ES2392730T3 - Composiciones para el uso como un componente de generación de señales y métodos par usar las mismas - Google Patents

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Abstract

Una composición adecuada para el uso como un componente de generación de señales en un inmunoensayo, que comprende: un vehículo revestido con un aminodextrano, teniendo un promedio la densidad del revestimiento de aminodextrano de al menos 45 μg por miligramo de vehículo y teniendo incorporado en el mismo, a una concentración de al menos 0, 065 mmol por gramo de vehículo, un complejo que tiene la fórmula: M (L1) x (L2) y, en la que M es un metal seleccionado del grupo que consiste en europio, terbio, disprosio, samario, osmio y rutenio; L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en DPP, TOPO, TPPO; L2 comprende un ligando que tiene la fórmula Fórmula 1 en la que R es uno o más sustituyentes, comprendiendo cada sustituyente un grupo donante de electrones; n >= 2-10; x >= 1-2; e y >= 2-4.

Description

Composiciones para el uso como un componente de generación de señales y métodos para usar las mismas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere generalmente a composiciones útiles como componentes de generación de señales en inmunoensayos. En particular, la invención se refiere a composiciones que proporcionan simultáneamente una señal fuerte así como una especificidad mejorada para los analitos de interés.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los reactivos de inmunoensayo tienen una funcionalidad que puede romperse en dos componentes amplios: una funcionalidad de generación de señales (también conocida como de amplificación) y una funcionalidad de unión a un ligando. La funcionalidad de generación de señales se requiere para la detección de la unión del ligando al analito, y la funcionalidad de unión al ligando es la especificidad del reactivo para el analito. La actividad de unión al ligando se lleva a cabo enlazando covalentemente los ligandos a la superficie de partículas. Anticuerpos y haptenos pequeños de significación biológica, tales como tiroxina, son ejemplos de ligandos comunes.
Se han usado mucho composiciones fluorescentes y quimioluminiscentes en componentes de generación de señales de inmunoensayos. Un componente de generación de señales típico incluye un vehículo, tal como una partícula de látex, teñido con una composición fluorescente o quimioluminiscente. En particular, se han usado mucho quelatos metálicos como colorantes fluorescentes y quimioluminiscentes debido a su desplazamiento de Stokes generalmente grande, pico de emisión agudo y larga longitud de onda de emisión. Típicamente, los quelatos metálicos son un complejo formado por un metal, tal como europio, samario o terbio, y ligandos tales como tiofenotrifluorobutanodiona (TTA), nafiltriflurobutanodiona (NTA) y 4,7-difenil-1,10-fenantrolina (DPP), óxido de trioctilfosfina (TOPO), óxido de trifenilfosfina (TPPO). Algunos quelatos metálicos comúnmente usados incluyen Eu(TTA)3DPP y Eu(NTA)3DPP.
Los vehículos teñidos que se usan para elaborar reactivos de ensayo deben tener tanto la capacidad para proporcionar generación de señales como la funcionalidad química para el enlace covalente de los ligandos. El procedimiento usado para enlazar los ligandos puede ser crítico para la calidad de la especificidad de la funcionalidad de unión a ligandos. La especificidad de los ligandos puede estar comprometida de varios modos por las elecciones inapropiadas de la química de enlace. Por ejemplo, si se produce adsorción pasiva de los ligandos simultáneamente con enlace covalente, los ligandos adsorbidos pasivamente pueden desprenderse del vehículo durante el ensayo. El ligando libre resultante interferirá con el ensayo y reducirá su sensibilidad. Otro problema que puede presentarse es la unión no específica del reactivo al otro vehículo, lo que conduce a una elevación de la señal de inmunoensayo en ausencia de analito.
Los ligandos a menudo están enlazados a partículas de poliestireno a través de grupos carboxi que están enlazados directamente a la superficie de las partículas. Este planteamiento puede tener ambos problemas descritos anteriormente. Los problemas de adsorción pasiva y unión no específica pueden evitarse introduciendo una o más capas de polímeros de hidrogel inmovilizados, tales como aminodextrano, entre las partículas de poliestireno y los ligandos. Es importante para la eliminación de la adsorción y la unión no específica tener una capa continua de estos polímeros de hidrogel.
Sin embargo, el revestimiento de partículas que están teñidas con colorantes convencionales tales como Eu(TTA)3DPP o Eu(NTA)3DPP típicamente da como resultado densidades de revestimiento de aminodextrano que son significativamente menores que las óptimas para prevenir la unión no específica. La densidad de acoplamiento del aminodextrano se reduce típicamente un 40-50% desde su máximo cuando estos colorantes se añaden al nivel óptimo para la respuesta quimioluminiscente del reactivo. Los niveles inferiores de colorante dan composiciones que interfieren menos con el procedimiento de revestimiento de aminodextrano, pero reducir el contenido de colorante también reduce la quimioluminiscencia necesaria para una señal fuerte.
De acuerdo con esto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de proporcionar un equilibrio más óptimo entre la amplitud de la señal de respuesta y la especificidad de los componentes de generación de señales en un ensayo de unión específica.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Las composiciones de la presente invención proporcionan componentes de generación de señales que tienen un equilibrio óptimo entre la reducción de la unión no específica mientras que permiten una señal de respuesta mejorada.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición adecuada para el uso como un componente de generación de señales en un inmunoensayo. La composición incluye un vehículo que tiene un revestimiento de un aminodextrano y teñido con un quelato metálico. El quelato metálico está presente en la cantidad de al menos 0,065 µM por miligramo de vehículo, y la densidad media del revestimiento de aminodextrano
es al menos 45 µg por miligramo de vehículo.
Una composición según otro aspecto de la invención incluye un vehículo revestido con un aminodextrano y con un complejo incorporado en el mismo que tiene la fórmula:
M (L1)x(L2)y,
en la que M es un metal seleccionado del grupo que consiste en europio, terbio, disprosio, samario, osmio y rutenio; L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en DPP, TOPO y TPPO; L2 comprende un ligando que tiene la fórmula
Fórmula 1
en la que R es uno o más sustituyentes, comprendiendo cada sustituyente un grupo donante de electrones; y n = 210, x = 1-2 e y = 2-4.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el analito. El método comprende realizar un inmunoensayo usando las composiciones de la presente invención como un componente generador de señales.
Las realizaciones actualmente preferidas, junto con otros aspectos de la invención, se entenderán mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un esquema que ilustra la síntesis de una realización de un quelato metálico según la presente invención.
La FIG. 2 es un esquema que ilustra la síntesis de otra realización de un quelato metálico según la presente invención.
La FIG. 3 es una representación gráfica de la concentración de aminodextrano y la señal de respuesta como funciones de la concentración de metal para una composición de la técnica anterior.
La FIG. 4 es una representación gráfica de la concentración de aminodextrano y la señal de respuesta como funciones de la concentración de metal para composiciones según la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Las composiciones de la presente invención son útiles como componentes de generación de señales en inmunoensayos. Las composiciones incluyen generalmente un vehículo revestido con un aminodextrano y tienen un quelato metálico incorporado en las mismas. Las composiciones proporcionan señales de respuesta fuertes que permiten determinaciones cuantitativas de analitos de interés, mientras que reducen errores provocados por la unión no específica.
Vehículos adecuados para la presente invención incluyen materiales en fase sólida, típicamente un soporte o una superficie, que pueden tener una cualquiera de un número de conformaciones, tales como una tira, una lámina, un cilindro, un pocillo, un tubo, una partícula o una cuenta. El material es habitualmente de un material insoluble en agua orgánico o inorgánico, hinchable o no hinchable, poroso o no poroso, magnético o no magnético. La superficie puede ser hidrófila o capaz de volverse hidrófila. El soporte sólido incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato magnésico y alúmina; materiales poliméricos naturales, particularmente materiales celulósicos y materiales derivados de celulosa, tales como papeles que contienen fibra, p. ej., papel de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros sintéticos o naturales modificados, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon, polivinilbutirato, etc.; bien usados por sí mismos o bien junto con otros materiales; vidrio disponible como Bioglass, materiales cerámicos, materiales magnéticos, metales y similares. También pueden emplearse dispositivos naturales o sintéticos tales como liposomas, vesículas fosfolipídicas y células.
En una realización de la presente invención, el vehículo es una partícula. "Partícula", según se usa en la presente memoria, abarca esferas, esferoides, cuentas o también otras conformaciones. Las partículas adecuadas tienen típicamente al menos 20 nm y no más de aproximadamente 20 µm, habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de 10 µm, preferiblemente de 0,1 a 10 µm, más preferiblemente de 0,1 a 5 µm, y aún más preferiblemente de 0,15 a 3 µm. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, teniendo cualquier densidad, pero preferiblemente de una densidad aproximada a la del agua, generalmente de 0,7 a 1,5 g/ml, preferiblemente puede ser suspendible en agua y estar compuesta por un material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser partículas de núcleo y envuelta, tales como partículas con un núcleo magnético y un revestimiento de envuelta duro de un monómero o monómeros polimerizados. Preferiblemente, las partículas están cargadas negativamente. Las partículas son preferiblemente sólidas, p. ej., partículas de polímero, soles metálicos (partículas comprendidas por un metal pesado tal como, p. ej., oro o plata), partículas de vidrio, partículas de silicio, partículas magnéticas, cristalitos de colorante.
Una partícula especialmente preferida es una partícula de látex. "Látex", según se usa en la presente memoria, significa un material polimérico en partículas insoluble en agua, suspendible en agua. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido tal como as: poliestireno-butadieno, poliacrilamida-poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), acrilonitrilo-butadieno, copolímeros de estireno, poli(acetato-acrilato de vinilo), polivinilpiridina, copolímeros de acrilato-cloruro de vinilo, y similares. Se prefieren polímeros no reticulados de estireno y estireno carboxilado funcionalizado con otros grupos activos tales como amino, hidroxilo, halo y similares. Frecuentemente, se usarán copolímeros de estirenos sustituidos con dienos tales como butadieno.
Los vehículos según la presente invención se revisten con una o más capas de aminodextrano. Un aminodextrano es un polímero de glucosa derivado con grupos amino que tiene un peso molecular de 10.000 a 2.000.000, preferiblemente 500.000. Métodos para preparar aminodextranos y vehículos de revestimiento se conocen en la técnica. Métodos adecuados se describen en US 5.707.877, columnas 18-20, y US 5.639.620, columnas 21 y 22.
En un método preferido, el aminodextrano se reviste sobre el vehículo mediante enlace covalente del grupo amino del aminodextrano a los grupos carboxilo superficiales u otro grupo funcional reactivo con amina del vehículo. Tal método se describe en US-B-7.179.660 de cesionario común, titulada "Carriers Coated with Polysaccharides, Their Preparation and Use".
El revestimiento de aminodextrano mejora la especificidad del vehículo en ensayos de unión específica y por lo tanto mejora la sensibilidad de los inmunoensayos. Se ha descubierto que el quelato metálico de la presente invención permite inesperadamente el revestimiento de vehículos con aminodextrano en la cantidad de al menos aproximadamente 45 µg por miligramo de vehículo en presencia de una concentración de colorante tan alta como al menos 0,065 µM. Según una realización preferida de la presente invención, el revestimiento de aminodextrano está presente en al menos aproximadamente 49 µg por miligramo de vehículo.
En una realización preferida de la invención, el vehículo puede revestirse con una segunda capa que comprende un polisacárido, según se describe en US-B-7.179.660. El polisacárido puede acoplarse covalentemente a la capa de aminodextrano mediante grupos funcionales reactivos con amina. En una realización preferida, la segunda capa comprende dextranoaldehído.
Un quelato metálico se incorpora en el vehículo a través de un procedimiento conocido, tal como tinción. El quelato metálico permite que se detecte una señal fluorescente o quimioluminiscente. El quelato metálico se elige de modo que concentraciones relativamente superiores del quelato metálico no interfieran con la unión del revestimiento de aminodextrano al vehículo. Según una realización de la presente invención, el quelato metálico está presente en la cantidad de al menos 0,065 µM por miligramo de vehículo, mientras que la densidad media del revestimiento de aminodextrano es al menos 45 µg por miligramo de vehículo. En otra realización de la invención el quelato metálico está presente en la cantidad de al menos 0,065 µM y menos de 0,150 µM por miligramo de vehículo, más preferiblemente de 0,079 µM a 0,150 µM por miligramo de vehículo, y más preferiblemente aproximadamente 0,087 µM por miligramo de vehículo. En otra realización de la invención, el quelato metálico está presente en la cantidad de 0,110 µM a 135 µM. Se ha encontrado que estas concentraciones de quelato metálico y aminodextrano proporcionan un equilibrio apropiado de señal de respuesta y especificidad de los componentes para el analito de interés.
Según una realización de la presente invención, el quelato metálico tiene la fórmula general
M (L1)x(L2)y
en la que M es un metal seleccionado del grupo que consiste en europio, terbio, disprosio, samario, osmio y rutenio; L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en DPP, TOPO y TPPO; L2 comprende un ligando que tiene la fórmula
Fórmula 1
5 en la que R es uno o más sustituyentes, comprendiendo cada sustituyente un grupo donante de electrones;
n = 2-10;
x = 1-2; e
y = 2-4.
Grupos donantes de electrones adecuados son los que ponen a disposición una carga negativa adicional en los
10 grupos perfluoroalquilo. En una realización, el grupo donante de electrones R se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1 a C6, dialquilaminas, éteres, tioéteres y grupos arilo.
Sin querer limitarse por una teoría, se cree que los quelatos metálicos de la presente invención son eficaces para permitir que cantidades optimizadas de aminodextrano revistan el vehículo debido a que los quelatos metálicos proporcionan un complejo inesperadamente estable con relación a colorantes de quelato metálico previos. La
15 estabilidad del complejo reduce la cantidad del metal libre, lo que se cree que inhibe el enlace del aminodextrano al vehículo. También se cree que los grupos donantes de electrones R también se suman a la estabilidad del complejo poniendo a disposición carga negativa adicional a los grupos perfluoroalquilo de los ligandos, mejorando de ese modo la capacidad del grupo perfluoroalquilo para unirse al metal en el complejo.
Según una realización particular de la invención, M es europio y el vehículo es una partícula de látex. Según
20 realizaciones preferidas de la invención, n = 3 o 7, y x = 1 e y = 3. Según realizaciones específicas de la invención, L2 se selecciona de entre las siguientes fórmulas:
Fórmula 2 Fórmula 3 Fórmula 4 Fórmula 5 Fórmula 6
En una realización preferida de los ligandos descritos anteriormente, n = 3 o n = 7. En una realización de la invención, los ligandos L2 son 2-(1’,1’,1’,2’,2’,3’,3’-heptafluoro-4’,6’-hexanodion-6’-il)-naftileno (NHA) y 4,4’bis(1",1",1",2", 2", 3",3"- heptafluoro-4",6"-hexanodion-6"-il)-o-terfenilo (BHHT).
En una realización particularmente preferida de la presente, el quelato metálico comprende Eu(NHA)3DPP y Eu(BHHT)2DPP. Generalmente, los quelatos metálicos pueden prepararse combinando el cloruro metálico con la relación deseada de moléculas de ligando metálico en un disolvente orgánico y suficiente base para recoger el ácido clorhídrico liberado. Síntesis adecuadas se ilustran en las FIGS. 1-2, respectivamente.
Se ha encontrado que los colorantes de quelato metálico de la presente invención permiten una densidad superior de revestimiento de aminodextrano con concentraciones relativamente superiores de los colorantes de quelato metálico cuando se comparan con colorantes convencionales, según se muestra en los Ejemplos Comparativos posteriores. A concentraciones de colorante optimizadas constantes, los quelatos metálicos de la presente invención permitirán generalmente un revestimiento de aminodextrano en de 45 a 55 µg por mg de cuentas en comparación con de 23 a 35 µg por mg de cuentas para los colorantes convencionales. De acuerdo con esto, los colorantes de la presente invención pueden estar presentes en cantidades suficientes para dar señales de respuesta fuertes como parte de un componente de generación de señales en un ensayo de unión específica, mientras que permiten que el vehículo se revista con un aminodextrano en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de unión no específica.
Las composiciones de la presente invención son adecuadas para el uso como un componente de generación de señales en ensayos de unión específica. Las composiciones son adecuadas para cualquier inmunoensayo en el que se mida una señal en respuesta a la unión de un ligando a un analito. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que las composiciones tienen una amplia utilidad en un número de formatos de ensayo.
En una realización de un ensayo de unión específica según la presente invención, el componente generador de señales se usa para realizar el Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (LOCI™) que se describe en EP-A20 515 194. En este método para la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito, al menos un socio de unión específica está unido a un vehículo según la presente invención. Un medio que se sospecha que contiene un analito se trata bajo condiciones tales que el analito afecta a la cantidad de un sensibilizador capaz en su estado excitado de generar un oxígeno singlete y un compuesto quimioluminiscente que pueden entrar en estrecha proximidad de modo que el oxígeno singlete generado por dicho fotosensibilizador pueda activar dicho compuesto quimioluminiscente, que posteriormente produce luz y, medir la luz, estándo relacionada la cantidad de la misma con la cantidad de analito en dicho medio.
En otra realización, el método de LOCI™ incluye las etapas de: (A) combinar bien simultáneamente o bien de forma totalmente o parcialmente secuencial (i) un medio que se sospecha que contiene el analito; (ii) un primer socio de unión específica asociado con un sensibilizador capaz en su estado excitado de generar oxígeno singlete; y (iii) un segundo socio de unión específica asociado con una composición que comprende un compuesto quimioluminiscente, que es una sustancia que sufre una reacción química con oxígeno singlete para formar una especie intermedia metaestable que puede descomponerse con la emisión simultánea o posterior de luz; (B) permitir la formación de complejos que comprenden el primer y el segundo socio de unión específica, la formación del complejo pone el sensibilizante en estrecha proximidad con el compuesto quimioluminiscente, (C) activar el sensibilizador para generar oxígeno singlete; y medir la cantidad de luz emitida por el compuesto quimioluminiscente, la luz es directamente o inversamente proporcional a la cantidad de analito en el medio. La composición que comprende el compuesto quimioluminiscente también puede comprender una o más moléculas fluorescentes que son excitadas por el compuesto quimioluminiscente activado. La luz emitida por dichas moléculas fluorescentes puede medirse para determinar la cantidad de analito en el medio.
En una realización de la invención que usa el método de LOCI, el vehículo puede teñirse con un quelato metálico y un aceptor de oxígeno. El aceptor de oxígeno es un componente que reacciona con el oxígeno singlete para formar un producto altamente inestable que se descompone rápidamente hasta un estado excitado. La energía en exceso
del estado excitado es transferida por el colorante mediante una transferencia de energía de Forster que tiene lugar en unos pocos nanosegundos. El colorante de quelato metálico emite a continuación un fotón de luz que ser detectado con un contador de fotones. Aceptores de oxígeno adecuados se divulgan en las Pat. de EE. UU. Nº
5.578.498 y 5.811.311. Un aceptor de oxígeno particularmente preferido es tioxeno C-28, que tiene la siguiente fórmula:
Fórmula 7
EJEMPLO: PREPARACIÓN DE UN COMPONENTE DE GENERACIÓN SIMPLE
Una mezcla de 100 ml de solución al 10% de cuentas de látex carboxiladas (de Seradyn), 138 ml de 1-metoxi-2propanol, 280 ml de agua destilada y 10 ml de NaOH 0,1 M se pone en un matraz de tres bocas equipado con un agitador mecánico y un termómetro. La mezcla se lleva hasta 80°C con agitación. A continuación se prepara una solución separada con 2 g de tioxeno C-28 y 2,7 g de Eu(NHA)3DPP en 220 ml de 1-metoxi-2-propanol, y la solución se calienta hasta 80°C con agitación hasta que se disuelve. La solución de colorante se vierte a continuación en la solución de cuentas y se agita durante 30 min. a 80°C y a continuación se deja enfriar lentamente hasta 40°C. Las cuentas se lavan a continuación mediante diafiltración con etanol al 10% v/v en agua ajustada hasta pH 10 con NaOH. Las cuentas se concentran a continuación hasta aproximadamente 20 mg/ml durante el lavado, y a continuación se almacenan a 4°C protegidas de la luz.
20 mg/ml)se
׽ El revestimiento de aminodextrano se aplica a continuacióncomosigue. 1 ml de las cuentas teñidas (
mezcla con 20 mg/ml de hidroxipropilaminodextrano (PM 500K) en MES 0,05M / pH 6,0 en presencia de 3,8 mg/ml de EDAC. Después de incubar esta mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente (en la oscuridad) las cuentas se lavaron una vez con 2 ml de MES 0,05M / pH 6,0, a continuación con 6 ml de MES 0,05M, NaCl 1,0M / pH 6,0. Finalmente, las cuentas se resuspendieron en 1 ml de MES 0,05M / pH 6,0 para dar las cuentas revestidas. El lavado se realizó mediante el método de centrifugación (usando una centrífuga Sorval RC-5B Plus o una centrífuga 5415 C de Ependorf) y las pellas se resuspendieron mediante sonicación (usando Branson Sonifer-450).
La capa de dextranoaldehído pueden añadirse a continuación como sigue. 1 ml del dextranoaldehído a 20 mg/ml en MES 0,05M se mezcla con 1 ml de las cuentas revestidas con aminodextrano en presencia de 2 mg/ml de NaBH3CN. Después de incubar a 37°C durante 20 horas (en la oscuridad), las cuentas se lavaron una vez con 4 ml y a continuación con otros 5 ml de tampón de MES. Las cuentas se resuspendieron en 0,5 ml de MES 0,05M, Tween20 al 0,4% / pH 6,0 para dar aproximadamente 40 mg/ml de cuentas revestidas.
EJEMPLO COMPARATIVO 1
Un primer grupo de partículas de látex se tiñó con Eu(NTA)3DPP y tioxeno y se revistió con un aminodextrano según los métodos descritos en la presente memoria. Asimismo, un segundo grupo de partículas de látex se tiñó con Eu(NHA)3DPP y tioxeno y se revistió con un aminodextrano.
Para cada una de las composiciones, las densidades del revestimiento de aminodextrano y la quimioluminiscencia de midieron simultáneamente a varias concentraciones del quelato metálico. La densidad del revestimiento de aminodextrano se midió mediante una prueba colorimétrica después de tratarse con antrona y ácido sulfúrico al 80%. La quimioluminiscencia se midió en recuentos de LOCI mediante un lector Envision-Alpha vendido por Perkin-Elmer. Los puntos de datos para Eu(NTA)3DPP se tabulan en la Tabla 1 y se muestran gráficamente con ajuste de curva en la FIG. 3. Los puntos de datos para Eu(NHA)3DPP se tabulan en la Tabla 2 y, para concentraciones hasta 0,094, se muestran gráficamente con ajuste de curva en la FIG. 4.
Tabla 1: Recuentos de LOCI y concentraciones de aminodextrano como una función de la concentración de europio en Eu(NTA)3DPP
Eu (mmol/g de cuentas)
Revestimiento de aminodextrano (µg/mg de cuentas) Señal de LOCI, recuentos de MM
0,169
30 9,7
0,085
36 9,2
0,042
45 6,7
0,021
55 2,8
0,000
62 0,0
Tabla 2: Recuentos de LOCI y concentración de aminodextrano como una función de la concentración de europio en Eu(BHHT)2DPP
Eu (mmol/g de cuentas)
Revestimiento de Andex (µg/mg de cuentas) Señal de LOCI, recuentos de MM
0,020
3,8 60
0,028
5,3 57
0,035
6,6 55
0,043
7,7 53
0,050
8,6 51
0,057
9,4 50
0,065
10,0 49
0,072
10,5 49
0,079
10,8 49
0,087
10,9 50
0,094
10,8 50
0,0135*
10,8* 50*
* resultados no mostrados en la FIG. 4
Como puede observarse a partir de la FIG. 3, en la composición de la técnica anterior, la carga de aminodextrano y la señal de LOCI no podrían mantenerse simultáneamente estables para la respuesta con respecto a la composición. La señal de respuesta no empieza a ser estable hasta aproximadamente 0,085 mmol de Eu / gramo de
10 cuentas. A concentraciones superiores, la concentración del revestimiento de aminodextrano está solo a 36 µg/mg de cuentas, y continúa descendiendo con concentraciones crecientes de europio.
En contraste, según se muestra en la FIG. 4, el compuesto según la presente invención empieza a ser estable tanto con respecto a la concentración de aminodextrano como a la señal de LOCI con tan poco como 0,065 mmol de Eu / gramo de cuentas. A esta concentración, la concentración media del revestimiento de aminodextrano es 49 µg/mg
15 de cuentas. Por otra parte, la concentración de aminodextrano generalmente se mantiene estacionaria a medida que se incrementa la concentración de europio.
EJEMPLO COMPARATIVO 2
Cuentas de látex de Seradyn se tiñeron con 0,171 mmol de colorante de europio y 0,303 mmol de tioxeno C-28 por gramo de cuenta para cada uno de dos colorantes convencionales, Eu(TTA)3DPP y Eu(NTA)3DPP, y dos colorantes
20 según la presente invención, Eu(BHHT)2DPP y Eu(NHA)3DPP. A continuación, las cuentas se revistieron con aminodextrano según se describe en la presente memoria. Las densidades del aminodextrano se determinaron a continuación, así como la amplitud de su señal de respuesta. Los datos se tabulan en la Tabla 3.
Todos los componentes de generación de señales proporcionaban una señal adecuada, según se medía mediante recuentos de LOCI. Sin embargo, los colorantes de la presente invención dan un intervalo significativamente superior de densidades de revestimiento de aminodextrano.
Tabla 3: Densidad del Revestimiento de Aminodextrano de Partículas Teñidas con Complejos de Europio
Tipo de Colorante
Densidades del revestimiento de aminodextrano (µg/mg de cuenta) Recuentos de LOCI (MM)
Eu(TTA)3DPP
21-44 8,4-13,3
Eu(NTA)3DPP
30-47 6,8-9,6
Eu(BHHT)2DPP
63-69 9,9-10,3
Eu(NHA)3DPP
48-60 5,9-9,1

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición adecuada para el uso como un componente de generación de señales en un inmunoensayo, que comprende: un vehículo revestido con un aminodextrano, teniendo un promedio la densidad del revestimiento de 5 aminodextrano de al menos 45 µg por miligramo de vehículo y teniendo incorporado en el mismo, a una concentración de al menos 0,065 mmol por gramo de vehículo, un complejo que tiene la fórmula:
    M (L1)x(L2)y, en la que M es un metal seleccionado del grupo que consiste en europio, terbio, disprosio, samario, osmio y rutenio;
    10 L1 es un ligando seleccionado del grupo que consiste en DPP, TOPO, TPPO; L2 comprende un ligando que tiene la fórmula
    Fórmula 1
    en la que R es uno o más sustituyentes, comprendiendo cada sustituyente un grupo donante de electrones;
    15 n = 2-10; x = 1-2; e y = 2-4.
  2. 2. La composición según la reivindicación 1, en la que cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilos C1 a C6, dialquilaminas, éteres, tioéteres y arilos.
    20 3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en la que M comprende europio.
  3. 4.
    La composición según la reivindicación 3, en la que el vehículo comprende una partícula de látex.
  4. 5.
    La composición según la reivindicación 1, en la que n = 3.
  5. 6.
    La composición según la reivindicación 2, en la que x = 1 e y = 3.
  6. 7.
    La composición según la reivindicación 1, en la que n = 7.
    25 8. La composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que L2 comprende un ligando seleccionado del grupo que consiste en
    Fórmula 2
    Fórmula 3
    Fórmula 4
    y
    Fórmula 5
    Fórmula 6.
  7. 9. La composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el revestimiento comprende además una segunda capa que comprende un dextranoaldehído.
    5 10. La composición según una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el vehículo comprende además un aceptor de oxígeno.
  8. 11. Un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el analito, comprendiendo el método:
    realizar un inmunoensayo usando la composición según la reivindicación 1 como un componente generador 10 de señales.
  9. 12.
    El método según la reivindicación 11, en el que el inmunoensayo comprende un inmunoensayo luminiscente de canalización de oxígeno.
  10. 13.
    La composición según la reivindicación 1, en la que el complejo está presente en la cantidad de 0,065 mmol por gramo a 0,150 mmol por gramo de vehículo.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2092084B1 (en) * 2006-11-13 2016-02-24 PerkinElmer LAS, Inc. Detecting molecular interactions
CA2943923C (en) 2008-04-29 2018-02-06 Psychemedics Corporation Solid phase multi-analyte assay
US8084215B2 (en) 2008-04-29 2011-12-27 Psychemedics Corporation Non-proteolytic method for the determination of analytes in keratinized structures
US9347947B2 (en) 2009-03-12 2016-05-24 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent
EP2230515B1 (en) * 2009-03-16 2014-12-17 Agilent Technologies, Inc. Passivation of surfaces after ligand coupling
US8153442B2 (en) * 2009-10-21 2012-04-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of signal generation in particles used in assays
WO2012009721A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Elitech Holding B.V. Orthogonal nucleic acid affinity pairs
US20140004534A1 (en) 2012-06-28 2014-01-02 Psychemedics Corporation Detection of analytes in hair wash samples

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4283382A (en) * 1977-12-28 1981-08-11 Eastman Kodak Company Fluorescent labels comprising rare earth chelates
US4220450A (en) * 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
SE425439B (sv) * 1981-04-30 1982-09-27 Wallac Oy Immunologisk analys med lantanidkelatkomplex som markor
US4637988A (en) * 1981-07-01 1987-01-20 Eastman Kodak Company Fluorescent labels for immunoassay
SE454115B (sv) * 1982-09-13 1988-03-28 Wallac Oy Homogenfasanalys med lantanidkelat som merksubstans
US6165729A (en) * 1986-04-30 2000-12-26 Hyperion Catalysis International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US4925804A (en) * 1986-06-17 1990-05-15 Baxter International Inc. Interligand metal transfer assay
US4978625A (en) * 1987-10-19 1990-12-18 Becton, Dickinson And Company Fluorescence immunoassay using water insoluble dyes
US5639620A (en) * 1990-10-31 1997-06-17 Coulter Corporation Polymeric particles having a biodegradable gelatin or aminodextran coating and process for making same
US5466609A (en) * 1990-10-31 1995-11-14 Coulter Corporation Biodegradable gelatin-aminodextran particle coatings of and processes for making same
FI88654C (fi) * 1991-03-15 1993-06-10 Datacity Center Oy Fluorescenshoejningsmetod
US5578498A (en) * 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
ATE246360T1 (de) * 1991-05-22 2003-08-15 Dade Behring Marburg Gmbh Partikel, die eine zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende verbindung umfassen
JP3464798B2 (ja) * 1992-07-31 2003-11-10 デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 光活性化化学発光基質
US6399397B1 (en) * 1992-09-14 2002-06-04 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
JP2000019171A (ja) * 1998-04-28 2000-01-21 Kazuko Matsumoto 標識プローブによる分析方法
US6080839A (en) * 1998-06-25 2000-06-27 Wallac Oy Labeling reactants and their use
US6389318B1 (en) 1998-07-06 2002-05-14 Abiomed, Inc. Magnetic shield for primary coil of transcutaneous energy transfer device
JP3497092B2 (ja) * 1998-07-23 2004-02-16 名古屋大学長 プラズマ密度情報測定方法、および測定に用いられるプローブ、並びにプラズマ密度情報測定装置
EP1141404A1 (en) * 1998-12-24 2001-10-10 Aclara BioSciences, Inc. Individually addressable solid surfaces for multiplexed operations
US20010055776A1 (en) * 2000-02-11 2001-12-27 Dale Greenwalt High throughput cell-based assay kits
EP1264181B1 (en) * 2000-03-06 2007-06-06 Dade Behring Marburg GmbH Carriers coated with polysaccharides, their preparation and use
JP2001249131A (ja) * 2000-03-07 2001-09-14 Mitsubishi Chemicals Corp 標識微粒子およびその製造方法
US6339397B1 (en) * 2000-06-01 2002-01-15 Lat-Lon, Llc Portable self-contained tracking unit and GPS tracking system
US20030133972A1 (en) * 2000-10-11 2003-07-17 Targesome, Inc. Targeted multivalent macromolecules
JP2002181816A (ja) * 2000-12-08 2002-06-26 Univ Waseda 二本鎖核酸の検出試薬と二本鎖核酸検出方法
EP1409735A4 (en) 2001-06-25 2005-10-05 Georgia Tech Res Inst DOUBLE-RESONANCE ENERGY TRANSFER NUCLEIC PROBES
US7053249B2 (en) * 2002-10-25 2006-05-30 Idexx Laboratories, Inc. Metal chelates and methods of using them for time-resolved fluorescence
US20070106674A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-10 Purusharth Agrawal Field sales process facilitation systems and methods

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