ES2396376T5 - Sitios intergénicos entre genes conservados en el genoma del virus vaccinia de vaccinia Ankara modificado (MVA) - Google Patents

Sitios intergénicos entre genes conservados en el genoma del virus vaccinia de vaccinia Ankara modificado (MVA) Download PDF

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Description

Sitios inlergénioos enlre genes conservados en el genana del virus vaccinia de vaccinia Ankara modificado (WNN¡
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a silbs de inserción útiles para la iltegración eslcble de secuencias exógenas de AON en el genana del tINA
Descripción de la técnica relacionada
Los miembros de la fami lia poxvirus tienen grandes genomas de AON bicatenario q..¡e codifican varios centenares de proteinas (~s, B_ 2007 "Poxviridae: lhe Viruses and Their Replicalionn en Fields Virology, 58 edición (DM Knipe,
P.M. Howley, D.E. Griffin, R. A Lamb, M.A. ~rtjn, B. Roizman, yS.E. Straus, Eds), Lippinootl Williams & Wilkins, Philadephia, PA)_La secuencia genómica de la cepa \laccinia fuertemente atenuada vaccinia Ankara modificada (MVA) (~'Jf, A et al. 1978 Zentralbl Bakteriol 167:375-390), que no puede crecer en la ma~ría de las células de mamífero y que es un buen candidato para Ln 'vector de vacuna recombnalte, es conocida (Sutler, G_y ~ss, B 1992 Proc Nall .Acad Sci USA 89:10847-10851 ; y Suller G_et al. 1994 Vaccine 12:1032-1040) ha sido sometida a pases más de 570 veces en fibroblastos de embrión de pollo, durante lo cual se han producido 6 deleciooes principales con relación a la cepa parental M kara de tipo salvaje, aCOO1pañadas por una restricción severa en el campo del hospedador (~yer, H et al _1991 J Gen Vlrol 72: 1031 -1038)
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a nuel,lOs sitios de inserción útiles para la integración de secuencias exógenas en una región intergénica (IGR) de un genoma del virus vaccinia, en la q..¡e la IGR está localizada entre o está flanqueada por los marcos de lectura abiertos (ORF) 069-070 del genoma del virus vaccinia en la nomenclatura de CDCf.Acambis y donde los ORF corresponden a genes conservados, ya 'vectores plasmidicos afires útiles para insertar AON exógeno en el genoma del virus vaccinia, y adicionalmente a virus vaccinia recombinantes que comprenden Lna secuencia elÓgena insertada en dicho nuel,lO sitio de inserción como medicamento o vacuna
Breye descriPCión de los dibujos
Figura 1. Relaciones filogenéticas de V1H-1 YVIH-2 basadas en la identidad de secuencias del gen pd. SIVep¡: y SIVsmm son lenti".;rus de primates subhtmalos reruperados de un chimpmcé y un mono negro mangabey, respectivamente . Figura 2_Relaco nes filogenélicas de los grl4los M, N YO de V1H-1 con 4 aislados SIVep¡:. diferentes basadas en seruencias del gen fXil de longitud total. La barra indica una distancia genética de 0,1 (divergencia de nucleótidos 10%) y las posiciones del asterisco agrupan aislados N de VlH-1 basados en secuencias de env Figura 3. Propiedades trópicas y biológicas de aislados de VlH-1. Figura 4. Proteínas codificadas por VlH. Se indican la localización de los genes de V1H, los tamaños de los productos primarios de traducción (en algunos casos poliproteínas). ylas proteínas "';rales maduras procesadas Figura 5_Representación esquemática de un virión de V1H-1 macLiro Figura 6. Representación lineal de la glicoproteina Envde V1H-1. La necha indica el sitio de la escisién de gp160 en gp120 y gp41 . En gp120, las áreas sombreadas representan dornnios variables (VI a Vs) y los recuadros vacíos representan secuencias ronservadas (Cl a Cs)_ En el eclcx:lomilio g:¡41 se indican varios daninios: el péptioo de fusioo N-terminal. y las dos hé~ces de eclodoolinio (hélices N y C) -El domilio que abarca la membrana está representado por un recuadro negro . En el domino citq¡lásmico gp41, se represent<rl el motiw de endocitosis T}1'"-X-X-Leu (YXXL) (SEO ID NO: 1) y dos dominios helicoidales predichos (hélice-1 y -2). Se indican los m:meros de los am inoácidos . Figura 7. Veclorde transferencia pLW-73. Figura 8_Seruencia de nucleótidos del 'vector de transferencia pLW-73 (cadena superior. SEO ID NO: 2; cadena inferior, SEO ID NO: 3). Figura 9_Secuencia de nudeólidos que ccx:lifica la proteína Env del ciado O Uga"ldan (aislado A07412) (SEO ID NO , 4). Figura 10. Secuencia de nucleótidos alterada en codooes que codifica la proteína gagpol del ciado O Ugandan (ais lado A03349 (SEO ID NO: 5) Figura 11 Generación de WNA recombnantes y análisis de estabilidad de los genes insertados_ A) diagrama esquemático de inserción de env y gagpoi en los sitios Del 11 Y Del 111, respectivamente. B) evaluación de la estabilidad por inmunotnción. Figura 12_TIpos yfrecuencia de mutaciones de E!fIv en MVA165A1G env Figura 13. Inserción de Enven 18RIG1 L IGR Y Gag Poi en Del 111. Figura 14 foIodificaciones de los construcciones AlG para aumentar la. estabilidad Figura 15. Elopresioo de Envdespués de pases en placas. Figura 16 Análisis PCR ypor transferenda Western de clones ildividuales Figura 17 Elopres ioo de AlG env por MVAdoble recombinante Figura 18. Virus recanbinantes que e~resan env ygagpol de los aislados V1H-1 Ugandan.
Figura 19 MVNUGD4a -análisis de placas envsil tincién
Figura 20. ~dificación del gen UGD enven MVA recombinante .
Figura 21. MVNUGD4b -análisis de placas gag sin tinción .•, locaüzación de tramos de 4-6 residuos G o C.
Figura 22 ~dificación del gen gagpol UGD en M'v'Arecombinante
Figura 23 Construcción de M'v'Aestable recombinante que expresa UGD env ygagpol
Figura 24. Respuestas celulares suscitadas por M'v'NUGD4d.
Figura 25. Respuestas de anticuerpos suscitadas ~r MVNUGD4d .
Depósito de m icroorganismos
El microorganismo sigJiente ha sido depos itado de acuerdo con los tém,.,os de l Tratado de Buclapest con la ,<\meriean T}-pe Cu lture Collection (ATCC) fv1anassas , VA, en la fecha indicada:
Mic roorganismo
N". de acceso
Fecha
¿I aemarlDUe¿UlJ..}
I ","R 1\....10n 1
El clon 1 de MVA 1974/NIH se depositó como No. de Acceso en ATCC : PTA-5095 en fecha 27 de marzo de 2003 con la ,<\merican T~e Culture Collection (ATCC), 10801 University BI'vd., fv1anassas , VA 20110-2209, Estados Unidos Este depósito se realizÓ de acuerdo con las estipulaciones del Tratado de Budapest acerca del Recorocimiento Intemacional del Depósito de fv'icroorganismos para bs Propósitos de Procedimiento de Patente y las Regulaciones e~uestas en el mismo (Trataoo de Budapest)
[)escripcjón detallada de la realizaciÓn preferjda
A no ser que se defina otra cosa, los términos témicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una pe/Sona con experiencia ordnaria en la técnica a la que se refiere esta invención. Véase, v.g., Sngleton P y Sainsbury D., Diclionary of Mcrobiobgy and ~Iecular Biobgy, 3a edición,
J. Wiley& Sons, Chichester, Nueva York, 2001 and Fiek:ls Virology, 5th Ed. (D.M. Knipe, P.M. Howley, D.E. Griffin,
R. A. Lamb, M.A fv1artin, B. Roi2l11an, and S.E. Straus, eds), Lippincoll Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2007.
El término de tralSiciln "que comprende" es snónimo de "que inclu}e", "que contiene", o "caracterizado por", es inclusivo o indefinido yno exclu~ elementos adicionales , no citados , o pasos de procedimientos
La expresión de transición "ccnstituido por" excluye cualquier elemento, paso, o ilgrediente no especificado en la reivindicación, pero no excluye componentes o pasos adicionales que ro estén relacionados con la invenciál tales como impurezas asociadas ord inariamente con el los
La expresión de transición "constituido esencialmente por" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados y aquélbs que no afectan de modo sustancial a la o las caracteristicas tésicas y novedosas de la invencioo reivindicada.
Los ~xvirus se dividen en las subfam ilias GhJrdcpoxvilinae y Entomopoxvilinae, basadas en caTlpO de hospedador vertebrado e insecto. La stilfanilia ChorrJopoxvirinae está constituida por 8 géneros: Orfhopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Gapripoxvirus, Leporlpoxvirus, SUipoxvirus, !IIolluscipoxvirus, y Yatapoxvirus. El miembro prototíp ico del género Orthopoxvirus es el virus vaccinia.
Se han consignado secuencias genánicas ccmpetas para al menos un m iembro de cada género de Ghordopoxvirus y dos &7tomopoxvirus. En todos bs ChorckJpoX'ofrus se cooservan aproximadamente 100 genes , y aproximadamente la m itad de éstos están presentes también en los Entomopoxvirus. Basárxlose en lo anterior, pueden hacerse varias generalizaciones : los genes son en gran parte no-solapantes , tienden a existir en bloq..¡es que apuntan hacia el extremo más próximo del gencma, estál localizados usualmente en la región central si se conservan en gran parte y conciernen a funciones esenciales de replicación, y están localizados usualmente en las regiooes extremas si 500 variables y están relacionados con nteracciones del hospedador. La disposición de los genes centra les es notablemente sim ilar en todos los ctlordopoxvirus . Una convenciál para la nomenclatura de los genes u ORF (marcos de lectura abiertos) del virus vaccinia, originada mtes de la secuenciación del genoma entero y utilizada subsiguienternente para la seruencia completa de la cepa Copenhague del virus vaccinia, consiste en utilizar la letra del fragmento de AON de la endonucleasa de restricción Hndlll, seguida por el número de ORF (de izquierda a derecha) dentro del fragmento, y Lo R, dependiendo de la direcdón del ORF. Una excepción a esta regla se hizo para el fragnento Hndlll C; los ORFse enllTleraron desde la derecha a fin de evitar el comienzo en el eldremo altanente variable de la izquierda del genoma. Los nombres de bs polipéplidos corres~nden a los ncmbres de los genes , eycepto que se suprime la Lo R. en la mayoría de las seruencias subs igu ientes del genorna comp leto de ~xvirus, los ORF se nllTleraron sucesivamente desde lfi eldremo del genoma al otro. Sin embargo, las designaciones antiguas de letras se han mantenido como nombres comunes a fin de proporcionar continuidad en la bib~ografia. El rílmero de ORF de la cepa Western Reserve (WR) de! 'virus vaccinia se ind ica canúrmente en los libros de referencia debido a que esta cepa ha sido utilizada para la gran mayoría de bs estudios bioepímicos y
genéticos
Los inventores de una realización de la presente nvenclón identificaron nueo"os sitios para la inserción de seruenaas de PON exógenas en el genoma del virus vaccinia AAkara modificado (~A). Los nuevos sitios de inserción están localizados en las regiones intergénicas (IGRs) del genoma viral, en el que las IGRs están, a su vez. loca~z.adas entre o fla"lqueadas por los marcos de lectura abiertos (ORF) 069-070 del genoma del Ml/A en la nomendatura de CDC/kambis .
De acuerdo con lo anterior, una realizacién de la im.encién se refiere a un Ml/A recombinante que comprende una seruenaa heter~oga de PON insertada en una IGR del gerloma viral que está localizada entre, o flan~eada por los marcos de lectura abiertos (ORF) 069-70 del genoma del MVAen la nomenclatura de CDC/kambis.
Sorprendentemente, se encontró que las secuencias exógenas de PON se mantienen insertadas de manera estable en las IGRs del genoma del M.JA El genana del M.JA debe consideralSe como bastante nestable. Parece ser que los genes o seruenaas de ADN ro esencia les para la propagación del virus están delecionados o fragmentados .AiJnque se encontró -por lJ'"Ia parte -que se obtienen MVA estab les recombinantes cUa"ldo se insertan secuencias heterólogas de PON en los sitios de delecién del genana del MVA existentes naturalmente, se encontró por otra parte que a veces estos MVA recombinantes son nestables. Por esta razón, podría negalSe a la conclusión de que sería de esperar que la inserción de seruenaas heterólogas de PON no esenaales para la propagacién viral en los espacios entre los ORF fuera delecionada asimismo por el virus .
Si bien la seruencia de nudeótidos de lJ'"I ORF codifica una secuencia de aminoácidos que forman un péptido, polipéptx:lo o proteína, las IGRs entre dos ORF no tienen capacidad cocIifica1te alguna, pero pueden comprerder elementos reguladores , sitios de fijación , seruencias pranoloras y/o inlensificacbras esenciales para o implicadas en el control de la transcripción de la expresién del gen viral. Por tanto, la IGR puede estar involucrada en el control de regulación del ciclo vital del virus. Sin embargo, los autores de la presente rea~zación han demostrado también que los nuevos sitios de inseraón tienen la ventaja inesperada de que pueden insertalSe de manera estable seruenaas e>ógenas de PON en el genoma del MVA sin influir o cambiar las características típicas y la expresión génica del MVA Los nuevos sitios de inseraón son especialmente útiles, dado que no se ha alterado nngÚrl ORF o seruenaa cocificante del MVA.
La secuencia de nucleótidos de un ORF oom ienza regulamente con un rodón de partida y termina con un coclón de parada . Dependiendo de la orientación de los dos ORF adyacentes, la IGR, la región entre estos ORF, está flanqueada por los dos codones de parada de los dos ORF adyacentes, o bien por los dos codones de partida de los dos ORF adyacentes, o bien por el codón de parada del primer ORF y el codón de comien2D del segundo ORF, o por el codón de comienzo del primer ORF y el codón de parada del segundo ORF
De aruerdo con lo anterior, el sitio de inserciál para la secuencia exógena de ADN en la IGR puede encontralSe aguas abajo o en posición 3' del codón de parada de un primer ORF. En el caso de que el ORF adyacente, denomina::lo también segundo ORF, tenga la misma orientación que el primer ORF, este siro de inserción aguas abajo del codón de parada del primer ORF se encuentra aguas arriba o en ¡:x>Sición 5' del codón de comienzo del segundo ORF
En el caso de que el segundo ORF tenga una orientación opuesta con relación al primer ORF, lo cual siglifica que la orientación de los dos ORF adyacentes apunta uno hacia otro, entonces el sitio de inserción se encuentra aguas abajo de los coclones de para::la de anbos ORF
Como tercera altemativa, en el caso de que los dos ORF adyacentes se lean en direcciOl es opuestas, pero la orientación de los dos ORF adyacentes apunte en direcciones opuestas respecto al otro, lo que es sinónimo de un posicionamiento que se caracteriza porque los cocbnes de comienzo de los dos ORF son adyacentes uno a otro,
entonces el ADN exógeno está ilsertado aguas arriba con relación a anbos cxx:Iones de canien2D
Los ORF en el genoma del MVA se presentan en dos direcciones rodificantes. Por consiguiente, la actividad de síntesis de mRNA tiene lugar de i:zquierda a derecha, es decir, en cirección hacia delante y, correspondientemente, de derecha a izquierda (dirección imelSa). Es pláctica común en poxvirologia yse ha convertido en una clasificación estándar para los virus vaccinia identificar los ORF por su orientación y su posición en los diferentes fragmentos de digestión ¡nr restricción ron Hirdlll del genoma. Para la nomendatura, los diferentes fragmentos de Hirdlll se nombran por letras mayúsculas descendentes rorres¡nndientes ron su tanaño decreciente. Los ORF se enl..lTleran de izquierda a derectla en cada fragmento Hindlll, y la orientación del ORF se indica ron una ma}-ÚScula L (que representa la transcripción de derecha a izquierda) o R (que representa la trmscripaón de i:zquierda a derecha) . .Adicionalmente, eJdste una pub~cación más reciente de la estructura del geruna del MVA, que utiliza una nomendatura diferente, numerardo s implemente el ORF del extremo izquierdo al extremo derecho del genoma e indicando su orientación con una Lo R ma~srula (Antaine, G. et al., 1998 Vlrology244: 365-396). Como ejemplo, el ORF 18R,de acuerdo con la nomendatura antigua, corresponde al ORF 069R de acuerdo cOl AAtoine et a l.
En sus esfuerzos para produar recombinZlltes del virus vaccinia AAkara modificado (MVA) que e~resen genes de VlH como vacunas candidato , los inventores han observado inestabi~dad en la expresión de los genes de VlH . Los mismos han determinado q..¡e una de las causas de nestabilidad se debe a deleciones del gen extraño y el MVA
flanqueante. Para reso lver este problema, los inventores se propusieron insertar genes extraños entre los genes conservados a fu de evitar que ocurrieran deleciooes viables en los MVA recombinantes . Los virus que llevan tales deleciones presentan una ventaja de crecimiento y superaJán por tanto a las pobiacones de virus rMVA Si se insertan genes extraños enlre los genes conservados en el genoma de vaccinia (se considera que estos genes son necesarios para la replicación del virus vaccinia y son por tanto "genes esenciales"), cualquier deleción de un gen esencial inhibiría la replicación del virus y, por tanto, no superaría a los MVA recombinantes. Así pues, la e;q¡resión estable de la población de rMVA se mantiene. La cepa de MVA que bs imentores han estado uti~"tndo para producir sus recanbinantes fue prq>arcionooa por ellos a los Centros para Control y Prevención de Enfermedades (CDC) y fue secuenciada posteriormente por .Acambis (número de acceso a GenBank AY603355). La cepa de MItA en la que Bavarian Nordic ha basooo su publicación WO 031097845 es una cepa de virus vaccinia .A.nkara mcxlificada (número de acceso a GenBank U94848) seaJenciada por .A.ntoine, G. et al. 1998 Virology 244: 365-396. (Obsérvese que los números de genes en estas dos secuencias para un gen dado son diferentes .)
Los autores de la invención ronsderaron inicialmente los genes ronservados en la fam~ia Poxviridae así romo aquellos genes conservados en la subfami~a Chordopoxvirinae (los poxvirus de vertebrados) (Upton C. et al. 2003 Journal of Virology 77: 7590-7600). Estos genes están enumerados en la nomendalura del virus vaccinia de Copenhague (número de acceso a GenBank M35027) da::la en el Poxvirus Bioinformatics Resource Center, que se encuentra en Intemet en poxvirus.org. Estos genes tota~2an 49 genes conservados en la familia Poxvirus y41 genes adiconales conservados en bs chordopoxvirus , lo que hace un total de 90 genes cooservados . De estos 90 genes conservados, los inventores listaron sitios intergénicos entre pares de genes conservados. Estos pares de genes se entmeran en la Tabla 1. (Obsérvese que están marcados genes que no han sido incltidos en la ptblicación de Bavarian Nordic WO 031097845 ). Las orientaciones de estos genes son variables, transcribiéndose algunos hacia la derecha, y algunos hacia la izquierda. Estosignifica que algunos de los sitios intergénicos contienen promotores que tendrían que conservarse en la construcción del vector de inserción. Adicionalmente, para genes conservados solapantes, durante la construcción del vector los genes tendrían que reconstruirse utilizando codones alternativos para m inimizar las secuencias de repetición.
Los inventores concentraron su atención en los genes conservados cuya orientación es "extremo a extremo" de ta l mcxlo que los cxx:Iones de parada 3' de los genes están en proximidad estrecha uno a olro. La construcción de los 'vectores de transferencia utilizados en estos sitbs se 've faciHada por el hemo de que en esta región no habria ningún prom olor entre los codooes de parada. Si eJOslen nucleótidos inlergénicos que separan los codones de parada, enlonces la construcción del vector de inserción es directa. Si el codón de parada de un gen se encuentra dentro del extremo 3' del otro gen, entonces, durante la construcción del vector de transferencia del plásmido, el gen puede recoostruirse utilizando codones alternativos para minimizar las secuencias de repetición, o, dependiendo de la magnibJd del solapaTIiento, corregirse simplemente en la PCR de los flancos a fin de no solaparse. La Tabla 2 proporciona los sitios intergéniros que a.mplen el requisito de que la orientación de los genes conservados sea "extremo a extremo" Los genes intergénicos resaltados en gris carecen de extremos solapantes y por consiguiente son más simples de constrtir.
Los inventores concentraron su atención específiCérnente en bs 6 sitios intergéniros que carecen de extremos solapanles. En un ejemplo de trabap de estos 6, eligieron el sitio inlergénico, 18R-G1L, a fin de insertar su gen extraño.
Además de utilizar el requisito de los genes conservados arriba entJ"T1erados en la ap~cación de Upton, para cualq.¡ier gen que se haya delecionado e;q¡erimentalmente y cuya replicacioo del virus se haya reducido 10 veces en el mutante, este gen podría ronsiderarse como un "gen esencial~. Si este gen se enaJentra adyacente a otro gen esencial o ronservado, el sitio intergénico entre los dos genes podría considerarse cx:mo un sitio de inserción diferente para un gen extraño
Tabla 1
Sitios Inte rgénicos entre Genes Conservados
GenesfCopenhague
CDCJ Genes Acambis Anto ine et al. Genes ¿Publicado en la lisla de WOO31097845? N ' No
F9L-F10L F12L-F13L F17R E1L
038L-039L 042L-043L 047R-048L N N
E1 L E2L E8R-E9L
048L-049L 055R-056L N
E9L E10R
056L-057L N
-12L-13L loL-loL
063L-064L N
16L-17L
067L-068L N
CDCI Genes, , elal. Genes
, en la Ils la de N= No I I '1L
N N
N
N N N
H7R-D1R
N
~
101R-102R 1U"K-1U3K
N
D9R-C10R 106R-107R
N 1UK-lJ11L
~
110L·1 1L
113L-114L
115L·116R
A14L N N N
(continuación)
Sitios Intergénicos entre Ge nes Conservados
llenes/t;opennague
CUI> <>enes ACamo,s Anto lne el al, llenes ¿euo"c~aoen_,a '~~ta ae WOO3/097845? N' No
A18R A19L -
129R130L - N
A21L A20R A20K-A22K
131L-132R 132K-133K N N
A22R-A23R
133R-134R
A28L A29L A29L A30L
139L·140L 140L·141L N N
Tabla 2
"'mes , ,con, , ¡' "
Genes,
Genes ,
<>enes< a
Genes '
O,
K-o
I
No
o,
,
~i Si
,
er
H
No
o,
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116R-1171
O,
A"K-AllL
NO
,
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I Los ~";":e , i , ;i:'::' g,. ,
De acuerdo con la presente invención, pueden insertarse secuencias de ADN heterólogas en una IGR del genoma del MVA que está Ioca~zada entre o flan~eada por los ORF con la orientación "extremo a extremo".
Las seruenaas heterólogas o exógenas de ADN son secuencias que, en la naturaleza, no se encuentran asociadas normalmente con el poX\lirus tal como se utiliza de aruerdo con la presente invención. De aruerdo cm una rea lización adicional de la presente invención, la secuencia exógena de ADN comprende al menos una seruencia codificante. La secuencia codificante está enlazada operativamente a un elemento de control de la transcripción, preferiblemente a un elemento poX\liral de control de la transcripción . .Adicionalmente, pueden utilizarse lanbién combinacimes entre elementos de control de la transcrpción poX\lirales y, v.g., sitios de entrada de ribosoma internos
De acuerdo con una realización adicional, la seruenaa exógena de.ADN puede comprender también dos o más seruenaas codificantes enlazadas a uno o varios elementos de control de la transcripción. Preferiblemente, la seruenaa codificante cocifica una o más proteínas , pol~éptidos , péptidos , antígenos extraños o epítopes antigénicos , especialmente los de genes terapéuticamente interesantes
Genes terapéuticcrnente interesantes de acuerdo con la presente invención pueden ser genes derivados de u homólogos a genes de microorganismos patógenos o infecdosos que son causantes de enfermedades. De acuerdo con eno, en el conteJdo de la presente invención tales genes terapéuticamente interesantes se presentan al sistema inmunitario de un organismo a fin de afectar, preferiblemente inducir, una respuesta inmune específica y, por consig..¡iente, vacunar o proteger profllácticamente el organismo contra una infeccioo con el microorganismo. En realizaciones preferidas adicimales de la presente invención, los genes terapéulicanente interesantes se seleccionan de genes de virus infecciosos, v.g., • pero sil carácter limitante • el virus del dengue, el virus de la hepatitis B o e , o virus de la inmunodeficiencia humana tales como VlH. Si la seruenaa heterólcga de PON se deriva de VlH , la misma es preferiblemente VlH env
A:::I icionalmente, los genes terapéuticamente interesantes de aruerda con la presente invención comprenden también genes relacionados con enfermedades , que tienen un efecto terapéutico sobre enfermedades de trastomo proliferatiw, cáncer o enfermedades metabólicas. Por ejemplo, un gen terapéuticamente interesante relacionado con el cá-lcer podría ser un antígeno de cáncer que terga la capacidad de induar una reacción irrnune anticáncer especifica.
De acuerdo con una realización adiaonal, la secuencia cocificante ccmprende al menos un marcador o gen de selección
Los genes de selección transducen una resistencia partirular a una célula, por lo rua l se hace p:¡s ible un cierto procecimiento de selección. El técnico experimentado está familiarizado con Lna diversidad de genes de selecaón, que pueden utilizarse en un sistema ¡:oX\liral. Entre éstos se encuentran, v.g., el gen de resistencia a la neanicina (NPT) o el gen de fosforribos .-transferasa (gpt)
Los genes marcadores induren tila reacaón coloreada en las cél¡jas transducidas, que puede utilizarse para identificar las células transducidas. El térnico experimentado está familiarizado con una dive/Sidad de genes marcadores , que pueden utilizarse en un sistema poX\lira l. Entre éstos se encuentran el gen que cod ifica , v.gp galactosidasa (l3-gal), ¡3-gucosidasa (¡3-glu), la proteína verde fluorescente (EGFP) o la protelna fluorescente azul.
De aruerdo con otra rea~zación adiaonal, la secuencia exógena de .ADN comprende una secuencia espaciadora, que separa el elemento de oontrol de la transcripción poX\liral yfo la seruenaa ccdificante en la seruenaa exógena de ADN del codón de parada yfo el codón de comienzo de los ORF adyacentes. Esta secuencia espaciadora entre el codón de parada/comienzo del ORF adyacente y la seruenaa codificante insertada en el ADN exógeno tiene la ventaja de estabilizar el PON e>ógeno insertado y, por tanto, cualquier virus recombinante resultante. El tamaño de la secuencia espaciadora es variable con tal q..¡e la seruencia carezca de su prcpia función cocificante o reguladora
De acuerdo con una realización adicional, la seruencia espaciadora q..¡e separa el elemento de control de la transcripción poxviral y/o la secuencia codificante en la secuencia exógena de ADN del codón de parada del ORF adyacente tiene al menos un nucleótido de longitud .
De acuerdo oon otra rea~zación, la seruenaa espaciadora que separa el elemento de control de la transcripción poX\liral yfo la secuencia coclficante en la secuencia exógena de ADN del ccdón de comien2D del ORF adyacente tiene al menos 30 nudeótidos . ParticulalTTlente, en los casos en q..¡e un elemento promotor típico del virus vaccinia se identifica a9Jas arriba de un codón de com ienzo, la inserción del .ADN exógeno puede no separar el elemento promotor del codón de comienzo del ORF adyacente. Un elemento promotor típico de 'roccinia puede identificarse por escaneo para, v.g., la secuencia "TAAAT" para prom otores tardíos (Davison & foJ'oss, 1989 J. foJ'ol. Biol.; 210:771 · 784) y un dominio rico en NT para promotores tempranos. Una seruenaa espaciadora de aproximadamente 30 nucleótidos es la distancia preferida para asegurar que un promotor poX\liral Ioca~zado aguas arriba del codón de comienzo del ORF no se \-ea influenciado. A:::Iiciooalmente, de aruerdo con otra realización preferida, la distanaa entre el PON exógeno insertado y el c<Xlón de comienzo del ORF adyacente es alrededor de 50 nudeótidos , y más preferiblemente alrededor de 100 nucleótidos
De acuerdo con una realización adicbnal, la secuencia espadadora comprende un elemento de control de la transcripción poxviral adiconal que es capazde controlar la transcripción del ORF adyacente.
Una cepa típica de MVA que puede utilizarse de acuerdo con la presente in~nción para generar un MoJA recombnante es MoJA 1274fNIH Clan 1, que hasido depositada como ATCC Accesson No.: PTA-5095 en fecha 27 de marzo de 2003 con la ,American Type Culture Collection (ATCC, 10801 Uni~rsity Blvd ., Wlanassas , VA 201102209, Estados Unidos.
El ténnino "derivados" de un virus de arueroo con la presente n\ención se refiere a virus de la progenie que muestran los mismos rasgos caracteristicos que el virus parental, pero que presentan diferencias en una o más partes de su genoma. B ténnino "derivado de MoJA" describe un virus, que tiene las mismas características funcionales cOO1parado con MoJA. Por ejemplo, un derivado de MoJA 1974/NIH Cloo 1 tiene los rasgos caracteristicos de MVA 1974fNIH Clon 1. Una de estas características de MVA 1974/NIH Clon 1 o derivados del mismo es su atenuación ysu severa restricción en gama de hospedadores
El MVA recombinante de acuerdo con la presente invención es útil como medicamento o vacuna . El mismo puede utilizarse para la introducción de la secuencia oodificante exógena en una célula diana, siendo dicha seruencia homóloga o heteróloga respecto al genoma de la célula diana.
La introduccién de una secuencia cocificante exógena en una célula diana puede hacerse in vitro para prodJcir proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos o epitopes antigénicos. Este procedimiento comprende la infección de una célula t"Ospedadora con el MoJA recombinante de aruerdo con la invencién, cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas, yaislamiento ylo enriquecimiento del polipéptido, péptido, proteina, antígeno, epítope y/o virus pro:::lucido por dicha célula hospedadora .
.Adicionalmente, el procedimiento para introducción de una o más seruencias homólogas o una o más seOJencias heterólogas en las células puede aplicarse para terapia in vitro e in vivo. Para la terapa in vitro, células aisladas que han sido infectadas previamente (ex vivo) con el MoJA recombinante de arueroo con la invencién se administral al cuerpo animal vivo para afectarb, irduciendo preferiblemente una respuesta inmune. Para la terapia in vivo, el poxvirus recombinante de aruerdo con la invencién se aannistra directamente al cuerpo animal vi\.O para afectarlo, induciendo preferiblemente lila respuesta nmune. En este caso, las células que rodean el sitio de inoaJlación, pero también aquellas células a las que el virus se transporta por via , v.g., del torrente sanguíneo, son infectadas directamente in vivo por el MoJA recombinante de acuerdo con la in~ncién. Después de la infección, estas céluas s n tetizan las proteinas , péptidos o epitopes antigénicos de los genes terapéuticos , que son axlificados por las seOJencias oodificantes exógenas y, subsigLientemente, presentan los mismos o partes de los mismos en la superficie celular. Las células especializadas del sistema inmune reconocen la presentacién de tales proteínas, péptidos o epítopes heterólogos y lanzan una respuesta inmune específica.
Dado que el MoJA tiene fuertemente restringido su crecm iento y, por tanto, está fuertemente atenuado, el mismo es útil para el tratam iento de una amplia gama de mamíferos con nclusión de los hllTlaros, que induye animales o humanos con sistema inmune comprometido. La presente n..ención pro¡x>rciona también composiciooes farmacéuticas yvacunas para indudr una respuesta nmune en un cuerpo animal vivo , con indus ién de un hllTlal""O
La composición fannacéutica puede induir generalmente urx:. omás portadores, aditivos, antibióticos, conservantes, ad}-tJvantes , diluyentes ylo estab~izadores fannacéuticamente aceptables ylo aprobados. Tales SLEtalcias auxiliares pueden ser agua, solución salina., glicerol, etanol, agentes tumectantes o emulsionantes, sustandas tamponadoras del pH, o análogos. Portadores aderuados son típicamente moléculas grandes que se metalolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos po~glicó~cos, amiroácidos polímeros, copolínerns de aminoácidos, agregados ~pidicos, o aná logos.
Para la preparación de vacunas , el poxvirus recombinante de acuerdo con la in..ención se convierte en una fonna fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunación crntra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H. et al., 1974 Dsch fv1ed Wochenschr. 99:2386-2392 ). Por ejemplo, el virus purificado se guarda a -80°C con un titulo de 5xl0 E8 TCIDsimJ formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCI140 mM, pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofi~zan 1OE2-1 OE8 partículas del virus en 100 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona. y 1 % de alb.ímina humana. en una ampolla, preferiblemente una <nlpolla de vid rio. Alternativamente , las dosis de vacuna pueden prooucirse por liofi~zación gradual del virus en una fonnulacioo. Esta formulación puede contener <l:fitivos adicionales tales como manito, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirml idona u otros ad}-tJvantes tales como antioxidantes o gases n ertes , estabi~zadores o proteinas reccmbilantes (v.g., seroalbúmna htmana) adecuados para adm inistracicr, in \.fvo. La ampolla de vidrio se sena luego y puede guardarse entre 40C y la temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, mientras que no exista necesidad algma, la ampona se guarda preferiblemente a temperaturas inferiores a -20OC.
Para vacunación o terapia, el liofilizado puede disolverse en 0,1 a 0,5 mi de una solución aruosa, preferiblemente solución sa~na fisiológica o tampón Tris , o adm inistrarse sea sistémica o localmente , es decir, por vias parenteral, subcutánea, intramuscuar, por escarificacién o cualquier otra vía de admnistración conocida por el técnico experimentado. El modo de administraciál, la dosis yel número de administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la lécrica de manera conocida. Sin embargo, en la ma}Qría de los casos un ~cienle se vacuna con una segunda dosis aproximadamente 1 mes a 6 semanas después de la primera dosis de vacunación.
La presente in'vención se refiere adidonalmente a vectores plasm idicos, que pueden utilizarse para generar MItA recomb inante de acuerdo con la presente invención, yse refiere también a ciertas secuendas de ADN.
Reg¡jarrnente, la IGR localizada entre o flanqueada por 2 ORF adyacentes cOOlprende secuendas de nudeótidos en las cua les puede insertarse la seruenda exógena de ADN de interés . Por cons~uiente, el 'vector plasmídico de acuerdo con la presente descripción comprende tila secuencia de ADN derivada de u hOOl~Oga al genoma del MVA, en el que dictla secuencia de ADN comprende un fragnento completo o pardal de una secuencia IGR loca~zada entre o flanqueada por dos ORF adyacentes del geflOOla viral. Preferiblemente, el vector plasmídico comprende, insertado en dicha secuencia derivada de IGR al menos tIl sitio de clonacién para la inserción de una seruenda exógena de ADN de interés y, preferiblemente, para la inserción de un elemento de control de la transcripción poxviral enlazado operativamente a dictla secuencia hetefÓloga de ADN. Opcionalmente, el 'vector plasmídico comprende una casete de gen indicador ylo gen de selección.
Las seruencias de ADN son preferiblem ente derivadas de u lunólogas al genoma del MVA depositado como ATCC kcession No.. PTA-5095 en fecha 27 de marzo de 2003 con la Ivnerican T~e Cu lture CoI lection (ATCC, 10801 UniversilyBlvd ., ~nassas, VA20110-2209, Estados Unidos.
Para generar un vector plasmídien de acuerdo con la presente invención, las secuencias se aislan y se donan en un vector de clonación estándar, tal como pBluescript (Stratagene), en el que aquéllas flarquean el ADN exógeno a insertar en el genoma del MItA Opcionalmente, un vector plasmidico de este tipo comprende una casete de gen de selección o gen io:::licador, que puede delecionarse del "';rus recanbinante final, debido a una secuencia repetitiva incluida en dicha casete.
Los procecimientos para introducir secuencias exógenas de ADN por un vector plasmidico en un genoma del MVA y procedimientos para obtener MVA reoombinmte son bien conoados por las personas expertas en la técnica y, adiconalmente, pueden dedudrse de ~Iec¡jar Cloning , A Laooratory ~nual, Segunda Edidón, J. Sanbrook, E.F Fritsch y T. Maniatis, CoId Spring Harbar Laboratory Press, 1989 y Current Protocols in fvblerular Bology, John Wiley and Sons Inc. 1008, capítulo 16, sección IV, ~Elq)ression of proteins in mammalian ceUs using vaccinia viral
vectors~.
El MVA de acuerdo ron la presente invención puede prcducirse por transfección de una célula con un vector plasmídien de aruerdo con la presente invención, infección de la célula Iransfectada con un MItA y, subsig..¡ientemente, identificación, aislamiento y, opcionalmente, purificadón del MVA de acuerdo con la inwncién.
Las secuencias de ADN de acuerdo con la invencién pueden utüizarse para identificar o aislar el WNA o sus derivados de acuerdo con la invención y células o individlDS infectados con un MVA de acuerdo con la imención. Las seruenaas de ADN se utilizan, v.g., para generar cebadores de PCR, sondas de hibridación, o se utilizan en tecnologías de redes .
Los VlH ySu Replicación
El agente etiológien del síndrome de la irmtllodeficiencia adquirida (SIDA) está reennoado por ser un retrovin.lS que exhibe caracteristicas tipicas del género lentivirus, al que se hace referencia corno virus de la inmunodefidenda htmana (VlH). Las relaciones filogenéticas de los lenti.,.;rus humanos se muestran en Rg. 1. VIH-2 está más estrechamente relaco na:::lo con SIVr;mm, un "';rus aisla:::lo de monos tiznados Mangabeyen su hábitat natural, que con VlH-1 . klualmente se cree ~e VlH-2 representa una transmisión ZDonótica de SIVr;mrn al hombre. Una serie de aisla:::los lentivirales de chimpancés cautivos, designados SIVep¡:, son parientes genéticns cercanos de VlH-1.
Los primeros análisis filogenéticos de aislados de VlH-1 concentraron su atendón en muestras de Europa/América del Norte y África; agrupaaones discretas de virus se identificaron de estas cbs áreas del mundo. Subtipos o da:::los genéticos distintos de VlH-1 se definieron subs~uientemente y se dasificaron en 3 grupos: M (principal); O (aberrante); y N (no-M ni O) (Rg. 2). El grupo M de VlH-1, que inckJ~ más del 95% de bs aislados de virus globales, está ennslitudo por al menos 8 ciados discretos (A, S, C, D, F, G, H yJ), basados en la secuencia de los genomas \rirales completos. Wiembros del grupo O de VlH-1 han sido reruperados de individuos que \rivian en CamerLn, Gabón, y Guinea Ecuatorial; sus genanas comparten menos de 50% de dentidad con secuencias de nudeótidos que presentan los "';rus del grupo M. Las cepas de VlH-1 del grupo N descubiertas más recientemente han sido identificadas en inclviduos infectados de CamerúrJ, no reaccionan serológic:amente en el ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ElISA) del virus total estándar, pero sro fácilmente detectables ¡nr análisis de transferencia Westem com-encionales
El conocimiento más actual acerca de la variación genética de VlH-1 proviene de estudios de virus del grupo M de origen geográfico di..efSO. Los datos recogidos durante la última década indican que la pobladón de VlH presente en un individuo infectado puede variar desde 6% a 10% en secuencia de nucleótidos. Aislados de VlH-1 dentro de un ciado pueden presentar distancias de nucleótidos de 15% en gag y hasta 300k en secuendas codificantes de gp120 La variación genética interclados puede osdlar entre 30% y40% dependiendo del gen analizado
La totalidad de los subtipos del grupo M de \IIH -1 pueden encontrarse en África. Los virus del ciado A son genéticamente los más divergentes yeran el subtipo más común de V1H-1 en áfrica al comienzo de la epidemia. Con la rápida prq:¡agaciál de \IIH-1 al África del Sur durante medianos a últiTlos de los años 1900, los virus del dad:> C se han coovertido en el subtipo dominante y dan cuenta actualmente del 48010 de las infecciones de VlH-1 en todo el mundo. Los virus del ciado B, el subq:¡o de V1H-1 más intensamente estudia:::lo, siguen siendo los aislados más
prevalecientes en Europa y América del Norte
Las tasas elevadas de recombinación genética son un sello de los retrovirus. Inicialmente se creía que las infecciones simultáneas por cepas de virus genéticamente diversas no era probable que se establecieran en individuos en riesgo para V1H-1. Hacia 1995, sin embargo, se hizo evidente que una fracción importante de la diversidad global del grupo M de VIH-1 incluía recombinantes virales intercla:::lo. Actualmente se percibe que se encontrarán recombina1tes de \IIH-1 en áreas geográficas tales como .África, Amélica del Sur, yel SUdeste de As ia, donde coexisten subtipos múltiples de \IIH-1 y pueden dar cuenta de más del 10% de las cepas de VlH-1 circula-ltes. M>lecularrnente, los genomas de estos virus recombinantes se asemejan a mosaicos de retazcs, con segnentos de subtipos diversos de V1H-1 ~xtapuestos, que reflejan los eventos de cruzamiento múltiples que han contribuido a su generación. La mayoría de los recanbinantes de V1H-1 han surgido en M ica y una mayor parte contiene segnentos delivados originalmente de virus del dado A En Tailandia, por ejemplo, la composición de la cepa ci rculante predominante está constituida por un segmento del gen gag más poi de l ciado A yun gen env del ciado E. Dado que el gen envdel ciado E en las cepas Thai V1H -1 es estrechamente afín al envdel claoo E presente en los aislados virales de la República Centroafricana, se cree que el e-.ento original de recombinación ocurlió en M ica, con la introducción subsiguiente de l.Il virus descendente en Tailandia. Es interesante que, hasta la fecha, no se ha informado de ningún aislado de longitud total de \IIH-1 subtipo E (es dedr, con genes de los subtipos E gag, poi, yenv).
El desrubrimiento de que los receptores de las qlimioquinas a y 13 funcionan como correceptores para la fusión y entrada de virus en células susceptibles CD4' ha conrucido a un esquema de clasificación revisado para \/lH-1 (Fig. 3). Los aislados pueden agr~arse ahora sobre la base de la utilización de receptores de quimb quinas en ensayos de fusión en los cuales las proteínas coneceptoras de VlH-1 gp120 Y CD4' se elqlresan en células separadas Como se ndica en Rg. 3, los aislados de V1H-1 que utilizan el receptor CXCR4 (designados ahora "';rus X4) son usualmente cepas de la línea de células T (TCL)-trópicas io:::luctoras de sincitios (SI), mientras que aquéllos qJe utilizan exclusivamente el receptor CCR5 (virus R5) son predominantemente macrófagos (M)-trópicos y no inductores de sincitios (N SI). Las cepas duales-trópicas R51X4, que pueden comprender la mayoria de los aislados de pacientes yexhiben un continuo de fenotipos trópicos, son frecuentemente SI
Como sucede para todos los retrovirus competentes en replicación, los 3 productos de traducción primalios de V1H1, todos enos proteínas codificantes estructurales, se sintetizan inicialmente como precursores potiproteínicos, que soo procesados subsiguientemente por proteasas virales o celulares en proteinas maduras asociadas a particulas (Fíg. 4). El precursor de Gag de 55 kilodallons Pr55Gag se esdnde en las proteínas de la matriz (MA), de la cá~ida (CA), de la IlJcleocápsida (NC), y p6. La autocatálisis de la poliproteína de 160 kilodaltons Gag-Poi, Pr160Gag· ,da lugar a la proteasa (PR), la transcliptasa inversa heterodiTIera (RT), y las proteínas integrasas (IN), mientras que la digestión proteolítica por una o más enzimas celulares convierte el precursor glicos ilado g>100 de Env de 160
kilodaltons en los productos de escisión gp120 de la superfide (SU), y gp41 transmembranal (1M). Las 6 proteínas remanentes codifica:::las por V1H-1 (Vit, Vpr, Tat, Rev, Vpu y Nef) son los productos de traducción plimarios de los mRNAs remodelados .
Las proteínas Gag de VlH, como las de otros retro"';rus, son necesarias y suficientes para la formación de partículas no infecciosas semejantes al "';rus. Las proteínas Gag retrovirales se sintetizan generalmente como precursores poliproteínicos; el precursor gag de VlH ·1 ha sido des~nado, basándose en su masa molerular aparente, Pr55Gag Como se ha indicado previamente, el mRNA para Pr5SGag es el trcnscrito de 9,2 kb no remodelado (Rg. 4) que requiere Rev para su elqlresión en el citoplasma: cuando está presente el ORF poi, la proteasa (PR) viral escinde Pr55Gag durante o poco después de la gemación de la célula para generar las proteínas Gag maduras p17 (MA), p24 (CA), p7 (NC), y p6 (\oéase Rg. 4). En el "';rión, MA está localizada inmediatamente dentro de la bicapa lipídica de la
en\-Oltura viral, CA form a la porción exterior de la estructure de núcleo de forma cónica en el centro de la partícula, y NC está presente en el cerJtro de un complejo de rioonudeCflroteína con el genoma viral del RNA (Fig. 5).
El prerursor de V1H Pr55Gag se oligomeriza después de su traduccién y se direcciona a la membrana plasmática, donde se ensemblan partículas de temaño y densidad suficientes que son visibles por EM. La formación de partículas semejantes a virus por PrSSGag es un procedimiento de autoensemblamiento, tenieo:::lo lugar interacciones críticas Gag-Gag entre dominios múltiples a lo largo del prerursor de Gag. El ensamblaje de partículas semejantes a virus no requiere la participación de RNA genómico (aunque la presencia de ácido nucleico parece ser esencial), enzimas cxx:I ificadas por p oi, o glicoproteínas Env, pero la producción de viriones infecdosos re::¡uiere la encapsidadón delJenoma "';ral de RNA y la incorporaciál de las glicoproteínas Env y el precursor poliproteinico
Gag-Poi Pr100Gagf>9uas abajo de gag se encuentra la región más altanente conservada del genoma de VlH, el gen poI, que codifica 3 enzimas: PR , RT, e IN (~ase Fig. 4). RT e IN soo necesarias, respectivamente, para la transcripción in~rsa del genoma de RNA viral en una copia bicatenaria de ADN, y para la integracon del ADN viral en el cromosoma de la célula hospedadora. PR juega posteriormente un papel crítico en el cicb vital por mediación de la producdón de viriones infecciosos maduros. Los productos del gen pd se derivan por escisión enzimática de una proteína de
Pd
fusión Gag-Poi de 160 kilodaltons, a la que se hace referencia como Pr160Gao-. Esta proteína de fusión se prodJce por cambio de marco ribosáTl ico durante la traducciál de Pr55Gao (~ase Fig. 4). El mecanismo de cambo de marco para la expresión de Gag-Poi, ut~izado también por mudlOs otros retrovirus, asegura que las proteínas derivadas de polse expresan a un ni~1 bajo, ~rQ)Qmadcrnente 5% a 10% del ni~1 de expresión de gag. Al igual que PrSSGao , el término N de Pr160G<og-PoI está miristila::lo ydireccionado a la membrana plasmática
Proteasa
Estudios iniciales de pulso y caza realizados con retrovirus aviares indicaban clarcrnente que las proteinas Gag retrovirales se sintetizan inicialmente cano preaJrsores pol iproteínicos ~e se escinden para generar productos más pequeños . Estudios subsiguientes demostraron que la función de procescrniento es proporcona:::la por una enzima viral en lugar de una enzima celular, y que la digestión proteolílica de los precursores Gag y Gag-Poi es esencial para la infectividad del virus. El análisis de la secuencia de las PRs recombinantes indicaba q..¡e las mismas están relaconaclas oon proteasas celulares "aspárticas " tales cxmo pepsina y renina. Además de estas enzimas cel¡jares, las PRs retrovirales utilizan dos residuos Asp ~xtapuestos en el sitio activo para ooordinarse a una moléaJla de agua que cata liza la hidrólisis de un enlace peptidioo en la proteina diana. Al contrario que las proteasas aspárticas
celulares, que funcionan como pselKlodíneros (utilizando dos piegues de la misma moléc¡ja para generar el sitio activo), las PRs retrovirales funcionan como díneros \€rdaderos. Los datos cfistalográficos de ra}()S Xde la PRde VlH-1 indican que los dos mcnómeros se mantienen unidos en parte por una lámina f3 antipa ralela de 4 cadenas derivada de ambos extremos N y e de cada monómero. El sitio de fijaciÓn de sustrato está bcatizado dentro de una hendidura formada entre los dos mon6rneros. Al igual que sus hOO1ó1ogos animales, el dímero VlH PR contiene "aletas" flexibles q..¡e ruelgan del sitio de fijaciÓn y pueden estabilizar el sustrato dentro de la hendidura; los sitios Asp del sitio activo se encuentran en el centro del diTIero. Es interesante q..¡e, aunque se observa cierta hcmobgía lim itada de aminoácidos alrededor de bs residuos del sitio activo, las seaJencias primarias de las PRs retrovirales son Slrnamente di~rgentes,s i bien sus estructuras son rotablemente similares.
Transcriptasa In\€rsa
Por definición, los retrovirus poseen la capacidad de con\€rtir sus genanas de RNA monocatenario en ADN bicatena rios durmte las últimas etapas del procedimiento de infección. La enzima que cataliza esta reacción es RT, en asociación cm su actividad asocia:::la de RNasaH. Las RTs relrovirales tienen 3 actividades enzimáticas: (a) polimerización de ADN dirigda al RNA (para síntesis de la cadena menos del DNA), (b) actividad de RNasaH (para la degradación del cebador tRNA y el RNA genómico presentes en los híbrdos intermedios DNA-RNA), y (c) polimerización de ADN dirigida por el ADN para la sin tesis de la segunda cadena de ADN o cadena más).
La holoenzima madura RTde VlH-1 es un hetercdímero desubunidades de 66 y51 kd. La subunidad de 51 kd (p51 ) se deriva de la stbunidad de 66 kd (p6S)poreliminacién proteolítica del domino RNasaH de 15 kd del terminal e de pSS por PR (véase Fig_ 4). La estructura cristalina de la RT de VlH-1 revela un pliegue altamente asimélrico en la cual las orientaciones de las sublllidades pSS y p51 difieren sustancialm ente. La subunidad p6S ¡x.¡ede visualizarse como una mano derecha, con el sitio activo de la polimerasa en la palma, yuna hendidura profunda de fijacién de molde formada por la palma, los dedos , y subdominios de dedo ¡x.¡lgar. El dominio de polimerasa está ligado a la RNasaH por el subdom inio de condensación. El sitio activo, localizado en la palma, contiene 3 resduos Asp criticos (110, 185 Y 18S) en proximidad estredla, y dos iones 1\I'g2+ coordinados . la mutación de estos residuos Asp anula la actividad de polime rizacién de RT. La orientación de los 3 residuos Asp del sitio activo es similar a la observada en olras DNA-polimerasas (v.g. el fragnento Klenow del ADN poi t de E. coll). La subundad p51 parece ser rigida y no forma una hendidura de polimerizacién; Asp 110, 185 Y 186 de esta subunidad están ocultos en el interior de la molécula. Aproximadamente 18 pares de bases del dt'4llex cebador-molde se encuentran en la hendidura de fgación de ácido nucleico, prdorgándose desde el sitio activo de la polimerasa al dominio de RNasaH
En la estructura RT-cebador-mok::le-dNTP, la presencia de un ddesoxinudeótido en el extremo 3' del ceba:::lor permite la visualización del oomplejo catalítico capturado inmediatamente mtes del ataque sobre el dNTP entrante. La comparación con estructuras obtenidas previamente sugiere un mode lo por el cua l los dedos se cierran para atrapar el molde y el dNTP antes del ataque nudeófilo del 3'-OH del cebadorsoore el dNTP entrante. Des¡x.¡és de la adición del dNTP entrante a la cadena en crecimiento, se ha propuesto que los dedos adq:ltan una configuración más abierta, libermdo con ello el pirofosfato y permitiendo que la RT se fije al dNTP siguiente. La eslructura de la RNasaH de VlH-1 ha sido determinada también por cristalografía de ra}OS X; este dominio exhibe un p~egue global similar al de la RNasaH de E. coli
Inregrasa
Un rasgo distintivo de la replicación de los retro"';rus es la insercién de una copia de ADN del genana viral en el cromosoma de la célula del hospedador después de la transcripción in~/Sa. El ,AON vira l integrado (el provirus) sirve como molde para la sintesis de RNAs virales y se mantiene como parte del genoma de la célula hospedadora durante tocla la "';da de la cékJla infectada. Los mutantes retrovirales deficientes en la capacidad para integrarse no consiguen establecer generalmente una nfección productiva.
La integración del ADN viral está catalizada por la integrasa, una proteina de 32 kd generada por escisión mediada por PR de la ¡:orcioo C-terminal de la ¡:oliproteína Gag-Poi de V1H-1 (véase Fig. 4).
Las proteinas retrovirales IN se compalen de 3 dominios estructural y funciooalmente distintos: un dominio Ntermnal que oontiene dedos de cinc, un dominio central, y un domnio C-termnal relativamente no conservado Debdo a su baja solubildad, no ha sdo posible cristalizar hasta <tIora la proteina de 288 an n oácidos IN de VlH-1 entera. Sin embargo, la estructura de los 3 dom nios ha sido resuelta independientemente por procedimientos de cristalografía de ra}-Qs Xo Rrvf'.I. La estructura cristalina del dominio central del virus del sarcoma aviar IN ha sdo determinada. El domno N-terminal (residuos 1 a 55), cuya estructura se resolvió mediante espectroscq¡ia Rrvf'.I, se compone de 4 hélices con un cnc coordinado por los <VTlnoácidos His-12, His-16 Cys-40, y Cys-43. La estructura del dominio N-terminal es reminiscente de las proteínas de fijación de ADN heliooidales que contienen un motivo denominado hélice-welta-hélice; sin embargo, en la estructura del V1H-1 este motivo contribu}-e a la formación de dímeros . Inicialmente, la escasa solt.tli~dad dificultó los esfuerzos para resol..er la estructura del OOminio central. Sin embargo, los intentos de cristalografía alcanzaron éxito cUa1do se observó que un cambio de Phe a Lys en el residuo 185 IN aumentaba notablemente la solubilidad sin disrupción de la actividad catalítica in vitro. Cada mon6mero del domnio central IN de VlH-1 (residuos IN 50 a 212) está compuesto de una lámina 13 pentacatenaria flanqueada por hélices; esta estructura exhibe una anabgía notable a otras ¡:olnucJeotidil-transferasas que incluyen RNasaH y la transposasa M./A del bacteriófago. Tres resduos altanente conservados se encuentran en posiciooes análogas en otras polinucleotidil-transferasas; en VlH-1 IN éstas soo Asp-64, Asp-116 Y Glu-152, el denominado moti\O D,D-35-E. Las mutaciones en estas pos iciones blcquean la Mción de VlH IN tanto in vivo como in vitro. La estrecna proximidad de estos 3 aminoácdos en la estructura del cristal tanto del virus del sarcoma aviar como de los dominios centrales de VlH-1 respalda la hipótesis de que estos residuos juegan un p~el fundanental en la catá~sis de la reacción de transferencia de po~nudeotidib que se encuentra en el corazón del procedimiento de integración. El dominio C-terminal, cuya estructura ha sido resue lta por procedimientos Rrvf'.I , adq¡ta una topología de pliegue pentacatenaria en barril B rem iniscente de un dominio Src de homología 3 (SH3). Recientemente, se han resuelto las estructuras de rayos Xde fragmentos de la proteina IN del virus SIVyel "';rus del sarcoma de Rous, que abarcan tanto el domnio central como el dominio C-termnal
Las glicoproteínas Env de V1H juegan un papel fundamental en el ciclo vital del virus. Las mismas contienen los
determ inantes que interaccionan con el receptor CD4 yel correceptor, y cata liza n la reacción de fusión entre la bicapa ~pídica de la envoltura viral y la membrana plasmática de la célula hospedadora. />(jicionalmente, las glicoproteínas Envde VlH contienen epítopes que prowcan respuestas irrnunes ~e son importantes desde ambas perspectivas de diagrDstico yde desarrollo de vacunas.
La glicoproteína Env del VlH se sintetiza a partir del mRNA bicistrónico Vpu/Env de 4,3 kb remodelado una sola vez (véase Fig. 4); la traducción ocurre en ribosomas asociados con el reticulo endoplasmático rugoso (ER). El precursor de la poliproteina de 160 kd (gp160) es una proteina integral de membrana que está anclada a las membranas celulares por una señal hidrófoba de interrupción de la transferencia en el dominio destinado para ser la glicoproteina Env TM madura, g::¡41 (Fig. 6). El gp160 está rJicosilado cotraduccionalmente, foma enlaces disulfuro, y sufre oligomerización en el ER. La forma oligÓlTlera predomnante parece ser un trimero, aunque se observan también dineros y tetrámeros. El gp160 es transportado al GoIgi, donde, al igual que otras proteínas precursoras de la enwltura retroviral, es escindido proteoliticamente por las enzimas celulares al gp120 de la rJicoproteina SU madura ya la glicoproteína 1M gp41 (véase Rg. 6). La enzima ceh-Jlar respoosa~e de la escisión de los precursores retrovirales de Env que sigue a un moti\() Lys/Arg-X-L~/Arg-hg altamente conservado es furina o una proteasa semejante a furina, alJ1que otras enzimas pueden catalizar tanbién el procesamiento de gp160. La escisiál de gp160 es necesaria para la actividad de fusión irKIucda por Env y la infectividad del virus. Sui::siguientemente a la escisión de gp160, gp120 y gp41 forman una asociación no covalente que es crítica para el transporte del complejo Env desde el Golgi a la superficie de la célula. La interacción gp120-gp41 es bastante débil, y una cantidad sLEtancial de gp 120 se desprende de la s t.perficie de las células que expresan Env.
El caTIplep de gkoproteínas Env de VlH, en partirular el dominio SU (gp120), está glicosilado muy fuertemente; aproximadamente la mitad del peso molerular de pg160 se cOO1¡:one de cadenas laterales de oligosacáridos. Durante el trans¡:orte de Env desde su sitio de síntesis en el ER a la membrana plasmática, muchas de las cadenas laterales soo mcdifica::las por la adición de a:z1Ícares complejos. Las rumerosas cadenas laterales de o~gosacárK:los forman b que podría imaginarse como una nube de azúcar, oscurecierdo gran parte del gp120 oontra el reconocimiento nmune del hospedaoor. Como se muestra en Fig. 6, gp120 contiene dominios conservados (Cl a Cs) y variables (Vl a Vs) intercalados. Los residoos Cys presentes en los gp121l; de diferentes aislados están altamente conservados y forman enlaces disulfuro que unen las cuatro primeras regiones variables en budes grandes .
Una función primaria de las gliroproteínas Env virales es promover una reaccién de fusión de membranas entre las bicapas lipíd icas de las membranas de la en\Oltura \riral y la célula del hospedaoor. Este evento de fusión membranal permite que el centro \rirallogre entrar en et citoplasma de la célula hospedaoora. Han sido implica:::las varias regiones tanto en gp120 como en g>41, directa o indirectamente, en la fusién membranal media::la por Env. Estudios de la proteina hemaglutinina HA2de los ortomixovirus y la proteína F de los paramixovirus indicaron que un dominio fuertemente hidrófobo en el ténn iro N de estas proteínas , al que se hace referenda como el péptido de fusión, juega un papel crítico en la fusión membranal. Los análisis de mutaciones demostraron que un dcminio análogo estaba localizado en el término N de las gliroproteínas 1M de V1H-1 V1H-2, Y SIV (~ase Rg. 6). Sustituciones no hidrófobas en esta región de gp41 reducían rotablemente o bloqueaban la formación de sincitios y dabarJ corno resutado la producción de viriones no n fecciosos de la progenie
En posición C-termnal al péplido de fusión pg41 se encuentran dos dom nios anfipálicos helicodales (~ase Rg. 6) que juegan un papel fundamenta l en la fus ión membranal. Las mutaciones en la hé~ce N-terminal (a la que se hace referencia como hélice N), que contiene un moti\O de repetición de hepta::la semejante a una cremallera de Leu, deterioran la infectividad y actividad de fus ión membranal, y los péptidos derivados de estas seruencias e>dliben una acli\ridad anti\riral potente en culti\O. La estructura del ectodomnio de V1H-1 ySIVgp41, los dos moti\Os helicoidales en particular, ha sido el foco de arJálisis estructurales en los últimos años. Las estructuras se determinaron por cristalografía de ra~s X o espectroscopia NrvR, sea para proteínas de fus ión que cmtenían los dominios heliooidales, una mixtura de péptidos derivados de las hélices N y C, o en el caso de la estructura de SIV, la seruencia intacta del ectodcminio gp41 desde el residJo 'll al 149. Estos estudios obtuvieron fundamentalmente estructuras trímeras sim ilares , en las cuales los dos dcminios hel icoidales están empaquetados en una modalidad antiparalela para generar 1r1 haz de 6 hélices. Las hélices N forman un serpentín enrollado en el centro del haz, estando empaquetadas las hé~ces C en hendiduras hidrófobas en el exterior.
En los pasos que conducen a la fusión membranal, la fíjación de CD4 induce cambios de conformación en Envque facilitan la fijación de correceptores. Después de la formadón de un complejo temario gp120fC04fcorreceptor, gp41 adopta una conformadón hipotética que permite que el péplido de fus ión se inserte en la bicapa lipídica diana. La formación del haz de 6 hélices g::¡41 (que imp~ca interacciones antiparalelas entre las hé~ces N '1C de gp41) une las membranas viral ycelu lar y tiene lugar la fusión membranal.
Uso de Virus MItA Recombinante para Reforzar la Respuesta Irmune de las Cé lulas CO+8
La presente invención se refiere a la generacién de una respuesta inmune de las células T coa' caltra 1Il cntigeno, así como a la pro\Ocación de una respuesta de antiruerpos . rv'ás particularmente, la presente invención se refiere a regímenes de inmunizacién "de cebado y refuerzo" en los cuales la respuesta irmune nducida por la aaninistración de una composidón cebadora se refuerza por la a::Iministraciál de una composición reforzante. La presente invención está basada en la demostraciál experimental previa de que puede conseguirse un refuerzo eficaz utilizando vectores vaccinia AAkara modificados (MItA), después de cebado con cualquiera de una di..efsidad de tipos diferentes de compos ico nes cebadoras que ncluyen MItA recombinante propiamente dicho.
Un componente protector prindpal de la respuesta inmune contra varios patógenos está mediado por lintodlos T del tipo coa', conocidos también como linfedtos T citotóxicos (CTL). Una fracdón importante de las células COS· es la secreciál de interferÓll gamma (IFNy), y este proporciroa una medida de la respuesta inmune de las células T COS' Un segurKIo com ponente de la respuesta inmune es un anticuerpo dirigido contra las proteínas del patógeno
La presente invenciál emplea MItA que, como demuestran e>q:lerinlentos anteriores, se ha encootrado que es un medio eficaz para proporciooar un reforzamiento a una respuesta irmune de las céluas T coa' cebadas para el antígeno utilizando cualqtiera de una diversidad de com pos ico nes cebadoras diferentes y pro\Ocando también una respuesta de anticuerpos
Resu lta interesante que un trabajo experimenta l anterior demuestra que el uso de predecesores de la presente invención permite que un virus MItA recomb inante que e>q:lresa un antígeno de V1H refuerce una respuesta inmune de las células T COS+ cebada por una vacuna de .ADN , pro\Ocando también una respuesta de anticuerpos. Puede encontrarse que el MItA induce una respuesta de células T COS' después de nmuni?ación. Puede demostrarse también que MItA recombincnte ceba una respuesta irmune que es refonada por una o más inoruladones de MItA recornb n ante
Primates no humaros inmunizados con AON plasmidico y reforzadas con la MItA resultaban prote9das eficazmente contra el enfrentamiento e>q:los ición intramucosal con virus vi\O (.Amara et al. 2001 , Scienre 292: 69-74). Ventajos<nlente , los inventores cootemplan ~e puede emplearse un régimen de vacunaciál uti ~zando inmunización intradénnica, intramuscular o mucosal tanto para cebado corno para refuerzo, constituyendo un réginlen de nmuni?ación general aderuado para inducir las células T CDS' y pro\Ocando también una respuesta de anticuerpos, v.g., en humanos
En diversos aspectos y rea lizaciones , la presente invención emplea un vector de MVA que codifica un antígero de VlH para reforzar una respuesta inmune de las céhJlas T coa· al antígeno cebado por la admilistración previa de ácido nudeico codificante del antigeno y provocar también una respuesta de anticuerpos
Un aspecto general de la presente fl'.'ención proporciona el uso de un ~ctor MVA para reforzar una respuesta inmune de las células T CDa' a un antigeno de VlH y provocar también una respuesta de anticuerpos
Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de reforzamiento de la respuesta irmune de las células T coa' a un antígeno de VlH en un individuo, y provocar también una respuesta de antiruerpos, indu}-endo el procedimiento la provis ioo en el individuo de un vector de MVA que inclu~ ácido nucleico ccdificante del antígeno, enlazado operalivamente a seruencias reguladoras para la produccién de antígeno en el individuo por e¡q:¡resión del ácido nudeico, por el cual se refuerza una respuesta inmune de las células T CDa' al antígeno cebado previamente en el individuo.
Una respuesta inmune a un antigeno de VlH puede ser cebada por inmunizacioo con ADN plasmidico o por infeccioo con un agente infeccioso
Un aspecto adicional de la in vención prqlOrciona un procedimiento de inducción de una respuesta inmune de las células T coa' a III antígeno de VlH en un individuo, prowcando también una respuesta de anticuerpos, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo una composición cebadora que comprende ácido nucleico que cod fica el antígeno y administrando luego una composicioo reforzante que comprende un \oector de MVA que incluye ácido nudeico coelficante del antígeno enlazado operativamente a secuencias reguladoras para producción de antígeno en el individuo por expresión del ácido nudeico
Un aspecto aelcional proporciona el uso de un vector de MVA, como se describe, en la fabricación de un medicamento para acrninistración a un mcmífero a fin de reforzar una respuesta inmune de las células TeDa' a un antígeno VlH , provocando también una respuesta de antiruerpos . Un medicamento de este tipo está destinado generalmente a administración después de la administración previa de una composicioo cebadora que comprende ácido nudeico codificante del antigeno
La composicién cebadora puede comprender ADN codificante del antígeno, encootrándose dicoo .ADN preferiblemente en la forma de III plásmido cirrular que no es capaz de replicarse en céllJas de mamífero. Cualquier marcadorselecciooable no deberia ser resistente a un antibiótico utilizado dinicamente; así, p:>r ejempo, se prefiere la resistencia a Kanamicina a la resistencia a Ampic~ina. La expresión del antígeno debería estar impulsada por un promotor que sea acti-.u en células de mamífero, por ejemplo el pranotor inmediato temprano de citan egalovirus (CMVIE).
En realizaciones particulares de los diversos aspectos de la presente invencioo, la administración de una composición cebadora va seguida por reforzamiento con lila composición reforzante, o composiciooes de refuerzo primera y segunda, siendo las composiciones de refuef2D primera y segunda iguales o diferentes una de otra. Otras composiciones de refuerzo adicionales pueden emplearse sin apartarse de la presente in~nción. En una realización, un régimen de inmunización triple emplea .ADN, a continuación adenovirus como primera composición cebadora, seguido por MVA como una seg.¡nda canposición reforzante, seguida opcionalmente por una composición cebadora ulterior (tercera) o administración reforzante subsiguiente de uno u otro o cmbos ~ctores iguales o diferentes. otra opción es .ADN seguido por MVA, seguido a su vez por adenovirus, seguido opciooalmente por adm inistración de refuerzo subs~uiente de uno u otro o <rnbos \ectores iguales o diferentes
El antígeno a codificar en las composiciones respectivas de cebado y refuerzo (sin embargo se emplean mucnas composiciones de refuerzo) no precisa ser idéntico, pero debe compartir al menos un epítope de las células T coa' El antigeno puede corresponder a un antigeno completo, o un fragmento del mismo. Pueden emplearse epítopes peptídicos o cadenas artificiales de epítopes, cariando más eficientemente una secuencia innecesaria de proteína en el antígeno y la secuencia codificante en el vector o vectores. Pueden induirse uno o más epítopes adiciooales, por ejemplo epitopes que sean recooocidos por las céhJlas T ad}-\Jvantes, espedalmente epítopes reconocidos en individuos de diferentes tipos HLA
Un <rItígeno de VlH de la invencién a codificar por un virus MVA recombinante inclu~ polipéplidos que tienen actividad irmunógena prowcada por una secuencia de aminoácidos de una seruencia de am inoácidos de V1H Env, Gag, Poi, Vlf, Vpr, Tat, Rev, Vpu, o Nef romo al menos un epitope de las células T COS'. Esta seruencia de aminoácidos se corresponde sustancialmente con al menos un fragmento de 10-900 aminoácidos y/o secuencia de consenso de un Env o Poi de V1H conocido; o al menos un fragmento de 10-450 aminoácidos y/o secuencia de consenso de un Gag de VlH conocido; o al menos un fragmento de 10-100 cminoácidos yfo secuencia de consenso de un VIt, \.1lr, Tat, Rev, Vpu, o Nefde VIH conocido
Aunque se presenta una secuencia precursora de 8w de longitLXl total para uso en la presente invencioo, Envestá opcicnalmente delecionado de las subsecuencias. Por ejemplo, pueden estar deleco nooos regiones de la superficie de gp120 y productos de escis ión transmembrana les de gp41 .
Aunque se presenta una secuencia precursora de Gag de long itud tota l para uso en la presente invención , Gag esta deledonado cpcionalmente de las subseruendas Por ejemplo, pueden estar delecionadas regones de la proteína matriz (p17), reg iones de la proteína de la ~ida (p24), regiones de la proteína de la nudeocápsida (p7), y reg íones de p6 (el péptido C-termínal de la pdíproteína Gag).
~nque se presenta una seruencia precursora Poi de bngitud total para uso en la presente invención, Poi esta deledonado cpcionalmente de las subseruendas . Por ejemplo, pueden estar delecionadas regiones de la proteína proteasa (p10), regiones de la proteína transcriptasa nversa (p66/p51), yregiones de la proteína integras a (p32 ).
Una Env, Gag o Poi de V1H de este tipo puede tener identidad global de al menos 50% con respecto a una seruenda de aminoáddos de la proteína Env, Gag o Poi, tal como identidad de 50-99%, o cua quier intervalo o valor comprendido entre ellos, prowcando al mismo tiempo una respuesta inmtllógena cootra al menos una cepa de un
V1H.
El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, por comparación de la información de seruenda utilizando el programa de computadora G.AP, versión 6.0, disponible del Grupo de Computadoras de Genética de la Universidad de Wisconsn (UWGCG). El programa GAP utiliza el procedimiento de alineaciérl de Nee::lleman y Wunsch (J. r-tol. Biol. 197048:443), como ha sido revisado por Smittl yWaterman (Adv .Appl fv1ath 1981 2:482). Brevemente, el programa G.AP define la identidad como el número de sÍ11bdos alineados (es decir, nude6tidos o aminoácidos) que son idénticos, dividitb por el núm ero total de s ín bdos de la más oorta de las dos secuencias. Los parámetros preferidos por defecto para el programa G.AP incluyen: (1) una matriz de comparaciérl unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y O para no-identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess (Nucl. Acids Res 1986 14:6745), como ha sido descrita por Schwartz y Oa~off (editores, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biom edical Research Foundation, Washington, O.C. 1979, pp. 353-358); (2) una penalidad de 3,0 por cada laguna y una penalidad ad idonal de 0,10 por cada siTIbdo en cada laguna; y (3) sin penalidad para los lagunas en los eJdremos.
En una realización preferida, una Envde la presente invención es una forma variante de al menos una proteina de la enwltura de V1H. Preferiblemente la Env está compuesta de gp120 Y el gp41 que abarca la membrClla yel ectodOO1inio, pero carece de parte o la totalidad del dominio citoplásmioo de gp41.
Secuendas conocidas de V1H están disponibles fácilmente de bases de datos de secuencias de VlH comerciales e institucionales , tales como GENB.ANK, o como compiladones pub~cadas, tales como fv1yers et al. eds., Human Retroo...1ruses and AJDS, A Compilation and Malysis af Nudeic Acid and Amino Acid Sequences, Vals. I y 11, Theoretical Biologyand Biophysics, Los Alamos, N. fv\:;!x. (1993), o en Intemet en hiv-web.lanl.govl.
Las sustituciones o inserciooes de tila Env, Gag o Poi de V1H para obtener una Env, Gag o Poi de V1H adicional, codificadas por un ácido nucleico para uso en un virus de MItA recombinante de la presente invención, pueden incluir sustitudones o inserciones de al menos un residuo de amnoáddo (v.g., 1-25 aminoácidos). Alternativamente, al meros un am inoácido (v.g., 1-25 aminoácidos) puede delecionarse de una secuencia Env, Gag o Poi de VlH Preferiblemente, tales sustituciones, nsercones o deleciones se identifican basándose en características de seguridad, niveles de expresión, inmunogenicidad ycompatibilidad coo tasas de repicación altas de MVA
Pueden prepararse variaciones en la secuencia de aminoácidos en una Env, Gag o Poi de V1H de la presente invención, v.g., por mutadones en el .ADN. Tales Env, Gag o Poi de V1H induyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de nucleótidos que codificéV"l diferentes residuos de am inoácidos dentro de la secuenda de aminoácidos . Obo...1amente , las mutaciones que se harán en el ácido nudeioo codificante de una Env, Gag o Poi de VlH no deben poner la secuencia fuera del marro de lectura, y preferiblemente no crearán dominios complementaros que pudieran producir estructuras de m RNAserundarias
El ácido nucleico codificante de Env, Gag o Poi de V1H de la presente invención puede prepararse también por amplificación o mutagénesis orientada de nucleótidos en .ADN o RNA codificante de una Env, Gag o Poi de VIH y síntesis o transcripciál im.ersa subsiguiente del .ADN codifica1te para producir.ADN o RNA codificante de una Env, Gag o Poi de V1H, basándose en la doctrina y las directrices presentadas en esta memoria
Los o...1rus de MItA recombinantes que expresan Env, Gag o Poi de V1H de la presente invención induyen un conjunto finito de secuencias codificantes de Env, Gag o Poi de V1H como nucleótidos de sustitución que pueden ser obtenidos rutinariamente por una persooa cal e~erienda ordinaria a la técnica sin experimentadón excesiva, basándose en la doctrina y las orientaciones presentadas en esta memoria. Para una descripción detallada de química y estructura de las proteínas, véase Schulz, G.E. et al., 1978 Principies of Proten Structure, SpringerVer1ag, Nueva York, N.Y., y Creighton, T.E., 1983 Proteins: Structure and r-tolecuar Proper1ies, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA Para una presentacón de sustitudones de secuencias de nudeótidos, tales como pO referencias de cooones, \oéase Ausubel et al. eds. Current Protocols n Molecular BiOlogy, Greene PlIblishng Assoc. , Nueva York, N.Y. 1994 en §§ A 1.1-A.1.24, Y Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory
fv1anual, Second Edition, Cdd Spring Harbar LaboratoryPress, Cok:! Spring Harbar, N.Y. en los .Apéndices C y O
Así pues, una persona con experiencia ordinaria a la técnica, dadas la doctrina y orientaciones presentadas en esta memoria, ronocerá el modo de sustituir otros residJos de aminoácidos en otras posiciones de un .ADN o RNA de env, gag o poi de V1H para obtener Env, Gag o Poi de VlH alternativas, con inclusiál de variantes por sustitudón, deledón o nserción.
Dentro del vector de MVA, secuendas reguladoras para la expresón del antígeno codificado induirán Ln promotor
Por ~pranotor" se entiende una secuencia de nudeótidos a partir de la cual puede inicia~e la transcripción de ,AON enlazado operativamente aguas abajo (es decir, en la dirección 3' en la cadena sentido del ,AON bicatenario). ~Enlazado operativamente" significa unido como parte de la misma molérula de ácido nudeico, posicionado adecuad<nlente y orientado para que se inide la transcripción a partir del pranotor. El .ADN enlazado operativamente a un pranotor se encuentra ~bajo regulación de la iniciación transcripciona l" del promotor. Otras seruencias reguladoras que incluyen fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, genes marcadores y otras secuencias pueden induilSe en caso apropiado, de acuerdo con el corncimiento y la práctica de la persona con experiencia ordinaria en la técnica: véase, por ejempo, fv"'oss, B. (2001). PoX\riridae: the viruses and lheir replicalion. En Fields Vlrology, D.M. Knipe, y P.M. Howley, eds. (Phila::lelphia, Lippincoll Wiliiams & Wilkins), pp. 2849-2883. MJchas técnicas y protocolos corncidos para manipulación de ácicb nudeioo, por ejemplo en la preparación de coostrucciooes de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ,AON en células y expresión de genes, así como anális is de proteínas, se describen en detalle en Current Protoools in fvblecular Biolcgy, 1998, Ausubel et al. editores., John Wiley& Sonso
Los promotores para uso en aspectos y realizaciones de la presente invencón pueden ser compatibles con sistemas de elqlresión de poX\rirus e incluyen secuencias naturales, modificadas ysintéticas
Una rualquiera o anbas de las composiciones de cebado y refuerzo pueden induir un ad~vante, ta l como el factor estimulmte de colonias granulocitos-rnacrófagos (GM-CSF) o el ácido nudeico codificante del mismo.
La administradón de la romposición reforzante se realiza por regla general aproximad<nlente 1 a 6 meses después de la adminislradón de la composición cebadora, con preferenda aproximadanente 1 a 3 meses
Preferiblemente, la administración de la composición cebadora, la romposición reforzante, o ambas composiciones cebadora y reforzante, es inmUlización intradélTTlica, intramusrular o mucosal.
La administración de vacunas de MVA puede realizarse utilizando una aguja para inyectar una suspensión del virus. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin a9Jja para acrninistrar una suspensión de virus (utilizando, v.g., el inyector sin aguja BojectorTId ) o un poi\() liofilizado resuspendido que contiene la vacuna, que hace posible la producción de dosis preparadas individualmente, q..¡e no precisan almacenamiento en frio. Esto representaria una gran ventaja para una vacuna que es necesaria en las áreas rurales de África
MVA es un virus con un registro de seguridad excelente en inmunizaciones humanas. La generacién de virus recombinantes puede realizarse senci"amente, y los mismos se pueden fabricar de manera reproducilje en grandes cantidades La administración intradérmica, intramuscuar o mucosal del virus MVA recombnante es por consiguiente sumamente adecuada para vacunación profiláctica o terapéutica de humanos contra el SIDA que puede ser controlada por una respuesta de las células T CDS'
El individuo puede pa:::lecer SIDA con lo que el stministro del antígeno y la generación de una respuesta irmune de las cé lulas T CDS' al antígeno son beneficiosos o tienen un efecto terapéuticamente beneficioso
MJy probablemente, la aannislracón tendrá final idad profiláctica para generar una respuesta inmune contra VlH o SIDA antes de la infección o el desarrollo de los síntomas
Los componentes a aaninistrar de aruerdo con la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas . Estas composiciones pueden canprender un excipiente, portacbr, tampón, estab~izador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Ta les materiales deberían ser no tóxicos y no deberían interferir cm la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la ruta de administración, v.g., las rutas intravenosa, rulánea o stbcutánea, nasal, intramuscuar, o intraperitoneal .
Como se ha ndicado, la adminislradón es preferiblemente intradénnica, intramuscular o mucosal
Puede indui¡se soluciÓll salina fisiolÓJica , dextrosa u otra solución de sacir"idos o gliooles tales como etilenglicol, prop~ergliool o poiietilenglicd .
Para inyecciérl intravenosa, cutánea, subcutánea, intramuscular o mucosal, o in'yección en el sitio de la afeccioo, el ingrediente activo se encontrará en la fonna de una soluciérl acuosa parenteralmente aceptable que está exenta de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las personas con experiencia relevante en la técnica son perfectamente capares de preparar soluciones aderuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de aorum de Sodio, Inyección de Ringer, in~cción de Ringer Lactada En caso requerido, pueden incluirse, conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes ylu otros aditi\()s
Puede emplearse una formulación de ~beraciérllenta.
Después de la produccirn de las partículas de WNA y formulación opcional de tales partículas en canposiciones, las partículas pueden administra~e a un individuo, partirulannente un htmano u otro primate. La administración puede realizarse a otro mamífero, v_g_un roedor tal como ratén, rata o hámster, coba~, conejo, o\eja, cabra, cerdo, cabaao, vaca, burro, perro o gato.
La crlninistraciÓll se real iza preferiblemente en una ~cantidad profilácticamente eficaz" o una ~cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la profilaxis puede ronsiderarse terap ia) siendo ésta suficiente para beneficiar al individuo. La callidad real admiristrada, y la tasa de evoludón tem~ral de la acministradón, dependerán de la naturaleza y gra\edad del problema ~e se esté tratando. La prescripción del tratamiento, v.g., decisiones acerca de dosificación, etc, está dentro de la responsab~idad de los médicos generalistas y otros doctores en medicina, o en un contexto \eterinario de un técnico \eterinario, y tipicamente tiene en ClJenta el trastorno a tratar, el estado del paciente individua l, el punto de suministro, el procecimiento de administracién Y otros factores ronocidos por los expertos. Ejemplos de las térnicas y protocolos mencionados alteriormente pueden encontrarse en Remingtoo's Pharmaceutical Sciences, edición 163, 1980, Osol, A. (Edit.).
En un régimen preferido, el ADN se administra a una dosis de 300 I-Ig a 3 mglinyecoon, seguido por WNA a una dosis de 106 a 109 partículas infecciosas de virusfinyección
Una comp:>Sición puede ooministrarse sola o en combinación con otros tratamientos, sea simultánea o seruencialmente dependierdo de la afeccién a tratar.
El slll1inistro a un mamífero no h.Jmano no precisa ser pare un propósito terapéutico, s ino que puede ser pam uso en un contexto experim ental, por ejemplo, en la in\estigación de mecanismos de respuestas irrnunes a un antígeno de interés , v.g_ , protección contra VlH o SIDA
Un plásmido lanzadera construccién recOOlbinante de vacuna cl ínica MHAI VlH 1 Y mecanismo para retención de insercjones de genes extraños intactos en MM recombioonte por alteracjón de codones del oen extraño e josercjón del gen extraño entre dos genes esenciales del virus vaccinia.
La invencién proporciona mecanismos para·
• retencién de genes extraños intactos por inserción de los mismos entre dos genes de virus vaccinia que son esenciales para la replicación del MVA La deleción del gen extraño puede proporciooar una ~ntaja significativa de crecimiento para el MVA recombinante permitiendo que el mismo compita con MVA que contiene el gen extraño iltacto después de sornetimiento a pases repetidos_ Sin embargo, la mayoría de las deledones de un gen extraño induyen la pérdida de alguna parte del ADN del virus vaccinia f1anqueante. Si el ADN del virus vaccinia es esencial, entonces dimos virus con deleciones no se replicarán ycompetirán con el MVA que contiene el gen extraño intacto. Esta metooología será útil en la pro:::lucción de virus vaccinia recombinantes que tienen que amplificarse en gran escala por ejemplo para utilización en pruebas clínicas , y • estabi~zación de inserciones de genes extraños por alteración de ~puntos calientes~ específicos que en caso contrario sufren fácilmente mutacién después de sometimiento a pases repetidos del virus recombinante. Esta metodología es útil en la pro:::lucción de virus recombinantes que tienen que amp~ficarse en gran escala por ejemplo para uso en pruebas clínicas.
y describe·
•
el plásmido lanzadera, pLW-73, utilizado para inserción de un gen extraño entre dos genes esenciales del virus vaccinia; y
•
la ccnslruccioo MVMJGD4d de vacuna clínica recombinante MVNVlH-1, un material que inrorpore el uso de estos dos mecanismos .
Nue\oOs procedimientos para la generacién de virus MVA recomb inantes rstables
Los autores de la invención han obtenido recombinantes del virus vaccinia Ivlkara modificado (MVA) que expresan los genes env ygagpol a partir de aislados de VlH-1 de diferentes localizaciones geográficas. Los genes extraños se insertaron en 2 sitios, Deleción 11 y Deleción 111 de MVA. Se ha demostrado que la estab.idad de estos genes después de pases repetidos de MVA recombinante en cultivo de tejidos es variable. Los inventores demostraroo que la inestabilidad era debida, o bien a delecién del gen extraño entero y algo de ADN f1anquea"lte, o a mutaciooes puntuales específicas que daba"l como resultado la propagadón de viriones de la progenie que tienen una \entaja de crecimiento debido a que no expresan el gen extraño. En este caso los inventores describen dos nue\oOs procedimientos de retendón del MVA recombinanle del gen extraño intacto_ En primer lugar, los in~ntores construyeron un vector de tr<rlSferencia que dirige la josercó n de un gen extraño entre 2 genes esenciales del virus vaccinia en la región central ccnservada del genorna. El uso de este sito para inserción de genes evita el desarrollo de variantes que rontengan grandes deledones que indu~n el ADN esencial del virus vaccinia _.Adicionalmente, este plásmido puede utilizarse para nsercon de genes adicionales en virus recornbinantes_En segundo lugar, el análisis de aislados con mutaciones puntuales re\eló ciertos "puntos calientes~ con propensión para la inserdón o delación una sola base que cause terminación prematura durante la traduccién. Los inventores demostraroo que la generacioo de mutaciones s ilenciosas en estos sitios daba como res¡jtado la estab~ización del gen insertad:> l Construcción y aplicación del nuevo vector de transferencia
Cons!nJccón de! nue\9 vector de !ransferenOa pi W.73
1.
La regién cerJtral del geruna del MVA, K7R·.tQ4R, se examnó respecto a 1) pares de genes conservados en la fami1ia poxvirus o la subfanil ia Chordopoxvirus y 2) genes que se enUJentran en direccién opuesta de tal mooo que sus extremos 3' está"¡ en proximdad estrecha, prq19rcionando con eno un sitio de insercién que podría ro causar disrupción de un pranotor de vaccinia. El sitio elegido cano nuevo sitio de inserción se encontrará entre dos genes esenciales , 18R yG1 L
2.
El flanco izquierdo del nue\9 \-ector se constru}Ó de manera siguiente: se cortó el plásmido LAS·1 con las enzimas de restricción EcoRI y Xhol para eliminar el flanco del 111 MVA, GFP, Yla repetición directa del fl~co de MVA Esta inserción se cortó con Ascl y Sac!, y se aisló el fragmento GFP. Se amp~ficaron por PCR quinientos treinta y uno pares de bases en el extremo del gen ISR (con inclusión del cod:)n de parada TAA) con los sitios de restricdón EcoRI y Ascl en los extremos del producto PCR. La <nlp tificación por PCR de 229 pares de bases de la repetición drecta (desde el extremo del gen ISR que incluía el coclón de parada TM) se rea~2Ó con oligonudeótidos que contenían los sitios de restricción Sacl y Xho!. La totalidad de ras 4 piezas de I>DN , 1) la cadena principal del vector con los extremos EcoRI y Xhol, 2) el nuevo flanco izquierdo que contenía el extremo de ISR con los extremos EcoRI y Asc!, 3) GFP con extremos ksl y Sacl y 4) la repetición directa del flanco ISR con extremos Sacl y Xhol se ligaroo para produdr el plásmido pLW-72
3.
El fl~co derecho se construyó como sigue: se cortó pLW-72 con las enzimas de restricción Pstl y Hio:::llll para libelar el flanco del 111 del MVA en el plásmdo. Se amplificaron por PCR setecientos dos pares de bases en el extremo del gen G1L cm los sitios de las enzimas de restricción PsII y Hindlll en los extremos yse ligaron en el vector pLW-72 para producir pLW-73 (Fig. 7). La secuencia de pLW-73 se proporciona en Fig. 8.
4.
Las caracteristicas salientes de pLW-73 son: 1) el vector estaba diseñado para inserdón de genes extraños entre los genes esenciales en el genana del MVA El flanco izquierdo está constittido por el extremo del gen ISR yel flanco derecho está constituido por el extremo del gen G1L; 2) se incluye el gen GFP para selecdón nicial fáci l del virus recanbin~te, 3) el GFP está flarKlueado por repeticiooes directas del gen ISR, lo cual permite la ellpresión transitoria de GFP, dado que el GFP se perderá después de pases repetidos del virus recombnante Con referencia a WO 2004/007201 , las caracteristicas 2 y 3 estaban contenidas también en los plásmdos anteriores utilizados para producir recombinantes fvfVAlVlH, pLAS-1 YpLAS-2
OOlicación de pLW-73
1 El gen env del aislado NJA del ciado B de VlH·1 se donó en pLW-73 y se obtu\9 un virus fvfVA recombinante
La secuenciadón del NJN confirmó la localizacién e integridad del gen env
2. Un virus MVA recombinante que e>q:lresaba el gen env del ciado O Ugandan (aislado A07412) (Fig. 9) en el sito Delecién 11 de MVAresultóser inestable, es decir, después de pases seriados en cultivo, el gen se delecionó de una porción significativa de la progenie del virus. El mismo gen se donó luego en pLW-73 y se obtu\9 y caracterizó un virus MVA recombinante. La insercién del gen envera estable des¡x.¡és de pases seriados repetidos (8x) en culti\(), es decir, no se encontró deleción alguna del gen inserta::lo o la región flanCf.Jeante de MVA M icionalmente, nose registró ninguna otra mutación cuanclose insertó el gen en este sitio.
I! Mutación puntual de "puntos calientes"
AAálisis de mutaciones nJntuales
Un virus fvfVA recombnante que expresaba el gen gagpol del Ciado D Ugandan (aislado A03349) en el sitio Deledón 111 de fvfVA resultó ser inestable. La alteradón genética prncipal ela la generación de mutacones en un solo ¡x.¡nto en tramos de 4-6 residuos G o C (Tabla 3). Micionalmente, se encontraron mutacones ¡x.¡ntuales similares en placas sn tinción de virus recombinantes similares que ellpresaban los genes gagpol de un aislooo del cladoAde Kenia yun aislado del ciado C de Tan23nia de VlH-1 .
MJtagénesis de puntos ca lientes vaná lisis de estabilidad en Virus reC9!TIbinante
Utilizando mutagénesis orientada, se produjeroo mutaciooes silenciosas en seis regiones de este tipo del gen 9a9 procedente del aislado de VlH-1 Ugandan. Este gen alterado, UGD 4d gagpo! orf (Fig. 10), se clooó en plAS-1 y se recombnó en el mismo sitio Deledón de fvfVA como se hiLO durante la construcción del virus inestable. Des¡x.¡és de pase seriado repetido (8x) en culti\9, no se encontró placa alguna que no se expresara La seruendacién del NJN del stock de virus del pase 8 comprobó que se mantenia la integridad del gen gagpol.
111. Construcción del recombinante doble
Virus MVMJGD4d
El virus MVMJGD4d, un virus recombinante que e~Hesa la envoltura del subtipo D AD7412 Ugandan y el gagpol A03349, se construyó de la manera siguiente: Se insertaron los genes de la en\Qltura ygagpol en el Clon 1 de MVA 1974/NIH por recanbinacit.'n hCI11óloga utilizando los plásmickE Ian2adera pLW-73 y pLAS.1, respectivamente. Se aisló MVAlUGD4d por 6 tandas de purificadón en placas en céulas fibroblastos de embrión de pollo y se <nlplificó y caracteri2Ó subsiguientemente
Sumario
1.
Se construyó un vector de transferencia de plásmido que dirige la recombinación de un gen extraño entre dos genes esenciales, ISR y G1 L, en la región central conservada del genoma del fv1VA Se demostró q..¡e el uso de este sitio inhibe la selección de virus mutantes con deleciones de los flancos genlMVA insertados
2.
Se alteraron tramos altamente mutables de residuos G y C por mutagénesis orientada y se generaron mutadones s ~encicsas en la seruenda codificante. Se demostró que este camb o estabi~zaba el gen cuando se insertó en De leción 111 de MVA
3.
Utilizando estos dos procedimientos anteriores, se constru}Ó el recombinante doble de MVA UGD4d que expresa de manera estable tanto el envcomo el gagpol del ciado D Ugandan.
EJemplo 1
Se han produddo MVA recombinantes que expresan bs genes env y gagpol de VlH-1 a partir de muchos aisla::los diferentes . La estabilidad de bs genes insertados después de sometimiento a pases repelidos en c¡jti\Q de tejido ha demostrado ser variable. En este caso los in~ntores (1) demuestran que la inestabi~dad representa una combinación de mutacioo o deledón espontánea del gen insertado yla selección de mutantes que no se expresan, y
(2) describen nuevos procedimientos para reducción de la inestab~idad .
Visión general
Se constru}Eron MVA recombinantes que expresan env y gagpol de mumos aislacbs diferentes Se sometió cada "';rus a pases repetidos en células fibroblastos de embrión de pollo para mimetizar la amplificación en gran escala requerida para la producción de virus para pruebas clínicas . Se monitorizó la estab.idad de la inserción por inmunotinción de env y gag de placas individuales. Para algunos virus reccmbnantes, se encontró que la expresión de env y/o gag se perdia rápidamente en una fracdón significativa de la pobladón de virus . Para identificar el o los mecanismos de pérdida de e><presión, se aislaron placas individuales y se caracteri2Ó la naturaleza de las mutaciones. En alguros casos, se identificaron secuencias específicas de.ADN con propensión a mutar por adición
o deleción de un sob nucleótido. La generación de tales mutaciones podía e"';tarse por alteración de rodooes sin
cambio del producto de traducción predicho. En otros casos, la pérdida de e~resi6n estaoo causada por grarx:les deledones que se extendían frecuentemente en los genes de MVA f1anqueantes ro esenciales. Para impedir que ocurriera esto, se constru}Ó un nue\Q plásmido lanzadera que se diseñó para dirigir la inserción de bs genes extraños entre dos genes esendales de fv1VA La recomb inación en este s itio reducía las deleciones del .ADN extraño. En un caso, sin embargo, la toxicidad asodada con la e><presión de env de VlH de allo nivel era tan grave que la selección de mutantes ratos daba todavía como resulta::lo una población inestable. En este caso, únicamente la truncación del domilio transmembranal de env penn itió la construcdón de un fv1VA recombinante estalle
Generación de MVA recombinantes y análisis de la estabilidad de los genes insertados
Se clonaron los genes env y gagpol en vectores lanzadera de MItA Se analizaron la elqlresión y la función por ensa}Os de e><presión transitoria. Se recombinó gagpol en MVA 1974fNIH Oon 1. Se pUlificaron bs MItA recornbilantes en placas con 6-8 tandas seguido por <fllplificacién del virus. Se recanbinó env en el aisla::lo MVNgagpol y los MItA recombinantes dobles (Fig. 11A) se purificaron en placas con 6-8 tandas y se amplificaron Para evaluar la estabilidad de las inserciones, se sometió el virus a pases seriados en células CEF utilizancb una multipticidad de infecdón (m.o.i.) de -1 pfu/célula para mimetizar la producción en gran escala. Se evaluó la estabi~da::l por detenninacioo del porcentaje de células que e><presaba'"! env o gag, caTlO se detenn ifÓ por inmunotinción con a'"!ticuerpos monodonales (Fig. 116).
Estabil idad de los MVA recombinantes
Se construyeron MVA recombinantes que e><presaban genes de aislados de VlH -1 de loca~zaciones geográficas diferentes. Se insertaron los geres env y gagpol en las deledores 11 y 111 del MVA, respectivamente; ambos bajo control del promotor H5 modificado. La estabilidad de los geres env y gagpol de 7 MVA recombinantes se muestra en la Tabla 4. Se observaron grados variables de inestabitidad en los 7 virus . En MltA165NG, la e><pres ión de envse perdía rápidamente, expresando sob 25% de los viriones env en el pase 6. En M'v'MJGD4a, la expresión tanto de envcomo de gagpol se perdía cada vez más con los pases sucesivos del virus. Dado que se requieren al menos 6-7 pases para la prorucciÓll de una gran cantidad de virus para una prueba en Fase 1, estos 00s virus se consideraron inadecuados .
Análisis de la expresión de MVA/65NG
Haciendo referencia a Fig. 12, se seleccionaron aleatoriamente 13 placas de P3 yP5 de MVA/65NG yse analizaron por inmunotinción con T-24 mM (sitio de fijación representado en a), transferencia Western, PCR, y secuenciadón. Se encontraroo 5 tipos de placas y los números de estas placas ootenidcs para cada tipo se dan a la derecha de Fig. 12. Las pacas a, b, y c se teñía'"!, pero by c eran -...ersiones truncadas debido a sustitución de bases (causarxlo el codén de parada) (b) ydeleción del extremo del gen envyparte del flanco de MVA(c) l as placas d ye sin tinción eran resultado de la adicón de G a un tramo 5G que causaba un cambio demarco (d) y una gra"l deleción del gen env entero y partes de los flancos de MVA (e). Así, la adición de pares de bases, sustitución, y deleciones conlribuía"l todas enas a la expresión inestable del gen enven MVN65AJG. Este env NG, el ejempb más inestable con el que se trabajó, se seleccionó para estudiar modificaciones que pudieran aumentar la estabilidad
Modificaciones en las construcciones AtO para aumentar la estabilidad
1.
Se produjo una enwltura sintética eliminando tramos de 4 Y 5 G Y C por mutaaones silenciosas a fin de prevenir mutaciones puntuales
2.
Se ronstru}Ó el \'ector 18fG1 , es decir, plW-73, con un sitio de inserción entre los genes esenciales 18R y G1 L a fin de pre\€nirdeleciones de genes y flancos de WNA que fuesen \1ables. Los extremos de los genes ISR (500 pb) Y G1 L (750 pb) de MVA se amplificaron por PCR yse insertaron en un vector que cootenía el praTlotor mH5 tempranoftardío del virus vaccinia rontrolador de la expresión de genes extraños. Se utilizó este vector 18fG1 para insertar genes extraños en WNApor recombnación homóloga (Ag. 13). Las deleaones de genes insertados y MVA flanqueante del gen insertado no serían viab les debido a que partes de genes esenciales se habrían delecionado. Por consig.Jiente, los virus con estas mutaciooes no serían capaces de superar a la población ron su ventaja de crecimiento normal.
3.
La enwltura NG de gp140 se mutó por delecioo del dominio transmembranal y la cola citoplásmica de g>41 , dando como resultado una proteína secretada
Análisis de las modificaciones para aumentar la estabilidad
Se produjeron 7 virLE recombinantes simples ccn modificacones env ylo uso del nuew vector como se muestra en Fig. 14. Se aislaron 5 placas de cada virus yse sometieron a pases independientemente en CEF para determinar si las modificaciones aumentaban la expresioo estable de la enwltura. Las placas sometidas a pases se analizaron por inmunotincón con mAb T-43 (sitio de fijación mapeado a 101-125 aa de env), transferencia Western, PCR, y seruenciación.
Expresión de En v después de pases en placas
Haciendo referencia a Fig. 15, 5 aislados de placas sometidos io::lependientemente a pases de cada uno de los 7
reccmbnantes arriba enumerados se caracte rizaron en los pases 1,3,5 Y 7 por inmunotindón ron m..o.b T-43 (que se fija entre los aninoácidos 101 y 125 en gp120). CUatro de 7 virus (Fig. 15, a, b, e, e) tenían e>q:lresión n estable de proteínas en cada una de las 5 placas sometidas a pases ; dos pases de placa de (Ag. 15f) tenían también expresión inestable de env. Estos inch.Jían virus ron el env sintético tanto en del 11 (Fig. 15c) como en el sitio esencial del gen (Ag. 15f) del genoma del MVA Únicamente bs virus recombinantes q.Je rontenían la enwltura como gp140 truncado y secretadose mantenían expresando de manera estable la en\oOltura (Ag. 15, d Y g)
Transferencia Western, PCR y análisis de secuencia
De los pases en placas seleccionados, se escogieron cienes para analizar la expresión de proteínas por transferencia Westem, PCR, y análisis de seruenda (Ag. 16). Para el análisis por transferencia Westem, se utilizaron T-24 y T-32 que se fijaban en el principio y el fin de la en\oOltura del ciado A, respectivamente, a fin de determ inar si se producía únicamente envoltura parcial o envoltura de longitud total. Los virus de cootrol, marcados c, se encuentran a la deredla de cada lransferenda. Para los 3 virus producidos en la delecién IIde MVA(Fig.16 a, b, y c), únicamente en Fig. 16 c (es decir, los clones gp1 40), se enrontraban todos los clones q.Je expresaban proteína detectable en Westem. Esta proteína (como se midió por T-32) ro estaba truncada. Cuando se insertó la enwltura en el s ito del gen esendal por el vector 18fG1 (Ag. 16 d, e, y f), nuevamente, sob la enwltura de gp140 se e>q:lresaba en todos los clones yno estaba truncada . .AJJnque el uso del \€ctor 18/G1 no impedia mutadones en la seruencia env, el mismo impedía las deleciones que se habían observado en la envoltura insertada en del 11. (Obsérvense bs procl.Jctos PCR positivos para todos los clones testados a partir del \€ctor 18/G1 , yen cambo los productos PCR negati\Os a partir de los clones testados ulitizando el \€ctor del 11)
Expresión de Env en el c iado AJG recombinante dobte
Basándose en resultados previos con análisis simple de env, se produjeron recombinantes dobles que expresaban gagpol con gp140 o con el gen sintético gp160, yse testaron respecto a estab~idad de la expresión de env(Fig.17) Se aislaron 5 placas de cada uno como se ha descrito previamente, y se sometieron a pases 7 veces para a"Ia~zar la estabilidad de la expresión de env. En el pase 7, las placas procedentes de los pases se sometieron a inmunotincó n con mAbs T-43 y T-32 (que se fijan a gp120 y gp41, respectivamente). Con mM T-43, uno de 5 clones de la enwltura s n tética de e¡q;Jresión recombinante estaba constituido únicamente p:;!r placas sin tinción. La tinción subsiguiente con T-32 de estas placas demostró que otra placa tenía expresión tnncada de la enwltura Todas las placas sometidas a pases del recombinante doble que contenía la enw ltura de gp140 parecían estables por inmunoÜlción tanto ron T-43 corno con T-32. Los títulos eran tanbién 2 I~ mayores que con el otro recombnante doble. Por tanto In reccmbinante doble del dado NG que e>q:lresaba de manera estable la enwltura pudo p:;!día producirse únicamente con la envoltura de gp140.
Virus recombinantes que expresan env y gag poi a partir de aislados de VIH-1 Ugandan
Se consbuyeron \rirus Ml/A recombinantes que e>qlresaban los genes env y gagpol de \IIH-1 a partir de aislados A0741 y .A03349 Ugandan, como se muestra en Hg. 18. Se sanetieron a pases seriados cuatro a seis aislados indeperdientes de cada uno y se encontró que ambos genes eran inestables tanto si se expresaban solos como en combinación (Tabla 5). En contraste, la e>qlresién de gp140 en lugar de gp160 fijado a la membrana daba anlO resultad:> la estabilidad del gen envdespués de pases seriados (Fig. 18 Y Tabla 5).
MVAJUGD4a -Análisis de placas de env sin tinción
Para detenninar el meca1ismo de la inestabildad, se aislaron 24 placas indi\riduales sin linción (uti ~zando Mab T -43) del pase 6 de MVNUGD4a, se amplificaron, yse caracterizaron. Se identificaron dos pequeñas deleciones (1,2 yO,3 kb) por amplificacioo PCR y secuenciaciál del PON (Fig. 19). Todos los restantes aislados contenían deleciooes muy grardes que se extendían al MItA flanquea1te. Los ¡xmtos de rotura aproximados para estas deledones se idenlificaron utilizando pares de cebadores proce::lentes del interior del gen envo las regbnes flanqueantes de MVA
Modificación del env UGO en MVA recombinante
Para mejorar el problema de la inest<bi ~dad del gen env UGD, el gen env .AD7412 se inserló en MItA utilizando el nuevo vector, 18/G1, que dirige la recom binación de un gen extraño entre dos genes esenciales del virus vaccinia, 18 y G1 Y utiliza el promotor H5 modificado (Hg. 20). Se sometieroo a pases seriados cuatro placas irdependientes y se analizaron respecto a la expresión de env por inmunotinción con I\I1abs T-43 y T-32 en el pase 5 El gen era estable en todos los ais lados (Tabla 6)
MVAJUGD4b -Análisis de placas gag sin tinción
Para detenninar el mecanismo de nestabildad del gen gag, se esoogieron 8 placas ndi\riduales sn linción (utilizando r.lab 183-H12-5C -Depósito NIAJD AJOS) del pase 6 de rvfVAlUGD4b, se amplificaron, yse secuenció la inserción gag poi (Tabla 7). En 7 aislados se enoontró una insercioo o deleción de un solo residuo G en la posición 564-569. En un aislado, se delecb nó un residuo C de la secuencia CCCC en la posición 530-534. Micionalmente, las placas sn tinción de los stock.s de fv1VA'KEA y MVAlTZC sometidos a mucnos pases re-.elaban un punto caliente similar para mutación, a saber, la posición 564-569. El examen de la secuencia completa del gen gagpol UGD .AD7412 exh ibia 22 tramos de 4 o más resduos G o C (Hg. 21)
Modificación del Gen gag poi UGD en MVA recombinante
Dado que el mecanismo de inestabilidad del gen gagpol era fundaTlentalmente inserción o deleción de Ln sdo nucleótido en Ln tramo de 4-6 residuos G o C, la estrategia para mejorar la estabilidad de este gen fue generar mutaciones s~endosas en tales sitios. Así, se empleó mutagénesis orientada en 6 sitios en gag p17 yp24 (Tabla 3) El gen del codoo alterado (c.a.) resultante insertado en rvfVA en la misma localización, es decir, Deleción 111, resultó estable después de sometimiento seriado a pases (Fig. 2 Y Tabla 8).
Construcción de MVA estable recombinante que expresa env y gagpol UGO
Se conslru}Ó un virus recombinante que el'presaba el gen env UGD en ellorus 18/G1 y el gen gagpol alterado en codones en Deleción III de rvfVA (Fig. 23). El sanelimiento a pases seria:::los demostró la ausencia de inestab~idad de cualquier gen. Micionalmente, el nivel de la expresioo de proteínas y la secuencia de ADN se mantenían inalterados durante el sometimiento a pases (Tabla 9).
Conclusiones
La nestabilidad de las inserciooes env y gagpol se atribuye a la generación de mutacbnes y deleciones pLntuales y a la \'entaja de crecimiento de los mutantes de MItA que no se expresan. La inestabilidad puede reducirse generalmente por alteración de codooes y/o inserción en una región esencial del genoma del rvfVA (MVMJGD4d) pero tu\O que alterarse enven un caso (MVN65A1G)
EJemplo2
Inmunogenicidad de MVAJUGD4d en ratones BALBJc
Grupos de 10 ratones cada uno se inmunizaron por la vía intraperitoneal con 106 Ó 107 unidades ilfecciosas de MVMJGD4d. Grupos de 5 ratones cada uno se irrnurizaron análogamente con MltA-1974 parental. Los ratones se inmunizaron en las semanas O y3 yse sangraron en las semanas O, 3, Y 5. Se extirparon los bazos en lasemana 5.
Se midieron las respuestas celulares en esplenocitos recientes por linción intracelular con Oitoquininas. Los esplenocitos se estimularon por separaclo con lo siguiente: 1) el péptido gag inmunodcmilante (M1QM...KETI (SEQ ID NO: 6»,2) péptidos env(DTEVHN'vWATHACVP (SEQ ID NO: 7) y QQQSNLLRAJEAQQH (SEQ ID NO: 8», 3) péptidos poi (8 péptidos con variantes de M1inoáciOOs s imples de ELRQHLLRWGLTI (SEQ ID NO : 9) y HGVYYDPSKDLlAE (SEQ ID NO: 10», y4) MVA
Se tiñeron las céll.J as para expres ó n superficial de CD4 y coa y luego para expresión intracelular de IFN-ye IL2 o TNF. Como se muestra en Rg. 24, MVM.JGD4d pro\Qcaba respuestas de C08/IFN-y al ~ptido gag, los péptidos poi, y MVA. Las respuestas al péptido gag emn multifuncionales, e:xpresando tanto IFN-y como IL2 o TNF. Asimismo, se pro\Ocaron respuestas de CD4f1FN-yal conjunto de péptidos env.
Se midieron las respuestas hlmorales por ELlSA (Fig. 25). Se demostraron respuestas fuertes a UGD env al cabo
de 3 seméVlas después de una inmunización, y se reforzaron por la segunda nmunización. A::Iiciooalmente, se
pro\Ocaron respuestas fuertes de virus vaccinia después de 1 y2 inmunizaciooes
Tabla 3. Cambios de Nucleátidos MV AlUOO Realizados Para Biminar Tramos de O y e(Aislado A03349 de VIH-1)
N. °de nucleótido que comienza con ATO
Secuencia original Secuencia modificada
-70-74
GGGGG GGAGG
4UO-41
UUUC 1uuuA
530533 564569 686689
CCCC GGGGGG GGGG CACC AGGAGG GAGG
Tabla 4. Estabilidad de los MVA recombinantes
Porcentaje de placas sin ti nción
Virus
CIado Origen geografico Siembra de LVD Pase 3/4 Pase6/ 7 Pase 8/9 Pase 1013 Lote de vacuna
env
gag e nv gag e nv gag e nv gag env gag env gag
KEA5b
A Kenia <1 <1 0,13 0,33 0,34 0,36 0,54 2,4 0,64 0,77
65A1G
AlG Costa de Marfil <2 <1 28 1 75
628
B US <1 <1 <1 <1 6 <1 10 1
TZCa
C Tanzania <1 <1 <1 <1 1,7 2,8 3,6 3,7
71C
C India <1 <1 <1 1 <1 2 12 14
UGD4a
D Uganda <1 <1 3 0,28 6,7 6 12,2 17,4
CMDR
E/A Thailandia <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1
Tabla 5. Virus Recombinantes que Expresan env y gagpol de los Aislados VIH-1 Ugandan
% Sin tinción
ase 9
env 12,2 gag 17,4
UGD4a
5 2,7 17,6 "
o 5
0 ,4 11 ,4 ,8,0
5
3,3 9,3
UGD4b
5 5 4 7,9 15,2 Nd 4,4 5,0 18,8
UGD1a
4 4 4 Nd Nd Nd 46,7 64,9 38,1
UGDgag3349
8 ~
UGD env
6 8 8 9,0 13,3 22,9
UGDgaglgp140
8 5 14,3 1,2 18,9
5
2,3 17,6
Tabla 6. Modificación del Gen env UGD en MVA Recombinanle
% Sin tinción
Pase
env gag
UG09
5 0,5
5
0,4
5
0,0
5
0,5
Tabla 7. MVAJUGD4b -Análisis de Placas gag sin tinción # Placas Individuales con Mutación
N.O de placas individuales con mutación
Gen
Base# Secuencia MVNUGD MVNKEA MVNTZC
p1l
"O
70
GGGGG n 1
p24
408 GGGG
oJU
CCCC n '1
564
GGGGGG n-7 n-16 n-21
686
GGGG
(continuación)
N.O de placas individuales con mutación
~n
Ijase¡:¡: ;::,ecuenaa
1050
GGGGGG
p7
1133 GGGG
P
'OLU ~~~~
p6
1361 occc
1387
GGGG
141"
uuuu
1473
CCCC
Proteasa RT
1494 GGGGG
""U
1599
GGGGG
2362
GGGG
LOOU
~~~~
2528
GGGGG
2596
GGGG
¿."~
uuuu
3001
CCCC
Tabla 8. Modificación del Gen gag poi UGO en MVA Recombinante
V/o ;::ilntlnCIOn
Pase
eny gag
UOO gag (c.a.)
6 0,9
"
u,u
6
0,5
Tabla 9. Construcción de MVA Estable Recombinanle que Expresa env y gag poi UOO
% Sin tinClon
Pase
eny gag
UGD4d
11 0,0 0,7

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un 'Virus vaccinia Ankara modificado (Ml/A) recombnanle q.Je oomprende una seruencia de AON helefÓloga insertada en una regiál intergénica (IGR) del gerorna del Ml/A, que está localizado entre, o flanqueado por, los marros de lectura abiertos (ORF) 069-070 del genoma del Ml/A en la nomendattJra de CDCf.Acambs
  2. 2.
    El MVA de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de .ADN hetefÓloga comprende al menos una seruencia cocificante, bajo el control transcripcional de un elemento de control de la transcripción poxviral.
  3. 3.
    El MVA de acuerdo con cualquiera de las rei'Vindicacbnes 1-2, en el que la secuencia de .ADN heteróbga codifica una o más proteínas, polipéptidcs o péptidos.
  4. 4.
    El MVA de acuerdo con cualqtiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de .ADN hetefÓloga se deriva del virus de la inmunooeficiencia humana (V1H).
  5. 5.
    El WNA de acuerdo ron la reivindicaciál 4, en el que la secuencia de .ADN heteróloga derivada del virus de la inmunodeficiencia humana cocifica para V1H env
  6. 6.
    El MVA de acuerdo con cualquiera de las rei'Vindicaciooes 1-5, en el que el genoma del Ml/A es el del Ml/A depositado en ATCC bajo el número de acceso PTA-5095
  7. 7.
    El MVA de acuerdo coo cualqtiera de las rei\-indicaciones 1 a 5, en el que el gencma del MVA es el que tiene la seruencia de GenBank nlinero de acceso AY603355
  8. 8.
    El MVA de acuerdo coo cualqtiera de las rei\-indicaciones 1 a 5, en el que el gencma del MVA es el que tiene la seruencia de GenBank, número de acceso l/94848.
  9. 9.
    Un vector plasmídico que comprende una seruencia de.ADN derivada de u homóloga al genoma de l..Il Ml/A, en el que dicha secuencia de.ADN comprende
    i) un fragmento cnmpleto o parcial de una secuencia IGR localizada entre las secuencias completas de los ORF 069-070 en la nomenclatura de CDC/.Acambis del genoma del MVA, e ii) nsertado en dicha secuencia IGR un sitio de donación para la inserción de lila secuencia de AON que es heteróloga al gencma del MVA, y iii) opcionalmente, una casete de gen indicooor o de selección.
  10. 10.
    Un ~ctor plasmídico que ccmprende una secuencia de.ADN derivada de u homóloga al genoma de un WNA, en el que dicha seruencia de.ADN comprende
    i) seruencias completas de los ORF 069-070 en la nomendatura de CDCfAcambis , e ii) insertado en dichos ORF, un sitio de donacién para la insercién de una secuencia de.ADN que es heteróloga al genoma del MVA, y iii) opcionalmente, una casete de gen indicador o de selección
  11. 11 . El \lector plasm ídico de acuerdo cm cualq,Jiera de las re ivindicaciooes 9 a 10, en el que la seruenda de.ADN se deriva de o es homóloga al gemma del MVAdepositado en ATCC bajo el nlinero de acceso PTA-5095
  12. 12.
    El vector plasm idico de acuerdo con cual~iera de las reivindicaciooes 9 a 10, en el que la seruencia de.ADN se deriva de o es homóloga al gemma del MVAque tiene la secuencia de GenBank número de acceso AY603355
  13. 13.
    El \lector plasmídico de acuerdo con cual~iera de las reivindicaciooes 9 a 10, en el que la seruencia de.ADN se deriva de o es homóloga al gemma del MVAque tiene la secuencia de GenBank, número de acceso U94848.
  14. 14.
    Una composicón farmacéutica, de vacuna o irmurógena que comprende el MVA de acuerdo coo cualquiera de las reivindicaciooes 1 a 8.
  15. 15.
    El MVA de acuerdo ron cualquiera de las reivindicaciooes 1 a 8, para su uso como medicamento, composición inmun6gena, o vacuna
  16. 16.
    Uso del WNA de acuerdo ron cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de un medicamento, composición inmunógena o vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una infección viral o una enfermedad proliferativa .
  17. 17.
    El MVA de acuerdo con cua.l~iera de las reivindicaciooes 1-8, para su uso en el lratamiento o la profilaxis de una infección \-iral o una enfermedad prolifera tiva
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9133478B2 (en) 2006-08-25 2015-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified vaccinia Ankara (MVA) virus recombinants comprising heterologous coding sequences inserted into the intergenic regions between essential genes
KR101621100B1 (ko) 2007-03-30 2016-05-13 더 리서치 파운데이션 오브 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕 백신에 유용한 약독화 바이러스
US8580276B2 (en) 2009-06-05 2013-11-12 City Of Hope Genetically stable recombinant modified vaccinia ankara (rMVA) vaccines and methods of preparation thereof
WO2011047324A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The U.S.A. As Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services . Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
WO2014018117A1 (en) 2012-07-27 2014-01-30 Diamond Don J An mva vaccine for delivery of a ul128 complex and preventing cmv infection
AU2015320409B2 (en) 2014-09-26 2019-03-28 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Virus-based expression vectors and uses thereof
WO2016115116A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus
EP3355924A1 (en) 2015-09-29 2018-08-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methods of treating and preventing amyotrophic lateral sclerosis
ES2944314T3 (es) 2016-01-08 2023-06-20 Geovax Inc Composiciones y procedimientos para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor
US20190030157A1 (en) 2016-02-03 2019-01-31 Geovax Inc. Compositions and Methods for Generating an Immune Response to a Flavivirus
WO2018064516A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Monsanto Technology Llc Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants
CN110546252A (zh) * 2017-02-23 2019-12-06 普罗拜奥根股份公司 具有广泛基因组对称的mva相关的新型痘苗病毒载体
WO2019018501A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Geovax Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING LASV IMMUNE RESPONSE
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
CN116322757A (zh) 2019-11-14 2023-06-23 埃利克斯疗法公司 用于疫苗的剂量方案
CN111063391B (zh) * 2019-12-20 2023-04-25 海南大学 一种基于生成式对抗网络原理的不可培养微生物筛选系统
EP4247410A1 (en) * 2020-11-19 2023-09-27 KaliVir Immunotherapeutics, Inc. Oncolytic immunotherapy by tumor micro-environment remodeling
CA3215344A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Kalivir Immunotherapeutics, Inc. Oncolytic viruses for modified mhc expression

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003219057A1 (en) † 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine
US7501127B2 (en) * 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
JP4895505B2 (ja) * 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
JP5052893B2 (ja) † 2003-02-20 2012-10-17 アメリカ合衆国 ポックスベクターにおける新規の挿入部位
WO2004098534A2 (en) † 2003-02-24 2004-11-18 Therion Biologics Corporation Methods for delivering angiogenic modulators using pox viruses
WO2004087201A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva virus expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
CA2545164C (en) † 2003-11-12 2016-11-29 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vectors expressing mucin and carcinoembryoinic antigen
US9133478B2 (en) 2006-08-25 2015-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified vaccinia Ankara (MVA) virus recombinants comprising heterologous coding sequences inserted into the intergenic regions between essential genes
EP2199400A1 (en) 2008-12-22 2010-06-23 Emergent Product Development Germany GmbH Single recombination system and methods of use
WO2011047324A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The U.S.A. As Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services . Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites

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