CN101563463B - 修饰的安卡拉（mva）痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点 - Google Patents

修饰的安卡拉（mva）痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因组的基因间区(IGR)内的新插入位点，其中所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并涉及用来插入外源DNA至痘苗病基因组内的相关质粒载体，并且还涉及作为药物或疫苗的含有插入所述新插入位点内的外源序列的重组痘苗病毒。

Description

修饰的安卡拉(MVA)痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点
相关申请
本申请要求保护2006年8月25日提交的美国临时申请号60/840,093和2006年8月28日提交的美国临时申请号601840,755的权益，所述两份文献因而公开地在此处通过引用的方式完整并入。
技术领域
本发明涉及用于稳定整合外源DNA序列至MVA基因组内的插入位点。
相关技术的描述
痘病毒科的成员具有编码数百种蛋白质的庞大双链DNA基因组(《费氏 病毒学，第五版》Moss，B.2007“痘病毒科：病毒及其复制”(″Poxviridae：TheViruses and Their Replication″in Fields Virology，5th Ed)(D.M.Knipe，P.M.Howley，D.E.Griffin，R.A.1 Lamb，M.A.Martin，B.Roizman和S.E.Straus，Eds)，LippincottWilliams & Wilkins，Philadelphia，PA)。已知高度减毒的痘苗病毒株-修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因组序列(Sutter，G.和Moss，B.1992美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)89：10847-10851；和Sutter，G.等1994疫苗(Vaccine)12：1032-1040)，其中所述的修饰的安卡拉痘苗病毒不能生长在大多数哺乳动物细胞中并且是重组疫苗载体的良好候选物。修饰的安卡拉痘苗病毒已经在鸡胚成纤维细胞中传代超过570次，在此期间相对于宿主范围严格限制的亲代野生型Ankara株而言，6个重大缺失已经出现(Meyer，H.等1991普通病毒学杂志(J Gen Virol)72：1031-1038)。
发明简述
本发明涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因组的基因间区(IGR)内的新插入位点，其中所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或所述的IGR位于该痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述ORF对应于保守基因，并涉及用来插入外源DNA至痘苗病基因组内的相关质粒载体，并且还涉及作为药物或疫苗的含有插入所述新插入位点内的外源序列的重组痘苗病毒。
附图说明
图1.基于pol基因序列同一性的HIV-1和HIV-2的系统发生学关系。SIVcpz和SIVsmm是分别从黑猩猩(chimpanzee)和白眉猴(sooty mangabeymonkey)中回收的类人灵长类慢病毒。
图2.基于全长pol基因序列的具有四种不同SIVcpz分离株的HIV-1 M组、N组和O组(group)的系统发生学关系。短棒表示遗传距离0.1(10％核苷酸趋异性)并且星号指出基于env序列的N组HIV-1分离株的位置。
图3.HIV-1分离株的嗜性及生物学特征。
图4.HIV-编码的蛋白质。显示HIV基因的位置、初级翻译产物(在一些情况下是多聚蛋白)的尺寸和加工的成熟病毒蛋白。
图5.成熟HIV-1病毒粒子的示意图。
图6.HIV-1 Env糖蛋白的线性示意图。箭头1表示gp1 60切割成gp120和gp41的位点。在gp120中，交叉线区域代表可变结构域(V1-V5)并且空心框描述保守序列(C1-C5)。在gp41胞外结构域中，显示几个结构域：氨基端融合肽和两个胞外结构域螺旋(氨基端螺旋与羧基端螺旋)。跨膜结构域由黑色框代表。在gp41胞浆结构域中，显示Tyr-X-X-Leu(YXXL)内吞基序(SEQID NO：1)和两个预测性螺旋结构域(螺旋-1和螺旋-2)。氨基酸编号被标出。
图7.pLW-73转移载体。
图8.pLW-73转移载体的核苷酸序列(上部链，SEQ ID NO：2；底部链，SEQ ID NO：3)。
图9.编码乌干达进化枝D Env蛋白(分离株A07412)的核苷酸序列(SEQID NO：4)。
图10.编码乌干达进化枝D gagpol蛋白(分离株A03349)的密码子变异的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图11.重组MVA的生成和对所插入基因的稳定性的分析。A)将env和gagpol分别插入Del II和Del III位点的示意图例。B)通过免疫染色法评价稳定性。
图12.MVA/65A/G env中env突变的类型和频率。
图13.在Del III中插入Env in I8R/G1L IGR和Gag Pol。
图14.修饰A/G构建体以增加稳定性。
图15.蚀斑传代后的Env的表达。
图16.各个克隆的PCR和蛋白质印迹分析。
图17.通过双重重组MVA(double recombinant MVA)表达A/G env。
图18.表达来自乌干达HN-1分离株的env和gagpol的重组病毒。
图19.MVA/UGD4a-无着色env蚀斑的分析。
图20.对重组MVA中UGD env基因的修饰
图21.MVA/UGD4b-无着色gag蚀斑的分析。*，成段4-6个G或C残基的位置。
图22.对重组MVA中UGD gagpol基因的修饰。
图23.构建表达UGD env和gagpol的稳定重组MVA。
图24.由MVA/UGD4d激发的细胞应答。
图25.由MVA/UGD4d激发的抗体应答。
微生物的保藏
以下微生物已经根据布达佩斯条约条款以所示日期保藏于弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)：
微生物     登录号     日期
MVA1974/NIH克隆1     PTA-5095     2003年3月27日
MVA1974/NIH克隆1以ATCC登录号：PTA-5095在2003年3月27日保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，Blvd大学，10801，美国典型培养物保藏中心(ATCC)。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的条款进行该保藏。这确保自保藏日起维持此保藏的活培养物30年。ATCC将根据布达佩斯条约的条款使该保藏物可获得并且该保藏物遵循申请人与ATCC之间合同，其中所述的合同确保在相关的美国专利发布时或在任何美国申请或外国申请的公众公开时，无论谁在先，公众可永久且不受限制地获得该保藏物的培养物的子代，并且确保美国专利商标局委员会根据35USC§122得到授权并且根据其委员会规定(包括37 CFR§1.14)决定的个人可获得所述子代。所保藏毒株的可获得性不得解释为与任何政府权利机关根据其专利法所授予的权力相抵触地许可实施本发明。
优选实施方案详述
除非另外定义，本文中所用技术术语和科学术语具有如本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。参见例如，Singleton P和Sainsbury D.，微生物学与分子生物学词典第三版(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology.3rd ed.)，J.Wiley & Sons，Chichester，New York，2001和费氏病毒学第 五版(Fields Virology.5th Ed.)编者D.M.Knipe，P.M.Howley，D.E.Griffin，R A.Lamb，M.A Martin，B.Roizman和S.E.Straus)，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，2007。
过渡态术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”是同义的，是包含性或开放的，并且不排除额外的、未提及的要素或方法步骤。
过渡态短语“由......组成”排除权利要求中未详述的任意要素、步骤或组分，但是不排除与本发明不相关的额外组分或步骤，如通常与本发明相关的杂质。
过渡态短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限于指定的材料或步骤和这样的材料或步骤，其实际上不影响要求权利保护的本发明基本和新颖的特征。
基于脊椎动物和昆虫宿主范围，将痘病毒分成脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)。脊椎动物痘病毒亚科由8个属组成：正痘病毒属(Orthopoxvirus)、副痘病毒属(Parapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)、野兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、软体动物痘病毒属(Molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)。正痘病毒属的原型成员是痘苗病毒。
已经对每种脊椎动物痘病毒的至少一种成员和两种昆虫痘病毒报道完整基因组序列。接近100种基因是在全部脊椎动物痘病毒中保守的并且这些基因大约一半也存在于昆虫痘病毒中。基于上述内容，可以产生几项概括：基因大多是非重叠的，倾向存在于指向基因组更近末端的模块内，若高度保守且涉及必需复制功能则通常位于中央区域内，并且若可变且涉及宿主相互作用则通常位于末端区域内。中央基因在全部脊椎动物痘病毒中的排列明显相似。源于完整基因组测序之前并随后用于痘苗病毒哥本哈根株完整序列的痘苗病毒基因或ORF(开放阅读框)命名惯例组成如下：使用HindIII限制性核酸内切酶的DNA片段字母编号，后接在该片段内的ORF编号(从左至右)和根据ORF方向后接L或R。对此规则的一个例外是HindIII C片段；对其ORF从右边开始编号以避免在所述基因组的高度可变性左末端处开始。除去掉L或R之外，多肽名称对应于基因名称。在大部分后续的痘病毒完整基因组序列中，对ORF从基因组的一个末端至另一个末端连续编号。然而，已经将早期字母编号保留作为俗名以提供文献连续性。在参考书中通常显示痘苗病毒西储(WesternReserve)(WR)株的ORF数，原因是该毒株已经用于众多生物化学研究和遗传学研究中。
本发明实施方案的发明人鉴定到用于插入外源DNA序列至修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因组内的新位点。所述的新插入位点位于该病毒的基因组的基因间区(IGR)内，其中所述的IGR依次位于MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或位于所述MVA基因组的两个相邻开放阅读框的侧面，并且其中所述的ORF对应于保守基因。
因此，本发明的实施方案涉及这样的重组MVA，其包含插入该病毒基因组的IGR内的异源DNA序列。根据该实施方案，一个或多个外源DNA序列可以插入一个或多个IGR内。
出人意料地发现插入MVA基因组IGR内的外源DNA序列保持稳定。认为MVA的基因组是很不稳定的。似乎对病毒增殖是非必需的基因或DNA序列受到缺失或片段化。在一方面虽然发现在异源DNA序列插入MVA基因组的天然存在性缺失位点时，获得稳定的重组MVA，然而另一方面发现有时这些重组MVA不稳定。因此，可以得出结论：预期插入ORF间的间隔序列内的对病毒增殖是非必需的异源DNA序列也被病毒删除。
尽管ORF的核苷酸序列编码形成肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列，然而在两个ORF之间的IGR没有编码能力，不过可以包含对转录性控制病毒基因表达是必需或参与其中的调节元件、结合位点、启动子和/或增强子序列。因此，IGR可以参与病毒生活周期的调节性控制。然而，本实施方案的发明人也已经证明所述的新插入位点具有出乎意料的优势，从而外源DNA序列可以稳定插入MVA基因组，而不影响或改变MVA的典型特征和基因表达。所述的新插入位点是特别有用的，因为MVA的ORF或编码序列没有改变。
ORF的核苷酸序列规律地以起始密码子开始并以终止密码子结束。根据两个相邻ORF的方向，IGR(在这些ORF之间的区域)在两侧具有这两个相邻ORF的两个终止密码子，或这两个相邻ORF的两个起始密码子，或第一ORF的终止密码子和第二ORF的起始密码子，或第一ORF的起始密码子和第二ORF的终止密码子。
因此，用于外源DNA序列进入IGR的插入位点可以在第一ORF的终止密码子下游或3′。在相邻ORF(又称第二ORF)与第一ORF具有相同方向的情况下，位于第一ORF的终止密码子下游的该插入位点位于第二ORF的起始密码子上游或5′。
在第二ORF与第一ORF具有相对方向的情况下，这意味着两个相邻ORF的方向彼此相对，则该插入位点位于两个ORF的终止密码子下游。
作为第三选择，在两个相邻ORF以相反方向阅读，但是这两个相邻ORF的方向彼此背离，这与特征如下的位置同义：这两个ORF的起始密码子彼此相邻，则外源DNA相对于这两个起始密码子而插入上游。
MVA基因组中的ORF以两个编码方向出现。因此，mRNA合成活性从左至右(即正方向)和相应从右至左(反方向)出现。通过在基因组的不同HindIII限制性消化片段上的方向和位置而鉴定ORF，这是痘病毒学惯例并且变成痘苗病毒标准分类法。就该命名法而言，不同HindIII片段由对应于其递减大小的顺次大写字母命名。ORF在每个HindIII片段上从左至右编号并且ORF的方向由大写L(代表转录从右至左)或R(代表转录从左至右)指示。此外，存在使用不同命名法的对MVA基因组结构的最近出版物。简而言之从基因组的左端至右端对ORF编号并且用大写L或R表示其方向(Antoine，G.等1998病毒学(Virology)244：365-396)。作为实例，根据既往命名法的I8R ORF对应于根据Antoine等的069R ORF。
在产生表达HIV基因的修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)重组体作为候选疫苗的工作中，本发明人已经观察到HIV基因表达的不稳定性。它们确定不稳定性的原因之一是外来基因及MVA侧翼区缺失。为解决这个问题，本发明人着手将外来基因插入保守基因之间以防止重组MVA中有效缺失发生。具有此类缺失的病毒具有生长优势并且因此将生长超过rMVA病毒群。若把外来基因插入痘苗病毒基因组内的保守基因(认为痘苗病毒复制需要这些基因并且它们因此是“必需基因”)之间，则必需基因的任何缺失会抑制病毒复制，并且因此不会生长超过重组MVA。因此，rMVA群体的稳定表达得以维持。本发明人已经用来产生重组体的MVA毒株由本发明人向美国疾病预防控制中心提供并且随后由阿卡姆贝斯(Acambis)测序(基因库(Genbank)登录号AY603355)。Bavarian Nordic以其W0031097845公开作为基础的MVA毒株是由Antoine，G.等1998 Virology 244：365-396测序的痘苗病毒株-修饰的安卡拉痘苗病毒(Genbank登录号U94848)。(请注意在这两个序列中对给定基因的基因编号是不同的)
本发明人最初寻找在痘病毒科中保守的基因以及在脊椎动物痘病毒(脊椎动物痘病毒)亚科中保守的那些基因(Upton，C等2003病毒学杂志(Journalof Virology)77：7590-7600)。这些基因在互联网址poxvirus.org上的痘病毒生物信息中心(Poxvirus Bioinformatics Resource Center)内所给出哥本哈根痘苗病毒(Genbank登录号M35027)的命名法中列出。这些基因总计是痘病毒科中的49个保守基因和在脊椎动物痘病毒中保守的41个额外基因，产生总计90个保守基因。从这90个保守基因中，本发明人列出保守基因对之间的基因间位点。在表1中列出这些基因对。(请注意不在Bavarian Nordic W0031097845公开中包含的基因被标记)。这些基因的方向是可变的，一些基因向右转录，一些基因向左转录。这意味某些所述基因间位点含有必须在插入载体的构建中予以保留的启动子。此外，对于重叠性保守基因，在载体构建期间，所述基因将必须使用另外的密码子加以重构以将重复序列最小化。
在优选的实施方案中，本发明人关注这样的保守基因，其方向为“尾对尾”，从而所述基因的3′终止密码子彼此紧密接近。用在这些位点中的转移载体的构建由以下事实促进，即在所述的终止密码子之间的这个区域中没有启动子。若存在分隔所述终止密码子的基因间核苷酸，则构建插入载体是简单明了的。若一个基因的终止密码子位于另一个基因的3′末端内部，则在质粒转移载体构建期间，所述基因可以使用另外的密码子加以重构以将重复序列最小化，或根据重叠区的大小，在PCR中单纯地修正所述侧翼区，从而不重叠。表2给出满足保守基因方向为“尾对尾”条件的基因间位点。以灰色突显的那些基因间位点没有重叠末端并且因而对构建是最简单的。
本发明人特别关注没有重叠末端的6个基因间位点。在这6个基因间位点的有效实施例中，本发明人选择基因间位点071-072(I8R-G1L)来插入外来基因。
除使用如上文在厄普顿出版物(Upton publication)中列出的保守基因条件之外，对于已经实验性缺失并且病毒复制在该突变体中降低达10倍的任何基因，可以视其为“必需基因”。若该基因位于另一种必需基因或保守基因近旁，则这两个基因可以视作外来基因的不同插入位点。
表1保守基因之间的基因间位点
  基因/哥本哈根   CDC/Acambis基因  安托万(Antoine)等，基因   在WO03/097845公开中列出N＝No
  F9L-F10L   040-041   038L-039L
  F12L-F13L   044-045   042L-043L   N
  F17R-E1L   049-050   047R-048L   N
  E1L-E2L   050-051   048L-049L   N
  E8R-E9L   057-058   055R-056L
  E9L-E10R   058-059   056L-057L   N
  I1L-12L   064-065   062L-063L   N
  I2L-13L   065-066   063L-064L   N
  I5L-16L   068-069   066L-067L
  I6L-17L   069-070   067L-068L   N
  I7L-I8R   070-071   068L-069R   N
  I8R-G1L   071-072   069R-070L   N
  G1L-G3L   072-073   070L-071L   N
  G3L-G2R   073-074   071L-072R   N
  G2R-G4L   074-075   072R-073L   N
  G4L-G5R   075-076   073L-074R   N
  G5R-G5.5R   076-077   074R-075R   N
  G5.5R-G6R   077-078   075R-076R   N
  G6R-G7L   078-079   076R-077L   N
  G7L-G8R   079-080   077L-078R
  G8R-G9R   080-081   078R-079R
  G9R-L1R   081-082   079R-080R   N
  L1R-L2R   082-083   080R-081R
  L2R-L3L   083-084   081R-082L
  L3L-L4R   084-085   082L-083R
  L4R-L5R   085-086   083R-084R   N
  L5R-J1R   086-087   084R-085R   N
  J3R-J4R   089-090   087R-088R   N
  J4R-J5L   090-091   088R-089L
  J5L-J6R   091-092   089L-090R
  J6R-H1L   092-093   090R-091L   N
  H1L-H2R   093-094   091L-092R   N
  H2R-H3L   094-095   092R-093L
  H3L-H4L   095-096   093L-094L   N
  H4L-H5R   096-097   094L-095R
  H5R-H6R   097-098   095R-096R   N
  H6R-H7R   098-099   096R-097R
  H7R-D1R   099-100   097R-098R
  D1R-D2L   100-101   098R-099L   N
  D2L-D3R   101-102   099L-100R   N
  D3R-D4R   102-103   100R-101R   N
  D4R-D5R   103-104   101R-102R
  D5R-D6R   104-105   102R-103R   N
  D6R-D7R   105-106   103R-104R
  D9R-D10R   108-109   106R-107R   N
  DIOR-D1IL   109-110   107R-108L
  D11L-D12L   110-111   108L-109L
  D12L-D13L   111-112   109L-110L
  D13L-A1L   112-113   110L-111L
  A1L-A2L   113-114   111L-112L   N
  A2L-A2.5L   114-115   112L-113L   N
  A2.5L-A3L   115-116   113L-114L
  A3L-A4L   116-117   114L-115L
  A4L-A5R   117-118   115L-116R
  A5R-A6L   118-119   116R-117L   N
  A6L-A7L   119-120   117L-118L
  A7L-A8R   120-121   118L-119R
  A8R-A9L   121-122   119R-120L   N
  A9L-A10L   122-123   120L-121L   N
  A10L-A11R   123-124   121L-122R   N
  A11R-A12L   124-125   122R-123L
  A12L-A13L   125-126   123L-124L
  A13L-A14L   126-127   124L-125L
  A14L-A14.5L   127-128   125L-125.5L   N
  A14.5L-A15L   128-129   125.5L-126L   N
  A15L-A16L   129-130   126L-127L   N
  A16L-A17L   130-131   127L-128L   N
  A17L-AI8R   131-132   128L-129R   N
  A18R-A19L   132-133   129R-130L   N
  A19L-A21L   133-134   130L-131L   N
  A21L-A20R   134-135   131L-132L   N
  A20R-A22R   135-136   132R-133R   N
  A22R-A23R   136-137   133R-134R
  A23R-A24R   137-138   134R-135R
  A28L-A29L   141-142   139L-140L   N
  A29L-A30L   142-143   140L-141L   N
表2具有“尾对尾”方向的保守基因
  尾对尾的基因   重叠末端   CDC/Acambis基因  安托万(Antoine)基因
  F17R-E1L   是   049-050   047R-048L
  E8R-E9L   否   057-058   055R-056L
  I8R-G1L   否   071-072   069R-070L
  G2R-G4L   是   074-075   072R-073L
  G6R-G7L   是   078-079   076R-077L
  L2R-L3L   是   083-084   081R-082L
  J4R-J5L   否   090-091   088R-089L
  J6R-H1L   是   092-093   090R-091L
  H2R-H3L   否   094-095   092R-093L
  D1R-D2L.   是   100-101   098R-099L
  D10R-D11L   否   109-110   107R-108L
  A5R-A6L   是   118-119   116R-117L
  A8R-A9L   是   121-122   119R-120L
  A11R-A12L   否   124-125   122R-123L
  AI8R-A19L   是   132-133   129R-130L.
根据本发明，异源DNA序列可以插入两个相邻ORF间的一个或多个IGR内，其中所述的两个相邻ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/阿卡姆贝斯(Acambis)的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所组成的组中。
在优选的实施方案中，所述异源序列插入位于具有“尾对尾”方向的两个相邻ORF侧翼的IGR，其中所述的两个相邻ORF选自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122和132-133所组成的组中。
在有效实施例中，所述异源DNA序列插入其中保守基因没有071-072重叠末端的IGR。
异源或外源DNA序列是这样的序列，在自然界中通常无法找到所述序列与如本发明所用的痘病毒连接。根据本发明的其它实施方案，所述外源DNA序列包含至少一个编码序列。该编码序列与转录控制元件、优选与痘病毒转录控制元件有效连接。此外，也可以使用痘病毒转录控制元件间的组合和例如内部核糖体进入位点。
根据其它实施方案，所述的外源DNA序列也可以包含与一个或几个转录控制元件连接的两个或两个以上编码序列。优选地，该编码序列编码一种或多种蛋白质、多肽、肽、外来抗原或抗原表位，尤其那些有治疗意义的基因。
本发明有治疗意义的基因可以得自作为疾病病因的病原性或感染性微生物的基因或是与其同源的基因。因此，在本发明的上下文中，此类有治疗意义的基因呈递至机体免疫系统以便影响、优选诱导特异性免疫应答并且因而接种或预防性保护该机体免遭所述微生物感染。在本发明的又一优选实施方案，所述有治疗意义的基因选自感染性病毒例如-但不限于-登革病毒、乙型或丙型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒(如HIV)的基因。
根据本发明的优选实施方案，所述异源DNA序列得自HIV并且编码HIV包膜(HIV env)，其中所述的HIV env基因优选地插入ORF 071-072(I8R-G1L)之间的IGR内。
另外，本发明的有治疗意义的基因也包含对增殖病、癌症或代谢病具有治疗效果的疾病相关基因，例如，有治疗意义的基因就癌症而言可以是具有诱导特异性抗癌免疫反应的癌抗原。
根据本发明的其它实施方案，编码序列包含至少一种标记基因或选择基因。
选择基因将特定抗性转导至细胞，因而某种选择方法变得可行。技术人员熟知可以用在痘病毒系统中的多种选择基因，例如新霉素抗性基因(NPT)或磷酸核糖基转移酶基因(gpt)属于这些选择基因。
标记基因在转导细胞中诱导可用来鉴定转导细胞的颜色反应。技术人员熟知可以用在痘病毒系统中的多种标记基因。例如编码例如P-半乳糖苷酶(P-gal)、P-葡萄糖苷酶(P-glu)、绿色荧光蛋白(EGFP)或蓝色荧光蛋白的基因属于这些选择基因。
根据本发明的又一实施方案，所述外源DNA序列包含这样的间隔序列，该间隔序列将痘病毒转录控制元件和/或该外源DNA序列内的编码序列与相邻ORF的终止密码子和/或起始密码子隔开。在相邻ORF与所插入的外源DNA序列内编码序列之间的这种间隔序列具有稳定所插入外源DNA的优势，并且因此稳定任意的所得重组病毒。该间隔序列的大小是可变的，只要此序列没有自己的编码或调节功能即可。
根据其它实施方案，将痘病毒转录控制元件和/或外源DNA序列内的编码序列与相邻ORF的终止密码子隔开的间隔序列是至少1个核苷酸长。
根据本发明的另一个实施方案，将痘病毒转录控制元件和/或外源DNA序列内的编码序列与相邻ORF的起始密码子隔开的间隔序列是至少30个核苷酸长度。尤其，在起始密码子上游所鉴定的常见痘苗病毒启动子元件的情况下，外源DNA的插入可以不将该启动子元件与相邻ORF的起始密码子隔开。常见痘苗病毒启动子元件可以通过扫描例如晚期启动子的序列“TAAAT”(Davison和Moss 1989分子生物学杂志(J.Mol Biol.)；210：771-784)和晚期启动子的A/T丰富域进行鉴定。约30个核苷酸的间隔序列是确保位于ORF起始密码子上游的痘病毒启动子不受影响的优选距离。此外，根据又一个优选的实施方案，所插入外源DNA与相邻ORF的起始密码子之间的距离是约50个核苷酸并且更优选是约100个核苷酸。
根据本发明的又一个优选实施方案，所述间隔序列包含能够控制相邻ORF转录的额外痘病毒转录控制元件。
可以根据本发明用于产生重组MVA的常见MVA株是已经以ATCC登录号：PTA-509在2003年3月27日保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，Blvd大学，10801，美国典型培养物保藏中心(ATCC)的MVA1974/NIH克隆1。
术语本发明病毒的“衍生物”指显示与亲代病毒相同的特征子，不过在其基因组的一个或多个部分内显示差异的子代病毒。术语“MVA的衍生物”描述具有与MVA相比的相同功能性特征的病毒。例如，MVA1974/NIH克隆1的衍生物具有MVA1974/NIH克隆1的特征性特点。MVA1974/NIH克隆1或其衍生物的这些特点之一是其减毒作用和宿主范围严格限制。
本发明的重组MVA可用作药物或疫苗。根据其它实施方案，它用于导入外源编码序列至靶细胞内，所述的序列与靶细胞的基因组是同源或异源的。
可以体外导入外源编码序列至靶细胞以产生蛋白质、多肽、肽、抗原或抗原表位。这种方法包括用本发明的重组MVA感染宿主细胞、在合适条件下培养感染的宿主细胞并分离和/或富集由所述宿主细胞产生的多肽、肽、蛋白质、抗原、表位和/或病毒。
另外，用于导入一个或多个同源序列或一个或多个异源序列至细胞内的方法可以用于体外和体内疗法。对于体外疗法，将事先已经用本发明重组MVA(离体)感染的分离细胞施用至活的动物体以影响、优选诱导免疫应答。对于体内疗法，将本发明的重组痘病毒直接施用至活的动物体以影响、优选诱导免疫应答。在这种情况下，接种部位周围的细胞以及通过例如血液使病毒运输至其附近的细胞直接被本发明的重组MVA感染。在感染后，这些细胞合成治疗性基因的蛋白质、肽或抗原表位，其中所述的蛋白质、肽或抗原表位由外源编码序列编码并且随后将它们或其部分呈现在细胞表面上。免疫系统的特化细胞识别此类异源蛋白质、肽或表位的呈现并发动特异性免疫应答。
由于MVA是高度生长受限的并且因此被高度弱化，故MVA用于治疗类型广泛的哺乳动物，包括人，所述的哺乳动物包括免疫缺陷的动物或人。本发明也提供用于诱导在包括人的活的动物体中免疫应答的药物组合物和疫苗。
所述药物组合物可以通常包括一个或多个/种药学上可接受的和/或经批准的载体、添加物、抗生素、防腐剂、辅药、稀释剂和/或稳定剂。此类辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、湿润或乳化剂、pH缓冲物质等。合适的载体一般是大体积、代谢缓慢的分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
为制备疫苗，将本发明的重组痘病毒转化成生理可接受的形式。这可以基于制备抗天花免疫接种所用的痘病毒疫苗的经验(如Stickl，H.等1974 DtschMed Wochenschr.99：2386-2392所述)进行。例如，将纯化的病毒贮存在-80℃，以5×10E8TCID50/ml的滴度配制在约10mM Tris，140mM NaCl pH7.4的缓冲液内。为制备疫苗注射剂(vaccine shot)，例如冻干在100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)内在2％胨和1％人白蛋白存在下于安瓿、优选优选玻璃安瓿中10E2-10E8个颗粒的病毒。备选地，该疫苗注射剂(vaccine shot)可以通过逐步冻干在制剂中的病毒而产生。所述制剂可以含有额外的添加物，如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或适于体内施用的其它助剂，如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。随后玻璃安瓿被密封并且可以在4℃与室温之间贮存数月。然而只要无需求，则将安瓿优选地贮存在低于-20℃的温度。
为免疫接种或治疗，冻干物(lyophilisate)可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液、优选生理盐水或或Tris缓冲液，并全身或局部地施用，即胃肠道外、皮下、肌内、通过划痕法或技术人员已知的任何其它施用途径施用。施用模式、施用的剂量和次数可以由本领域技术人员以已知方式优化。然而，患者最常见地在首次免疫接所述受注射剂后约1个月至6周后以第二注射剂接种。
本发明还涉及可用来产生本发明重组MVA的质粒载体，并且也涉及某些DNA序列。
通常，位于两个相邻ORF之间或位于所述两个相邻开放阅读框的侧面的IGR包含这样的核苷酸序列，其包含其中可以插入目的外源DNA序列。因此，本发明的质粒载体包含得自MVA基因组或与其同源的DNA序列，其中所述的DNA序列包含在该病毒基因组的两个相邻ORF之间或在该病毒基因组的两个相邻开放阅读框的侧面的IGR序列的完整或部分核酸。优选地，所述质粒载体包含在所述IGR衍生性序列内插入的至少一个克隆位点，所述克隆位点用于插入目的外源DNA序列并优选地用于插入与所述异源DNA序列有效连接的痘病毒转录控制元件。任选地，该质粒载体包含报道基因盒和/或选择基因盒。该质粒载体优选地也包含在IGR序列的所述完整片段或部分片段侧翼的两个相邻ORF的序列。
已经鉴定到不包含核苷酸序列的一些IGR。在这些情况下，该质粒载体包含IGR侧翼序列的DNA序列，即两个相邻ORF的DNA序列。优选地，向所述IGR插入用于插入异源DNA序列的克隆位点。该IGR侧翼序列的DNA用来指导外源DNA序列插入MVA基因组中相应IGR内。此种质粒载体可以还包含IGR序列的完整片段或部分片段，其中所述的IGR序列的完整片段或部分片段包含用于插入异源DNA序列和任选插入报道基因盒和/或选择基因盒的克隆位点。
两个相邻ORF的IGR-DNA序列以及IGR侧翼序列优选地分别选自IGR和ORF，所述的IGR和ORF以示例性方式或其相应方式选自由(使用CDC/Acambis的命名法则)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-10105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所组成的组中。
该序列更优选地分别选自IGR和ORF，所述的IGR和ORF选自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122和132-133所组成的组中。
在有效实施例中，选择所述的IGR衍生性序列为071-072。
所述DNA序列优选地得自MVA的基因组或与其同源，其中所述的MVA以ATCC登录号：PTA-5095在2003年3月27日保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，Blvd大学，10801，美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
为产生本发明的质粒载体，将所述序列分离并克隆至标准克隆载体，如pBluescript(Stratagene)，其中它们位于待插入MVA基因组的外源DNA的侧翼。任选地，这种质粒载体包含选择基因盒或报告基因盒，其可以从最终重组病毒中因包含于所述表达盒内的重复序列而被缺失。
由质粒载体导入外源DNA序列至MVA基因组的方法和获得重组MVA的方法是本领域技术人员熟知的，并且还可以从1989年冷泉港实验室出版社J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆实验手册》第二版(MolecularCloning，A Laboratory Manual，Second Edition，，1，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)和John Wiley and Son Inc的《最新分子生物学实验方法》第16章第IV部分“使用痘苗病毒载体在哺乳动物中表达蛋白质”(Current Protocolsin Molecular Biology.John Wiley and Son Inc.1998，Chapter 16，section IV，″Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vectors″)中推导出来。
本发明的MVA可以通过用本发明的质粒载体转染细胞、用MVA感染转染的细胞并且随后鉴定、分离和任选纯化本发明的MVA而产生。
本发明的DNA序列可以用来鉴定或分离本发明的MVA或其衍生物和用本发明的MVA感染的细胞或个体。所述DNA序列例如用来产生PCR-引物、杂交探针或用来阵列技术中。
HIV及其复制
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体认为是显示慢病毒属(lentivirus)典型特征的逆转录病毒，其称作人免疫缺陷病毒(HIV)。在图1中显示人慢病毒的系统发生学关系。HIV-2比HIV-1与分离自野生白眉猴的病毒SIVsmm亲缘关系更近。目前认为HIV-2代表SIVsmm至人的动物性传播。命名为SIV的来自圈养黑猩猩的一系列慢病毒分离株是HIV-1的密切遗传近亲。
最早对HIV-1分离株的系统进化分析集中于源自欧洲/北美洲和非洲的样品；从世界这两个地区鉴定到独立的病毒群。随后鉴定到明显不同的HIV-1遗传亚型或进化枝并将它们划分成三个组：M(主要)；O(无关项)和N(非M或O)(图2)。包含超过95％全部病毒分离株的HIV-1组M由基于完整病毒基因组序列的至少8个独立进化枝(A、B、C、D、F、G、H和J)组成。HIV-1组O的成员已经从生活在喀麦隆、加蓬和赤道几内亚的个体中回收到；它们的基因组与组M病毒共有低于50％的核苷酸序列同一性。最近发现的组N HIV-1株已经在感染的喀麦隆人中鉴定出来，不能在标准的完整病毒酶联免疫吸附测定法(ELISA)中以血清学方式反应，然而是轻易通过常规蛋白质印迹分析法可检测的。
有关HIV-1遗传性变异的最新知识源于研究地理来源各异的组M病毒。过去十年间收集的数据表明感染个体中存在的HIV-1群可以在核苷酸序列方面变异6％-10％。在一个进化枝内的HIV-1分离株可以在gag方面显示15％核苷酸距离并且在gp120编码序列方面显示至多达30％的核苷酸距离。根据所分析的基因，进化枝间遗传性变异可以在30％与40％之间变化。
可以在非洲找到HIV-1组M的全部亚型。进化枝A病毒具有最大的遗传趋异性并且是在非洲早期流行中最常见的HIV-1亚型。随着HIV-1在90年代中晚期迅速传播至南部非洲，进化枝C病毒已经成为优势亚型并且现在占世界范围HIV-1感染的48％。研究最充分的HIV-1亚型-进化枝B病毒仍是欧洲和北美的最流行分离株。
高遗传重组率是逆转录病毒的标志。最初认为遗传多样性病毒株的同时感染不太可能在HIV-1风险个体中建立。然而在1995年，显而易见的是显著比例的HIV-1组M全球多样性包括进化枝间病毒重组体。现在认为将会在地理地区如非洲、南美洲和东南亚找到HIV-1重组体，那里多种HIV-1亚型共存并且可以构成超过10％的循环HIV-1株。从分子角度，这些重组病毒的基因组与相似拼图嵌合体(patchwork mosaics)，具有并列的不同HIV-1亚型节段，这反映对产生所述拼图嵌合体有贡献的多个交叉事件。大部分HIV-1重组体源自非洲并且大多数含有最初得自进化枝A病毒的节段。在泰国，例如，优势传播株的组合体由进化枝A的gag加pol基因节段和进化枝E的env基因组成。因为在Thai HIV-1株中的进化枝E env基因与存在于源自中非共和国的病毒分离株中的进化枝E env密切相关，故认为原初重组事件在非洲发生，而后子代病毒进入泰国。有趣地，迄今没有报告全长HIV-1亚型E分离株(即具有亚型E的gag、pol和env基因)。
发现α和β趋化因子受体作为病毒融合及进入易感CD4+细胞的辅助受体(coreceptor)发挥作用，此发现导致修改HIV-1分类方案(图3)。现在，分离株可以基于在融合测定法中的趋化因子受体利用性进行分组，在所述的融合测定法中HIV-1 gp120和CD4+辅助受体蛋白在各自的细胞中表达。如图3中所示，利用CXCR4受体的HIV-1分离株(现在命名为X4病毒)通常是T细胞系(TCL)嗜性合胞体诱导(Si)株，而排它性利用CCR5受体的那些HIV-1分离株(R5病毒)优势地具有巨噬细胞(M)嗜性和非合胞体诱导性(NSI)。可以包括大部分患者分离株并且显示连续嗜性表型的双重嗜性R5/X4株常常是SI。
如有复制能力的全部逆转录病毒那样，均编码结构蛋白的3种主要HIV-1翻译产物最初合成为多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体随后由病毒蛋白酶或细胞蛋白酶加工为成熟颗粒结合的蛋白质(图4)。55kd Gag前体Pr55Gag被切割成基质蛋白(MA)、衣壳蛋白(CA)、核衣壳蛋白(NC)和p6蛋白。160kd Gag-Pol多聚蛋白Pr160Gag-Pol的自催化作用产生蛋白酶(PR)、异二聚体逆转录酶(RT)和整合酶(IN)蛋白，其中细胞酶的蛋白酶水解消化作用将糖基化160kd Env前体gp160转化成gp120表面(SU)切割产物和gp41跨膜(TM)切割产物。HIV-1编码的剩余6个蛋白质(Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef)是剪接mRNA的初级翻译产物。
Gag
如同其它逆转录病毒的那些Gag蛋白，HIV的Gag蛋白对于形成非感染性病毒样颗粒是必需且充分的。逆转录病毒Gag蛋白通常合成为多聚蛋白前体；HIV-1的Gag前体已经基于其表观分子量进行命名Pr55Gag。如前指出，Pr55Gag的mRNA是非剪接的9.2kb转录物(图4)，其中所述的转录物在胞浆内的表达需要Rev。当pol ORF存在时，病毒蛋白酶(PR)在从细胞出芽期间或在其之后马上切割Pr55Gag以产生成熟Gag蛋白p17(MA)、p24(CA)、p7(NC)和p6(见图4)。在病毒粒子中，MA紧邻病毒包膜的脂质双层内部存在，CA在该颗粒的中心形成锥形核心结构的外表部分，并且NC在所述核心内具有病毒RNA基因组的核糖核蛋白复合体中存在(图5)。
HIVPr55Gag前体在翻译后发生寡聚化并定向至胞浆膜，在胞浆膜处通过EM可见的尺寸和密度足够大的颗粒装配。Pr55Gag形成病毒样颗粒是一个自装配过程，而关键性Gag-Gag相互作用在沿Gag前体的多个结构域之间发生。病毒样颗粒的装配不要求基因组RNA(尽管核酸的存在似乎是必需的)、pol编码的酶或Env糖蛋白参与，不过感染性病毒粒子的产生要求病毒RNA基因组包入衣壳以及并入Env糖蛋白和Gag-Pol多聚蛋白前体Pr160Gag-Pol。
Pol
gag的下游存在HIV基因组的最高度保守区域pol基因，该基因编码3种酶：PR、RT和IN(见图4)。病毒RNA基因组逆转录成双链DNA拷贝和病毒DNA整合至宿主细胞染色体分别需要RT和IN。PR通过介导成熟感染性病毒粒子产生而在生活周期晚期发挥重要作用。pol基因产物通过称作Pr160Gag-Pol的160kd Gag-Pol融合蛋白的酶切割作用而衍生。这种融合蛋白通过Pr55Gag翻译期间的核糖体移码作用产生(见图4)。用于Gag-Pol表达的核糖体移码机制也为众多其它逆转录病毒所利用，该机制确保pol衍生性蛋白质以低水平表达，大约是Gag水平的5％-10％。与Pr55Gag相似，Pr160Gag-Pol的氨基端经肉豆蔻酰化并定向至胞浆膜。
蛋白酶
用禽逆转录病毒开展的早期脉冲追踪研究清楚表明逆转录病毒Gag蛋白最初作为多聚蛋白前体合成，所述的多聚蛋白前体被切割成更小产物。后续研究证实加工功能由病毒蛋白酶而非细胞蛋白酶内提供，并且Gag和Gag-Pol前体的蛋白酶水解消化对于病毒感染性是必需的。逆转录病毒PRD序列分析表明它们与细胞“天冬氨酸”蛋白酶(如胃蛋白酶及肾素)相关。与相似这些细胞酶，逆转录病毒PR使用在活性部位处两个靠近的Asp残基来调整催化靶蛋白中肽键水解的水分子。与作为假二聚体(利用同一分子内的两个折叠来产生所述活性部位)发挥功能的细胞天冬氨酸蛋白酶不同，逆转录病毒PR作为真实二聚体发挥作用。来自HIV-1PR的X射线晶体学数据表明两个单体部分地由一个四链反平行β折叠固定在一起，其中所述的β折叠从每个单体的氨基端和羧基端衍生。底物-结合位点位于所述两个单体之间形成的裂隙内。与相似其细胞性同系物，HIV PR二聚体含有在所述结合位点上方悬垂并且可以稳定裂隙内底物的柔性“盖板”；活性部位的Asp残基位于所述二聚体的中央。有趣地，尽管在活性部位残基周围观察到一些有限的氨基酸同源性，然而逆转录病毒PR的一级序列是高度趋异的，不过它们它们的结构是非常相似的。
逆转录酶
就定义而言，逆转录病毒具有在感染过程早期将其单链RNA基因组转化成双链DNA的能力。催化这种反应的酶是RT，连同其相关的RNA酶H活性。逆转录病毒RT具有三种酶活性：(a)RNA指导的DNA聚合(用于负链DNA合成)、(b)RNA酶H活性(用于降解DNA-RNA杂合中间体中存在的tRNA引物和基因组RNA)和(c)DNA指导的DNA聚合作用(用于第二链或正链DNA合成)。
成熟HIV-1RT全酶是66kd和51kd亚基的异二聚体。51kd亚基(p51)通过PR以蛋白酶水解方式移去p66羧基端15kd RNA酶H结构域而从66kd(p66)亚基中衍生(见图4)。HIV-1RT的晶体结构揭示一个高度不对称性折叠，其中p66亚基和p51亚基的方向明显不同。p66亚基可以视为一只右手，聚合酶活性部位位于手掌内并且由手掌、手指和拇指亚结构域形成结合模板的深裂隙。这个聚合酶结构域由连接亚结构域与RNA酶H连接。位于手掌内部的活性部位含有紧密接近的3个关键Asp残基(第110、185和186位)和两个配位Mg2+离子。突变这些Asp残基则取消RT的聚合活性。三个活性部位Asp残基的方向与其它DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNApolI的Klenow片段)中观察到的活性部位Asp残基的方向相似。p51亚基似乎是刚性的并且不形成聚合化裂隙(a polymerizing cleft)；该亚基第110、185和186位Asp埋入分子内部。大约18个碱基对的引物-模板双链体位于从该聚合酶活性部位伸展至RNA酶H结构域的核酸结合裂隙内。
在RT-引物-模板-dNTP结构中，双脱氧核苷酸在引物3′末端处的存在促使恰好在攻击正在进入的dNTP之前所捕获的催化性复合体可视化。与先前所得结构的比较提出这样的模型，其中手指握紧以便在引物3′-OH亲核攻击正在进入的dNTP之前捕获模板和dNTP。在添加正在进入的dNTP至正在生长的链后，已经提出所述手指采取更开放的构象，因而释放焦磷酸并使RT结合下一个dNTP。HIV-1RNA酶H的结构也已经通过射线晶体分析法测定；该结构域表现与大肠杆菌RNA酶H相似的整体折叠。
整合酶
逆转录病毒复制的区别性特征是逆转录后该病毒基因组的DNA拷贝插入宿主细胞染色体。整合的病毒DNA(前病毒)充当合成病毒RNA的模板并且作为该宿主细胞基因组的一部分维持持续感染细胞终身。整合能力缺陷的逆转录病毒突变体通常不能建立生产性感染。
病毒DNA的整合由整合酶催化，其中所述的整合酶是通过PR介导的HIV-1Gag-Pol多聚蛋白羧基端部分切割作用而产生的32kd蛋白质(见图4)。
逆转录病毒IN蛋白质由三个结构和功能迥异的结构域：组成氨基端、含锌指结构域、核心结构域以及一个相对不保守的羧基端结构域组成。因为其低溶解度，仍不可能使完整288个氨基酸的HIV-1IN蛋白质结晶。然而，全部三种结构域的结构已经分别由X射线晶体分析法或NMR法解析。也已经测定禽肉瘤病毒IN的核心结构域的晶体结构。通过核磁共振分光术解析其结构的氨基端结构域(第1-55位残基)由含有锌的4个螺旋组成，其中所述的锌与氨基酸His-12、His-16、Cys-40和Cys-43配位。氨基端结构域的结构与含有所谓螺旋-转角-螺旋基序的螺旋DNA结合蛋白相似；然而，在HIV-1结构中，该基序对二聚体形成有贡献。最初，不良溶解度阻碍核心结构域结构的解析工作。然而当观察到在IN第185位残基处将Phe改变成Lys会明显提高溶解度而不破坏体外催化活性时，晶体学工作获得成功。HIV-1IN核心结构域(IN第50-212位残基)的每个单体由侧面有螺旋的一个五链β折叠组成；此结构与其它多核苷酰基转移酶(包括RNA酶H和噬菌体MuA转座酶)具有令人震惊的相似性。在其它多核苷酰基转移酶中的类似位置内存在三个高度保守的残基；在HIV-1 IN中，这些残基是Asp-64、Asp-116和Glu-152，即所谓D，D-35-E基序。在这些位置处的突变阻断HIV IN体内和体外功能。这三个氨基酸在禽肉瘤病毒核心结构域及HIV-1核心结构域的晶体结构中的密切接近支持如下假设：这些残基在催化作为整合过程核心的多核苷酰基转移反应中发挥关键作用。已经通过NMR法解析其结构的羧基端结构域采用使人想起Src同源性3(SH3)结构域的五链β桶折叠拓扑学。最近，已经解析了包含核心结构域和羧基端结构域的SIV IN蛋白片段和罗氏肉瘤病毒IN蛋白质片段的X射线结构。
Env
HIV Env糖蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。它们含有与CD4受体和辅助受体相互作用的决定簇，并且它们催化病毒包膜的脂质双层蛋与宿主细胞胞浆膜之间的融合反应。此外，HIV Env糖蛋白含有激发从诊断开发与疫苗开发角度看均重要的免疫应答的表位。
HIV Env糖蛋白从单一剪接的4.3kb Vpu/Env双顺反子mRNA中合成(见图4)；翻译在结合于糙面内质网(ER)的核糖体中发生。160kd多聚蛋白前体(gp160)是通过在结构域中的疏水性转移终止信号而锚定至细胞膜内的整合型膜蛋白，其中所述的结构域必定成为成熟TM Env糖蛋白gp41(图6)。gp160在ER中以共翻译方式糖基化，形成二硫键并且发生寡聚化。优势的寡聚化形式似乎是三聚体，尽管也观察到二聚体和四聚体。gp160运输至高尔基体，在此处如同其它逆转录病毒包膜蛋白前体蛋白那样，它被细胞酶以蛋白酶水解方式切割为成熟SU糖蛋白gp120和TM糖蛋白gp41(见图6)。负责按照高度保守Lys/Arg-X-Lys/Arg-Arg基序切割逆转录病毒Env前体的细胞酶是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶，尽管其它酶也可以催化gp160加工。gp160的切割为Env诱导的融合活性和病毒感染性所需。切割gp160之后，gp120和gp41形成对于Env从高尔基体运输至细胞表面至关重要的非共价联合。gp120-gp41的相互作用相当微弱，并且从表达Env的细胞的表面散落大量gp120。
HIV Env糖蛋白复合体，尤其SU(gp120)结构域，是极度糖基化的；gp160的大约一半分子量由寡糖侧链组成。Env从ER中的合成部位运输至胞浆膜期间，众多侧链因复杂糖的添加被修饰。众多寡糖侧链形成可以想像为遮蔽大量gp120而免遭宿主免疫系统识别的糖云。如图6中所示，gp120含有交错的保守(C1-C5)和可变(V1-V5)结构域。存在于不同分离株的gp120中的Cys残基是高度保守的并且形成连接巨大环袢中的前四个可变区的二硫键。
病毒Env糖蛋白的主要功能是促进病毒包膜的脂质双层与宿主细胞膜之间的膜融合反应。这种膜融合事件能使病毒核心进入宿主细胞胞浆。gp120和gp41的众多区域在Env介导的膜融合中具有直接或间接意义。对正粘病毒HA2血凝素蛋白与副粘病毒F蛋白的研究表明这些蛋白质氨基端处的称作融合肽的高度疏水性结构域在膜融合中发挥至关重要作用。突变分析表明类似结构域处于HIV-1、HIV-2和SIV的TM糖蛋白的氨基端(见图6)。在gp41的这个区域内的非疏水性置换明显降低或阻断合胞体形成并且导致产生非感染性子代病毒粒子。
gp41融合肽的羧基端是在膜融合中发挥核心作用的两个两性螺旋结构域(见图6)。在含有拉链样七肽重复基序的氨基端螺旋(称作N-螺旋)中突变则破坏感染性和膜融合活性，并且从这些序列中衍生的肽在培养物中显示强烈抗病毒活性。近年来两个螺旋基序HN-1和SIV gp41的胞外结构域的结构已经成为结构分析的焦点。通过X射线晶体分析法或核磁共振分光术对含有所述螺旋结构域的融合蛋白、从N-螺旋和C-螺旋衍生的肽的混合物或在SIV结构的情况下来自第27-149位残基的完整gp41胞外结构域序列测定结构。这些研究获得基本上相似的三聚体结构，其中所述螺旋结构域以反平行方式叠压以产生一个6-螺旋束。所述的N-螺旋在其中央形成一个卷曲螺旋，所述C-螺旋叠压至外侧表上面的疏水槽内。
在导致膜融合的步骤中，CD4结合诱导在Env中促进辅助受体结合的构象变化。在形成三重gp120/CD4/辅助受体复合体后，gp41采取允许所述融合肽插入目的脂质双层的假设性构象。形成gp41的6-螺旋束(这涉及gp41的N-螺旋与C-螺旋之间的反平行相互作用)引起病毒膜和细胞膜靠近并且膜融合发生。
重组MVA病毒增强CD+8细胞免疫应答的用途
本发明涉及生成针对抗原的CD8+T细胞免疫应答并且还涉及激发抗体应答。更具体地，本发明涉及“引起和增强”免疫接种方案，其中通过施用引发性组合物(priming composition)所诱导的免疫应答因施用增强性组合物(boosting composition)而增强。本发明以这样的既往实验论证为基础，即可以在用任意多种不同类型的包含重组MVA本身的引发性组合物引发后，通过使用修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体实现有效的增强。
针对众多病原体的免疫应答的主要保护性组分由CD8+型T淋巴细胞(又称作细胞毒T淋巴细胞(CTL))介导。CD8+细胞的重要功能是分泌γ干扰素(IFNγ)，并且这提供了CD8+T细胞免疫应答的一种手段。免疫应答的第二组分是针对该病原体的蛋白质的抗体。
本发明采用这样的MVA，其中如既往实验所证实，已经发现所述MVA是用于针对CD8+T细胞的免疫应答提供增强作用并且也激发抗体应答的有效工具，其中使用任意多种不同类型的引发性组合物引发所述的CD8+T细胞免疫应答。
值得注意的是，既往实验工作证实使用本发明的先驱物(predecessor)为表达旨在增强由DNA疫苗引发的CD8+T细胞免疫应答的HIV抗原并且也激发抗体应答的重组MVA病毒创造条件。可以发现该MVA在免疫接种后诱导CD8+T细胞应答。也可以证实重组MVA引发这样的免疫应答，其因一次或多次接种重组MVA而增强。
有效地保护用质粒DNA免疫并用所述MVA增强的非人灵长类免受用活病毒作粘膜内攻击的影响(Amara等20015科学(Science)292：69-74)。有利地，本发明人构思可以采用这样的免疫方案，该免疫方案使用真皮内、肌内或粘膜免疫接种以引发并增强，从而构成例如在人类中适用于诱导CD8+T细胞并且也激发抗体应答的通用免疫接种方案。
本发明在多个方面和实施方案中使用编码HIV抗原并且也激发抗体应答的MVA载体，其中所述的HIV抗原用于增强通过事先施用编码该抗原的核酸所引发的针对该抗原的CD8+T细胞免疫应答。
本发明的一般方面提供MVA载体用于增强针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫应答并且也激发抗体应答的用途。
本发明的一个方面提供在个体中增强针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫应答并且也激发抗体应答的方法，该方法包括在所述个体中提供包含编码所述抗原的核酸的MVA载体，其中所述的核酸与调节序列有效连接以在该个体中通过来自所述核酸的表达而产生所述抗原，因而该个体中事先引发的针对该抗原的CD8+T细胞免疫应答被增强。
针对HIV抗原的免疫应答可以通过用DNA免疫接种或通过用感染性生物感染加以引发。
本发明的又一方面提供在个体中诱导针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫应答并且也激发抗体应答的方法，该方法包括对所述个体施用包含编所述抗原的核酸的引发性组合物并且随后施用包含MVA载体的增强性组合物，所述的MVA载体包括编码所述抗原的核酸，所述的核酸与调节序列有效连接以在该个体中通过来自所述核酸的表达而产生抗原。
如所披露，本发明的又一方面提供MVA载体的用途，用于制造施用至哺乳动物以增强针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫应答并且也激发抗体应答的药物。此类药物一般在先期施用包含编码所述抗原的核酸的引发性组合物后施用。
所述引发性组合物可以包含编码所述抗原的DNA，这种DNA优选地处于不能在哺乳动物细胞中复制的环状质粒形式。任何选择标记应当不是针对临床使用的任何抗生素的抗性，例如卡那霉素抗性优先于氨卞青霉素抗性。抗原表位达应当由哺乳动物细胞中有活性的启动子(例如细胞巨化病毒立即早期(CMV IE)启动子)驱动。
在本发明各种方面的具体实施方案中，施用引发性组合物，随后用增强性组合物或第一或第二增强性组合物增强，所述的第一和第二增强性组合物是彼此相同或不同的。其它增强性组合物仍可以使用而不脱离本发明。在一个实施方案中，三重免疫接种方案使用DNA，随后使用腺病毒作为第一增强性组合物，随后使用MVA作为第二增强性组合物，任选地随后使用又一种(第三)增强性组合物或随后增强性地施用一种或其它或两种相同或不同载体。另一个选项是DNA，随后是MVA，随后是腺病毒，任选地随后增强性地施用一种或其它或两种相同或不同载体。
在相应引发性组合物和增强性组合物(不若使用多种增强性组合物)中待编码的抗原不需要是完全相同的，不过应当共有至少一个CD8+T细胞表位。所述抗原可以对应于完整抗原或其片段。可以使用肽表位或人工成串表位，从而更有效地切除载体中抗原序列或编码序列内不需要的蛋白质序列。可以包括一个或多个额外表位，例如由T辅助细胞识别的表位，尤其在HLA类型不同的个体中所识别的表位。
由重组MVA病毒待编码的本发明HIV抗原包括具有免疫原活性的多肽，其中所述的免疫原活性由HIV Env、Gag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Nef氨基酸序列中作为至少一个T细胞表位的氨基酸序列激发。这种氨基酸序列基本上对应于已知HIV Env或Pol中10-900个氨基酸的至少一个片段和/或共有序列；或已知HIV Gag中10-450个氨基酸的至少一个片段和/或共有序列；或已知Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Nef中10-100个氨基酸的至少一个片段和/或共有序列。
虽然提出全长Env前体序列用于本发明中，不过Env任选地缺失亚序列，例如，可以缺失gp120表面区和gp41跨膜切割产物区。
虽然提出全长Gag前体序列用于本发明中，不过Gag任选地缺失亚序列，例如，可以缺失基质蛋白(p17)区、衣壳蛋白(p24)区、核衣壳蛋白(p7)区和p6区(Gag多聚蛋白的羧基端肽)。
虽然提出全长Pol前体序列用于本发明中，不过Pol任选地缺失亚序列，例如，可以缺失蛋白酶蛋白(p10)区、逆转录酶蛋白p66/p51)区和整合酶蛋白(p32)区。
这种HIV Env、Gag或Pol可以与已知Env、Gag或Pol蛋白质的氨基酸序列具有至少50％的整体同一性，如50-99％同一性或其间的任何范围或值，同时激发针对至少一株HIV的免疫原性应答。
同一性百分数可以例如通过使用从威斯康辛大学遗传计算机组(University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))可获得的GAP计算机程序6.0版本比较序列信息而确定。GAP程序使用Needleman和Wunsch比对方法(分子生物学杂志(J Mol Biol)197048：443)，后者由Smith和Waterman改进(应用数学进展(Adv Appl Math)19812：482)。简而言之，GAP程序将同一性定义为完全相同的所比对符号(即核苷酸或氨基酸)数目除以两个序列中较短者中符号的总数。GAP程序的优选默认参数包括：(1)单一比较矩阵(unitary comparison matrix)(含有用于同一性的值1和用于同一性的值0)和Gribskov和Burgess加权比较矩阵(核酸研究(Nucl Acids Res)198614：6745)，如Schwartz和Dayhoff所述(编者，1979年华盛顿特区国家生物医学研究基金会《Atlas蛋白质序列与结构》第353-358页(Atlas of ProteinSequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.1979，pp.353-358)；(2)每个空位的罚分3.0和对每个空位中每个符号的额外罚分0.10；和(3)对每个空位无罚分。
在优选的实施方案中，本发明的Env是至少一种HIV包膜蛋白的变异形式。优选地，该Env由gp120以及gp41跨膜结构域和胞外结构域组成，不过缺少gp41的部分或全部胞浆结构域。
已知的HIV序列轻易地可从商业性或机构HIV序列数据库如基因库(GENBANK)或可作为出版的汇编物如新墨西哥州洛斯阿拉莫斯理论生物学和生物物理学出版社Myers等1993年编辑《人逆转录病毒和AIDS，核酸与氨基酸序列的汇编与分析》第I和II卷(Human Retroviruses and AIDS，ACompilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences，Vol.I and II，Theoretical Biology and Biophysics，Los Alamos，N.Mex.)或在互联网上hiv-web.lanl.gov/处获得。
置换或插入HIV Env、Gag或Pol以获得由本发明重组MVA病毒中所用核酸编码的额外HIV Env、Gag或Pol可以包括置换或插入至少一个氨基酸残基(例如1-25个氨基酸)。或者，可以从HIV Env、Gag或Pol序列中缺失至少一个氨基酸(例如1-25个氨基酸)。优选地，基于安全性特征、表达水平、免疫原性和与MVA高复制速率的匹配性，鉴定此类置换、插入或缺失。
在本发明HIV Env、Gag或Pol中的氨基酸序列变异可以例如通过在DNA中突变加以制备。此类HIV Env、Gag或Pol包含例如编码所述氨基酸序列中不同氨基酸的核苷酸的缺失、插入或置换。显然，在编码HIV Env、Gag或Pol的核酸中将产生的突变不应使该序列对开放阅读框错位并优选地将不产生可能产生mRNA二级结构的互补性结构域。
基于本文中呈现的教授内容和指导，也可以通过这样的方式制备本发明编码HIV Env、Gag或Pol的核酸，即通过扩增或位点定向诱变在编码HIV Env、Gag或Pol的DNA或RNA中的核苷酸，并且此后合成或逆转录所述编码性DNA以产生编码HIV Env、Gag或Pol的DNA或RNA。
本发明表达HIV Env、Gag或Pol的重组MVA病毒包括有限套数的HIVEnv、Gag或Pol-编码性序列作为这样的置换核苷酸，其可以基于本文中呈现的教授内容和指导，由本领域普通技术人员例行地获得，无需过多实验。对于蛋白质化学与结构的详细描述，参见Schulz，G.E.等，1978《蛋白质结构原理》(Principles cf Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，N.Y.和Creighton，T.E.，1983《蛋白质：结构与分子特点》(Proteins：Structure and MolecularProperties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA。对于核苷酸序列置换如密码子偏好性的描述，参见1994年纽约州纽约Greene出版协会Ausubel等编辑《最新分子生物学实验方法》§§A.1.1-A.1.24(Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.，New York，NY 1994at§§A.1.1-A.1.24)和1989年冷泉港实验室出版社Sambrook，J.等《分子克隆实验手册》第二版附录C和D(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.at Appendices C and D)。
因此，给定本文中呈现的教授内容和指导，本领域普通技术人员会知道如何置换在HIV Env、Gag或Pol DNA或RNA的其它位置中的其它氨基酸残基以获得另外的HIV Env、Gag或Pol，包括置换性、缺失性或插入性变体。
在MVA载体中，用于表达编码抗原的调节序列将包括启动子。“启动子”意指这样的核苷酸序列，从其中可以启动在下游有效连接的DNA转录(即在双链DNA的有义链以3′方向)。“有效连接的”意指作为相同核酸分子的部分联合，其中所述的部分处在从该启动子中启动的转录的适合位置和方向上。与启动子有效连接的DNA处于该启动子的“转录起始调节作用”下。按照需要，根据本领域技术人员的知识和习惯，可以包括其它调节序列，这包括终止子片段、聚腺苷酸化序列、标记基因和其它序列：参见例如D.M.Knipe和P.M.Howley编辑《费氏病毒学》第2849-2883页Moss.B(2001).痘病毒科：病毒及其复制(Moss，B.(2001).Poxviridae：the viruses and their replication.In FieldsVirology，D.M.Knipe，and P.M.Howley，eds.(Philadelphia，LippincottWilliams &Wilkins)，pp.2849-2883)。用于操作核酸的众多技术，例如制备核酸构建体、诱变、测序、导入DNA至细胞和基因表达以及蛋白质分析在1998年John Wiley&Sons出版社Ausubel等编辑《最新分子生物学实验方法》(Current Protocolsin Molecular Biology，1998Ausubel et al.eds.，John Wiley&Sons)中详细描述。
本发明的方面和实施方案中所用的启动子可以兼容于痘病毒表达系统并且包括天然序列、修饰序列及合成性序列。
所述引发性组合物和增强性组合物两者之一或这两者可以包含辅药，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其编码核酸。
增强性组合物的施用通常在施用引发性组合物后约1-6个月，优选地约1-3个月。
优选地，引发性组合物、增强性组合物或引发性组合物与增强性组合物的施用是真皮内、肌内或粘膜免疫接种。
MVA疫苗的施用可以通过使用针头注射该病毒的混悬剂而实现。可选项是使用无针头注射装置来施用病毒混悬剂(使用例如BiojectorTM无针头注射器)或含有该疫苗的重悬冻干粉剂，前提是制造出无需冷藏的分别制备的药剂。这将极有利于非洲农村地区所需要的疫苗。
MVA是在人免疫接种中具有优异安全记录的病毒。可以简单地完成重组病毒的产生，并且它们可以重复地大量制造。重组MVA病毒的真皮内、肌内或粘膜施用因此极适用于人抗AIDS的预防性或治疗性免疫接种，其中所述的AIDS可以受CD8+T细胞应答控制。
个体可以患有AIDS，从而抗原送递和产生针对该抗原的CD8+T细胞免疫应答是有益的或具有治疗有益效果。
最有可能地，施用将具有预防性目的以在感染或症状发展之前产生针对HIV或AIDS的免疫应答。
本发明待施用的组分可以配制在药物组合物中。这些组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。此类材料应当无毒并且不应当干扰该活性成分的效力。所述载体或其它材料的确切性质可能依赖于施用途径，例如静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌内、腹膜内途径。
如所指出，施用优选地是真皮内、肌内或粘膜施用。
可以包含生理盐溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、皮肤、皮下、肌内或粘膜注射或在临近部位注射，所述活性成分将处在胃肠道外可接受的水溶液形式中，其中所述的水溶液剂无热原并具有合适pH、等张性和稳定性。本领域技术人员完全能够制备合适的溶液剂，使用等张性载体如氯化钠注射液、林格(Ringer)注射液、乳酸钠林格注射液(Lactated Ringer′s Injection)。可以根据需要包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加物。
可以使用缓释制剂。
在产生MVA颗粒并将此类颗粒任选地配制成组合物后，可以施用所述颗粒至个体，尤其人或其它灵长类。可以施用至另一种哺乳动物，例如啮齿类如小鼠、大鼠或仓鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猪、马、奶牛、猴、犬或猫。
施用优选地以“预防有效量”或“治疗有效量”(如情况即为此，尽管预防可以视为治疗)进行，所述的量足以显示出有益于此个体。实际施用量和施用的速率和时间-过程将取决于正在治疗疾病的性质和严重性。治疗的处方(例如剂量决定等)属于全科医师和其它医生或在兽医环境中兽医师的职责范围，并且一般考虑待治疗疾病、单个患者的体况、送递部位、施用方法和执业医生已知的其它因素。上文所提及技术和方法的实例可以在1980年Osol，A.编辑的《雷明顿药物科学第十六版》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，1980，Osol，A.(ed.))中找到。
在一个优选方案中，DNA以300μg-3mg/注射的剂量施用，随后在106-109个感染性病毒颗粒/注射的剂量上施用MVA。
组合物可以单独地或与其它疗法组合同时或依次地施用，这取决于待治疗的疾病。
送递至非人哺乳动物无需出于治疗目的，不过可以用在实验环境下，例如在研究针对目的抗原的免疫机制中，例如针对HIV或AIDS的保护作用。
穿梭质粒、重组MVA/HIV1临床疫苗构建体和在重组MVA中通过外来基 因的密码子改变和在两个痘苗病毒必需基因间插入此外来基因而保留完整该 外来基因的机制
本发明提供以下机制：
·通过将完整外来基因插入MVA复制所必需的两个痘苗病毒基因之间而保留所述完整外来基因。外来基因的缺失可以提供为重组MVA提供明显生长优势，从而使这种重组MVA在反复传代时与含有所述完整外来基因的MVA竞争。然而，外来基因的大部分缺失包括丢失痘苗病毒侧翼DNA的一些部分。若这种痘苗病毒DNA是必需的，则带缺失的那些病毒将不复制并且不与含有所述完整外来基因的MVA竞争。本方法学将用于产生必须进行大规模扩增如用于临床试验的重组痘苗病毒，和
·通过改变特定“热点”而稳定外来基因插入物，否则其中所述的热点在重组病毒反复传代后轻易地发生突变。本方法学将用于产生必须进行大规模扩增如用于临床试验的重组痘苗病毒。
并且描述：
穿梭质粒pLW-73，其用于将外来基因插入2个痘苗病毒必需基因之间；和
重组MVA/HIV-1临床疫苗构建体MVA/UGD4d，它是体现这两种机制用途的材料。
用于生成稳定重组MVA病毒的新方法
本发明人已经产生表达来自不同地理区域HIV-1分离株中的env和gagpol基因的修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)重组体。外来基因插入2个位点即MVA的缺失II和缺失III。证明在组织培养中对重组MVA反复传代后这些基因的稳定性是可变的。本发明人证实这种不稳定性是因完整外来基因或一些侧翼性DNA的缺失或特定点突变所致，其中所述的缺失或点突变导致子代病毒粒子增殖，其中所述的子代病毒粒子因不表达外来基因而具有生长优势。因此，本发明人描述了产生保留完整外来基因的重组MVA的两种新方法。首先，本发明人构建了指导外来基因在痘苗病毒基因组的保守中央区域中插入痘苗病毒的两个必需基因之间的转移载体。使用该位点插入基因则阻止含有大规模缺失的变体过度生长，其中所述的大规模缺失包含痘苗病毒必需DNA。此外，这种质粒可以用于插入额外基因至重组病毒内。其次，就点突变方面对分离株的分析揭示了具有单个碱基插入或缺失倾向性的某些“热点”，其中所述的单个碱基插入或缺失造成翻译期间的过早终止。本发明人证实在这些位点内生成沉默突变引起所插入基因的稳定
I.新转移载体构建和应用
新转移载体pLW-73的构建
1.对MVA基因组的中央区域K7R-A24R检验1)痘病毒科或脊椎动物痘病毒亚科中保守的成对基因和2)处于相对方向从而其3′末端紧密接近的基因，因而提供不会破坏痘苗病毒启动子的插入位点。选作新插入位点的所述位点位于两个必需基因I8R与G1L之间。
2.这种新载体的左侧翼区以下列方式构建；用限制酶EcoRI和XhoI切割质粒LAS-I以除去del III MVA侧翼区、GFP和MVA侧翼区的同向重复序列。用AscI和SacI切割该插入物并分离GFP片段。PCR扩增在I8R基因末端处的531个碱基对(包括TAA终止密码子)，同时在PCR产物的末端带EcoRI和AscI限制位点。用含有SacI和XhoI限制位点寡核苷酸进行该同向重复序列的229碱基对(从I8R基因末端起，包括TAA终止密码子)的PCR扩增。连接全部四个DNA片段：1)带EcoRI和Xho I末端的载体主链、2)含有I8R末端的带EcoRI和AscI末端的新型左侧翼区、3)带AcsI和SacI末端的GFP和4)带SacI和XhoI末端的I8R侧翼区的同向重复序列以产生质粒pLW-72。
3.右侧翼区产生如下：用限制酶PstI和HindIII切割质粒LAS-I以释放该质粒中MVA的delIII侧翼区。CR扩增在G1L基因末端处的702个碱基对，同时在PCR产物的末端带PstI和HindIII限制酶位点并且连接至pLW-72载体以产生pLW-73(图7)。在图8中给出pLW-73的序列。
4.pLW-73的突出特征是：1)该载体设计用于在MVA基因组内的必需基因之间插入外来基因。所述左侧翼区由I8R基因的末端组成而右侧翼区由G1L基因的末端组成。2)包括GFP基因以便容易地初始选择重组病毒。3)由于GFP将在该重组病毒反复传代时丢失，故GFP位于导致GFP瞬时表达的I8R基因同向重复序列的侧翼。参考WO 20041087201，在用于产生MVA/HIV重组的较早期质粒pLAS-1和pLAS-2中也含有特征2和3。
pLW-73的应用
1.将源自HIV-1进化枝B ADA分离株的env基因克隆至pLW-73并且产生重组MVA病毒。DNA测序证实env基因的位置和完整性。
2.在MVA的缺失II位点中表达乌干达进化枝D(分离株A07412)env基因的重组MVA病毒(图9)证明是不稳定的，即在培养物中反复连续传代后，该基因从明显比例的子代病毒中缺失。随后将这种基因克隆至pLW-73并且产生重组MVA病毒及对其表征。该env基因插入在培养物中反复连续传代后是稳定的，即没有发现插入的基因或MVA侧翼区缺失。此外，当该基因插入此位点时，没有其它突变发生。
II.对“热点”的点突变
对点突变的分析
在MVA的缺失III位点中表达乌干达进化枝D(分离株A03349)gagpol基因的重组MVA病毒证明是不稳定的。主要的遗传性变异是在成段4-6G或C残基中生成单个点突变(表3)。此外，在源自相似重组病毒的无着色蚀斑中找到相似的点突变，其中所述的相似重组病毒表达来自HIV-1肯尼亚进化枝A分离株和坦桑尼亚进化枝C分离株的gagpol基因。
热点的诱变和对重组病毒中稳定性的分析
利用位点定向诱变，在来自HIV-1乌干达分离株的6个如此区域中产生沉默突变。将这种变异的基因UGD 4d gagpol orf(图10)克隆至pLAS-1并且如构建不稳定性病毒中所进行那样重组至MVA的相同缺失III位点内。在培养物中反复连续传代(8x)后，找到非表达性蚀斑。对第8病毒原液代的DNA测序验证gagpol基因的完整性得到维持。
III.双重重组构建体
MVA/UGD4d病毒
MVA/UGD4d病毒(表达乌干达亚型D 15 A07412包膜蛋白和A03349gagpol的重组病毒)以下列方式构建：通过同源重组，利用穿梭质粒pLW-73和pLAS-1将包膜蛋白基因和gagpol基因分别插入MVA1974/NIH克隆1。MVA/UGD4d通过在鸡胚成纤维细胞中6轮蚀斑纯化进行分离并且随后扩增和表征。
总结
1.构建了指导外来基因在MVA基因组的保守中央区域中在两个必需基因I8R和G1L之间重组的质粒转移载体。证明该位点的使用抑制选择到缺失所插入基因/MVA侧翼区的突变病毒。
2.通过位点定向诱变改变高度可突变性G和C残基串并且产生在编码序列中的沉默突变产生。证明这种变化在所述基因插入MVA的缺失III内时使该基因稳定。
3.利用上述这两种方法，构建了稳定表达乌干达进化枝D的env和gagpol的UGD4d双重MVA重组体。
实施例1
已经产生表达来自不同分离株的HIV-1 env和gagpol基因的重组MVA。所插入基因在组织培养反复传代后的稳定性已经证明是可变的。这里，发明人(1)证实不稳定性代表插入的基因自发性突变或缺失与选择无表达突变体的组合并且(2)描述用于降低不稳定性的新方法。
概述
构建了表达来自众多不同分离株的env和gagpol的重组MVA。每种病毒在鸡胚成纤维细胞中进行反复传代以模拟对产生临床试验用病毒所需要的大规模扩增。通过单个蚀斑的env和gag免疫染色法监测插入稳定性。对于一些重组病毒，发现env和/或gag表达在显著比例的病毒群中迅速丢失。为鉴定表达丢失的机制，分离单个蚀斑并表征突变的本质。在一些情况下，鉴定到倾向通过添加或缺失单个核苷酸而突变的特定DNA序列。可以通过改变密码子而不改变预测的翻译产物而避免产生此类突变。在其它情况下，表达丢失由经常延伸至侧翼非必需MVA基因内的大规模缺失所致。为防止这种情况出现，构建了设计旨在将外来基因插入两个MVA必需基因之间的新型穿梭质粒。在所述位点内的重组降低外来DNA的缺失。在一种情况下，然而，与HIV env高水平表达相关的毒性是如此强烈，以至对稀有突变体的选择仍然产生不稳定的群体。在这种情况下，仅截短env的跨膜结构域即可导致构建稳定的重组MVA。
重组MVA的生成和所插入基因的稳定性分析
将Env和gagpol基因克隆至MVA穿梭载体。通过瞬时表达测定法分析表达和功能。将Gagpol重组至MVA 1974/NIH克隆1。将重组MIVA经6-8轮蚀斑纯化，随后扩增病毒。将Env重组至MVA/gagpol分离株并且将双重重组MVA(图11A)经6-8轮蚀斑纯化并进行扩增。为评估插入物的稳定性，将病毒在CEF细胞中使用感染复数(m.o.i.)约1pfu/细胞进行连续传代以模拟大规模生产。通过确定表达env或gag的细胞的百分数，如通过用单克隆抗体的免疫染色法，评价稳定性(图11B)。
重组MVA的稳定性
构建了表达来自不同地理地区HIV-1分离株中基因的重组MVA。将env和gagpol基因分别插入MVA的缺失II和III；它们均处于修饰的H5启动子控制下。在表4中显示来自7种重组MVA的env和gagpol基因的稳定性。在这7种病毒中观察到不同程度的不稳定性。在MVA/65A/G中，env的表达迅速丢失，到第6代仅25％的病毒粒子表达env。在MVA/UGD4a中，env和gagpol的表达随病毒连续传代而递增性丢失。由于需要至少6-7次传代以产生用于I期试验的大量病毒，故认为这两种病毒不适用。
分析MV A/65A/G的表达
参照图12，从MVA/65A/G的P3和P5中随机挑取十三个蚀斑并且通过用T-24mAb(在a上显示结合位点)的免疫染色法、蛋白质印迹法、PCR和测序法进行分析。找到5个类型的蚀斑并且在图12右侧给出对每种类型所获得的蚀斑的数目。蚀斑a、b和c着色，不过b和c是截短形式，原因是碱基置换(产生终止密码子)(b)和缺失env基因末端和MVA侧翼区(flank)的部分(c)。无着色蚀斑d和e因向一个5G段添加G而造成移码(d)和完整env基因及部分MVA侧翼区的大规模缺失(e)而产生。因此，碱基对的添加、置换和缺失均对MVA/65A/G中env基因的不稳定表达有贡献。挑取这种A/Genv(加以研究的最不稳定性实施例)以研究可能增强稳定性的修饰。
对A/G构建体增加稳定性的修饰
1.通过防止点突变的沉默突变除去4和5G与C段(run)而产生合成性包膜蛋白。
2.构建了载体I8/G1即pLW-73，其在必需基因I8R和G1L之间带有防止发生基因和MVA侧翼区缺失的插入位点。MVA的I8R(500bp)和G1L(750bp)基因的末端通过PCR进行扩增并插入含有控制外来基因表达的痘苗病毒早期/晚期mH5启动子的载体。使用这种I8/G1载体以将外来基因通过同源重组插入MVA(图13)。缺失所插入的基因和在该插入基因侧翼的MVA将是不可行的，因为将不会缺失必需基因的部分。因此，带这些突变的病毒将不能够生长超过具有正常生长优势的群体。
3.通过缺失gp41的跨膜结构域和胞质尾使A/G gp140包膜蛋白突变，从而产生分泌蛋白。
测试增加稳定性的修饰
如14图中所示，用env修饰和/或使用新载体产生7个单一重组病毒。分离每种病毒的5个蚀斑并将其在鸡胚成纤维细胞(CEF)中独立传代以确定修饰是否增强包膜蛋白的稳定表达。传代的蚀斑通过用mAb T-43(结合位点定位至env第101-125位氨基酸)的免疫染色法、蛋白质印迹法、PCR和测序法进行分析。
蚀斑传代后的Env表达
参考图15，上文所列7种重组体的5个独立传代的蚀斑分离株在第1、3、5和7代通过用mAb T-43(结合在gp120第101-125位氨基酸之间)的免疫染色法进行表征。7种病毒中的4种病毒(图15，a、b、c、e)在全部5个传代蚀斑中具有不稳定的蛋白质表达；(图15f)的两个蚀斑传代也具有不稳定的env表达。这些病毒包括在MVA基因组del II(图15c)和必需基因位点(图15f)内均具有合成性env的病毒。仅含有截短分泌性gp140作为包膜蛋白的重组病毒保持稳定表达的包膜蛋白(图15，d和g)。
蛋白质印迹法、PCR和序列分析法
从选择的蚀斑传代中，挑取克隆以通过蛋白质印迹法、PCR和序列分析法分析蛋白质表达(图16)。对于蛋白质印迹分析法，分别使用在进化枝A包膜蛋白的始端和末端处结合的T-24和T-32以确定是否仅产生部分长度或完整长度的包膜蛋白。标为c的对照病毒位于每个印迹物的右侧。对于在MVA的缺失II中所产生的三种病毒(图16a、b和c)，仅在图16c(即gp140克隆)中均是表达在Western内可检测蛋白的克隆。这种蛋白质(如由T-32测量)不是截短型的。当通过载体I8/G1将包膜蛋白基因插入必需基因位点时(图16d、e和f)，再次，仅gp140包膜蛋白在全部克隆中表达并且不是截短型的。虽然I8/G1载体的使用没有防止env序列突变，不过它的确阻止已经在插入del II的包膜蛋白基因中所见到的缺失。(注意阳性PCR产物源于I8/G1载体的全部所测试克隆，但是阴性PCR产物源于使用del II载体测试的克隆)。
Env在进化枝A/G双重重组体中的表达
基于用单一env分析法的先前结果，产生用gp140或合成性gp160基因表达gagpol的双重重组体并且对其测试env表达的稳定性(图17)。如前所述，从每种病毒中分离5个蚀斑，并且对其传代7次以分析env表达的稳定性。在第7代上，传代蚀斑以T-43和T-32mAb(其分别结合gp120和gp41)进行免疫染色。借助T-43mAb，表达合成性包膜蛋白的重组体的5个克隆之一仅由无着色蚀斑组成。随后对这些这些蚀斑进行T-32染色，显示另一个蚀斑具有截短包膜蛋白的表达。通过T-43和T-32免疫染色法显示来自含有gp140包膜蛋白的双重重组体中的全部传代蚀斑是稳定的。其滴度也比其它双重重组体高2log。因此，仅可能用gp140包膜蛋白产生稳定表达包膜蛋白的进化枝A/G双重重组体。
表达来自乌干达HIV-1分离株的env和gagpol的重组病毒
如18图中所示构建了表达来自乌干达分离株A07412和A03349的HIV-1env与gagpol基因的重组MVA病毒。每种重组MVA病毒的4-6个独立分离株进行连续传代并且发现这两个基因均是不稳定的，无论是单独表达或联合表达(表5)。相反，gp140的表达，而不是膜结合性gp160的表达，导致env基因在连续传代后的稳定(图18和表5)。
MVA/UGD4a-无着色env蚀斑的分析
为确定不稳定性的机制，将24个独立的无着色蚀斑(使用MabT-43)从MVA/UGD4a第6代中分离、扩增和表征。通过PCR扩增和DNA测序鉴定到两个小缺失(1.2和0.3kb)(图19)。全部其它分离株含有延伸至MVA侧翼区内的极大规模缺失。使用来自env基因或MVA侧翼区内部的引物对鉴定到这些缺失的大致断点。
在重组MVA中修饰UGD env基因
为改进UGD env基因的不稳定性问题，使用新载体I8/G1，将A07412env基因插入MVA，其中所述的新载体指导外来基因插入痘苗病毒的2个必需基因I8与G1之间并且使用修饰的H5启动子(图20)。将四个独立蚀斑连续传代并通过用Mab T-43和T-32的免疫染色法在第5代对其分析env表达。在全部分离株中，A07412env基因是稳定的(表6)。
MVA/UGD4b-无着色gag蚀斑的分析
为确定gag基因的不稳定性机制，将8个独立的无着色蚀斑(使用Mab183-H12-5C-NIAJD AIDS Repository)从MVA/UGD4b第6代中挑取、扩增，并且将gagpol插入物测序(表7)。7个分离株中在第564-569位置处发现单个G残基插入或缺失。在一个分离株中，一个C残基从位置564-569处的序列CCCC中缺失。另外，来自MVNKEA和MVA/TZC高代原液的无着色蚀斑揭示相似的突变热点，即，第564-569位置。检验UGD A07412gagpol基因的全序列显示22段4个或4个以上G或C残基(图21)。
在重组MVA中修饰UGD gagpol基因
由于gag基因的不稳定性机制主要是单个核苷酸在一段4-6G或C残基内插入或缺失，故改进该基因稳定性的策略是在这类位点处产生沉默突变。因此，在p17和p24gag中6个位点处采用位点定向诱变(表3)。证明连续传代时，在相同位置即缺失III处插入MVA的所得密码子变异(c.a.)的基因是稳定的(图22和表8)。
构建表达UGD env和gagpol的稳定重组MVA
构建了这样的重组病毒，其表达在I8/G1基因座内的UGD env基因和在MVA的缺失III内的密码子变异的gagpol基因(图23)。连续传代证明这两种基因均是稳定的。另外，蛋白质表达的水平和DNA序列在传代期间是不改变的(表9)。
结论
env和gagpol插入物的不稳定性归因于点突变的生成和缺失和无表达的MVA突变体的生长优势。不稳定性可以通常地通过密码子改变和/或插入MVA基因组(MVA/UGD4d)的必需区域而降低，不过在一种情况下env必须加以改变(MVA/65A/G)。
实施例2
MVA/UGD4d在BALB/c小鼠中的免疫原性
含10只小鼠的组用106或107感染单位的MVA/UGD4d通过免疫腹膜内途径免疫。各含5小鼠的组类似地用亲代MVA-1974免疫。小鼠在第0和第3周进行免疫并且在第0、3和5周放血。在第5周收集脾脏。
在新鲜脾细胞中通过胞内细胞因子染色法测量细胞应答。脾细胞分别用以下物质刺激：1)免疫优势性gag肽(AMQMLKETI(SEQ ID NO：6))、2)env肽(DTEVHNVWATHACVP(SEQ ID NO：7)和QQQSNLLRAIEAQQH(SEQ IDNO：8))、3)pol肽(具有HGVYYDPSKDLIAE(SEQ ID NO：10)和ELRQHLLRWGLTT(SEQ ID NO：9)的单一氨基酸变体的8种肽)和4)MVA。
就CD4和CD8的表面表达并随后就IFN-γ和IL2或TNF的胞内表达对细胞染色。如24图中所示，MVA/GD4d激发针对gag肽、pol肽和MVA的CD8/IFN-γ应答。gag肽应答是多功能性的，从而表达IFN-γ和IL2或TNF。另外，激发针对env肽汇集物的CD4/IFN-γ应答。
体液应答由ELISA测量(图25)。针对UGD env的强烈应答在首次免疫后3周得到证实并且通过第二次免疫进行强化。此外，在一次和两次免疫后激发强烈的痘苗病毒应答。
表3.产生旨在消除成段G和C(HIV-1分离株A03349)的MVA/UGD核苷酸变化
  始于ATG的核苷酸#   原始序列   修饰的序列
  28-32   GGGGG   GGAGG
  70-74   GGGGG   GGAGG
  408-411   GGGG   GGGA
  530-533   CCCC   CACC
  564-569   GGGGGG   AGGAGG
  686-689   GGGG   GAGG
Figure G2007800353853D00411
表5.表达来自乌干达HIV-1分离株的env和gagpol的重组病毒
Figure G2007800353853D00421
表6.在重组MVA中env和gagpol基因的修饰
Figure G2007800353853D00431
表7.MVA/UGD4b-无着色蚀斑的分析
#带突变的单个蚀斑
Figure G2007800353853D00432
表8.在重组MVA中修饰UGD gagpol基因
表9.构建表达UGD env和gagpol的稳定重组MVA
Figure G2007800353853D00442
***
尽管于清晰和理解的目的，本发明已经以某些细节加以描述，本领域技术人员将理解可以在形式和细节上提出各种改变而不脱离把本发明的真实范围。上文参考的全部图片、表格和附注以及专利、申请和出版物因而通过引用的方式并入。

Claims (17)

1.重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含插入所述MVA基因组的基因间区(IGR)内的异源DNA序列，其中，所述的IGR位于必需基因I8R和G1L之间，其中必需基因I8R和G1L采用GenBank登录号M35027的哥本哈根痘苗病毒的命名法命名。
2.根据权利要求1所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的异源DNA序列包含在痘病毒转录控制元件的转录性控制下的至少一个编码序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的异源DNA序列编码一种或多种蛋白质。
4.根据权利要求1或2所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的异源DNA序列得自人免疫缺陷病毒(HIV)。
5.根据权利要求4所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述得自人免疫缺陷病毒的异源DNA序列编码HIV包膜。
6.根据权利要求1或2所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的MVA基因组是保藏于美国典型培养物保藏中心登录号PTA-5095下的MVA的基因组。
7.根据权利要求1或2所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的MVA基因组是具有Genbank登录号AY603355的序列的MVA基因组。
8.根据权利要求1或2所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其中，所述的MVA基因组是具有Genbank登录号U94848的序列的MVA基因组。
9.质粒载体，其包含来自于MVA病毒的IGR序列和插入所述IGR序列的克隆位点，所述IGR序列位于来自于所述MVA基因组的两个相邻ORF的DNA序列之间，所述克隆位点用于插入与该MVA的基因组异源的DNA序列和任选地插入报道基因盒或选择基因盒，其中所述的两个相邻ORF是I8R和G1L，其中两个相邻ORF I8R和G1L采用GenBank登录号M35027的哥本哈根痘苗病毒的命名法命名。
10.质粒载体，其包含得自MVA的基因组的DNA序列，其中，所述的DNA序列包含来自于两个相邻ORF的序列，克隆位点位于所述两个相邻ORF的序列之间，所述克隆位点用于插入与该MVA的基因组异源的DNA序列和任选地插入报道基因盒或选择基因盒，其中所述的两个相邻ORF是I8R和G1L，其中两个相邻ORF I8R和G1L采用GenBank登录号M35027的哥本哈根痘苗病毒的命名法命名。
11.根据权利要求9或10所述的质粒载体，其中，权利要求9所述的来自于所述MVA基因组的两个相邻ORF的DNA序列或者权利要求10所述的得自MVA的基因组的DNA序列得自保藏于美国典型培养物保藏中心登录号PTA-5095下的MVA的基因组。
12.根据权利要求9或10所述的质粒载体，其中，权利要求9所述的来自于所述MVA基因组的两个相邻ORF的DNA序列或者权利要求10所述的得自MVA的基因组的DNA序列得自具有Genbank登录号AY603355的序列的MVA的基因组。
13.根据权利要求9或10所述的质粒载体，其中，权利要求9所述的来自于所述MVA基因组的两个相邻ORF的DNA序列或者权利要求10所述的得自MVA的基因组的DNA序列得自具有Genbank登录号U94848的序列的MVA的基因组。
14.药物、疫苗或免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-8中任意一项所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒。
15.权利要求1-8中任意一项所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒用于制备药物、免疫原性组合物或疫苗的用途。
16.权利要求1-8中任意一项所述的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒在制备用于治疗或预防病毒感染或增殖病的药物、免疫原性组合物或疫苗中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，用于治疗或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
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