control que controlan la transcripcion de un gen o la traduccion del ARN derivado. En formas de realizacion particulares, pueden regularse las secuencias de control de la expresion. La estructura precisa de las secuencias de control de la expresion puede variar dependiendo de la especie o el tipo celular pero comprende habitualmente secuencias no transcritas en 5' y no traducidas en 5' y 3' implicadas en la iniciacion de la transcripcion
o la traduccion, tal como la caja TATA, secuencia de ocupacion de extremos, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias de control de la expresion no transcritas en 5' comprenden una region promotora que engloba una secuencia promotora para el control de la transcripcion del acido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresion tambien pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en el sentido de 5'.
El termino quot;promotorquot; o quot;region promotoraquot; se refiere a una secuencia de ADN en el sentido de 5' (en 5') de la secuencia codificante de un gen y controla la expresion de la secuencia codificante proporcionando un sitio de reconocimiento y union para ARN polimerasa. La region promotora puede incluir sitios de reconocimiento y union adicionales para factores adicionales, implicados en la regulacion de la transcripcion del gen. Un promotor puede controlar la transcripcion de un gen procariota o eucariota. Un promotor puede ser quot;induciblequot; e iniciar la transcripcion en respuesta a un inductor, o puede ser quot;constitutivoquot; si la transcripcion no esta controlada por un inductor. Un promotor inducible se expresa solo en un grado muy pequeno o nada en absoluto, si esta ausente un inductor. En presencia del inductor, quot;se activaquot; el gen o se aumenta el nivel de transcripcion. Esto esta mediado habitualmente por la union de un factor de transcripcion especifico.
Promotores preferidos son, por ejemplo, promotores para polimerasa de SP6, T3 o T7.
El termino quot;expresionquot; se utiliza en su significado mas general y comprende la produccion de ARN o de ARN y proteina. Tambien comprende la expresion parcial de acidos nucleicos. Ademas, la expresion puede ser transitoria o estable. Con respecto al ARN, el termino quot;expresionquot; o quot;traduccionquot; se refiere en particular a la produccion de peptidos o proteinas.
Ademas, un acido nucleico que codifica para una proteina o un peptido puede unirse a otro acido nucleico que codifica para una secuencia peptidica que controla la secrecion de la proteina o el peptido codificado por el acido nucleico de una celula huesped. Un acido nucleico tambien puede unirse a otro acido nucleico que codifica para una secuencia peptidica que provoca el anclaje de la proteina o el peptido codificado a la membrana celular de una celula huesped o la compartimentalizacion de la misma en organulos particulares de dicha celula. De manera similar, puede establecerse una union a un acido nucleico que representa un gen indicador o cualquier quot;etiquetaquot;.
En una realizacion preferida, esta presente un acido nucleico en un vector, dado el caso con un promotor que controla la expresion del acido nucleico. El termino quot;vectorquot; se utiliza a este respecto en su significado mas general y comprende cualquier vehiculo intermedio para un acido nucleico que, por ejemplo, permita que se introduzca dicho acido nucleico en celulas procariotas y/o eucariotas y, dado el caso, que se integre en un genoma. Tales vectores se replican y/o se expresan preferentemente en la celula. Los vectores comprenden plasmidos, fagemidos o genomas virales. El termino quot;plasmidoquot;, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere en general a un constructo de material genetico extracromosomico, habitualmente un duplex de ADN circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosomico.
El termino quot;celula huespedquot; se refiere a cualquier celula que puede transformarse o transfectarse con un acido nucleico exogeno, preferentemente ADN o ARN. El termino quot;celula huespedquot; comprende segun la invencion celulas procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, celulas de mamifero, en particular celulas de seres humanos, celulas de levadura y celulas de insecto). Se prefieren especialmente celulas de mamifero tales como
celulas de seres humanos, ratones, hamsteres, cerdos, cabras y primates. Las celulas pueden derivarse de una multiplicidad de tipos de tejido y comprenden celulas primarias y lineas celulares. Los ejemplos especificos comprenden queratinocitos, leucocitos de sangre periferica, celulas madre de medula osea y celulas madre embrionarias. En otras formas de realizacion, la celula huesped es una celula presentadora de antigeno, comprendiendo el termino quot;celula presentadora de antigenoquot; segun la invencion celulas dendriticas, monocitos y macrofagos. Un acido nucleico puede estar presente en la celula huesped en una unica o en varias copias y, en una realizacion, se expresa en la celula huesped.
En aquellos casos de la descripcion, en los que una molecula de CMH presenta una proteina o un peptido, un vector de expresion tambien puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica para dicha molecula de CMH. La secuencia de acido nucleico que codifica para la molecula de CMH puede estar presente en el mismo vector de expresion que el acido nucleico que codifica para la proteina o el peptido, o ambos acidos nucleicos pueden estar presentes en vectores de expresion diferentes. En este ultimo caso, los dos vectores de expresion pueden cotransfectarse en una celula. Si una celula huesped no expresa ni la proteina o el peptido ni la molecula de CMH, ambos acidos nucleicos que codifican para los mismos pueden transfectarse en la celula o bien en el mismo vector de expresion o bien en vectores de expresion diferentes. Si la celula ya expresa la molecula de CMH, solo puede transfectarse la secuencia de acido nucleico que codifica para la proteina o el peptido en la celula.
Kits para amplificar un acido nucleico con el fin de detectar de ese modo el acido nucleico o determinar su cantidad comprenden, por ejemplo, un par de cebadores de amplificacion que se hibridan con el acido nucleico que va a amplificarse. Los cebadores comprenden preferentemente una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, 15-30 o 20-30, nucleotidos contiguos del acido nucleico que va a amplificarse y no se solapan con el fin de evitar la formacion de dimeros de cebadores. Uno de los cebadores se hibridara con una cadena del acido nucleico que va a amplificarse y el otro cebador se hibridara con la cadena complementaria en una disposicion que permita la amplificacion del acido nucleico.
Pueden utilizarse quot;acidos nucleicos antisentidoquot; para regular, en particular reducir, la expresion de un acido nucleico. El termino quot;acido nucleico antisentidoquot; significa un oligonucleotido que es un oligorribonucleotido, oligodesoxirribonucleotido, oligorribonucleotido modificado u oligodesoxirribonucleotido modificado y que se hibrida en condiciones fisiologicas a ADN que comprende un gen particular o a ARNm de dicho gen, inhibiendo de ese modo la transcripcion de dicho gen y/o la traduccion de dicho ARNm. Un quot;acido nucleico antisentidoquot; comprende tambien un constructo que contiene un acido nucleico o una parte del mismo en orientacion inversa con respecto a su promotor natural. Un transcrito antisentido de un acido nucleico o de una parte del mismo puede formar un duplex con el ARNm que se produce de manera natural que especifica un peptido o una proteina, impidiendo por tanto la traduccion del ARNm en dicho peptido o dicha proteina. Otra opcion es la utilizacion de ribozimas para inactivar un acido nucleico. Los oligonucleotidos antisentido preferidos presentan una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, 15-30 o 20-30, nucleotidos contiguos del acido nucleico diana y preferentemente son totalmente complementarios al acido nucleico diana o una parte del mismo.
Preferentemente, el oligonucleotido antisentido se hibrida con un sitio N-terminal o en el sentido de 5' tal como un sitio de iniciacion de la traduccion, un sitio de iniciacion de la transcripcion o un sitio promotor o el oligonucleotido antisentido se hibrida con una region no traducida en 3' o un sitio de corte y empalme de ARNm.
En una forma de realizacion, un oligonucleotido consiste segun la invencion en ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos o una combinacion de los mismos. El extremo 5' de un nucleotido y el extremo 3' de otro nucleotido se unen a este respecto mediante un enlace fosfodiester. Estos oligonucleotidos pueden sintetizarse de la manera habitual o producirse de manera recombinante.
Preferentemente, un oligonucleotido es un oligonucleotido quot;modificadoquot;. A este respecto, el oligonucleotido puede estar modificado de maneras muy diferentes, por ejemplo, con el fin de aumentar su estabilidad o eficacia terapeutica, sin impedir su capacidad para unirse a su diana. El termino quot;oligonucleotido modificadoquot; significa un oligonucleotido en el que (i) al menos dos de sus nucleotidos se unen entre si mediante un enlace internucleosidico sintetico (es decir, un enlace internucleosidico que no es un enlace fosfodiester), y/o (ii) un grupo quimico que normalmente no esta presente en acidos nucleicos se une covalentemente al oligonucleotido. Enlaces internucleosidicos sinteticos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, esteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triesteres de fosfato, acetamidatos, esteres carboximetilicos y peptidos.
El termino quot;oligonucleotido modificadoquot; tambien comprende oligonucleotidos con una o mas bases modificadas covalentemente y/o uno o mas azucares modificados covalentemente. Los quot;oligonucleotidos modificadosquot; comprenden por ejemplo oligonucleotidos con residuos de azucar que se unen covalentemente a grupos organicos de bajo peso molecular distintos a un grupo hidroxilo en la posicion 3' y un grupo fosfato en la posicion 5'. Los oligonucleotidos modificados pueden comprender, por ejemplo, un residuo de ribosa alquilado en 2'-O o otro azucar en lugar de ribosa, tal como arabinosa.
El termino quot;peptidoquot; se refiere a sustancias que comprenden al menos dos, al menos 3, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 13, al menos 16, al menos 20 y preferentemente hasta 50, 100 o 150, aminoacidos consecutivos que se unen entre si mediante enlaces peptidicos. El termino quot;proteinaquot; se refiere a grandes peptidos, preferentemente peptidos con al menos 151 aminoacidos, pero los terminos quot;peptidoquot; y quot;proteinaquot; se utilizan en la presente memoria en general como sinonimos.
Las proteinas y los peptidos descritos estan preferentemente aislados. Los terminos quot;proteina aisladaquot; o quot;peptido aisladoquot; significan que la proteina o el peptido estan separados de su entorno natural. Una proteina o un peptido aislado pueden estar en un estado esencialmente purificado. El termino quot;esencialmente purificadoquot; significa que la proteina o el peptido esta esencialmente libre de otras sustancias con las que esta asociado en la naturaleza o in vivo.
Tales proteinas y peptidos sirven, por ejemplo, para la produccion de anticuerpos y pueden emplearse en un ensayo inmunologico o de diagnostico o como agentes terapeuticos. Las proteinas y los peptidos descritos en la presente memoria pueden aislarse de muestras biologicas tales como homogeneizados tisulares o celulares y tambien pueden expresarse de manera recombinante en una multiplicidad de sistemas de expresion procariotas o eucariotas.
Los quot;derivadosquot; de una proteina o un peptido o de una secuencia de aminoacidos comprenden variantes de insercion de aminoacidos, variantes de delecion de aminoacidos y/o variantes de sustitucion de aminoacidos.
Las variantes de insercion de aminoacidos comprenden fusiones amino- y/o carboxi-terminales, asi como inserciones de aminoacidos individuales o multiples en una secuencia de aminoacidos particular. En variantes de la secuencia de aminoacidos con una insercion, se introducen uno o mas residuos de aminoacido en un sitio predeterminado en una secuencia de aminoacidos, aunque tambien es posible la insercion al azar con el examen adecuado del producto resultante. Las variantes de delecion de aminoacidos se caracterizan por la eliminacion de uno o mas aminoacidos de la secuencia. Las variantes de sustitucion de aminoacidos se caracterizan porque al menos se elimina un residuo en la secuencia y otro residuo se inserta en su lugar. Las modificaciones estan presentes preferentemente en posiciones en la secuencia de aminoacidos que no estan conservadas entre proteinas
o peptidos homologos y/o se sustituyen preferentemente aminoacidos por otros que presentan propiedades similares tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, volumen de la cadena lateral y similares (sustitucion conservativa). Las sustituciones conservativas se refieren, por ejemplo, a la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que se enumera a continuacion en el mismo grupo como el aminoacido sustituido:
1.
Pequenos residuos alifaticos, apolares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2.
Residuos cargados negativamente y sus amidas: Asn, Asp, Glu, Gln
3.
Residuos cargados positivamente: His, Arg, Lys
4.
Grandes residuos alifaticos, apolares: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5.
Grandes residuos aromaticos: Phe, Tyr, Trp.
Tres residuos se ponen entre parentesis debido a su papel particular en la arquitectura de proteinas. Gly es el unico residuo sin una cadena lateral y por tanto confiere flexibilidad a dicha cadena. Pro presenta una geometria inusual que restringe en gran medida la cadena. Cys puede formar un puente disulfuro.
Las variantes de aminoacidos descritas anteriormente pueden prepararse facilmente con la ayuda de tecnicas de sintesis peptidica conocidas tales como, por ejemplo, mediante quot;sintesis en fase solidaquot; (Merrifield, 1964) y procedimientos similares o mediante manipulacion de ADN recombinante. La manipulacion de secuencias de ADN para producir proteinas y peptidos con sustituciones, inserciones o deleciones se describe en detalle en Sambrook et al. (1989), por ejemplo.
Los quot;derivadosquot; de proteinas o peptidos tambien incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones individuales o multiples de cualquier molecula que este asociada con la proteina o el peptido, tal como hidratos de carbono, lipidos y/o proteinas o peptidos. El termino quot;derivadoquot; ademas se extiende tambien a todos los equivalentes quimicos funcionales de las proteinas y los peptidos y a sustancias que no contienen solo los componentes de aminoacido sino tambien componentes distintos de aminoacidos tales como azucares y estructuras de fosfato, y tambien comprenden sustancias que contienen enlaces tales como enlaces ester, enlaces tioeter o enlaces disulfuro.
Una parte o un fragmento de una proteina o un peptido presenta preferentemente una propiedad funcional de la proteina o el peptido del que se deriva. Tales propiedades funcionales incluyen, por ejemplo, la interaccion con anticuerpos o la interaccion con otros peptidos o proteinas. Una propiedad importante es la capacidad para formar un complejo con moleculas de CMH y, dado el caso, para generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, mediante la estimulacion de celulas T citotoxicas o cooperadoras. Una parte o un fragmento de una proteina o un peptido comprende preferentemente una secuencia de al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al
menos 20, o al menos 30, y preferentemente hasta 8, 10, 12, 15, 20, 30 o 50, aminoacidos consecutivos de la proteina o el peptido.
Una parte o un fragmento de un acido nucleico que codifica para una proteina o un peptido se refiere segun la invencion preferentemente a la parte del acido nucleico que codifica al menos para la proteina o el peptido y/o para una parte o un fragmento de la proteina o el peptido, tal como se definio anteriormente.
Pueden producirse antisueros que contienen anticuerpos, que se unen especificamente a una diana mediante diversos procedimientos convencionales; vease, por ejemplo, quot;Monoclonal Antibodies: A Practical Approachquot; de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 22-9, quot;Antibodies: A Laboratory Manualquot; de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142 y quot;Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NOquot; de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. A este respecto tambien es posible generar anticuerpos que presentan afinidad y especificidad que reconocen proteinas de membrana complejas en su forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Esto es especialmente importante para la produccion de anticuerpos que pretenden utilizarse terapeuticamente, pero tambien para muchas aplicaciones de diagnostico. Esto puede implicar la inmunizacion con la proteina completa, con subsecuencias extracelulares, asi como con celulas que expresan la molecula diana en una forma plegada fisiologicamente.
Los anticuerpos monoclonales se producen tradicionalmente con la ayuda de la tecnologia del hibridoma (detalles tecnicos: veanse quot;Monoclonal Antibodies: A Practical Approachquot; de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19963722-9; quot;Antibodies: A Laboratory Manualquot; de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, quot;Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NOquot; de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Se sabe que solo una pequena parte de una molecula de anticuerpo, el paratopo, esta implicada en la union del anticuerpo a su epitopo (vease Clark, W. R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7a edicion, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento pero no estan implicadas en la union a antigenos. Un anticuerpo del que se ha eliminado enzimaticamente la region pFc' o que se ha producido sin la region pFc', denominado fragmento F(ab')2, porta ambos sitios de union a antigenos de un anticuerpo completo. De manera similar, un anticuerpo del que se ha eliminado enzimaticamente la region Fc o que se ha producido sin la region Fc, denominado fragmento Fab, porta un sitio de union a antigenos de una molecula de anticuerpo intacta. Ademas, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera unida covalentemente de un anticuerpo y parte de la cadena pesada del anticuerpo, denominado Fd. Los fragmentos Fd son los principales determinantes de la especificidad de anticuerpo (un unico fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes, sin alterar la especificidad del anticuerpo), y los fragmentos Fd cuando estan aislados mantienen la capacidad para unirse a un epitopo.
Dentro de la parte de union a antigenos de un anticuerpo, existen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que interaccionan directamente con el epitopo del antigeno, y regiones de entramado (FR) que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto en el fragmento Fd de la cadena pesada como en la cadena ligera de inmunoglobulinas IgG hay cuatro regiones de entramado (FR1 a FR4) que estan separadas en cada caso por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3). Las regiones CDR y en particular CDR3 e incluso mas la region CDR3 de la cadena pesada son responsables en gran medida de la especificidad de anticuerpo.
Se sabe que pueden sustituirse regiones distintas a CDR de un anticuerpo de mamifero por regiones similares de anticuerpos que presentan una especificidad igual o diferente, manteniendose la especificidad del epitopo del anticuerpo original. Esto hizo posible desarrollar los denominados anticuerpos quot;humanizadosquot; en los que se unen covalentemente CDR no humanas a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.
El documento WO 92/04381 describe como ejemplo diferente la produccion y la utilizacion de anticuerpos anti-VRS murinos humanizados en los que al menos parte de las regiones FR murinas se han sustituido por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de union a antigenos, se denominan frecuentemente anticuerpos quot;quimericosquot;.
La expresion quot;anticuerpoquot; tambien comprende fragmentos de anticuerpo F(ab')2, Fab, Fv y Fd, anticuerpos quimericos en los que regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias no humanas o humanas homologas, anticuerpos de fragmento F(ab')2 quimericos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias no humanas o humanas homologas, anticuerpos de fragmento Fab quimericos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han sustituido por secuencias no humanas o humanas homologas y anticuerpos de fragmento Fd quimericos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por secuencias no humanas o humanas homologas. El termino quot;anticuerpoquot; tambien comprende anticuerpos de cadena sencilla.
Los anticuerpos tambien pueden acoplarse a agentes de diagnostico especificos con el fin de presentar, por ejemplo, celulas y tejidos que expresan proteinas o peptidos particulares. Tambien pueden acoplarse a agentes terapeuticos.
Los agentes de diagnostico incluyen cualquier marcador que sea adecuado para: (i) proporcionar una senal detectable, (ii) interaccionar con un segundo marcador con el fin de modificar la senal detectable proporcionada por el marcador primero o segundo, por ejemplo FRET (transferencia de energia por resonancia de fluorescencia), (iii) influir en la movilidad tal como la movilidad electroforetica por medio de la carga, hidrofobicidad, forma u otros parametros fisicos, o (iv) proporcionar un grupo de captura, por ejemplo complejacion por afinidad, complejacion de anticuerpo/antigeno o complejacion ionica. Marcadores adecuados son estructuras tales como marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores cromoforos, marcadores radioisotopicos, marcadores isotopicos, preferentemente marcadores isotopicos estables, marcadores enzimaticos, marcadores de particulas, en particular marcadores de particulas metalicas, marcadores de particulas magneticas, marcadores de particulas polimericas, moleculas organicas pequenas tales como biotina, ligandos de receptores o moleculas de union tales como proteinas de adhesion celular o lectinas, y secuencias de marcaje que comprenden secuencias de acido nucleico y/o de aminoacidos. Los agentes de diagnostico comprenden, pero no se limitan a, sulfato de bario, acido iocetamico, acido iopanoico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y agentes de radiodiagnostico, incluyendo emisores de positrones tales como fluor-18 y carbono-11, emisores gamma tales como yodo-123, tecnecio-99m, yodo-131 e indio-111, y nuclidos para resonancia magnetica nuclear, tales como fluor y gadolinio.
La expresion quot;agente terapeuticoquot; significa segun la invencion cualquier sustancia que puede ejercer una accion terapeutica, y comprende, pero no se limita a, agentes anticancerigenos, compuestos dotados de yodo radiactivo, toxinas, farmacos citostaticos o citoliticos, etc. Los agentes anticancerigenos comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubina, doxorubicina, taxol, etoposido, fluorouracilo, interferon-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Se describen agentes anticancerigenos adicionales, por ejemplo, en Goodman y Gilman, quot;The Pharmacological Basis of Therapeuticsquot;, 8a edicion, 1990, McGraw-Hill, Inc., en particular el capitulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner)). Las toxinas pueden ser proteinas tales como proteina antiviral de fitolaca, toxina del colera, toxina pertusica, ricina, gelonina, abrina, exotoxina difterica o exotoxina de Pseudomonas. Los residuos de toxinas tambien pueden ser radionuclidos de emision de alta energia tales como cobalto-60.
El termino quot;complejo mayor de histocompatibilidadquot; o quot;CMHquot; se refiere a un complejo de genes que esta presente en todos los vertebrados. Las proteinas o moleculas de CMH estan implicadas en la senalizacion entre linfocitos y celulas presentadoras de antigeno en respuestas inmunitarias normales, en las que se unen a peptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de celulas T. Las moleculas de CMH se unen a peptidos dentro de un compartimento de procesamiento intracelular y presentan dichos peptidos en la superficie de celulas presentadoras de antigeno para su reconocimiento por celulas T. La region de CMH humana, tambien denominada HLA, esta ubicada en el cromosoma 6 y comprende las regiones de clase I y clase II. En una realizacion preferida segun todos los aspectos de la invencion, una molecula de CMH es una molecula de HLA.
El termino quot;pacientequot; comprende segun la invencion pacientes masculinos y femeninos, preferentemente pacientes femeninos. Los ejemplos de pacientes comprenden segun la invencion seres humanos, primates no humanos u otros animales, en particular mamiferos tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores tales como ratones y ratas. En una realizacion especialmente preferida, el paciente es un ser humano.
La expresion quot;enfermedad neoplasicaquot; se refiere a la formacion de novo de tejidos corporales en el sentido de crecimiento excesivo autonomo, no regulado y/o incontrolado, refiriendose el termino quot;enfermedadquot; a cualquier estado patologico. Una enfermedad neoplasica es una enfermedad tumoral o cancer tal como leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, gliomas, canceres de rinon, glandula suprarrenal, tiroides, intestino, higado, colon, estomago, tracto gastrointestinal, ganglios linfaticos, esofago, colorrectales, pancreas, oido, nariz y garganta (ONG), mama, prostata, utero, ovarios, huesos, vagina y pulmon, y en particular cancer del endometrio y metastasis del mismo que en el caso de cancer del endometrio, se producen, en particular, en ganglios linfaticos paraaorticos, huesos, pulmon, pelvis, higado y vagina. Se prefiere que se induzca una enfermedad neoplasica mediante carcinogenesis. Segun la invencion, las neoplasias se refieren a alteraciones benignas sin metastasis y alteraciones malignas, en particular con crecimiento invasivo y formacion de metastasis.
Segun la invencion, el termino quot;miometrioquot; se refiere a la fuerte capa intermedia de la pared uterina, formada por musculos lisos.
El termino quot;recidivaquot; se refiere segun la invencion a una recidiva de una enfermedad, en particular su recidiva tras su curacion o curacion aparente. Con respecto a una enfermedad tumoral, el termino quot;recidivaquot; se refiere a la recidiva de tumores tras el tratamiento satisfactorio inicialmente tal como tratamiento mediante cirugia, quimioterapia y/o radioterapia.
La expresion quot;cantidad aumentadaquot; se refiere preferentemente a un aumento en al menos el 10%, en particular al menos el 20%, al menos el 50% o al menos el 100%. La cantidad de una sustancia esta aumentada en un objeto de prueba tal como una muestra biologica con respecto a una referencia, incluso si puede detectarse en el objeto de prueba pero no esta presente y/o no puede detectarse en la referencia.
Una muestra biologica puede ser una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales, y/o una muestra celular, y puede obtenerse de la manera habitual tal como mediante biopsia de tejido, incluyendo biopsia en sacabocados, y tomando sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales.
Los terminos quot;celula Tquot; y quot;linfocito Tquot; incluyen celulas T cooperadoras y celulas T citoliticas o citotoxicas.
Algunos procedimientos terapeuticos se basan en una respuesta del sistema inmunitario de un paciente, que da como resultado la lisis de celulas presentadoras de antigeno tales como celulas cancerosas que presentan uno o mas peptidos. A este respecto, por ejemplo, se administran linfocitos T citotoxicos autologos que son especificos para un complejo de un peptido y una molecula de CMH a un paciente que presenta una anomalia celular. La produccion in vitro de tales linfocitos T citotoxicos se conoce.
En un procedimiento terapeutico que se denomina transferencia adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989) se combinan celulas que presentan el complejo deseado (por ejemplo, celulas dendriticas) con linfocitos T citotoxicos del paciente que va a tratarse, dando como resultado la propagacion de linfocitos T citotoxicos especificos. Los linfocitos T citotoxicos propagados se administran entonces a un paciente que presenta una anomalia celular, presentando las celulas anomalas el complejo especifico. Los linfocitos T citotoxicos lisan entonces las celulas anomalas, activando de ese modo una accion terapeutica deseada.
La transferencia adoptiva no es la unica forma de terapia que puede aplicarse. Tambien pueden generarse linfocitos T citotoxicos in vivo de manera conocida per se. En un procedimiento se utilizan celulas no proliferativas que expresan el complejo, tales como celulas tumorales irradiadas o celulas que se han transfectado con uno o ambos genes necesarios para la presentacion del complejo (es decir, el peptido antigenico y la molecula de CMH de presentacion). Una forma preferida es la introduccion de una proteina o un peptido que es caracteristico para un tumor, en forma de ARN recombinante, en celulas que entonces presentan el complejo de interes. Tales celulas se reconocen por linfocitos T citotoxicos autologos que entonces se propagan.
Puede lograrse una accion similar combinando una proteina o un peptido con un adyuvante para hacer posible la incorporacion in vivo en celulas presentadoras de antigeno. La proteina o el peptido pueden representarse como tal, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. La proteina o el peptido pueden procesarse de modo que se produzca una pareja peptidica para la molecula de HLA. Tambien es posible una presentacion sin que serequiera procesamiento adicional. Este es el caso en particular si los peptidos pueden unirse a moleculas de HLA. Se prefieren formas de administracion en las que el antigeno total se procesa in vivo por una celula dendritica, puesto que esto tambien puede producir respuestas de celulas T cooperadoras que se requieren para una respuesta inmunitaria eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74:75-79, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187:693-702, 1998).
Los terminos quot;inmunizacionquot; o quot;vacunacionquot; se refieren a un aumento o una activacion de una respuesta inmunitaria frente a un antigeno. Pueden emplearse modelos animales para someter a prueba un efecto de inmunizacion frente al cancer. Pueden introducirse, por ejemplo, celulas cancerosas humanas en un raton para crear un tumor, y administrarse uno o mas acidos nucleicos que codifican para proteinas o peptidos caracteristicos para celulas cancerosas. El efecto sobre las celulas cancerosas (por ejemplo, reduccion en el tamano tumoral) puede medirse como criterio para la eficacia de una inmunizacion mediante el acido nucleico.
Como parte de la composicion para inmunizacion, se administran preferentemente uno o mas antigenos o fragmentos estimulantes del mismo junto con uno o mas adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o aumentar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que se incorpora en el antigeno o se administra junto con el mismo y potencia la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden potenciar la respuesta inmunitaria proporcionando un reservorio de antigeno (de manera extracelular o en macrofagos), activando macrofagos y/o estimulando determinados linfocitos. Se conocen adyuvantes y comprenden de manera no limitativa monofosforillipido-A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; documento WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., Mol. Cells. 7:178-186, 1997), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanida, alumbre, oligonucleotidos CpG (vease Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biodegradables tales como escualeno y/o tocoferol. Preferentemente se administran peptidos en una mezcla con DQS21/MPL. La razon de DQS21 con respecto a MPL es normalmente de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1 y en particular de aproximadamente 1:1. En una formulacion de vacuna para la administracion a seres humanos, DQS21 y MPL estan presentes normalmente en un intervalo de desde aproximadamente 1 Ig hasta aproximadamente 100 Ig.
Tambien pueden administrarse otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria en el paciente. Por ejemplo, pueden utilizarse citocinas para una vacunacion debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Tales citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12) que ha mostrado que potencia los efectos protectores de las vacunas (vease Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
Pueden administrarse proteinas y peptidos de manera conocida per se. Por ejemplo, pueden administrarse acidos nucleicos mediante procedimientos ex vivo, es decir, retirando celulas de un paciente, modificando geneticamente las celulas para introducir un acido nucleico, y volviendo a introducir las celulas modificadas en el paciente. Esto comprende habitualmente introducir in vitro una copia funcional de un gen en las celulas de un paciente y devolver las celulas modificadas geneticamente al paciente. La copia funcional del gen esta bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten que el gen se exprese en las celulas modificadas geneticamente. El experto en la materia conoce procedimientos de transfeccion y transduccion. Tambien esta prevista segun la invencion la administracion de acidos nucleicos in vivo utilizando vectores tales como virus y liposomas dirigidos.
Preferentemente, se selecciona un vector viral para la administracion de un acido nucleico de entre el grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus, incluyendo virus Vaccinia y poxvirus atenuados, virus del bosque de Semliki, retrovirus, virus Sindbis y particulas pseudovirales Ty. Se prefieren especialmente adenovirus y retrovirus. Los retrovirus son normalmente deficientes para la replicacion (es decir, no pueden producir particulas infecciosas).
Pueden emplearse diversos procedimientos para introducir acidos nucleicos en celulas in vitro o in vivo. Tales procedimientos comprenden la transfeccion de precipitados con fosfato de calcio de acidos nucleicos, transfeccion de acidos nucleicos asociados con DEAE, transfeccion o infeccion con los virus anteriores que portan los acidos nucleicos de interes, transfeccion mediada por liposomas y similares. En formas de realizacion particulares, se prefiere el guiado del acido nucleico a celulas particulares. En tales formas de realizacion, un portador empleado para administrar un acido nucleico a una celula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede presentar una molecula de direccionamiento a la diana unida. Por ejemplo, puede incorporarse una molecula tal como un anticuerpo que es especifico para una proteina de membrana de superficie en la celula diana, o un ligando para un receptor en la celula diana, en el portador de acido nucleico o unirse al mismo. Si se desea la administracion de un acido nucleico mediante liposomas, pueden incorporarse proteinas que se unen a una proteina de membrana de superficie que esta asociada con endocitosis en la formulacion de liposomas para hacer que sea posible el direccionamiento a la diana y/o la captacion. Tales proteinas incluyen proteinas de la capside o fragmentos de las mismas, que son especificos para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteinas que se internalizan, proteinas que se direccionan a un sitio intracelular, y similares.
La presente invencion se describe en detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos que sirven exclusivamente para fines ilustrativos y no han de entenderse como limitativos. Formas de realizacion adicionales que estan englobadas asimismo por la invencion son accesibles al experto en la materia basandose en la descripcion y los ejemplos.
Figuras
Figura 1. Analisis de transferencia de tipo Northern utilizando una sonda especifica para EDI-3
Se obtuvo ARN de testiculos, musculo esqueletico, higado, pulmon, bazo, cerebro y corazon (carriles 1-8). Se encontro expresion del transcrito EDI-3 en testiculos (carril 1), musculo esqueletico (carril 3) y corazon (carril 8).
Figura 2. Expresion de EDI-3 en carcinomas endometriales primarios
Se encontro una expresion elevada en un factor de 6,4 en tumores metastasicos en comparacion con tumores no metastasicos (plt;=0,001; prueba de Mann-Whitney, bilateral). Solo se incluyeron las pacientes observadas a lo largo de un periodo de al menos 5 anos. Sin embargo, tambien se obtiene una diferencia con respecto a la expresion de EDI-3 cuando se incluyen las 57 pacientes, incluyendo tambien las observadas a lo largo de periodos mas cortos a 5 anos (plt;0,001, datos no mostrados). La linea horizontal en el centro de una caja indica el valor de la mediana de la muestra. Los bordes de una caja indican los percentiles 25° y 75°. Los bigotes indican el intervalo de valores que se encuentran dentro de 1,5 longitudes de caja.
Figura 3. Experimento de confirmacion utilizando un segundo par de cebadores para cuantificar la expresion de ARNm de EDI-3
El par de cebadores n.° 1 amplifica un fragmento entre las posiciones de pb 2872 y 3172, mientras que el par de cebadores n.° 2 da como resultado una amplificacion entre las posiciones de pb 3161 y 3362. La PCR cuantitativa produjo una correlacion con plt;0,001 y R=0,824.
Figura 4. Experimento de confirmacion utilizando un segundo par de cebadores para cuantificar la expresion de ARNm de EDI-3
De manera similar a los resultados obtenidos con el primer par de cebadores, se encontro una mayor expresion de EDI-3 en tumores metastasicos en comparacion con tumores no metastasicos (plt;0,001, prueba de Mann-Whitney, bilateral). Solo se tuvieron en cuenta las pacientes observadas a lo largo de un periodo de al menos cinco anos. La linea horizontal en el centro de una caja indica el valor de la mediana de la muestra. Los bordes de una caja marcan los percentiles 25° y 75° percentiles. Los bigotes indican el intervalo de valores que se encuentran dentro de 1,5 longitudes de caja.
Figura 5. Analisis de Kaplan-Meier de la asociacion entre la expresion del transcrito EDI-3 y el intervalo de tiempo hasta una recidiva tras reseccion de tejido de cancer endometrial
Se dicotomizo la expresion de EDI-3 utilizando el percentil del 75% (p=0,0023, prueba de rangos logaritmicos).
Figura 6. Analisis de Kaplan-Meier de la asociacion entre la expresion del transcrito EDI-3 y el intervalo de tiempo hasta una recidiva en funcion del estadio de FIGO
Se dicotomizo la expresion de EDI-3 utilizando el percentil del 75%.
Figura 7. Experimento de confirmacion utilizando un segundo par de cebadores para cuantificar la expresion de ARNm de EDI-3
De manera similar a los resultados obtenidos con el primer par de cebadores, el intervalo de tiempo hasta la aparicion de una recidiva fue mas largo para pacientes con baja expresion de EDI-3 en comparacion con pacientes con alta expresion de EDI-3 tras reseccion de tejido de cancer endometrial. Se dicotomizo EDI-en el percentil del 75% (plt;0,001, prueba de rangos logaritmicos).
Ejemplos
Ejemplo 1:�Pacienees y mueseras�ee eejieo
Entre 1985 y 2000, se trataron 269 pacientes con cancer de endometrio confirmado de manera histologica en el Departamento de Obstetricia y Ginecologia en el Hospital Universitario en Maguncia, Alemania.
Pudo obtenerse ARN de alta calidad solo de 63 de estas pacientes por tres motivos: (i) partes de las muestras de tumor utilizadas para el analisis de ARN se examinaron adicionalmente de manera histologica. Si la fraccion de celulas tumorales era menor que el 95%, la muestra no se incluyo en el presente estudio. (ii) No fue posible congelar ningun tejido de algunos pacientes con tumores pequenos. (iii) La calidad de algunas muestras de ARN no fue suficiente basandose en la razon de bandas de 28S y 18S, o la expresion del gen de huPO (fosfoproteina humana) constitutivo era demasiado baja (Mohrmann G. et al., Int. J. Cancer, en impresion, 2005). Basandose en la informacion de las historias clinicas, incluyendo informes quirurgicos e informes patologicos, se genero una base de datos. Se incluyeron el tipo y grado de tumor histologico, el peso, la altura y la edad de las pacientes, diabetes mellitus, el estadio de FIGO, el tipo de cirugia y la clasificacion TNM patologica. El estadio de FIGO seguia el sistema de determinacion de estadio quirurgico para carcinomas endometriales de 1988 (Creasman W T, Gynecol Oncol 1989; 35: 125-7). Se calculo el indice de masa corporal (IMC) utilizando la formula IMC = h. Se
[peso/(altura)2calculo el tiempo libre de recidiva como la diferencia entre la fecha de un tratamiento quirurgico y la fecha de una documentacion de una recidiva. Se desarrollaron recidivas debidas a un nuevo crecimiento tumoral en ganglios linfaticos paraaorticos, pelvis, huesos, pulmon, higado y vagina. Se evaluaron todas las muestras histologicas por un patologo experimentado. Se clasificaron todos los tumores segun la clasificacion OMS/ISGPY (Scully R E et al., International Classification and Histologic Typing of Female Genital Tract Tumours. Springer: Nueva York, 1994). Se determino el grado del tumor segun Kurman et al. (Kurman R J et al., En: Kurman R J, ed. Blaustein's Pathology of the Female Genital Tract, 4a ed. Springer: Nueva York, 1994, 439-86), teniendo en cuenta caracteristicas estructurales y caracteristicas centrales. Se clasifico la profundidad de invasion segun Sevin y Angioli (Sevin B-U, Angioli R. Uterine Corpus: Multimodality Therapy in Gynecologic Oncology. Thieme: Nueva York, 1996) en funcion de la infiltracion del tercio interno, central y externo del miometrio. Para el aislamiento de ARN, solo se incluyeron en el estudio muestras de tumor controladas de manera histologica que contenian al menos el 95% de celulas tumorales sin endometrio o miometrio no neoplasico. Un procedimiento quirurgico convencional fue la histerectomia abdominal y ovariosalpingectomia bilateral. Se diseccionaron los ganglios linfaticos en los casos en los que secciones congeladas intraquirurgicas mostraron infiltracion del tercio externo del miometrio y tambien en los casos con afectacion cervicouterina, dependiendo de factores de morbilidad general del paciente.
Entre los 63 pacientes con ARN disponible de alta calidad, se seleccionaron tres parejas de pacientes con estadio de FIGO, grado, tipo de tumor histopatologico, tipo de cirugia, estado menopausico, profundidad de invasion en el miometrio identicos, asi como un indice de masa corporal similar. Estas parejas comprendian en cada caso una paciente que desarrollo metastasis en el plazo de cinco anos tras la cirugia y otra paciente en la que no se encontro
que tuviera ninguna metastasis dentro de un periodo de observacion de al menos cinco anos. Se utilizaron las seis pacientes relacionadas (quot;conjunto de seleccion de tumoresquot;) para identificar genes expresados de manera diferencial.
Las 57 pacientes restantes sirvieron como quot;conjunto de validacionquot; y comprendian 13 pacientes que desarrollaron metastasis mas tarde, mientras que las demas pacientes permanecieron libres de tumor. Se utilizo el quot;conjunto de validacionquot; para tratar dos cuestiones con respecto a genes candidatos que se habian identificado en el quot;conjunto de seleccionquot; de tumores: (i) imostraron los tumores primarios de pacientes que mas tarde desarrollaron metastasis una mayor expresion de un gen candidato que las pacientes sin metastasis? (ii) ise identificaron genes candidatos en el quot;conjunto de seleccion de tumoresquot;, que estaban asociados con el periodo hasta una recidiva en un analisis multivariante? Se resumen las caracteristicas de las pacientes en la tabla 1.
Tabla 1. Propiedades del quot;conjunto de validacionquot; de pacientes con carcinomas endometriales primarios
Carcinomas endometriales primarios (n = 57)
Numero evaluado (n = 57)
% No analizable
Estadio de FIGO
1
Estadio I
35 62,5
Estadio II
7 12,5
Estadio III
11 19,6
Estadio IV
3 5,4
Grado histologico Estadio I Estadio II Estadio III
18 23 14 32,7 41,8 25,5 2
Profundidad de invasion1 baja alta
21 36 36,8 63,2 0
Metastasis2 No Si Estado menopausico pre post
42 13 6 51 76,4 23,6 10,5 89,5 2 0
Edad en la cirugia (anos, promedio p desviacion estandar)
68,5 p 11,5
Altura (cm, promedio p desviacion estandar)
163 p 5,2
Peso (kg, promedio p 79,5 p 16,9 desviacion estandar) 1Se clasifico la profundidad de invasion como baja (infiltracion de como maximo el tercio interno del miometrio) y alta (infiltracion de los tercios central y externo del miometrio).2Metastasis: tras haberse extirpado el tumor primario mediante cirugia convencional (histerectomia abdominal y ovariosalpingectomia bilateral), se distinguieron dos clases: (i) quot;sin metastasisquot;, si la paciente permanecio libre de tumor, (ii) quot;metastasisquot;, si se encontro un crecimiento tumoral renovado en cualquiera de los siguientes sitios: ganglios linfaticos paraaorticos, pelvis, huesos, pulmon, higado o vagina.
Ejemplo 2:�Preseneacion�ei�erencial
Se aislo ARN de tejido congelado utilizando un kit disponible comercialmente (MidiKit, Qiagen, Hilden, Alemania). Se evaluo la calidad del ARN aislado por medio de la razon de las bandas de 28S y 18S en un gel de agarosa al 1% y por medio de la expresion del gen de huPO constitutivo, tal como se describio anteriormente (Mohrmann G et al., Int.
J. Cancer, en impresion, 2005). Se determinaron espectrofotometricamente las concentraciones del ARN aislado. Se llevo a cabo transcripcion inversa utilizando el kit de presentacion diferencial DeltaTM (Clontech, Heidelberg,
Alemania). Se obtuvo la amplificacion utilizando los cebadores P y T representados a continuacion (Arbitrary Primer, Clontech, Heidelberg, Alemania):
Cebadores P
P 1: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3' P 2: 5'-ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3' P 3: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3' P 4: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3' P 5: 5'-ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3' P 6: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGTG-3' P 7: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3' P 8: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3' P 9: 5'-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3' P 10: 5'-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3'
Cebadores T
T 1: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAA-3' T 2: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAC-3' T 3: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAG-3' T 4: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCA-3' T 5: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3' T 6: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCG-3' T 7: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3' T 8: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3' T 9: 5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3'
Se fraccionaron los productos de la primera amplificacion en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 8% y se visualizaron mediante tincion con plata utilizando el kit de tincion con plata rapida (ICN Biomedicals, Ohio, EE.UU.). Se cortaron las bandas que eran visibles en muestras de pacientes con metastasis pero que estaban ausentes en muestras de pacientes con tumores no metastasicos, y se purifico el ADN utilizando el kit QiaExII (Qiagen, Hilden, Alemania). Para preparar suficiente ADN para la secuenciacion, se amplifico de nuevo el producto purificado con la ayuda de los mismos cebadores utilizados para la identificacion. Tras la purificacion por medio de columnas QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania), se determino la secuencia de ADN mediante secuenciacion ciclica.
Un estudio de presentacion diferencial del quot;conjunto de seleccion de tumoresquot; dio como resultado la identificacion de tres transcritos, concretamente EDI-1, EDI-2 y EDI-3, que estaban presentes en tumores que formaban metastasis, pero no se expresaban en carcinomas endometriales no metastasicos.
Se encontro EDI-1 por medio de los cebadores de Clontech P 3 y T 3 y presentaba una longitud de 260 pb en el gel de poliacrilamida. Tras una nueva amplificacion, purificacion y secuenciacion con la ayuda del cebador P 3, se obtuvo la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 1.
Se encontro EDI-2 por medio de los cebadores de Clontech P 2 y T 5 y presentaba una longitud de 190 pb en el gel de poliacrilamida. Tras una nueva amplificacion, purificacion y secuenciacion con la ayuda del cebador de Clontech P 2, se obtuvo la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 2.
Se obtuvo EDI-3 por medio de los cebadores de Clontech P 3 y T 3 y presentaba una longitud de 270 pb en el gel de poliacrilamida. Tras una nueva amplificacion, purificacion y secuenciacion con la ayuda del cebador de Clontech P 3, se obtuvo la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 3.
El fragmento de acido nucleico de EDI-3 secuenciado presenta homologia con un transcrito no caracterizado aun funcionalmente de 5444 pb (numero de registro AL109935.39.1.178601, SEQ ID NO: 7) que contiene un marco de lectura abierto predicho de 2016 pb. Segun la informacion de la base de datos, el gen correspondiente consiste en 20 exones y esta ubicado en el brazo corto del cromosoma 20 en la banda de p13. El analisis de transferencia de tipo Northern confirmo el tamano de transcrito esperado (figura 1).
Ejemplo 3:�RT-PCR cuaneieaeiva
Se llevo a cabo un analisis de TaqMan tal como se describio recientemente (Mohrmann G et al., Int. J. Cancer, en impresion, 2005). Brevemente, se aislo ARN total de tejido tumoral utilizando el minikit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) y se cuantifico midiendo la densidad optica a 260 nm. Se utilizaron 2 Ig de ARN total para una mezcla basica de sintesis de ADNc que contenia 2,5 Il de transcriptasa inversa MultiScribe (50 U/Il, Applied Biosystems), 10 Il de tampon RT, 22 Il de MgCl2 25 mM, 20 Il de mezcla de dNTP (Applied Biosystems), 2 Il de inhibidor de ARNasa (20 U/Il, Applied Biosystems), 5 Il de hexameros aleatorios (50 IM, Applied Biosystems) en un volumen
total de 100 Il. Se incubo la mezcla a 25°C durante 2 minutos, a 48°C durante 30 minutos, y se inactivo la enzima a 95°C durante 5 minutos. Se diluyeron todos los ADNc anadiendo 150 Il de agua tratada con DEPC y se almacenaron a -20°C. Para un analisis de PCR cuantitativa se utilizo la tecnologia de PCR Taq-ManTM (sistema de deteccion de secuencias Gene Amp 5700, ABI, Weiterstadt, Alemania). Se llevo a cabo una PCR en un volumen de 25 Il con 12,5 Il de mezcla maestra de PCR SYBR GREEN (que incluye tampon de enzima, colorante fluorescente y nucleotidos, Applied Biosystems), 5 IM de cada cebador (2,5 Il, 10 mM), 2,5 Il de agua tratada con DEPC y 5 Il de molde de ADNc. Se utilizaron dos pares de cebadores para el analisis de EDI-3: (i) 5'-TTTCA AAATG CTGCA GGGTA AT-3' y 5'-ACCCA CAAAG CAACA GTGTG TA-3', (ii) 5'-CACAA TCTGC TTCTA ATCCA AGAA-3' y 5'-TGCTT TGTGG GTTTG TTTTG TA-3'. La PCR comprendia preincubacion a 50°C durante 2 minutos, seguida por desnaturalizacion a 95°C durante 10 minutos. Se llevaron a cabo 40 ciclos, incluyendo desnaturalizacion a 95°C durante 15 segundos, hibridacion a 60°C durante 60 segundos y elongacion a 72°C durante 30 segundos. La reaccion estuvo seguida por el protocolo de disociacion, mediante el cual se estudio el intervalo entre 60 y 94°C. Se midieron los intervalos de emision del colorante fluorescente en tiempo real durante la PCR, y se obtuvieron valores relativos de cuantificacion de ARNm a partir del numero de ciclos umbral a partir del cual podia detectarse el aumento en la senal asociada con el crecimiento exponencial del producto de PCR. Se utilizo software de sistema de deteccion de secuencias, version 1.6 (ABI, Weiterstadt, Alemania). Se normalizo la cuantificacion mediante el gen de huPO (fosfoproteina humana) constitutivo segun Vlachtsis et al. (Vlachtsis K et al., Oncol Rep. 9: 1133-8, 2002). Se incluyo un control negativo sin transcriptasa inversa en todos los analisis de PCR.
Utilizando el quot;conjunto de validacion de carcinomasquot;, se investigo si era posible confirmar la diferencia con respecto a la expresion de EDI-3, hallada en el quot;conjunto de seleccion de tumoresquot;. Una RT-PCR cuantitativa indico una expresion elevada de EDI-3 en un factor de 6,4 en carcinomas endometriales metastasicos en comparacion con carcinomas endometriales no metastasicos (plt;0,001, figura 2). Se obtuvieron resultados similares en un estudio independiente de la misma especie de ARN utilizando un segundo par de cebadores (figuras 3 y 4).
Ejemplo 4:�aa�erpresion ee EDI-3�ineica �supervivencia�libre�ee�recieiva
Si la expresion de EDI-3 esta asociada con una formacion de metastasis, podria suponerse que EDI-3 fuese un indicador de la ausencia de recidiva. La expresion de EDI-3 (dicotomizada en el percentil del 75%) estaba asociada en efecto con una supervivencia libre de recidiva (figura 5). El intervalo de tiempo promedio hasta una recidiva era de 1,47 anos en el caso de pacientes que expresaban grandes cantidades de EDI-3. En cambio, el 79% de pacientes con baja expresion de EDI-3 estuvieron libres de tumor 5 anos tras la cirugia (p=0,0023). Utilizando el modelo de los riesgos proporcionales, EDI-3 era significativo en un analisis univariante (RR=4,3, P=0,002), y en un analisis de regresion ascendente multivariante con el estadio de FIGO (I, II frente a III, IV), una edad de mas de 70 anos, diabetes mellitus (s/n), determinacion del grado (1, 2 frente a 3) y la profundidad de invasion en el miometrio (0-2 mm frente a +3 mm) como covariables (RR=3,6, P=0,012). Solo la expresion de EDI-3 y el estadio de FIGO eran pronosticos en un analisis multivariante (tabla 2).
Tabla 2: Asociacion de la expresion de EDI-3 con la supervivencia libre de tumor en 57 pacientes con cancer primario del endometrio (quot;conjunto de validacion de tumoresquot;), utilizando el modelo de riesgos proporcionales univariante y multivariante (analisis de Cox)
Analisis univariante Factor Riesgo relativo Intervalo de confianza del Valor de p
95%
ARNm de EDI-3 4,3 1,7-11,0 0,002
Analisis multivariante Ajustado al estadio de FIGO (I, II frente a III, IV), determinacion de estado (1, 2 frente a 3), profundidad de invasion (0-2 mm frente a +3 mm), edad (menos frente a mas de 70 anos) y diabetes mellitus Factor Riesgo relativo Intervalo de confianza del Valor de p
95%
ARNm de EDI-3 3,6 1,3-9,7 0,012
(estadio de FIGO (estadio 5,1 1,8-14,0 0,002 I, II frente a III, IV)
Un ajuste con respecto al estadio de FIGO podria ser problematico debido a una posible violacion de la suposicion de riesgos proporcionales en la que se basa el modelo de Cox, y el pequeno tamano de muestra. Sin embargo, el efecto de EDI-3 sigue siendo significativo, si se incluye el estadio de FIGO como factor en el modelo de Cox (p=0,012), asi como si se utiliza el estadio de FIGO para estratificacion, suponiendo funciones de riesgo diferentes para una enfermedad limitada (FIGO I, II) y avanzada (FIGO III, IV) (plt;0,001, figura 6). Para someter a prueba la reproducibilidad de la RT-PCR cuantitativa, se estudio adicionalmente la misma especie de ARNm utilizando un segundo par de cebadores dirigidos a una region del transcrito EDI-3 ubicada mas en el sentido de 3'. Los datos obtenidos con el segundo par de cebadores coincidian con los del primer par de cebadores (plt;0,001, R=0,824) y confirmaron una relacion entre la expresion de EDI-3 y una supervivencia libre de recidiva (tabla 3, figura 7).
Tabla 3: Experimento de confirmacion utilizando un segundo par de cebadores para cuantificar la expresion de ARNm de EDI-3. De manera similar a los resultados obtenidos con el primer par de cebadores, la expresion del transcrito EDI-3 estaba asociada con la supervivencia libre de tumor en 57 pacientes con cancer primario del endometrio (quot;conjunto de validacion de tumoresquot;), utilizando el modelo de riesgos proporcionales univariante y multivariante (analisis de Cox)
Analisis univariante Factor Riesgo relativo Intervalo de confianza del Valor de p 95%
ARNm de EDI-3 7,9 3,0-21,3 lt; 0,001
Analisis multivariante Ajustado al estadio de FIGO (I, II frente a III, IV), determinacion de estado (1, 2 frente a 3), profundidad de invasion (0-2 mm frente a +3 mm), edad (menos frente a mas de 70 anos) y diabetes mellitus Factor Riesgo relativo Intervalo de confianza del Valor de p
95%
ARNm de EDI-3 7,3 2,7-19,9 lt; 0,001
aisea�ee �secuencias
lt;110� Johannes Gutenberg-Universidad de Maguncia, representada por el presidente, et al.
lt;120� Marcadores moleculares para el diagnostico y el tratamiento de tumores
lt;130� 410-3 PCT
lt;150� Documento DE 10 2005 059 242.2 lt;151�
lt;160� 31
lt;170� PatentIn version 3.1
lt;210� 1 lt;211� 162 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (5)..(5) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (8)..(8) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (17)..(17) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (20)..(20) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (25)..(25) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (26)..(26) lt;223� incierta lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (29)..(29)
5 lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (36)..(36) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (44)..(44)
15 lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (46)..(46) lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (50)..(50)
25 lt;223� incierta
lt;400� 1
lt;210� 2 lt;211� 51 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens
35
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (30)..(30) lt;223� incierta
lt;400� 2 cccttctccc tgcactcaat aaaccctcan taaatattct cattgtcaat c
51
45
lt;210� 3 lt;211� 156 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (5)..(5) lt;223� incierta
lt;400� 3
lt;210� 4 lt;211� 126 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (8)..(8)
5 lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (10)..(10)
10 lt;223� incierta
lt;220� lt;221� misc�feature lt;222� (14)..(14)
15 lt;223� incierta
lt;400� 4
20 lt;210� 5
lt;211� 70
lt;212� ADN
lt;213� �omo sapiens
lt;210� 6 lt;211� 145 30 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens
35 lt;210� 7 lt;211� 5444 lt;212� ADN lt;213� �omo sapiens
40 lt;220� lt;221� CDS lt;222� (206)..(2224) lt;223�
45 lt;400� 7
lt;210� 8 lt;211� 672 lt;212� PRT lt;213� �omo sapiens
lt;400� 8
lt;210� 9
5
lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
10
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 9 attaaccctc actaaatgct gggga
25
15
lt;210� 10 lt;211� 26 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
20
lt;220� lt;223� oligonucleotido
25 30
lt;400� 10 attaaccctc actaaatcgg tcatag lt;210� 11 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial lt;220� lt;223� oligonucleotido 26
lt;400� 11 attaaccctc actaaatgct ggtgg
25
5
lt;210� 12 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
15
lt;400� 12 attaaccctc actaaatgct ggtag lt;210� 13 lt;211� 26 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial 25
lt;220� lt;223� oligonucleotido
25
lt;400� 13 attaaccctc actaaagatc tgactg 26
lt;210� 14 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
35
lt;400� 14 attaaccctc actaaatgct gggtg 25
lt;210� 15 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
45
lt;220� lt;223� oligonucleotido lt;400� 15 attaaccctc actaaatgct gtatg 25
lt;210� 16 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
55
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 16 attaaccctc actaaatgga gctgg
25
lt;210� 17 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
65
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 17 attaaccctc actaaatgtg gcagg
25
5
lt;210� 18 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
15
lt;400� 18 attaaccctc actaaagcac cgtcc lt;210� 19 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial 25
lt;220� lt;223� oligonucleotido
25
lt;400� 19 cattatgctg agtgatatct ttttttttaa 30
lt;210� 20 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
35
lt;400� 20 cattatgctg agtgatatct ttttttttac 30
lt;210� 21 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
45
lt;220� lt;223� oligonucleotido lt;400� 21 cattatgctg agtgatatct ttttttttag 30
lt;210� 22 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
55
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 22 cattatgctg agtgatatct ttttttttca
30
lt;210� 23 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
65
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 23 cattatgctg agtgatatct ttttttttcc
30
5
lt;210� 24 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
15
lt;400� 24 cattatgctg agtgatatct ttttttttcg lt;210� 25 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial 30
lt;220� lt;223� oligonucleotido
25
lt;400� 25 cattatgctg agtgatatct ttttttttga 30
lt;210� 26 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
lt;220� lt;223� oligonucleotido
35
lt;400� 26 cattatgctg agtgatatct ttttttttgc 30
lt;210� 27 lt;211� 30 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
45
lt;220� lt;223� oligonucleotido lt;400� 27 cattatgctg agtgatatct ttttttttgg 30
lt;210� 28 lt;211� 22 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
55
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 28 tttcaaaatg ctgcagggta at
22
lt;210� 29 lt;211� 22 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
65
lt;220� lt;223� oligonucleotido
lt;400� 29 acccacaaag caacagtgtg ta
22
5
lt;210� 30 lt;211� 24 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial
10
lt;220� lt;223� oligonucleotido
15 20
lt;400� 30 cacaatctgc ttctaatcca agaa lt;210� 31 lt;211� 22 lt;212� ADN lt;213� secuencia artificial lt;220� lt;223� oligonucleotido 24
25
lt;400� 31 tgctttgtgg gtttgttttg ta 22

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de diagnostico y/o monitorizacion de un tumor endometrial en un paciente, que comprende
    (i)
    detectar y/o determinar la cantidad de un acido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un acido nucleico, que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6 y 7, y una parte de al menos 30 nucleotidos consecutivos de la misma,
    (b)
    un acido nucleico, que se hibrida con el acido nucleico de (a) en condiciones restrictivas,
    (c)
    un acido nucleico, que es degenerado con respecto al acido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un acido nucleico, que es complementario del acido nucleico de (a), (b) o (c), y/o
    (ii)
    detectar y/o determinar la cantidad de una proteina o peptido codificado por el acido nucleico de (i) o de una parte del mismo,
    en una muestra biologica aislada de un paciente, que comprende tejido corporal endometrial,
    en el que la presencia del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo y/o una cantidad aumentada del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo en comparacion con un paciente sin un tumor endometrial, sin riesgo de presentar un tumor endometrial, sin metastasis de un tumor endometrial y/o sin riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial, indica la presencia de un tumor endometrial, riesgo de presentar un tumor endometrial, metastasis de un tumor endometrial y/o riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial.
  2. 2. Procedimiento de evaluacion y/o pronostico del comportamiento metastasico y/o la aparicion de una recidiva de un tumor endometrial, que comprende
    (i)
    detectar y/o determinar la cantidad de un acido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un acido nucleico, que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6 y 7, y una parte de al menos 30 nucleotidos consecutivos de la misma,
    (b)
    un acido nucleico, que se hibrida con el acido nucleico de (a) en condiciones restrictivas,
    (c)
    un acido nucleico, que es degenerado con respecto al acido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un acido nucleico, que es complementario del acido nucleico de (a), (b) o (c), y/o
    (ii)
    detectar y/o determinar la cantidad de una proteina o un peptido codificado por el acido nucleico de (i) o de una parte del mismo,
    en una muestra biologica aislada de un paciente que comprende tejido corporal endometrial,
    en el que la presencia del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo y/o una cantidad aumentada del acido nucleico, la proteina o el peptido o la parte del mismo en comparacion con un paciente sin un tumor endometrial, sin riesgo de presentar un tumor endometrial, sin metastasis de un tumor endometrial, sin riesgo de presentar metastasis de un tumor endometrial, sin una recidiva de un tumor endometrial y/o sin riesgo de presentar una recidiva de un tumor endometrial, indica la presencia de metastasis o recidiva de un tumor endometrial o un riesgo de presentar metastasis o recidiva de un tumor endometrial.
  3. 3.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 2, que permite distinguir entre alteraciones benignas y malignas.
  4. 4.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la deteccion y/o determinacion de la cantidad comprende
    (i)
    poner en contacto la muestra biologica con un agente, que se une especificamente al acido nucleico o a la proteina o al peptido o a la parte del mismo, y
    (ii)
    detectar la formacion de un complejo entre el agente y el acido nucleico o la proteina o el peptido o la parte del mismo.
  5. 5.
    Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que
    (i) el agente, que se une especificamente al acido nucleico es un oligonucleotido o polinucleotido que se hibrida especificamente con el acido nucleico, o
    (ii)
    el agente, que se une especificamente a la proteina o al peptido o a la parte del mismo es un anticuerpo que 5 se une especificamente a la proteina o al peptido o a la parte del mismo.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en el que la monitorizacion de un tumor endometrial comprende determinar la regresion, el desarrollo o la aparicion del tumor endometrial en una muestra del paciente.
    10 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tumor endometrial es un tumor endometrial metastasico.
ES06829534T 2005-12-12 2006-12-12 Marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de tumores Active ES2407113T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200510059242 DE102005059242A1 (de) 2005-12-12 2005-12-12 Molekulare Marker für eine Tumordiagnose und -therapie
DE102005059242 2005-12-12
PCT/EP2006/011953 WO2007068449A2 (de) 2005-12-12 2006-12-12 Molekulare marker für eine tumordiagnose und -therapie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2407113T3 true ES2407113T3 (es) 2013-06-11

Family

ID=37944732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06829534T Active ES2407113T3 (es) 2005-12-12 2006-12-12 Marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de tumores

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8349562B2 (es)
EP (1) EP1960544B1 (es)
DE (1) DE102005059242A1 (es)
ES (1) ES2407113T3 (es)
WO (1) WO2007068449A2 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005059242A1 (de) * 2005-12-12 2007-06-14 Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Vertreten Durch Den Präsidenten Molekulare Marker für eine Tumordiagnose und -therapie
EP2787350A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-08 Atlas Antibodies AB ASRGL1 in endometrial cancer
CR20170562A (es) 2015-06-24 2018-02-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad diseñada.

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO1999045147A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 Diadexus Llc A novel method of detecting and monitoring endometrial and uterine cancers
EP1109937B1 (en) 1998-09-02 2008-11-05 Diadexus, Inc. METHOD OF DIAGNOSING, MONITORING, STAGING, and IMAGING VARIOUS CANCERS
WO2001060860A2 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
US20030165831A1 (en) 2000-03-21 2003-09-04 John Lee Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US20030069180A1 (en) 2000-06-09 2003-04-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20020177552A1 (en) 2000-06-09 2002-11-28 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20020156011A1 (en) 2000-06-09 2002-10-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20030165863A1 (en) * 2001-01-16 2003-09-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. NARC10 and NARC16, programmed cell death-associated molecules and uses thereof
EP2500438A3 (en) * 2002-09-25 2012-11-28 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of psoriasis
EP1590441A4 (en) * 2003-02-05 2006-11-02 Millennium Pharm Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING HUMATOLOGIC STRAINS USING 9118, 990, 17662, 81982, 630, 21472, 17692, 19290, 21620, 21689, 28899, 53659, 64549, 9465, 23544, 7366, 27417, 57259, 21844, 943 , 2061, 5891, 9137, 13908, 14310, 17600, 25584, 27824, 28469, 38947, 53003, 965, 56639, 9661, 16052, 15
AU2004219603A1 (en) 2003-03-11 2004-09-23 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of immune related disease
AU2004303448A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Mount Sinai Hospital Methods for detecting markers associated with endometrial disease or phase
DE102005059242A1 (de) * 2005-12-12 2007-06-14 Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Vertreten Durch Den Präsidenten Molekulare Marker für eine Tumordiagnose und -therapie

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007068449A2 (de) 2007-06-21
WO2007068449A3 (de) 2007-10-11
EP1960544A2 (de) 2008-08-27
DE102005059242A1 (de) 2007-06-14
US20130266936A1 (en) 2013-10-10
US9109258B2 (en) 2015-08-18
US20100285452A1 (en) 2010-11-11
US8349562B2 (en) 2013-01-08
EP1960544B1 (de) 2013-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2434945T3 (es) Identificación de antígenos asociados a tumores para el diagnóstico y la terapia
JP6196350B2 (ja) 診断および治療のための腫瘍関連細胞表面抗原の同定
ES2346067T3 (es) Identificacion de antigenos asociados a la superficie para el diagnostico y la terapia de tumores.
ES2537319T3 (es) Identificación de antígenos asociados a superficies para el diagnóstico y la terapia de tumores
ES2744244T3 (es) Método para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de metástasis de cáncer de próstata usando c-MAF
ES2727904T3 (es) Método para el pronóstico y tratamiento de cáncer metastatizante del hueso que se origina a partir de cáncer de mama
ES2963717T3 (es) Métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento del cáncer
PT1994410E (pt) Métodos e estojos para detecção precoce de cancro ou de predisposição a este
KR102047502B1 (ko) 포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물
Mauro et al. Estrogen receptor β and epidermal growth factor receptor as early-stage prognostic biomarkers of non-small cell lung cancer
Kleeff et al. Down-regulation of DOC-2 in colorectal cancer points to its role as a tumor suppressor in this malignancy
US11022612B2 (en) BARD1 isoforms in lung and colorectal cancer and use thereof
ES2407113T3 (es) Marcadores moleculares para el diagnóstico y el tratamiento de tumores
JP5145549B2 (ja) 腫瘍マーカー
CN102498219A (zh) 在得自对象的生物学样品中评价癌症的方法
ES2398391T3 (es) Polinucleótidos relacionados con cáncer de colon
US9822184B2 (en) DCLK1 short form specific binding agents
ES2267291T3 (es) Metodo de diagnostico, control, determinacion del estadio, obtencion de imagenes y tratamiento de los canceres ginecologicos.
ES2476375T3 (es) Procedimientos in vitro para detectar cáncer renal
ES2316501T3 (es) Moleculas marcadoras asociadas con tumores pulmonares.
JP2008169132A (ja) Ｌｉｎ７ｃの癌の転移診断への応用
KR20110036996A (ko) 편평세포암 진단 마커인 ｈｏ-1 및 이의 용도
ES2339524B1 (es) Nuevo biomarcador como diana terapeutica en cancer de pulmon.
WO2011126740A2 (en) Hip1 cancer markers
WO2015144968A1 (es) Método de predicción de respuesta al tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda