ES2391079T3

ES2391079T3 - SENP1 como marcador de cáncer

Info

Publication number: ES2391079T3
Application number: ES10175616T
Authority: ES
Inventors: Nancy Schoenbrunner; Russell Gene Higuchi; Cherie Holcomb
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2025-05-04
Also published as: ATE469986T1; EP2258876B1; EP1761640A1; CA2564484A1; EP2258876A1; US20060014171A1; JP4729038B2; EP2110439B1; US7776539B2; ES2464719T3; US7939251B2; DE602005021634D1; JP2008500028A; WO2005108603A1; ES2345720T3; EP1761640B1; EP2110439A1; US20090162846A1; CA2564484C

Abstract

Método para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica, en el que la expresión de SENP1 se encuentra incrementada en dicha muestra en comparación con una muestra que es conocido o se sospecha que no contiene células de cáncer, comprendiendo el método las etapas de determinar la cantidad de SENP1 mediante la detección del ARNm codificante de SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta o que se sospecha que presenta cáncer renal.

Description

SENP1 como marcador de cáncer.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para detectar células de cáncer mediante la detección de la cantidad de SENP1 y/o telomerasa en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mayoría de células en el cuerpo humano adulto normal no se divide. Sin embargo, las células de cáncer escapan a la regulación del crecimiento y se dividen sin restricciones. Para ello, deben replicar sus cromosomas, incluyendo los extremos de estos cromosomas, denominados telómeros. La activación del enzima, la telomerasa, que añade secuencia telomérica a los extremos cromosómicos (revisado en Collins K., Curr. Opin. Cell Biol. 12:378-383, 2000) puede superar dicha senescencia. Ver Bodnar A.G., Science 279:349-352, 1998; revisado en De Lange T., Science 279:334-335, 1998. Las líneas celulares con telomerasa activa se inmortalizan. In vivo, las células anteriormente senescentes con telomerasa activa crecen para convertirse en tumores. La actividad de telomerasa se ha detectado en esencialmente la totalidad de los tipos principales de cáncer (Shay J.W. y Bacchetti S., Eur. J. Cancer 33:787-791, 1997; Cong Y.S., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:407-425, 2002). Hanahan y Weinberg consideran la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa como uno de los seis sucesos clave comunes al cáncer (Cell 100:57-70, 2000). La expresión de los genes codificantes de la telomerasa (TERT y TERC) se ha propuesto como marcador molecular para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico del cáncer.

La patente WO nº 2004/031412 da a conocer que SENP1 se encuentra regulado negativamente en el cáncer pancreático. La patente WO nº 01/22920 da a conocer ADNc codificante de antígeno de cáncer de colon humano con SEC ID nº 1655, que corresponde al 100% de SENP1 entre los nt. 427 y 789. La patente US nº 6.596.527 da a conocer la SEC ID nº 1, que es idéntica a SENP1 y, además, un método para identificar los moduladores de SENP1. La patente WO nº 01/09292 da a conocer las secuencias de ácidos nucleicos y proteicas de SENP1. Las patentes US nº 2004/0029114 y WO nº 2004/031414 da a conocer SENP1 en relación al cáncer de mama y al cáncer de próstata, respectivamente. La patente EP nº 1.108.789 da a conocer métodos y reactivos para cuantificar la expresión de ARN de hTERT, que resulta útil para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. Hiroyuki, A. et al., Oncogene 23:3495-3500, 2004, da a conocer que el gen Niban se expresa comúnmente en carcinomas renales y que podría ser un nuevo marcador de la carcinogénesis renal. Sin embargo, no todos los tumores de un tipo de cáncer dado contienen niveles detectables de actividad de la telomerasa. Ver, por ejemplo, Shay, J.W. y Bacchetti, S. Eur. J. Cancer, 33:787-791, 1997); Yan P. et al. Cancer Res. 59:3166-3170, 1999. Por lo tanto, resulta importante identificar los marcadores moleculares que identifican los tumores inmortalizados por un mecanismo independiente de telomerasa.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona datos que demuestran que existe una asociación entre el cáncer de vejiga y la cantidad de expresión de SENP1. De esta manera, SENP1 proporciona un marcador útil para la detección del cáncer renal.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar la cantidad de SENP1 en una muestra biológica de un individuo que presenta o que se sospecha que presenta cáncer renal.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar la cantidad de SENP1 en una muestra biológica de un individuo y el registro de un diagnóstico de cáncer renal. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar la cantidad de SENP1 en una muestra biológica de un individuo, en los que se selecciona la muestra biológica de entre el grupo que consiste de una biopsia renal y una muestra de heces. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además registrar un diagnóstico de cáncer renal.

En algunas realizaciones, el método comprende además la obtención de la muestra biológica a partir del individuo.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además registrar un diagnóstico de cáncer renal.

En algunas realizaciones, la cantidad de SENP1 se detecta mediante la detección de un polinucléotido codificante de SENP1 en la muestra. En algunas realizaciones, se determina la secuencia de los polinucleótidos. En algunas realizaciones, la etapa de detección comprende amplificar el polinucleótido en una reacción de amplificación. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes, comprendiendo una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación cuantitativa. En algunas realizaciones se detecta el producto de amplificación de la reacción de amplificación en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el producto. En algunas realizaciones, el oligonucleótido detectablemente marcado comprende una fracción fluorescente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo desactivador. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación comprende una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR). En algunas realizaciones, la reacción de RT-PCR es una reacción de RT-PCR cuantitativa. En algunas realizaciones, se normaliza la cantidad del polinucleótido.

En algunas realizaciones, el método comprende además determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica. En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la detección de la actividad de telomerasa. En algunas realizaciones se detecta la actividad de telomerasa mediante la detección del alargamiento de un oligonucleótido que comprende dos o más repeticiones de TTAGG.

En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la detección de un componente de la telomerasa en la muestra. En algunas realizaciones, el componente es ARN de telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el componente es proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT). En algunas realizaciones, se detecta telomerasa mediante la detección de ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa inversa (TERT). En algunas realizaciones, el método comprende amplificar un polinucleótido SENP1 y un polinucleótido telomerasa en una reacción de amplificación multiplex. En algunas realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARN de telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT). En algunas realizaciones, el método comprende además comparar la cantidad de SENP1 y telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y una estándar de telomerasa, respectivamente, en la que el estándar de SENP1 representa SENP1 en células no de cáncer y el estándar de telomerasa representa cantidades de telomerasa en células no de cáncer. En algunas realizaciones, los estándares son valores predeterminados.

En algunas realizaciones el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el método comprende además registrar un pronóstico para el tratamiento del cáncer y/o la supervivencia del individuo. En algunas realizaciones, el método comprende además registrar la progresión del cáncer en el individuo.

La presente exposición se refiere además a métodos para identificar un antagonista de SENP1. En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto una pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1, en donde la célula no expresa telomerasa y la célula expresa un fenotipo neoplásico, y seleccionar un agente que inhibe un fenotipo neoplásico, identificando de esta manera un antagonista de SENP1. En algunas realizaciones, la célula no expresa TERT. En algunas realizaciones, los métodos comprende además someter a ensayo el efecto del agente seleccionado sobre células de cáncer seleccionadas de entre el grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer pancreático y cáncer de intestino delgado. En algunas realizaciones, el fenotipo neoplásico es crecimiento celular neoplásico. En algunas realizaciones, el fenotipo neoplásico es la expresión de un polipéptido o ARN asociado al crecimiento neoplásico. En algunas realizaciones, la célula expresa endógenamente SENP1. En algunas realizaciones, la célula comprende un casete de expresión exógena codificante de SENP1.

La presente exposición se refiere además a métodos de tratar un individuo que presenta un cáncer. En algunas realizaciones, los métodos comprenden administrar en un ser humano una cantidad terapéutica de un antagonista de SENP1, en donde el individuo presenta un cáncer caracterizado por la expresión incrementada de SENP1 en comparación con las células no de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de intestino delgado. En algunas realizaciones, el antagonista se identifica mediante las etapas de: poner en contacto una pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1, en donde la célula no expresa telomerasa y la célula expresa un fenotipo neoplásico, y seleccionar un agente que inhibe un fenotipo neoplásico, identificando de esta manera un antagonista de SENP1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista de SENP1 y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones se proporciona un antagonista de SENP1 para la utilización en medicina. En algunas realizaciones se utiliza un antagonista de SENP1 en la preparación de un medicamento o para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer, en particular de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y cáncer de intestino delgado. Resulta particularmente preferente el cáncer de vejiga.

La presente invención se refiere además a inhibidores de la actividad de proteasa SENP1. En algunas realizaciones, los inhibidores comprenden una secuencia de aminoácido que comprende Glu-Gln-Thr-Gly-Gly, o un mimético de la misma, en donde la Gly final termina en un aldehído. En algunas realizaciones el inhibidor comprende una secuencia de señal de localización nuclear. En algunas realizaciones la secuencia de señal de localización nuclear comprende Pro-Lys-Lys-Thr-Gln-Arg-Arg.

La presente invención proporciona además la determinación de la cantidad de SENP1 y de telomerasa en una muestra biológica procedente de un individuo. En algunas realizaciones, la cantidad de SENP1 se detecta mediante la detección de un polinucléotido codificante de SENP1 en la muestra. En algunas realizaciones el polinucleótido es ARN.

En algunas realizaciones, se determina la secuencia del polinucleótido. En algunas realizaciones, la etapa de detección comprende amplificar el polinucleótido en una reacción de amplificación. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación comprende por lo menos dos oligonucléotidos diferentes que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación cuantitativa. En algunas realizaciones se detecta el producto de amplificación de la reacción de amplificación en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el producto. En algunas realizaciones, el oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo fluorescente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo desactivador. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación comprende una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.

En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR). En algunas realizaciones, la reacción de RT-PCR es una reacción de RT-PCR cuantitativa.

En algunas realizaciones, se normaliza la cantidad del polinucleótido.

En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la detección de la actividad de telomerasa. En algunas realizaciones se detecta la actividad de telomerasa mediante la detección del alargamiento de un oligonucleótido que comprende dos o más repeticiones de TTAGG.

En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la detección de un componente de la telomerasa en la muestra. En algunas realizaciones, el componente es ARN de telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el componente es proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT).

En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la detección de ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa (TERT).

En algunas realizaciones, el método comprende amplificar un polinucleótido SENP1 y un polinucleótido de telomerasa en una reacción de amplificación multiplex. En algunas realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARN de telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT).

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y un estándar de telomerasa que representan las cantidades de SENP1 y de telomerasa en las células normales. En algunas realizaciones, los estándares son valores predeterminados.

En algunas realizaciones el individuo es un ser humano.

En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende un líquido corporal. En algunas realizaciones, el líquido corporal es sangre. En algunas realizaciones, el líquido corporal es orina. En algunas realizaciones, la muestra procede de una biopsia de tejido. En algunas realizaciones, el método comprende además obtener una muestra biológica de un individuo.

En algunas realizaciones, el individuo presenta, o se sospecha que presenta cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer renal.

En algunas realizaciones, el método comprende además registrar un diagnóstico de la presencia o ausencia de cáncer en el individuo. En algunas realizaciones, el método comprende además registrar un pronóstico para el tratamiento del cáncer y/o la supervivencia del individuo. En algunas realizaciones, el método comprende además registrar la progresión del cáncer en el individuo. En algunas de dichas realizaciones, el cáncer es cáncer renal.

La presente exposición proporciona además kits para detectar una célula de cáncer en una muestra biológica de un individuo. En algunas realizaciones, el kit comprende:

a) por lo menos un oligonucleótido comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que al someter el oligonucleótido y un polinucleótido que comprende la SEC ID nº 1, a una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento de la SEC ID nº 1, b) un oligonucleótido marcado detectablemente que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, c) por lo menos un oligonucleótido que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de:

i) ARN de telomerasa humana (TERC),

ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),

iii) un complemento de TERC, o iv) un complemento de TERT,de manera que, al someter TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de TERT, y d) un oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por

lo menos 10 nucleótidos contiguos de: i) ARN de telomerasa humana (TERC), ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERC), iii) un complemento de TERC, o iv)

un complemento de TERT. En algunas realizaciones, los kits comprenden por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, al someter los oligonucleótidos y un polinucleótido que comprende la SEC ID nº 1 a una reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1, y por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a

por lo menos 10 nucleótidos contiguos de: i) ARN de telomerasa humana (TERC), ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT), iii) un complemento de TERC, o iv) un complemento de TERT,

de manera que, al someter los oligonucleótidos y TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, los

oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de TERT. En algunas realizaciones, el kit comprende además transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, el kit comprende además una ADN polimerasa termoestable.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido detectablemente marcado comprende una fracción fluorescente. En

algunas realizaciones, los oligonucleótidos detectablemente marcados comprenden una fracción desactivadora. La presente exposición proporciona además una mezcla de reacción. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende:

a) por lo menos un oligonucleótido que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% apor lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que al someter el oligonucleótido y un polinucleótido que comprende la SEC ID nº 1, a una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento de la SEC ID nº 1, b) un oligonucleótido marcado detectablemente que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, c) por lo menos un oligonucleótido que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de:

i) ARN de telomerasa humana (TERC), ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT), iii) un complemento de TERC, o

iv) un complemento de TERT, de manera que, al someter el oligonucleótido y TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de TERT, y

d) un oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de: i) ARN de telomerasa humana (TERC), ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT), iii) un complemento de TERC, o iv) un complemento de TERT,

En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, al someter los oligonucleótidos y un polinucleótido que comprende la SEC ID nº 1 a una reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1, y por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de:

i) ARN de telomerasa humana (TERC),

ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),

iii) un complemento de TERC, o

iv) un complemento de TERT,

de manera que, al someter los oligonucleótidos y TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de TERT.

En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además una ADN polimerasa termoestable. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además los oligonucleótidos detectablemente marcados que comprenden un grupo fluorescente. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además los oligonucleótidos detectablemente marcados que comprenden una fracción desactivadora.

En algunas realizaciones, se normaliza la cantidad del polinucleótido.

En algunas realizaciones el individuo es un ser humano.

En algunas realizaciones, el individuo presenta, o se sospecha que presenta cáncer.

En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer renal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0050]

La figura 1 ilustra una curva de receptor-operador de SENP1 normalizado a la proteína fosfatasa 1 de gen de mantenimiento, subunidad catalítica, isoforma alfa (PPP1CA).

Las figuras 2A y 2B ilustran el nivel de expresión de SENP1 y de TERT respecto a la expresión ajustada de GAPDH en tejido renal normal y tejido renal tumoral. Para facilitar la representación de los datos en el gráfico a la misma escala, la expresión de TERT se ha multiplicado por un factor de 1x104. Se observa que la muestra nº 3 presenta un valor que se sale de la escala lineal mostrada.

DEFINICIONES

"SENP1" se refiere al polipéptido proteasa específico de sentrina/SUMO o a un polinucleótido codificante del polipéptido. Entre los polinucleótidos de SENP1 ejemplares se incluyen, por ejemplo, el número de acceso de Genbank NM_014554 (SEC ID nº 1). Entre los polipéptidos SENP1 ejemplares se incluyen, por ejemplo, el polipéptido ilustrado en el número de acceso Genbank NP_055369 (SEC ID nº 2). 2). El término "SENP1" pretende incluir las variantes alélicas de aquellas secuencias específicamente proporcionadas en la presente memoria, así como los fragmentos y mutaciones de las mismas. Los polinucleótidos SENP generalmente son idénticas por lo menos al 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID nº 1, o idénticas al 90%, 95% ó 99% a las secuencias de ADN codificantes de la secuencia SEC ID nº 2. Entre los polinucleótidos de SENP1 se incluyen, por ejemplo, ARNm codificante de polipéptidos SENP1, así como secuencias de ADN (por ejemplo de ADNc o de ARN genómico) codificante de polipéptidos SENP1. Los polipéptidos SENP1 generalmente son idénticos por lo menos al 90%, 95% ó 99% a la SEC ID nº 2.

El término "telomerasa" se refiere a un complejo riboproteico que mantiene los extremos de los cromosomas (los telómeros) o polinucleótidos codificantes de componentes de la riboproteína. Ver, por ejemplo, Shippen-Lentz et al., Science 247:546, 1990; Greiden et al., Nature 337:331, 1989. La telomerasa incluye dos componentes principales: la proteína transcriptasa inversa de la telomerasa (codificada por el gen TERT) y el componente ARN de la telomerasa (codificado por el gen TERC). Los componentes humanos equivalentes se conocen como TERT (por ejemplo la secuencia de proteína: NP_003210 (SEC ID nº 3), codificada por, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos: NM_003219 (SEC ID nº 4)) y TERC (NR_001566 (SEC ID nº 5)). Las variantes de procesamiento del ARN codificante de TERT pretenden encontrarse comprendidas dentro de esta definición.

La expresión "poner en contacto una pluralidad de agentes con una célula" se refiere a poner en contacto por lo menos dos agentes con una célula o células. Aunque pueden ponerse en contacto múltiples agentes con una célula o grupo de células, la expresión también comprende poner en contacto un primer agente con una primera célula o grupo de células, y un segundo agente con una segunda célula o grupo de células, por ejemplo de manera que cada célula o grupo de células se ponga en contacto con un único agente.

La expresión "determinar la cantidad de SENP1 o de telomerasa" se refiere a utilizar cualquier técnica conocida por el experto en la materia para cuantificar la cantidad de SENP1 ó polipéptido o polinucleótido de telomerasa (por ejemplo ARN estructural, ARNm o ADNc), o SENP1 o actividad de telomerasa en una muestra.

Un "fenotipo neoplásico" se refiere al fenotipo de una célula neoplásica. Entre los fenotipos ejemplares se incluyen, por ejemplo, el crecimiento celular en agar blando; la independencia de anclaje; la inhibición por contacto reducida y/o la limitación por densidad del crecimiento; la proliferación celular; la transformación celular; la independencia de factor de crecimiento o del suero; la acumulación de niveles de marcador específico de tumor; la invasividad en Matrigel; el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo; los patrones de ARNm y de expresión de proteínas de células que experimentan metástasis, y otras características de las células de cáncer.

Una "reacción de amplificación" se refiere a cualquier reacción (por ejemplo química o enzimática) que resulta en un número incrementado de copias de una secuencia molde de ácidos nucleicos o un nivel incrementado de señal que indica la presencia del ácido nucleico molde. Las expresiones "amplificación selectiva" o "amplificar selectivamente" se refieren a la amplificación de secuencias particulares en una población de secuencias.

La expresión "muestra biológica" comprende una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un organismo y puede utilizarse en un ensayo diagnóstico o de seguimiento. La expresión comprende orina, sedimento urinario, sangre, saliva y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. La expresión comprende muestras que han sido manipuladas de cualquier manera tras su recolección, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento para determinados componentes. La expresión comprende una muestra clínica, y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquidos corporales y muestras de tejido.

Un "antagonista" se refiere a una molécula que, al ponerse en contacto con una célula que expresa SENP1, inhibe la actividad o expresión de SENP1. Los antagonistas son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente una actividad, reducen, impiden, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la actividad o expresión de SENP1.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "ácido nucleico", "nucleótido", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas, fragmentos oligómeros que deben detectarse, controles oligómeros y oligómeros de bloqueo no marcados y es genérico para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), de polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y de cualquier otro N-glucósido de una base purina o pirimidina, o bases purina o pirimidina modificadas.

Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede comprender enlaces fosfodiéster o enlaces modificados, incluyendo, aunque sin limitación, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato puente, fosfonato de metileno puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato puente o enlaces sulfona, y combinaciones de dichos enlaces. Las expresiones comprenden ácidos nucleicos de péptidos (APN) y ácidos nucleicos intercalados (INA).

Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede comprender las cinco bases biológicamente naturales (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o otras bases aparte de las cinco bases biológicamente naturales. Estas bases pueden presentar varios propósitos, por ejemplo estabilizar o desestabilizar la hibridación; estimular o inhibir la degradación de una sonda; o como puntos de unión para grupos detectables o grupos desactivadores. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más grupos de bases modificadas, no estándares o derivatizadas, incluyendo, aunque sin limitación, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-benciladenina, imidazol, imidazolas sustituidas, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, β-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, β-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N62-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w,2,6-diaminopurina y 5-propinilpirimidina. Pueden encontrarse otros ejemplos de grupos de base modificados, no estándares o derivatizados en las patentes US nº 6.001.611, 5.955.589, 5.844.106, 5.789.562, 5.750.343, 5.728.525 y 5.679.785, cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

Además, un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede comprender uno o más grupos sacáridos modificados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

No se pretende que la presente invención se encuentra limitada por la fuente de un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido. Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede proceder de un mamífero humano o no humano, o de cualquier otro organismo, o derivarse a partir de cualquier fuente recombinante, sintetizarse in vitro u obtenerse mediante síntesis química. Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede ser ADN, ARN, ADNc, ADN-ARN, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de péptido (APN), un híbrido o una mezcla de los mismos, y puede existir en una forma de doble cadena, de una sola cadena o parcialmente de doble cadena. Entre los ácidos nucleicos de la invención se incluyen tanto ácido nucleicos como fragmentos de los mismos, en formas purificadas o no purificadas, incluyendo genes, cromosomas, plásmidos, los genomas de material biológico, tal como microorganismos, por ejemplo bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos y similares.

No se pretende realizar ninguna distinción de longitud entre las expresiones ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido y oligonucleótido, y estas expresiones se utilizarán intercambiablemente. Estas expresiones incluyen ADN de doble cadena y de una cadena, así como ARN de doble cadena y de una cadena. Aunque los oligonucleótido pueden presentar cualquier longitud, pueden presentar menos de 500 nucleótidos, por ejemplo 5 a 100, 10 a 100, 10 a 30, 15 a 30 ó 15 a 50 nucleótidos.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de residuos aminoácidos. Las expresiones se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y a miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados en el código genético, así como aquellos aminoácidos que resultan modificados posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que presentan la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono que se encuentra unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina y metilsulfonio de metionina. Dichos análogos presentan grupos R modificados (por ejemplo norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica del aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que presentan una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido natural.

Se puede hacer referencia a los aminoácidos en la presente memoria por sus comúnmente conocidos símbolos de tres letras, o por los símbolos de una letra recomendados por la comisión de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB. De manera similar, puede hacerse referencia a los nucleótidos por sus códigos de una letra comúnmente aceptados.

La expresión "se hibrida selectivamente (o específicamente)" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula predominantemente (por ejemplo por lo menos 50% de la molécula hibridante) con una secuencia particular de nucleótidos bajo condiciones astringentes de hibridación encontrándose presente la secuencia en una mezcla compleja (por ejemplo ADN o ARN total celular o de una biblioteca). Los polinucleótidos cebadores se hibridan específicamente a un polinucleótido molde en una reacción de amplificación (por ejemplo a una temperatura de hibridación de aproximadamente 60ºC) al amplificar los cebadores el molde en una mezcla de reacción que comprende una mezcla compleja de polinucleótidos (por ejemplo aislado a partir de una célula) para producir un producto de amplificación que es por lo menos el producto de amplificación más predominante Y preferentemente el único producto de amplificación significativo (por ejemplo que represente por lo menos 90% a 95% de todos los productos de amplificación en la muestra) de la reacción.

La expresión "condiciones astringentes de hibridación" se refiere a condiciones bajo las que una sonda se hibridará predominantemente a su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa de la hibridación de los ácidos nucleicos es Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, se selecciona que las condiciones astringentes sean aproximadamente 5-10ºC inferiores al punto de fusión térmica (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, pH y concentración de ácidos nucleicos definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (debido a que las secuencias diana se encuentran presentes en exceso, a la Tm 50% de las sondas se encuentran ocupadas en el equilibrio). Las condiciones astringentes son aquéllas en las que la concentración salina es inferior a aproximadamente 1,0 M de ión sódico, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sódico (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30ºC para las sondas cortas (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y de por lo menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo de más de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones astringentes con la adición de agentes desestabilizadores, tales como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es por lo menos dos veces la señal de fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación de fondo. Unas condiciones de hibridación astringente ejemplares pueden ser las siguientes: formamida al 50%, 5x SSC, y SDS al 1%, incubación a 42ºC, ó 5x SSC, SDS al 1%, incubación a 65ºC, con lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones astringentes todavía son sustancialmente idénticos en el caso de que los polipéptidos codificados sean sustancialmente idénticos. Esto se produce, por ejemplo, en el caso de que se cree una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En estos casos los ácidos nucleicos típicamente se hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente astringentes. Entre las "condiciones de hibridación moderadamente astringentes" ejemplares se incluyen la hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 1X SSC a 45ºC. Una hibridación positiva presenta por lo menos dos veces el nivel de fondo. El experto ordinario en la materia reconocerá fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y de lavado alternativas para proporcionar condiciones de astringencia similares.

Para la PCR, una temperatura de aproximadamente 36ºC es típica para la amplificación de baja astringencia, aunque la temperatura de hibridación puede variar entre aproximadamente 32ºC y 48ºC, dependiendo de la longitud del cebador. Para la amplificación por PCR de alta astringencia, es típica una temperatura de aproximadamente 62ºC, aunque las temperaturas de hibridación de alta astringencia pueden encontrarse comprendidas entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 65ºC, dependiendo de la longitud y especificidad del cebador. Entre las condiciones de ciclado ejemplares para amplificaciones tanto de alta como baja astringencia se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una etapa de desnaturalización de entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 2 minutos a una temperatura de entre 90ºC y 95ºC, una etapa de hibridación de entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 2 minutos a una temperatura de entre 50ºC y 70ºC, y una etapa de extensión de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 70ºC.

El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o de fragmentos del mismo, que se une y reconoce específicamente un antígeno. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la multitud de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, presentando cada pareja una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 ó 110, ó más, aminoácidos que es principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a dichas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Existen anticuerpos, por ejemplo, en forma de inmunoglobulinas intactas, o de varios fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con diversas peptidasas. De esta manera, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo bajo los enlaces disulfuro en la región bisagra, produciendo F(ab')2, un dímero de Fab que él mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El fragmento F(ab')2 puede reducirse bajo condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de esta manera el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (ver Fundamental Immunology (Paul, editor, 3a edición, 1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, el experto en la materia apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo químicamente o mediante la utilización de métodos de ADN recombinante. De esta manera, el término "anticuerpo, tal como se utiliza en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos completos, o los sintetizados de novo utilizando métodos de ADN recombinante (por ejemplo Fv de una sola cadena) o aquellos identificados utilizando bibliotecas de expresión fágica (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990).

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, puede utilizarse cualquier técnica conocida de la técnica (ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cole et al., páginas 77 a 96, en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985). Las técnicas para la producción de anticuerpos de una cadena (patente US nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra un polipéptido de la presente invención. Además, pueden utilizarse ratones transgénicos, u otros organismos, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, puede utilizarse tecnología de expresión fágica para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unan específicamente a antígenos seleccionados (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Marks et al., Biotechnology 10:779-783, 1992). La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo, o "inmunorreactivo específicamente (o selectivamente) con", en referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y de otros compuestos biológicos. De esta manera, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular por lo veces dos veces más que el nivel de fondo, y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales cultivados contra SENP1 para obtener únicamente aquellos anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con SENP1 y no con otras proteínas, excepto por variantes polimórficas y alelos de SENP1. Esta selección puede conseguirse descartando los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con las moléculas de SENP1 procedentes de otras especies o que reaccionan cruzadamente con proteínas que no son SENP1. Puede utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (ver, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, para una descripción de formatos de inmunoensayo y de condiciones que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva presentará por lo menos dos veces la señal de fondo o de ruido, y más típicamente más de 10 a 100 veces la señal de fondo.

Las expresiones "idéntico" o "identidad del 100%" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan la misma secuencia. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas", o presentan un determinado porcentaje de identidad en el caso de que dos secuencias presenten un porcentaje especificado de residuos aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad en una región especificada o, en el caso de que no se especifique, en la totalidad de la secuencia), en la comparación y alineación para máxima correspondencia en una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. La invención proporciona oligonucleótidos que son sustancialmente idénticos a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 ó más nucleótidos contiguos de polinucleótidos SENP1, o polinucleótidos de telomerasa, o complementos de los mismos.

Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa de secuencia de referencia, a la que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de ensayo y de referencia, se designan coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden utilizarse parámetros de programa por defecto, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula los porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de entre varias posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste de entre 5 y 600, habitualmente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, más habitualmente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50, en la que puede compararse una secuencia a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas tras alinearse óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos de la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970, mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 852:2444, 1988, mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Dos ejemplos de algoritmos que resultan adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977, y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. Los programas para llevar a cabo los análisis BLAST se encuentran públicamente disponibles a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar las parejas de secuencias de elevada puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta, que se corresponden o que satisfacen algún umbral de puntuación T de valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Esa palabra vecina inicial actúa como semilla para iniciar búsquedas de HSPs más largas que la contengan. Estas palabras localizadas se extienden en ambas direcciones a lo lago de cada secuencia en la medida en que se incremente la puntuación acumulativa de alineación. Se calculan las puntuaciones acumuladas utilizando, a modo de secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos correspondientes, en todos los casos >0) y N (puntuación de penalización para residuos no correspondientes; en todos los casos <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuaciones para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las palabras localizadas en cada dirección se detiene en cualquiera de los casos siguientes: la puntuación acumulada de puntuación cae en una cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada baja a cero o menos; debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (por "secuencias de nucleótidos") utiliza como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación entre ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3 y un valor esperado (E) de 10, y alineaciones (B) de matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación entre ambas cadenas. Cualquiera de los programas se ejecuta con el filtro de baja complejidad desactivado (en "off").

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5887, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidades mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca al azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la suma de probabilidades mínima en una comparación entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y todavía más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Introducción Sin embargo, no todos los tumores de un tipo de cáncer dado contienen niveles detectables de actividad de la telomerasa. Ver, por ejemplo, Shay J.W. y Bacchetti S., Eur. J. Cancer, 33:787-791, 1997); Yan P. et al. Cancer Res. 59 (1999) 3166-3170. En general, 50% a 100% de los tumores de diferentes tipos presentan una actividad medible de telomerasa (Bryan T.M., Nature Medicine 3:1271-1274, 1997; Kim N.W. et al., Science 266:2011-2015, 1994; Bacchetti

S. y Counter C.M., Int. J. Oncology 7:423-432, 1995). De esta manera, aunque esta falta de detección de actividad de telomerasa podría deberse a una incapacidad para medir niveles bajos, es más probable que la expresión de telomerasa resulte suficiente para causar cáncer, pero que no resulte necesaria. Es decir, algunos tumores podrían no expresar telomerasa activa. En efecto, se ha encontrado que algunas líneas celulares inmortalizadas y tumores son capaces de mantener telómeros sin telomerasa. Ver, por ejemplo, Bryan et al., Nature Medicine 3:1271-1274, 1997; Scheel C. y Poremba C., Virchows Arch 440:573-582, 2002; McEachern M.J. et al., Annu. Rev. Genet. 34:331-358, 2000). Este alargamiento alternativo de los telómeros (ALT), por lo menos en algunos casos, se produce mediante recombinación homóloga (Dunham M.A. et al., Nature Genetics 26:447-450, 2000). Las células epiteliales aparentemente resultan inmortalizadas por ALT mucho menos frecuentemente que los fibroblastos (Bryan T.M. et al., Nature Medicine 3:1271-1274, 1997; Mehle C. et al., Oncogene 13:161-166, 1996).

Resulta interesante que los cánceres en gran parte son de origen epitelial, lo que podría explicar los porcentajes generalmente altos de tumores que son positivos para telomerasa. Si embargo, debido a que los telómeros de los tumores en algunas poblaciones de pacientes se mantienen mediante un mecanismo independiente de telomerasa, esto establece un límite superior a la sensibilidad que puede alcanzarse con cualquier ensayo basado en una telomerasa diseñado para el diagnóstico o el seguimiento de la recurrencia de un cáncer. Determinados tumores escaparían a la detección utilizando una telomerasa como único marcador de cáncer.

Los inventores ha reconocido que existe una necesidad de un método para detectar tumores que no expresan telomerasa. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la expresión incrementada de SENP1 es un marcador útil para identificar cánceres que no presentan niveles detectables de telomerasa. De esta manera, mediante la detección de tanto SENP1 como telomerasa en una muestra, resulta posible detectar un número significativo de cánceres. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para detectar la presencia de células de cáncer renal en una muestra biológica mediante la determinación de la cantidad de SENP1 y telomerasa en la muestra.

Además, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la expresión incrementada de SENP1 resulta un marcador útil para identificar el cáncer renal. Además, los inventores han demostrado que la utilización de tanto SENP1 como la telomerasa como marcadores puede proporcionar una mayor sensibilidad y especificidad para detectar los cánceres renales que la utilización de cualquiera de los marcadores individualmente. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para detectar la presencia de células de cáncer renal en una muestra biológica mediante la determinación de la cantidad de SENP1, y opcionalmente de telomerasa, en la muestra. De esta manera, en algunas realizaciones de la invención se detectan tanto SENP1 como telomerasa, en donde un incremento de cualquiera de los marcadores indica la presencia de cáncer renal.

La presente invención se basa en técnicas rutinarias del campo de la genética recombinante. Entre los textos básicos que dan a conocer métodos generales de utilización en la presente invención se incluyen: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a edición, 2001; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 1990; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., editores, 2002).

II. Detección y cuantificación de SENP1 y/o telomerasa

La presente invención permite utilizar cualquier método de cuantificación de polinucleótidos de SENP1 y/o telomerasa (incluyendo ARNm de SENP1, ADNc de SENP1, ARNm de TERT, ADNc de TERT, ARN de TERC, ADNc de TERC, etc.) y/o polipéptidos SENP1 y/o telomerasa y/o la actividad de SENP1 y/o de telomerasa, conocido por el experto en la materia, secuencial o simultáneamente en un ensayo o en múltiples ensayos. Entre los enfoques ejemplares de la detección de SENP1 o de telomerasa se incluyen, por ejemplo, (a) la detección de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa, incluyendo la utilización de ensayos basados en la hibridación y/o la reacción de amplificación de polinucleótidos, (b) la detección de proteínas SENP1 o telomerasa, incluyendo la utilización de ensayos basados en un agente de afinidad que implican un agente que se une específicamente a un polinucleótido de SENP1 o polipéptido o polinucleótido de telomerasa, y/o (c) la detección o la cuantificación indirecta de las dianas detectadas, es decir SENP1 y telomerasa.

Típicamente, los polinucleótidos o polipéptidos SENP1 asociados a cáncer detectados en la presente invención son por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idénticos a la secuencia SEC ID nº 1 ó a aquellos polinucleótidos codificantes de la secuencia SEC ID nº 2 ó a una o más de las secuencias SENP1 disponibles, por ejemplo de GenBank (ver, por ejemplo, la secuencia de ARNm de SENP en NMR_014554 y el polipéptido SENP1 en NP_055369). De manera similar, los polinucléotidos de telomerasa (por ejemplo ARN de TERT o TERC) o los polipéptidos telomerasa (por ejemplo TERT) detectados en la presente memoria son aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a un polinucleótido o polipéptido de telomerasa. Los polinucleótidos o polipéptidos de SENP o de telomerasa detectados pueden representar formas funcionales o no funcionales del polinucleótido o polipéptido asociado a cáncer, o cualquier variante, derivado o fragmento del mismo. Típicamente, se detecta el nivel y/o presencia de polinucleótidos o polipéptidos asociados a cáncer en una muestra biológica.

Entre los métodos para detectar la expresión de la telomerasa pueden incluirse métodos del mismo tipo utilizado para detectar SENP1 (por ejemplo se detectan polinucleótidos tanto de telomerasa como de SENP1) o diferentes métodos (por ejemplo se detectan polinucleótidos de SENP1 y actividad de telomerasa). Sin embargo, para comodidad del usuario, puede resultar deseable utilizar el mismo ensayo de detección tanto para la telomerasa como para SENP1. Por ejemplo en algunas realizaciones, puede utilizarse una reacción multiplex cuantitativa de transcripción inversa-en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para cuantificar la expresión tanto de SENP1 como de telomerasa en una muestra. En algunas realizaciones, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa en tiempo real.

A. Detección de la expresión de ARNm

Pueden llevarse a cabo ensayos de detección en preparaciones que contienen ARNm o ADNc generado a partir de ARNm aislado de una manera que refleje los niveles relativos de transcritos de ARNm en la muestra. Los métodos para detectar el ARN de telomerasa han sido descritos y pueden adaptarse generalmente para la detección de SENP1. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.582.964; 5.846.723; 6.607.898; publicación de patente US nº 2002/0012969; y Angelopoulou et al., Anticancer Res. 23:4821-4829, 2003.

1. Ensayos basados en la amplificación

a. Métodos de detección

En algunas realizaciones, pueden determinarse los niveles de ARN utilizando reacciones de amplificación, tales como la PCR. Por ejemplo, puede utilizarse uno o más cebadores oligonucleótidos para amplificar una región de un polinucleótido SENP1 (por ejemplo un ADNc de SENP1 o de telomerasa). Entre las reacciones de amplificación que resultan útiles para la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202; PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications (Innit et al., editor, 1990)), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker et al., Nucleic Acids Res. 20:1691-1696, 1992; Walker, PCR Methods Appl. 3:1-6, 1993), la amplificación mediada por la transcripción (Phyffer et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841, 1996; Vuorinen, J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859, 1995), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Compton, Nature 350:91-92, 1995), la amplificación de círculo rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12:75-99, 1999; Hatch et al., Genet. Anal. 15:35-40, 1999), la amplificación de señal de ADN ramificado (ADNb) (ver, por ejemplo, Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13:315-320, 1999, y la replicasa Q-beta (Lizardi et al., Biotechnology 6:1197, 1988).

Aunque puede utilizarse cualquier tipo de reacción de amplificación, en algunas realizaciones se utiliza PCR para amplificar los ADN molde. Los cebadores de PCR típicamente se diseñan para hibridarse específicamente al polinucleótido de SENP1, por ejemplo bajo condiciones utilizadas en una reacción de PCR. Por ejemplo, los cebadores típicamente se hibridan en tampones de PCR estándares (tales como, aunque sin limitación, aquellos que contienen bicina 50 mM, pH 8,0, acetato de potasio 115 mM, glicerol al 8%, acetato de manganeso 3 mM, 200 μM de cada desoxiadenosina trifosfato, desoxicitina trifosfato, desoxiguanosina trifosfato y 500 μM de desoxiuridina trifosfato, 2 unidades de uracil-N-glucosilasa (UNG), 10 unidades de ADN polimerasa, 200 nM de cada cebador, directo e inverso, y opcionalmente una sonda polinucleótida) a aproximadamente 60ºC. Generalmente los cebadores se diseñan y/o se someten a ensayo para evitar una homología o hibridación significativa con otros polinucleótidos probablemente presentes en la muestra biológica (por ejemplo en el genoma humano). También se han descrito y pueden utilizarse métodos alternativos de amplificación (por ejemplo LCR, SDA, RCA, Q-beta, etc.).

En algunas realizaciones, puede detectarse ARN de SENP1 o de telomerasa utilizando transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los métodos de RT-PCR son bien conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., editores, 2002).

Los métodos de amplificación utilizados para detectar polinucleótidos de SENP1 pueden implicar una metodología de PCR cuantitativa tal como, por ejemplo, la PCR en tiempo real, incluyendo la RT-PCR cuantitativa. Se dan a conocer métodos de amplificación cuantitativa en, por ejemplo, las patentes US nº 6.180.349, nº 6.033.854 y nº 5.972.602, así como en, por ejemplo, Gibson et al., Genoma Research 6:995-1001, 1996; DeGraves et al., Biotechniques 34:106-110, 112-115, 2003; Deiman B. et al., Mol. Biotechnol. 20:163-179, 2002). Para cuantificar la cantidad de ARN específico en una muestra, puede generarse una curva estándar a partir de la transcripción run-off de un plásmido que contiene el gen de interés. Pueden generarse curvas estándar utilizando los valores umbral (Ct), determinados en la PCR en tiempo real, que se relacionan con la concentración inicial de ADNc utilizada en el ensayo. Además, puede generarse una curva estándar para un polinucleótido estándar (por ejemplo una secuencia anteriormente cuantificada). Esto permite la estandarización del contenido inicial de ARN de una muestra biológica respecto a la cantidad de estándar con fines comparativos. Ver, por ejemplo, The PCR Technique: Quantitative PCR, J. Larrick (editor), 1997).

Un método para detectar los productos de amplificación es el ensayo de PCR de la 5'-nucleasa (utilizando, por ejemplo, el COBAS TaqMan 48 AnalyzerTM (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Ver, por ejemplo, Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, 1991; Lee et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-3766, 1993; patentes US nº 6.214.979, nº 5.804.375, nº 5.487.972 y nº 5.210.015. Este ensayo detecta la acumulación de un producto de PCR específico mediante hibridación y corte de una sonda doblemente marcada fluorigénica durante la reacción de amplificación. La sonda fluorigénica puede consistir de un oligonucleótido (por ejemplo que se hibrida a un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa o el complemento del mismo) marcado con un pigmento informador fluorescente y un pigmento desactivador. Durante la PCR, esta sonda es cortada por la actividad 5' nucleasa de la ADN polimerasa, sólo y sólo si se hibrida con el segmento que se amplifica. El corte de la sonda genera un incremento de la intensidad de fluorescencia del pigmento informador.

En algunas realizaciones, los enzimas con actividad de 5' nucleasa son ácido nucleico polimerasas termoactivas y termoestables. Entre dichas polimerasas termoestables se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las formas nativas y recombinantes de polimerasas de una diversidad de especies de los géneros de eubacterias Thermus, Thermatoga y Thermosipho. Por ejemplo, entre las polimerasas de especies de Thermus que pueden utilizarse en los métodos de la invención se incluyen la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), la ADN polimerasa de Thermus especie Z05 (Z05), la ADN polimerasa de Thermatoga maritima, la ADN polimerasa de Thermatoga neapolitana y Thermus especie sps17 (sps17), tal como se describe en las patentes US nº 5.405.774, 5.352.600, 5.079.352, 4.889.818, 5.466.591, 5.618.711, 5.674.738 y 5.795.762.

Otro método de detección de productos de amplificación que se basa en la utilización de transferencia de energía es el método de la "baliza molecular" de Tyagi y Kramer (Nature Biotech. 14:303-309, 1996) que también es el objeto de las patentes US nº 5.119.801 y nº 5.312.728. Este método utiliza sondas oligonucleótidas de hibridación que pueden formar estructuras de horquilla. En un extremo de la sonda de hibridación (en el extremo 5' ó 3') existe un fluoróforo donante, y en el otro extremo, un grupo aceptor. En el caso del método de Tyagi y Kramer, este grupo aceptor es un desactivador, es decir, el aceptor absorbe la energía liberada por el donante, pero él mismo no emite fluorescencia. De esta manera, en el caso de que la baliza se encuentre en conformación abierta, la fluorescencia del fluoróforo donante es detectable, mientras que, en el caso de que la baliza se encuentre en la conformación de horquilla (cerrada), se desactiva la fluorescencia del fluoróforo donante. Al utilizarlas en una PCR, la sonda baliza molecular que se hibrida con una de las cadenas del producto de PCR se encuentra en "conformación abierta" y se detecta la fluorescencia, mientras que aquéllas que quedan no hibridadas no emiten fluorescencia (Tyagi y Kramer, Nature Biotechnol. 14 (19969 303-306. Como resultado, la cantidad de fluorescencia se incrementa a medida que se incrementa la cantidad de producto de PCR, y de esta manera puede utilizarse como medida del progreso de la PCR. El experto en la materia reconocerá que también se encuentran disponibles otros métodos de amplificación cuantitativa. Entre otro tipos de sondas útiles para los métodos de PCR en tiempo real se incluyen las sondas ScorpionTM, que se encuentran disponibles en formatos "unimarcados" y "bimarcados", de Proligo, C (Boulder, CO). Ver también Bates et al., Mol. Plant Pathol. 2:275-280, 2001.

En todavía otro ejemplo, pueden utilizarse dos cebadores y una sonda de la invención para detectar y cuantificar un ácido nucleico diana utilizando la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA). En algunos métodos de NASBA, se utilizan tres enzimas, incluyendo la transcriptasa inversa, la ARN polimerasa de T7 y la ARNasa H. El producto de amplificación final es ARN de una cadena con una polaridad contraria a la del ácido nucleico que debe detectarse. El producto de ARN amplificado puede detectarse en algunas realizaciones mediante la utilización de una sonda de captura específica de una diana unida a partículas magnéticas conjuntamente con una sonda detectora marcada con rutenio y un instrumento (NucliSens Reader, bioMérieux) capaz de medir la electroquimioluminiscencia (ECL). Alternativamente, el ARN amplificado mediante NASBA puede detectarse específicamente en tiempo real mediante la inclusión de balizas moleculares en la reacción de amplificación, tal como se ha indicado anteriormente. Puede encontrarse directrices adicionales sobre la utilización de los cebadores y sondas de la invención en artículos por Compton, Nature 350:91-92, 1991, y Kievits et al., J. Virol. Methods 35:273-286, 1991.

Otro ejemplo de métodos que utiliza un ácido nucleico cebador y una sonda para detectar y cuantificar un ácido nucleico diana implican la utilización de nanopartículas. En estos métodos, dos oligonucleótidos, tales como un cebador o sonda de la invención, que pueden hibridarse con regiones diferentes de un ácido nucleico que debe detectarse, se unen covalentemente a una nanopartícula. Las nanopartículas se ponen en contacto con un ácido nucleico diana bajo condiciones de hibridación. En el caso de que el ácido nucleico se encuentre presente, éste se unirá a los oligonucleótidos unidos a las nanopartículas, produciendo un complejo de gran peso molecular que puede detectarse. El complejo puede detectarse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia sin limitación. En determinadas realizaciones, el complejo se detecta mediante precipitación del complejo. Pueden encontrarse directrices adicionales sobre métodos de utilización de nanopartículas en relación a los cebadores y sondas de la invención en Taton et al., Science 289:1757-1760, 2000, y en las patentes US nº 6.506.564, nº 6.495.324, nº 6.417.340, nº 6.399.303 y nº 6.361.944.

En todavía otro ejemplo, puede utilizarse la amplificación de círculo rodante ("RCA") como parte de un método para detectar y cuantificar un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones de métodos RCA, se amplifica un ADN circular mediante extensión por polimerasa de un cebador complementario. Puede utilizarse cualquiera de los cebadores o sondas de la invención en dichos métodos. Los métodos de circularización del ADN son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la ligación de los extremos de una molécula de ADN bajo condiciones que favorecen la ligación intramolecular. El producto concatámero de una cadena seguidamente puede detectarse mediante cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido por el experto en la materia sin limitación. Por ejemplo, el producto concatámero puede detectarse utilizando una sonda detectablemente marcada de la invención. Otros ejemplos de métodos para detectar un ácido nucleico de secuencia conocida se describe extensivamente en la presente memoria. En otras realizaciones del RCA, puede utilizarse un segundo cebador que es complementario al producto concatámero. Este cebador permite la amplificación exponencial de las secuencias presentes en el ADN molde circular. Los productos de la amplificación todavía pueden detectarse, por ejemplo, mediante la utilización de una sonda detectablemente marcada de la invención. Pueden encontrarse directrices adicionales sobre la utilización de cebadores y sondas de la invención en los métodos RCA para la detección de un ácido nucleico diana en las patentes US nº 6.344.329, nº 6.350.580, nº 6.221.603, nº 6.210.884, nº 5.648.245 y nº

5.714.320 y en la patente WO nº 95/35390.

En otro ejemplo de dichos métodos, puede detectarse y amplificarse un ácido nucleico diana utilizando la amplificación por desplazamiento de cadena ("SDA"). En estos métodos, se detectan los ácidos nucleicos amplificados mediante la incorporación de un cebador de cadena sencilla que comprende un grupo fluorescente, un grupo desactivador, y un sitio de restricción introducido que separa los dos grupos. El experto en la materia podrá reconocer fácilmente cómo modificar cualquiera de los cebadores o sondas de la invención para la utilización en la SDA.

En una primera reacción de amplificación utilizada en la SDA, el cebador se utiliza para amplificar un ácido nucleico diana en presencia de, por ejemplo, tio-dCTP, incorporando de esta manera el cebador en el producto de amplificación. A continuación, puede utilizarse una endonucleasa de restricción para cortar el sitio de restricción en el cebador. La endonucleasa de restricción no puede cortar ambas cadenas del producto de amplificación debido a la incorporación de tio-dCTP en el producto de amplificación. Finalmente, el extremo 3' del cebador creado por el corte puede utilizarse para cebador una nueva reacción de polimerización, desplazando de esta manera la parte de la cadena 3' respecto al corte de la cadena de molde. El desplazamiento de la cadena separa el grupo fluorescente del grupo desactivado, evitando de esta manera la desactivación de la fluorescencia emitida por el grupo fluorescente. De esta manera puede detectarse y/o cuantificarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa mediante la medición de la presencia y/o cantidad de la fluorescencia. Pueden encontrarse directrices adicionales sobre la selección y modificación de cebadores y sondas para la utilización en la SDA en Little et al., Clin. Chem. 45:777-784, 1999, y en las patentes US nº 6.528.254 y nº 6.528.632.

En otro ejemplo, puede detectarse y cuantificarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando amplificación mediada por la transcripción ("TMA"). TMA es un sistema de amplificación por transcripción de ARN que utiliza la ARN polimerasa y la transcriptasa inversa para amplificar los ácidos nucleicos que deben detectarse. En el método se utiliza un cebador de la invención con un promotor para la ARN polimerasa para cebar la transcripción inversa de un ARN diana. A continuación, la actividad de ARNasa de la transcriptasa inversa degrada el molde de ARN, liberando la cadena de ADNc. La síntesis de la segunda cadena se ceba con un segundo cebador de la invención y es catalizada por una transcriptasa inversa. La ARN polimerasa seguidamente reconoce el promotor sintetizado en la segunda cadena y cataliza múltiples ciclos de transcripción del ARN a partir de la segunda cadena. El producto ARN seguidamente puede detectarse o puede servir como molde para otra ronda de amplificación.

A continuación, el producto ARN de la TMA puede detectarse y amplificarse mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. En determinadas realizaciones, el producto ARN puede detectarse con una sonda de la invención. En otras realizaciones, el producto ARN puede detectarse con una sonda de la invención que ha sido marcada con un marcaje de éster de acridina (Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Dichos marcajes pueden eliminarse químicamente de la sonda no hibridada, mientras que los marcajes en las sondas hibridadas no se alteran. De esta manera, en este tipo de realizaciones, la presencia de un ácido nucleico diana puede detectarse mediante la detección de la presencia del marcaje de éster de acridina. Pueden encontrarse directrices adicionales para la utilización de los cebadores y sondas de la invención en métodos basados en TMA en Arnold et al., Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989, Miller et al., J. Clin. Microbiol. 32:393-397, 1994, y en las patentes US nº 6.335.166 y nº 6.294.338. En otras realizaciones, puede utilizarse cualquier ensayo conocido por el experto en la materia que utilice un cebador o sonda de ácidos nucleicos de cadena sencilla que pueda hibridarse con un ácido nucleico con el fin de detectar un polinucleótido de SENP1 ó de telomerasa. Por ejemplo, puede detectarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando un cebador para iniciar una reacción de extensión de cebador. La extensión con éxito del cebador por parte de una ácido nucleico polimerasa indica la presencia del polinucleótido de SENP1 o de telomerasa. Otros ejemplos de métodos de detección de cebador o sonda de cadena sencilla que describen métodos que pueden utilizarse tal como se ha descrito o que pueden ser adaptados por un experto en la materia con el fin de dtectar un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa, en las patentes US nº 6.440.707, 6.379.888, 6.368.803, 6.365.724, 6.361.944, 6.352.827, 6.326.145, 6.312.906, 6.268.128, 6.261.784, 6.177.249, 6.140.055, 6.130.047, 6.124.090, 6.121.001, 6.110.677, 6.054.279, 6.022.686, 5.981.176, 5.958.700, 5.945.283, 5.935.791, 5.919.630, 5.888.739, 5.888.723, 5.882.867, 5.876.924, 5.866.336, 5.856.092, 5.853.990, 5.846.726, 5.814.447, 5.808.036, 5.800.989, 5.795.718, 5.792.614, 5.710.028, 5.683.875, 5.683.872, 5.679.510, 5.641.633, 5.597.696, 5.595.890, 5.571.673, 5.547.861, 5.525.462, 5.514.546, 5.491.063, 5.437.977, 5.294.534, 5.118.605, 5.102.784, 4.994.373, 4.851.331 y 4.767.700.

b. Cebadores de la invención

Los cebadores oligonucléotidos ejemplares pueden comprender una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 u otro número de nucleótidos contiguos de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa (por ejemplo TERC o TERT) o de complementos de los mismos.

La longitud y composición de la sonda puede seleccionarse para proporcionar suficiente estabilidad termodinámica para garantizar la hibridación de la sonda con el ácido nucleico molde bajo condiciones de reacción apropiadas, que dependen del método de detección que debe llevarse a cabo. Por ejemplo, las sodas con nucleótidos modificados, no estándares o derivatizados pueden ser más largas o cortos que aquéllas con nucleótidos convencionales, presentando propiedades termodinámicas de hibridación similares. Pueden encontrarse otros ejemplos de dichas bases no estándares en las patentes US nº nº 6.320.005, nº 6.174.998, nº 6.001.611 y nº 5.990.303. A modo de ejemplo adicional, las sondas con secuencias ricas en G/C pueden hibridarse con secuencias diana a temperaturas más altas que una sonda de longitud similar con secuencias ricas en A/T.

c. Sondas de la invención

Los cebadores oligonucléotidos ejemplarmente detectables pueden comprender una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 u otro número de nucleótidos contiguos de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa (por ejemplo TERC o TERT) o de complementos de los mismos.

Además de la secuencia de nucleótidos de la sonda tal como se ha indicado en la presente memoria, la sonda puede comprender secuencias de nucleótidos adicionales u otros grupos que no inhiban los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones de la invención, la sonda puede comprender secuencias de nucleótidos adicionales u otros grupos que faciliten los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la sonda puede bloquearse en su extremo 3' terminal para impedir el cebado no deseado de polimerización de ácidos nucleicos por parte de la sonda. Además, pueden encontrarse presentes grupos dentro de la sonda que estabilicen o desestabilicen la hibridación de la sonda o de fragmentos de la misma con la secuencia de nucleótidos. Las sondas de la invención también pueden comprender nucleótidos modificados, no estándares o derivatizados tal como se ha definido anteriormente.

En determinadas realizaciones de la invención la sonda puede comprender un grupo detectable. El grupo detectable puede ser cualquier grupo detectable conocido por un experto en la materia sin limitación. Además, el grupo detectable puede ser detectable mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia sin limitación. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos.

Una diversidad de grupos detectables que pueden utilizarse para detectar las sondas de la invención, así como métodos para su unión a la sonda, son conocidos de la técnica, y entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, enzimas (por ejemplo la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante) y los sustratos enzimáticos, grupos radioactivos, grupos fluorescentes, cromóforos, marcajes quimioluminiscentes, marcajes electroquimioluminiscentes, tales como OriginTM (Igen, Rockville, MD), ligandos que presentan parejas de unión específicos, o cualquier otro marcaje que pueda interactuar mutuamente para incrementar, alterar o reducir una señal. Evidentemente, en el caso de que se lleve a cabo una reacción de 5' nucleasa utilizando una ADN polimerasa termoestable a temperaturas elevada, en algunas realizaciones, el grupo detectable no se degrada o, de otro modo, se convierte en indetectable por dichas temperaturas elevadas. En determinadas realizaciones, el grupo detectable puede ser un grupo fluorescente. El grupo fluorescente puede ser cualquier grupo fluorescente conocido por el experto en la materia sin limitación. En algunas realizaciones, se utilizan grupos fluorescentes con desplazamientos de Stokes amplios, permitiendo la utilización fluorímetros con filtros y no monocromómetros, e incrementar la eficiencia de la detección. En determinadas realizaciones, el grupo fluorescente puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de los pigmentos de la familia de la fluoresceína (Integrated ADN Technologies Inc., Coralville, IA), pigmentos de la familia de polihalofluoresceína, pigmentos de la familia de la hexaclorofluoresceína, pigmentos de la familia de la coumarina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR), pigmentos de la familia de la rodamina (Integrated ADN Technologies Inc.), pigmentos de la familia de la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina, pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuaraína, pigmentos de la familia de los lantánidos quelados y pigmentos de la familia de BODIPY® (Molecular Probes Inc.). En algunas realizaciones, el grupo fluorescente es la 6-carboxifluoresceína (FAMTM) (Integrated ADN Technologies Inc.). Otros ejemplos de grupos fluorescentes que pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de la invención pueden encontrarse en la patente US nº 6.406.297, nº 6.221.604, nº 5.994.063, nº 5.808.044, nº 5.880.287, nº 5.556.959 y nº 5.135.717. En otras realizaciones, el grupo detectable puede ser un grupo detectable que no es un grupo fluorescente. Entre los grupos radioactivos, resultan preferentes los compuestos marcados con 32P. Puede utilizarse cualquier método conocido por el experto en la materia sin limitación para introducir 32P en una sonda. Por ejemplo, puede marcarse una sonda con 32P mediante marcaje 5' con una quinasa o mediante inserción aleatoria mediante corte y marcado ("nick translation"). Los grupos detectables que son enzimas típicamente pueden detectarse a partir de su actividad. Pro ejemplo, la fosfatasa alcalina puede detectarse mediante la medición de la fluorescencia producida por la acción del enzima sobre compuestos de sustrato apropiados. En el caso de que se utilice un miembro de parejas de unión específicas como grupo detectable, la presencia de la sonda puede detectarse mediante la detección de la unión específica de una molécula al miembro de la pareja de unión específica. Por ejemplo, puede unirse un antígeno a la sonda, y utilizarse un anticuerpo monoclonal específico para ese antígeno para detectar la presencia del antígeno y, por lo tanto, de la sonda. Entre otras parejas de unión específica que pueden utilizarse como grupos detectables se incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosas otras parejas de receptor-ligando bien conocidas de la técnica. Todavía otros ejemplos de grupos detectables que no son grupos fluorescentes pueden encontrarse en las patentes US nº 5.525.465, nº 5.464.746, nº 5.424.414 y nº 4.948.882.

La descripción anteriormente proporcionada de grupos detectables no pretende categorizar los diversos marcajes en clases diferentes, debido a que el mismo marcaje puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, 125I puede servir como grupo radioactivo o como reactivo electrodenso. La peroxidasa de rábano picante puede servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal. Además, pueden combinarse diversos grupos detectables para un efecto deseado. Por ejemplo, puede marcarse una sonda con biotina, y detectarse su presencia con avidina marcada con 125I, o con un anticuerpo monoclonal anti-biotina marcado con peroxidasa de rábano picante. Otras permutaciones y posibilidades resultarán fácilmente evidentes para el experto ordinario en la materia, y se consideran equivalentes comprendidos dentro del alcance de la presente invención.

El método de unión o conjugación del grupo detectable con la sonda depende, evidentemente, del tipo de grupo o grupos detectables utilizados y de la posición del grupo detectable en la sonda.

El grupo detectable puede unirse a la sonda directa o indirectamente mediante una diversidad de técnicas. Dependiendo del tipo exacto de grupo detectable utilizado, éste puede localizarse en el extremo 5' o 3' de la sonda, internamente en la secuencia de nucleótidos de la sonda, o unido a brazos espaciadores de diversos tamaños y composiciones para facilitar las interacciones de señales. Mediante la utilización de reactivos fosforamidita disponibles comercialmente pueden producirse oligonucleótidos que contienen grupos funcionales (por ejemplo tioles o aminas primarias) en cualquiera de los extremos mediante una fosforamidita apropiadamente protegida, y puede unirse a la misma un grupo detectable utilizando protocolos descritos en, por ejemplo, Innis et al (editores), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990).

Los métodos para introducir reactivos funcionalizadores de oligonucleótido para la introducción de uno o más grupos sulfihidrilo, amino o hidroxilo en la secuencia de la sonda oligonucleótido, típicamente en el extremo 5', se describen en la patente US nº 4.914.210. Puede introducirse un grupo 5' fosfato a modo de isótopo radioactivo mediante la utilización de polinucleótido quinasa y [γ-32P]ATP para proporcionar un grupo informador. Puede añadirse biotina en el extremo 5' mediante la reacción de un residuo aminotimidina o de un línker alquilamino, introducido durante la síntesis, con un N-hidroxisuccinimida éster de biotina. Otros métodos de unión de un grupo detectable, incluyendo un grupo fluorescente, a la sonda pueden encontrarse en la patente US nº 5.118.802.

También resulta posible unir un grupo detectable en el extremo 3' de la sonda mediante la utilización, por ejemplo, de polinucleótido transferasa terminal para añadir un grupo deseado, tal como, por ejemplo, cordicepín 35S-dATP, y dUTP biotinilado. Los derivados oligonucleótidos también son grupos detectables que pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de la presente invención. Por ejemplo, eteno-dA y eteno-A son nucleótidos adenina fluorescentes conocidos que pueden incorporarse en una sonda oligonucleótida. De manera similar, eteno-dC es otro análogo que podría utilizarse en la síntesis de una sonda. Las sondas que contienen dichos derivados de nucleótidos pueden degradarse para liberar mononucleótidos que son mucho más fuertemente fluorescentes que la sonda intacta mediante, por ejemplo una actividad 5' a 3' nucleasa de polimerasa.

En determinadas realizaciones de la invención, puede marcarse una sonda con más de un grupo detectable. En algunas de dichas realizaciones, cada grupo detectable puede unirse individualmente a diferentes bases de la sonda. En otras realizaciones, puede unirse más de un grupo detectable a la misma base de la sonda.

En determinadas realizaciones, el grupo detectable puede unirse al extremo 5' de la sonda. En otras realizaciones, el grupo detectable puede unirse a la sonda en un residuo que se encuentra a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40 residuos u otro numero de residuos del extremo 5' de la sonda. El grupo detectable puede unirse a cualquier parte de un residuo de la sonda. Por ejemplo, el grupo detectable puede unirse a un grupo azúcar, fosfato, o base de un nucleótido en la sonda. En otras realizaciones, el grupo detectable puede unirse entre dos residuos de la sonda.

En determinadas realizaciones de la invención, la sonda puede comprender un grupo fluorescente y un grupo desactivador. En dichas realizaciones, el grupo fluorescente puede ser cualquier grupo fluorescente conocido por el experto en la materia, tal como se ha indicado anteriormente. Además, el grupo desactivador puede ser cualquier grupo desactivador conocido por el experto en la materia sin limitación. En determinadas realizaciones, el grupo desactivador puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de pigmentos de la familia de la fluoresceína, pigmentos de la familia de la polihalofluoresceína, pigmentos de la familia de la hexaclorofluoresceína, pigmentos de la familia de la coumarina, pigmentos de la familia de la rodamina, pigmentos de la familia de la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina, pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuaraína, pigmentos de la familia de los lantánidos quelados, pigmentos de la familia de BODIPY® y grupos desactivadores no fluorescentes. En determinadas realizaciones, los grupos desactivadores no fluorescentes pueden ser pigmentos de la familia de BHQTM, Iowa BlackTM o Dabcyl (Integrated ADN Technologies Inc.). Entre otros ejemplos de grupos desactivadores específicos se incluyen, por ejemplo, aunque no en modo limitativo, TAMRA (N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina) (Molecular Probes Inc.), dabcilo (ácido 4-(4'dimetilaminofeilazo)benzoico), Iowa BlackTM (Integrated ADN Technologies Inc.), Cy3TM (Integrated ADN Technologies Inc.) o Cy5TM (Integrated ADN Technologies Inc.). En una realización preferente, el grupo desactivador es Cy5TM. Otros ejemplos de grupos fluorescentes que pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de la invención pueden encontrarse en las patentes US nº 6.399.392, nº 6.348.596, nº

6.080.068 y nº 5.707.813, cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

En determinadas realizaciones, el grupo desactivador puede unirse al extremo 3' de la sonda. En otras realizaciones, el grupo desactivador puede unirse a la sonda en un residuo que se encuentra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40 u otro número de residuos del extremo 5’ de la sonda. En una realización preferente, el grupo fluorescente se encuentra unido al extremo 5’ de la sonda y el grupo desactivador se encuentra unido a un residuo que se encuentra a aproximadamente 9 ó menos residuos del extremo 5’ de la sonda. El grupo desactivador puede unirse a cualquier parte de un residuo de la sonda. Por ejemplo, el grupo desactivador puede unirse a un grupo sacárido, fosfato o base de un nucleótido en la sonda. En otras realizaciones, el grupo desactivador puede unirse entre dos residuos de la sonda.

Aunque sin pretender restringirse a ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, se cree que, en el caso de que la sonda se encuentre intacta, un fotón emitido por el grupo fluorescente puede ser absorbido y de esta manera desactivdo por el grupo desactivador. El grupo desactivador seguidamente libera la energía del fotón en forma de un fotón de diferente longitud de onda o en forma de calor. De esta manera, el grupo desactivador también puede ser un grupo fluorescente. Tal como se ha indicado anteriormente, este fenómeno se denomina transferencia de energía por resonancia fluorescente (“FRET”). El corte de la sonda entre el grupo fluorescente y el desactivador resulta en una reducción de la desactivación de la fluorescencia emitida por el grupo fluorescente por parte del grupo desactivador.

Generalmente, la transferencia de energía entre el grupo fluorescente y el grupo desactivador depende de la distancia entre el grupo fluorescente y el grupo desactivador y de la distancia crítica de transferencia de la pareja particular de grupo fluorescente-grupo desactivador. La distancia crítica de transferencia es tanto característica como constante para un grupo fluorescente dado apareado con un grupo desactivador dado. Además, la reacción espacial del grupo fluorescente en referencia al grupo desactivador puede determinarse más sensiblemente en el caso de que la distancia crítica de transferencia de la pareja de grupo fluorescente-grupo desactivador se encuentre próxima a la distancia entre el grupo fluorescente y el grupo desactivador. Por consiguiente, el experto en la materia puede seleccionar el grupo fluorescente y el grupo desactivador para que presenten una distancia crítica de transferencia que se encuentre próxima a la distancia que separa el grupo fluorescente del grupo desactivador en la sonda. Las distancias críticas de transferencia de parejas particulares de grupo fluorescente-grupo desactivador son bien conocidas de la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en un artículo de Wu y Brand, Anal. Biochem. 218:1-13, 1994.

Entre otros criterios para la selección de parejas particulares de grupo fluorescente-grupo desactivador se incluyen, por ejemplo, el rendimiento cuántico de emisión fluorescente por parte del grupo fluorescente; la longitud de onda de la fluorescencia emitida por el grupo fluorescente; el coeficiente de extinción del grupo desactivador; la longitud de onda de fluorescencia, en caso de existir, emitida por el grupo desactivador; y el rendimiento cuántico de la emisión fluorescente, en caso de existir, por parte del grupo desactivador. Además, en el caso de que el grupo desactivador también sea un grupo fluorescente, el grupo desactivador y el grupo fluorescente pueden seleccionarse de manera que la fluorescencia emitida por uno pueda distinguirse fácilmente de la fluorescencia emitida por el otro. Pueden encontrarse directrices adicionales sobre la selección de parejas particulares de grupo fluorescente-grupo desactivador en un artículo de revisión de Klostermeier y Millar, Biopolymers 61:159-179, 2002.

Entre las combinaciones ejemplares de grupos fluorescentes y grupos desactivadores que pueden utilizarse en el presente aspecto de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, grupo fluorescente rodamina 590 y grupo desactivador cristal violeta. Una combinación preferente de grupos fluorescente y desactivador es el grupo fluorescente 6-carboxifluoresceína y el grupo desactivador Cy5TM. Otros ejemplos de parejas de grupo fluorescente-grupo desactivador que pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de la invención pueden encontrarse en la patente US nº 6.245.514.

Entre los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse tanto como grupo fluorescente como desactivador en FRET se incluyen fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 2’7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína, rodamina, 6-carboxirrodamina, 6-carboxi-X-rodamina y ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftalén-1-sulfónico (EDANS). La definición de si un grupo fluorescente es un donante o un aceptor se realiza a partir de sus espectros de excitación y de emisión, y el grupo fluorescente con el que se encuentra apareado. Por ejemplo, FAM TM resulta excitado más eficientemente por luz de una longitud de onda de 488 nm, y emite luz que presenta un espectro de 500 a 650 nm, y un máximo de emisión de 525 nm. Por consiguiente, FAM TM es un grupo fluorescente adecuado para la utilización con, por ejemplo, TAMRA como grupo desactivador, el cual presenta su máximo de excitación en 514 nm.

2. Ensayos basados en la hibridación

Los métodos para detectar y/o cuantificar el nivel de polinucleótidos de SENP1 ó de telomerasa (ARN o ADNc construido a partir del mismo) utilizando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos son conocidos del experto en la materia (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989). Las muestras biológicas pueden cribarse utilizando una sonda específica de SENP1 o de telomerasa. Dichas sondas corresponden en secuencia a una región del ARN de SENP1 o de la telomerasa, o al complemento de la misma. Bajo condiciones definidas, la hibridación específica de dicha sonda con un ácido nucleico de ensayo es indicativa de la presencia del polinucleótido de SENP1 o de telomerasa en una muestra. Las condiciones definidas resultarán suficientes para permitir la hibridación de la sonda con su diana sin hibridarse significativamente a otros polinucleótidos en una mezcla compleja (por ejemplo ADN genómico de una célula). Si se desea, puede utilizarse más de una sonda en la muestra de ensayo. La sonda puede comprender tan sólo 8, 15, 20, 50 ó 100, u otro número, de nucleótidos de la secuencia de ARN de SENP1 o de telomerasa, o el complemento de la misma, o puede comprender hasta 500, 1 kb o la secuencia de ARN completa o su complemento. En algunas realizaciones, la sonda presenta una longitud de entre 12 y 100 nucleótidos, o de entre 16 y 50 nucleótidos o de entre 18 y 40 nucleótidos.

Un método para evaluar la presencia, ausencia y/o cantidad de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa implica una transferencia northern: se aísla un ARNm a partir de una muestra biológica dada, se separa mediante electroforesis y se transfiere del gel a un soporte sólido (por ejemplo una membrana de nitrocelulosa). A continuación, las sondas de SENP o de telomerasa marcadas se hibridan con la membrana con el fin de identificar y/o cuantificar el ARNm. La expresión de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa también puede analizarse mediante otras técnicas conocidas de la técnica, por ejemplo transferencia de puntos, hibridación in situ, protección frente a la ARNasa, microchips de sondeo de ADN, y similares.

Un método alternativo que resulta bastante útil en el caso de que deba utilizarse un gran número de sondas diferentes es un formato de transferencia por puntos “inverso”, en el que la secuencia amplificada contiene un marcaje, y la sonda se encuentra unida al soporte sólido. Este formato resultaría útil en el caso de que los métodos de ensayo de la presente invención se utilizasen como uno de entre una batería de métodos realizados simultáneamente en una muestra. En este formato, las sondas no marcadas se unen a la membrana y se exponen a la muestra marcada bajo condiciones astringentes de hibridación apropiadas. La muestra marcada y no hibridada seguidamente se elimina mediante lavado bajo condiciones convenientemente astringentes, y después se analiza el filtro para la presencia de secuencias unidas.

Puede llevarse a cabo tanto el ensayo de transferencia por puntos directo como inverso convenientemente en una placa de microtitulación (ver la solicitud de patente US nº 07/695.072 y patente US nº 5.232.829).Las sondas pueden unirse a albúmina de suero bovino (BSA), por ejemplo, que se adhiere a la placa de microtitulación, inmovilizando de esta manera la sonda. Otro ejemplo de un método de utilización de una sonda de la invención para detectar un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa se describe en la patente US nº 6.383.756, que proporciona un método para detectar un ácido nucleico unido a una membrana.

En otro ejemplo, puede detectarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando métodos basados en ADN ramificado. En estos métodos, se construye un monómero dendrímero de dos cadenas de ADN que comparten una región de complementariedad de secuencia situada en la parte central de cada cadena. Al hibridarse las dos cadenas para formar el monómero, la estructura resultante presenta una parte central de doble cadena circundada por cuatro extremos de una sola cadena. Puede ensamblarse un dendrímero a partir de monómeros mediante hibridación de los extremos de una cadena de los monómeros entre sí, dejando todavía muchos extremos de una sola cadena libres. Estos extremos de una cadena libres pueden presentar las secuencias de cualquiera de los cebadores o sondas de la invención. Un dendrímero puede marcarse detectablemente con cualquier grupo detectable conocido por el experto en la materia, aunque sin limitación, tal como se ha indicado anteriormente en referencia a las sondas de la invención.

A continuación, pueden utilizarse dendrímeros como sonda en, por ejemplo, los ensayos de “transferencia por puntos” indicados posteriormente. Además, puede utilizarse un dendrímero como sonda en cualquier método conocido por el experto en la materia en el que la sonda se detecta directamente. Una sonda se detecta directamente en el caso de que la presencia de la sonda pueda determinarse sin ninguna reacción o modificación posterior, tal como una transferencia por puntos o transferencia southern. Pueden encontrarse directrices adicionales sobre la selección y utilización de los dendrímeros como sondas en la patente US nº 6.261.779 y en Nilsen et al., J. Theoretical Biology 187:273-284, 1997, Capaldi et al., Nucleic Acids Res. 28:21e, 2000; Wang et al., J. Am. Chem. 120:8281-8282, 1998, y en Wang et al., Electroanalysis 10:553-556, 1998.

B. Detección de ADN de SENP1

En algunos casos, resulta ventajoso detectar y analizar ADN genómico codificante de SENP1. Por ejemplo, puede resultar útil determinar la estructura y/o la secuencia de nucleótidos de una secuencia genómica codificante de SENP1

o que comprende secuencias reguladoras de SENP1 para identificar mutaciones asociadas con cáncer u otras enfermedades. De manera similar, pueden analizarse secuencias de ADNc de SENP1 y/o secuenciarse los nucleótidos.

En algunos casos, las secuencias genómicas de SENP1 se analizan para identificar polimorfismos (por ejemplo variantes) entre alelos comunes y alelos asociados a cáncer. Entre dichos tipos de análisis molecular se incluyen, aunque sin limitación: el análisis RFLP, los análisis basados en la PCR, los análisis de SNP, etc.

C. Detección y cuantificación de polipéptidos SENP1 o telomerasa

Además de la detección de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa, también pueden utilizarse ensayos de afinidad, tales como inmunoensayos, para detectar polipéptidos SENP1 ó telomerasa. Los inmunoensayos típicamente se utilizan para cuantificar los polipéptidos SENP1 o telomerasa en una muestra. Puede encontrarse una visión general de la tecnología aplicable en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con polipéptidos SENP1 o telomerasa son conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology, 1991; Harlow y Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a edición, 1986); y Kohler y Milstein, Nature 256:495-497, 1975).Entre dichas técnicas se incluyen la preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fágicos o similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante la inmunización de conejos o ratones (ver, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Ward et al., Nature 341:544-546, 198).

Pueden utilizarse polipéptidos SENP1 y/o telomerasa para producir anticuerpos reactivos específicamente con SENP1

o con telomerasa, respectivamente. Por ejemplo, se aísla y se purifica un SENP1 recombinante o un fragmento antigénico del mismo, por ejemplo tras la expresión recombinante en células eucarióticas o procarióticas. A continuación, el producto se inyecta en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales, para la utilización posterior en inmunoensayos para medir la proteína.

Puede recogerse anticuerpos monoclonales y sueros policlonales y titularse frente a la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Típicamente se seleccionan antisueros policlonales con un título de 104 o superior y se someten a reacción para su reactividad cruzada contra proteínas no SENP1 o telomerasa utilizando un inmunoensayo de unión competitiva. Los anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales específicos habitualmente se unen con una Kd de por lo menos aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente de por lo menos aproximadamente 1 μM, opcionalmente de por lo menos aproximadamente 0,1 μM o mejor, y opcionalmente de 0,01 μM o mejor.

Tras disponer de los anticuerpos específicos de SENP1 y/o de telomerasa, pueden detectarse polipéptidos SENP1 ó telomerasa mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión del os procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo, ver Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, editores, 7a edición, 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden llevarse a cabo en cualquiera de entre varias configuraciones, que se revisan extensivamente en Enzyme Immunoassay (Maggio, editor, 1980) y en Harlow y Lane, supra.

Pueden detectarse y/o cuantificarse polipéptidos SENP1 y/o telomerasa utilizando cualquiera de entre varios ensayos de unión inmunológico bien conocidos (ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.366.241, nº 4.376.110, nº 4.517.288 y nº 4.837.168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, ver Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, editor, 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, editores, 7a edición, 1991). Los ensayos de unión inmunológica (o inmunoensayos) típicamente utilizan un anticuerpo que se une específicamente a una proteína o antígeno de elección (en este caso los polipéptidos SENP1 o telomerasa o subsecuencia antigénica de los mismos). El anticuerpo (por ejemplo anti-SENP1 o anti-telomerasa) puede producirse mediante cualquiera de entre varios medios bien conocidos por el experto en la materia y tal como se ha indicado anteriormente.

Los inmunoensayos con frecuencia también utilizan un agente de marcaje para unirse específicamente y marcar el complejo formado por anticuerpo y antígeno. El agente de marcaje mismo puede ser uno de los grupos que comprende el complejo de anticuerpo/antígeno. De esta manera, el agente de marcaje puede ser un polipéptido SENP1 o telomerasa marcado o un anticuerpo anti-SENP1 o anti-telomerasa marcado. Alternativamente, el agente de marcaje puede ser un tercer grupo, tal como un anticuerpo secundario, que se une específicamente al complejo de anticuerpo/SENP1 o de anticuerpo/telomerasa (un anticuerpo secundario que típicamente es específico de anticuerpos de la especie a partir de la que se derivó el primer anticuerpo). Otras proteínas capaces de unirse específicamente a las regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G también pueden utilizarse como el agente de marcaje. Estas proteínas muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de inmunoglobulina de una diversidad de especies (ver, por ejemplo, Kronval et al., J. Immunol. 111:1401-1406, 1973; Akerstrom et al., J. Immunol. 135:2589-2542, 1985). El agente de marcaje puede modificarse con un grupo detectable, tal como biotina, al que puede unirse específicamente otra molécula, tal como estreptavidina. Es bien conocida por el experto en la materia una diversidad de grupos detectables.

Durante los ensayos, pueden resultar necesarias etapas de incubación y/o de lavado tras cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden durar entre aproximadamente 5 segundos y varias horas, opcionalmente entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación depende del formato de ensayo, antígeno, volumen de solución, concentraciones y similares. Habitualmente, los ensayos se llevan a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden llevarse a cabo en un intervalo de temperaturas, tal como entre 10ºC y 40ºC.

Los inmunoensayos para detectar polipéptidos SENP1 o telomerasa en muestras puede ser competitiva o no competitiva. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que se mide directamente la cantidad de antígeno. En los ensayos “sándwich”, por ejemplo, los anticuerpos anti-SENP1 o anti-telomerasa pueden unirse directamente a un sustrato sólido sobre el que se inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados seguidamente capturan los polipéptidos SENP1 o telomerasa presentes en la muestra de ensayo. El polipéptido SENP1 o telomerasa inmovilizado de esta manera seguidamente se une a un agente de marcaje, tal como un segundo anticuerpo anti-SENP1 o anti-telomerasa que porta un marcaje. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede no presentar un marcaje pero puede, a su vez, unirse a un tercer anticuerpo marcado específico de anticuerpos de la especie a partir de la que se derivó el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo típicamente se modifica con un grupo detectable, tal como biotina, a la que se une específicamente otra molécula, por ejemplo estreptavidina, para proporcionar un grupo detectable.

En los ensayos competitivos, se mide indirectamente la cantidad de polipéptido SENP1 o telomerasa presente en la muestra mediante la medición de la cantidad de un polipéptido conocido añadido (exógeno) SENP1 o telomerasa desplazado (competitivamente) de un anticuerpo anti-SENP1 o anti-telomerasa por el polipéptido SENP1 ó telomerasa desconocido presente en una muestra. En un ensayo competitivo, se añade una cantidad conocida de polipéptido SENP1 o telomerasa a una muestra y seguidamente ésta se pone en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SENP1 o telomerasa. La cantidad de polipéptido SENP1 o telomerasa exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporciona a la concentración de polipéptido SENP1 o telomerasa presente en la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo se inmoviliza sobre un sustrato sólido. La cantidad de polipéptido SENP1 o telomerasa unido al anticuerpo puede determinarse mediante la medición de la cantidad de polipéptido SENP1 o de telomerasa presente en un complejo SENP1/anticuerpo o telomerasa/anticuerpo, o alternativamente mediante la medición de la cantidad de proteína no acomplejada remanente.

También puede utilizarse el análisis de transferencia western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de polipéptidos SENP1 o de telomerasa en la muestra. La técnica generalmente comprende separar proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transfiriendo las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nilón o un filtro de nilón derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a SENP1 o a telomerasa. Los anticuerpos anti-SENP1 o anti-telomerasa se unen específicamente a SENP1 o a telomerasa sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden marcarse directamente o, alternativamente, pueden detectarse posteriormente utilizando anticuerpo marcados (por ejemplo anticuerpos antiratón de oveja marcados) que se unen específicamente a los anticuerpos anti-SENP1 o anti-telomerasa.

El experto en la materia apreciará que con frecuencia resulta deseable minimizar la unión no específica en inmunoensayos. Particularmente en el caso de que el ensayo implique un antígeno o anticuerpo inmovilizado sobre un sustrato sólido resulta deseable minimizar la cantidad de unión no específica al sustrato. Los medios para reducir dicha unión no específica son bien conocidos por el experto en la materia.Típicamente esta técnica implica recubrir el sustrato con una composición proteica. En particular, se utilizan ampliamente las composiciones de proteínas, tales como la albúmina de suero bovino (BSA), la leche desnatada en polvo y la gelatina.

El grupo de marcaje o detectable particular utilizado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención, con la condición de que no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que presente una propiedad física o química detectable. Este tipo de marcajes detectables han sido bien desarrollados en el campo de los inmunoensayos y, en general, puede aplicarse en la presente invención la mayoría de marcajes útiles en dichos métodos. De esta manera, un marcaje es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos

: o químicos. Entre los marcajes útiles en la presente invención se incluyen perlas magnéticas, pigmentos fluorescentes, marcajes radioactivos, enzimas y marcajes colorimétricos, tales como el oro coloidal, el vidrio coloreado o las perlas plásticas.

D.: Detección y cuantificación de SENP1 o de la actividad de telomerasa

La cantidad de SENP1 o de telomerasa también puede determinarse mediante la detección de la actividad de las proteínas.

SENP1 es una proteasa que elimina sentrinas de las proteínas. Ver, por ejemplo, la patente US nº 6.596.527; Gong et al., J. Biol. Chem. 275:3355-3359, 2000; y Bailey et al., J. Biol. Chem. 279:692-703, 2004. Por ejemplo, la actividad de SENP1 puede detectarse mediante la detección de la eliminación de las sentrinas de una cantidad conocida de proteína sentrinizada en la muestra.

La actividad de telomerasa puede medirse mediante cualquier ensayo de entre los ensayos conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Hiyama et al., Cancer Lett. 194:221-233, 2004. Por ejemplo, puede utilizarse TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas) para detectar la actividad telomérica con una elevada sensibilidad mediante la utilización de la PCR. Ver Kim N.W. et al., Science 260:2011-2015, 1994; Piatyszek M.A. et al., Meth. Cell Sci. 17:1-15, 1995; Woodring et al., Nuc. Acids Res. 23:3794-3795, 1995; patentes US nº 6.551.774, nº 6.391.554 y nº 5.837.453). Este método implica la detección de telomerasa mediante un sistema de ensayo de extensión de un único cebador y se divide en líneas generales en tres etapas. En primer lugar se extrae telomerasa de las células. A continuación, se lleva a cabo una reacción de extensión de una cadena TTAGGG mediante la telomerasa y los productos de reacción se amplifican mediante PCR utilizando dos cebadores. Finalmente, los productos amplificados se someten a electroforesis para detectar la actividad de telomerasa mediante confirmación de escaleras en una autorradiografía.

Una variación de TRAP incluye el verde SYBR en tiempo real para cuantificar la actividad de la telomerasa. Ver, por ejemplo Wege et al., Nuc. Acids Res. 31 e3, 2003).

Otra variación de TRAP se denomina PCR de extensión telomérica (PTEP). Ver, por ejemplo, Chen et al., Biotechniques 35:158-162, 2003. De manera similar a TRAP, este método se basa en la amplificación por PCR tras la reacción in vitro de la telomerasa, mientras que la reacción in vitro de la telomerasa en el presente caso se termina prematuramente, y no aleatoriamente. Aparte de lo anterior, los productos de extensión telomérica se utilizan como cebadores iniciales, en lugar de como moldes, para inducir la amplificación con un plásmido de ADN especialmente construido como molde que no puede amplificarse directamente con el cebador de telomerasa. Este producto final es un fragmento específico de ADN que refleja la actividad de la telomerasa. El experto en la materia reconocerá que también pueden utilizarse otros métodos para detectar la actividad de telomerasa. Ver, por ejemplo, la publicación de patente US nº 2002/0025518.

III. Estándares de cuantificación para los ensayos de la invención

En muchas realizaciones de la invención, la cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra biológica se compara con uno o más valores estándares. En general, el valor estándar representa la cantidad de SENP1 o de telomerasa encontrada en muestras biológicas procedentes de un individuo sano (por ejemplo no diagnosticado de cáncer y/o que no contiene un número significativo de células de cáncer). Resultarán apropiados diferentes valores estándares dependiendo de varios factores. Por ejemplo, la cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra procedente de un individuo sano puede variar dependiendo del método utilizado para cuantificar SENP1 o telomerasa. Además, el valor estándar puede variar dependiendo de la proporción de falsos positivos y de falsos negativos proporcionados en un ensayo diagnóstico. Por ejemplo, en el caso de que el valor estándar se fije en un valor bajo, el número de falsos negativos se reducirá, pero la proporción de falsos positivos (aquellos sin cáncer que se puntúan como presentando células de cáncer) se incrementará. De esta manera, un usuario puede comparar la cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra con diferentes valores estándares dependiendo de la tolerancia para resultados falsos negativos o falsos positivos.

En algunos casos, el valor estándar se determinará basándose en la media, la mediana u otro cálculo estadístico basado en una pluralidad de muestras que es conocido que no presentan células de cáncer o que es conocido que presentan células de cáncer. El valor estándar no es necesario que sea recalculado para cada ensayo, sino que puede ser un único valor o un intervalo predeterminado. El valor estándar puede almacenarse en una memoria de ordenador y accederse según resulte necesario.

En otras realizaciones, el valor estándar se determinada para cada muestra biológica cada vez que se procesa un conjunto de muestras biológicas. En estos casos, el valor estándar es la cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra que es conocido, o de la que por lo menos se sospecha, que contiene células de cáncer. En algunas realizaciones, estas muestras estándares se recogen del mismo individuo y se someten a ensayo para cáncer. Por ejemplo, pueden obtenerse un tumor sólido y una muestra que no contenga cáncer del mismo individuo y la cantidad de SENP1 y/o de telomerasa en la muestra que no contiene cáncer puede formar la base del valor estándar. En otras realizaciones, las muestras estándares se obtienen de otro individuo o individuos.

En algunos casos, las cantidades de SENP1 o de telomerasa (tanto de la muestra biológica de interés como del estándar de no cáncer) se normalizan respecto a un segundo valor. La normalización resulta útil, por ejemplo, para eliminar o minimizar errores introducidos por un usuario o por ensayos en las cantidades detectadas o para minimizar errores causados por números variables de células en una muestra. La normalización típicamente se basa en un valor que incorpora algunos de los mismos errores. Por ejemplo, la cantidad de un segundo transcrito en la misma muestra biológica puede utilizarse para normalizar los valores de SENP1 o de telomerasa. Típicamente se conoce o se sospecha que el segundo transcrito se encuentra afectado por la presencia o ausencia de células de cáncer en la muestra. Entre los “transcritos normalizadores” ejemplares (también conocidos como transcritos de “genes de mantenimiento”) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las proteínas humanas siguientes: proteína fosfatasa 1, subunidad catalítica, isoforma alfa (PPP1CA), proteína de unión a caja TATA (por ejemplo M55654), HPRT1 (por ejemplo M26434), β-glucuronidasa, β2-microblogulina, fosfoglicerol quinasa 1 (por ejemplo NM-000291), β-actina (por ejemplo NM_001141), receptor de transferrina (por ejemplo NM_003234), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (por ejemplo NM_002046), albúmina de suero humano (por ejemplo NM_000477), tubulina, hipoxantina fosforibosiltransferasa (por ejemplo NM_000194), proteína ribosómica mitocondrial L32 (por ejemplo NM_031903), ARN 28S, ARN 18S, 5-aminolevulinato sintasa, y porfobilinógeno desaminasa Ver también el kit de selección de gen de mantenimiento h LightCycler (Roche Applied Sciences, nº de catálogo 3310159); Thellin O. et al., J. Biotechnol. 75:291, 1999; Warrington J.A. et al., Physiol. Genomics 2:143, 2000). El experto en la materia reconocerá que muchos genes de mantenimiento, entre otros, proporcionarán valores normalizadores equivalentes. Los valores pueden normalizarse según cualquiera de los métodos estadísticos generalmente conocidos, incluyendo la simple división de los valores por la cantidad de transcrito

o de proteína normalizadora.

IV. Registro de un diagnóstico, pronóstico o estadio de cáncer

Los métodos de la invención pueden implicar el registro de la cantidad de SENP1 y/o telomerasa en una muestra y/o un diagnóstico, pronóstico o estadio de cáncer renal.

Dicha información puede registrarse en forma de texto o datos y puede almacenarse en una forma legible por ordenador. Este sistema informático típicamente comprende subsistemas principales, tales como un procesador central, una memoria de sistema (típicamente RAM), un controlador de entrada/salida (I/O), un dispositivo externo, tal como una pantalla de visualización mediante un adaptador de pantalla, puertos en serie, un teclado, una unidad fija de disco mediante un interfaz de almacenamiento y un dispositivo de lectura de disquete para recibir un disquete, y un dispositivo CD-ROM (o DVD-ROM) operativo para recibir un CD-ROM. Pueden conectarse muchos otros dispositivos, tales como un interfaz de red conectado mediante un puerto en serie.

El sistema informático también puede conectarse a una red, comprendiendo una pluralidad de dispositivos informáticos conectados mediante un enlace de datos, tal como un cable Ethernet (coaxial o 10BaseT), una línea telefónica, línea ISDN, red inalámbrica, fibra óptica u otro medio de transmisión de señales adecuado, en el que por lo menos un dispositivo de red (por ejemplo un ordenador, matriz de discos, etc.) comprende un patrón de dominios magnéticos (por ejemplo un disco magnético) y/o dominios de carga (por ejemplo una matriz de celdas DRAM) que componen un patrón de bits codificante de datos captados de un ensayo de la invención. El sistema informático puede comprender código para interpretar los resultados de cuantificación de SENP1 o de telomerasa en una muestra biológica. De esta manera, en una realización ejemplar, los resultados de genotipo se proporcionan a un ordenador en el que un procesador central ejecuta un programa informático para determinar un diagnóstico, pronóstico o estadificación de un cáncer renal.

V. Diagnóstico de cáncer

Los presentes métodos pueden utilizarse en el diagnóstico, pronóstico, clasificación y tratamiento de varios tipos de cáncer. Puede detectarse un cáncer en cualquier estado de progresión, tal como cáncer primario, metastásico y recurrente. La información referente a numerosos tipos de cáncer puede obtenerse, por ejemplo, de la American Cancer Society (www.cancer.org) o de, por ejemplo, Wilson et al., Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12a edición, McGraw-Hill Inc., 1991. La presente invención proporciona métodos para determinar si un mamífero (por ejemplo un ser humano) presenta o no cáncer renal, si una muestra biológica contiene o no células cancerosas, y la eficacia del tratamiento anticáncer en un mamífero que presenta cáncer renal. Dichos métodos se basan en el descubrimiento de que las células de cáncer presentan un nivel elevado de polinucleótido de SENP1. Por consiguiente, mediante la determinación de si una célula contiene niveles elevados de SENP1 o telomerasa resulta posible determinar si la célula renal es cancerosa. Además, la presencia de células renales cancerosas puede determinarse indirectamente, por ejemplo en determinadas realizaciones, una muestra biológica que no contiene ella misma células renales cancerosas, pero que se ha obtenido de un animal que presenta células cancerosas en otras partes de su cuerpo, puede contener niveles elevados de SENP1 o de telomerasa, reflejando la presencia de las células cancerosas.

En numerosas realizaciones de la presente invención, el nivel y/o presencia de SENP1 o telomerasa se detecta en una muestra biológica, detectando de esta manera la presencia o ausencia de células renales cancerosas en la muestra biológica o, en determinadas realizaciones, en el mamífero a partir del que se extrajo la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende una muestra de tejido procedente de un tejido que se sospecha que contiene células renales cancerosas. Por ejemplo, en un individuo que se sospecha que presenta cáncer de vejiga, se biopsia tejido de vejiga o se obtiene orina. En otras realizaciones, se determina la cantidad de SENP1 o telomerasa en un líquido corporal (por ejemplo sedimento urinario; ver, por ejemplo, Melissourgos et al., Urology 62:362-367, 2003), saliva, sangre, semen, etc.). En otras realizaciones, se analiza una muestra de tejido que es conocido que contiene células renales cancerosas, por ejemplo procedentes de un tumor, para medir los niveles de SENP1 o de telomerasa para determinar información sobre el cáncer renal, por ejemplo la eficacia de determinados tratamientos, la esperanza de supervivencia del animal, etc. Con frecuencia, los métodos se utilizan conjuntamente con métodos diagnósticos adicionales, por ejemplo la detección de otros marcadores de cáncer, etc.

Además, los presentes métodos pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un curso de tratamiento. Por ejemplo, en un mamífero con cáncer renal del que se ha encontrado que una muestra biológica contiene una cantidad elevada de SENP1 o telomerasa, puede evaluarse la eficacia de un tratamiento anticáncer mediante el seguimiento de los niveles de SENP1 o telomerasa durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, una reducción de los niveles de SENP1 o de telomerasa en una muestra biológica obtenida de un mamífero tras un tratamiento en comparación con un nivel en una muestra obtenida del mamífero antes del tratamiento, o anteriormente aunque durante el mismo, indica que el tratamiento resulta eficaz.

Los métodos para detectar cáncer renal pueden comprender la detección de una o más secuencias de polinucleótido o de polipéptido asociadas al cáncer. Por consiguiente, puede utilizarse SENP1 o telomerasa individualmente, conjuntamente o en combinación con otros marcadores para el diagnóstico o pronóstico del cáncer renal.

Los métodos de la presente invención pueden utilizarse para determinar el curso óptimo de tratamiento en un mamífero que presenta cáncer renal. Por ejemplo, la presencia de un nivel elevado de SENP1 o de telomerasa puede indicar una esperanza de supervivencia reducida de un mamífero que presenta cáncer renal, indicando de esta manera un tratamiento más agresivo para el mamífero. Además, puede establecerse fácilmente una correlación entre los niveles de SENP1 o de telomerasa, o la presencia o ausencia diagnóstica de SENP1 ó de telomerasa (es decir, una cantidad de SENP1 ó de telomerasa superior al valor estándar) y la eficacia relativa de uno u otro agente anticáncer. Dichos análisis pueden llevarse a cabo, por ejemplo, retrospectivamente, es decir, mediante la detección de los niveles de SENP1 o de telomerasa en muestras obtenidas previamente de mamíferos que posteriormente han sido sometidos a uno o más tipos de terapia anticáncer, y la correlación de los niveles de SENP1 ó de telomeraa con la eficacia conocida del tratamiento.

Al realizar un diagnóstico, pronóstico o evaluación de riesgo o clasificación basada en la expresión de SENP1 y de telomerasa, la cantidad de expresión de SENP1 y/o de telomerasa puede compararse con un valor estándar, tal como se ha comentado anteriormente. En algunos casos, puede realizarse un diagnóstico o pronóstico del cáncer renal en el caso de que la expresión de SENP1 y de telomerasa en la muestra biológica sea más alta que el valor estándar. En algunos casos, la cantidad de expresión de SENP1 y/o de telomerasa en la muestra biológica es por lo menos 10% más, 25% más, 50% más, 75% más, 90% más, 2 veces más, 3 veces más, 5 veces más, 10 veces más, 50 veces más

o superior en más de 100 veces al valor estándar (o a un valor que representa la expresión de SENP1 y de telomerasa en una muestra que no contiene cáncer).

VI. Preparación de muestras y amplificación de ácidos nucleicos

Las muestras generalmente se derivan o se aíslan a partir de sujetos, típicamente sujetos mamíferos, más típicamente de sujetos humanos. Opcionalmente se utiliza esencialmente cualquier técnica para obtener estas muestras, incluyendo, por ejemplo, biopsia, raspado, venipunción, exudados u otras técnicas conocidas de la técnica.

Los métodos para almacenar especimenes, cultivar células, aislar y preparar ácidos nucleicos a partir de dichas fuentes son generalmente conocidos de la técnica y muchos de ellos se describen adicionalmente en las referencias y/o ejemplos proporcionados en la presente memoria.

A título de ilustración adicional, antes de analizar los ácidos nucleicos diana indicados en la presente memoria, dichos ácidos nucleicos pueden purificarse o aislarse a partir de muestras que típicamente incluyen mezclas complejas de diferentes componentes. Las células en las muestras recogidas típicamente se lisan para liberar el contenido celular. Por ejemplo, las células en el sedimento urinario pueden lisarse mediante su puesta en contacto con diversos enzimas

: o compuestos químicos, y/o lisarse mediante otros enfoques conocidos de la técnica. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se analizan directamente en el lisado celular. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos se purifican

: o extraer adicionalmente a partir de los lisados celulares antes de la detección. Puede utilizarse esencialmente cualquier método de extracción de ácidos nucleicos para purificar los ácidos nucleicos en las muestras utilizadas en los métodos de la presente invención. Entre las técnicas ejemplares que pueden utilizarse para purificar ácidos nucleicos se incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad, la hibridación a sondas inmovilizadas sobre soporte sólidos, la extracción líquido-liquido (por ejemplo la extracción fenol-cloroformo, etc.), la precipitación (por ejemplo utilizando etanol, etc.), la extracción con papel de filtro, la extracción con reactivos formadores de micelas (por ejemplo cetil-trimetilamonio-bromuro, etc.), la unión a pigmentos intercalantes inmovilizados (por ejemplo bromuro de etidio, acridina, etc.), la adsorción a gel de sílice o a tierras diatomáceas, la adsorción a partículas de vidrio magnéticas o a partículas de organosilano bajo condiciones caotrópicas, y/o similares. El procesamiento de muestras también se describe en, por ejemplo, las patentes US nº 5.155.018, nº 6.383.393 y nº 5.234.809.

A título de ejemplo adicional, los ácidos nucleicos no modificados pueden unirse a un material con una superficie de sílice. Muchos de los procedimientos que se adaptan opcionalmente para la utilización en la puesta en práctica de los métodos de la presente invención se encuentran descritos en la técnica.A título ilustrativo, Vogelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619, 1979, describe la purificación de ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa en presencia de yoduro sódico utilizando vidrio al plomo molido. Marko et al., Anal. Biochem. 121:382-387, 1982, describen la purificación de ácidos nucleicos a partir de bacterias sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato sódico. En el documento DE nº A-3734442, se aíslan ácidos nucleicos sobre filtros de fibra de vidrio. Los ácidos nucleicos unidos a estos filtros de fibra de vidrio se lavan y después se eluyen con un tampón Tris/EDTA que contiene metanol. Se describe un procedimiento similar en Jakobi et al., Anal. Biochem. 175.196-201, 1988. En particular, Jakobi et al. describen la unión selectiva de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas y la separación de ácidos nucleicos de contaminantes, tales como agarosa, proteínas y residuos celulares. Para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, las partículas pueden centrifugarse o pueden pasarse líquidos a través de los filtros de fibra de vidrio. Además, la utilización de partículas magnéticas para inmovilizar los ácidos nucleicos tras la precipitación mediante la adición de sal y etanol se describe en, por ejemplo, Alderton et al., Anal. Biochem. 201:166-169, 1992, y en la patente PCT nº GB91/00212. En este procedimiento, los ácidos nucleicos se aglutinan conjuntamente con las partículas magnéticas. El aglutinado se separa del solvente original mediante la aplicación de un campo magnético y realizando una o más etapas de lavado. Tras por lo menos una etapa de lavado, los ácidos nucleicos típicamente se disuelven en un tampón Tris.

Las partículas magnéticas en una matriz de vidrio poroso que se cubre con una capa que incluye, por ejemplo, estreptavidina también puede utilizarse en determinadas realizaciones de la invención. Estas partículas pueden utilizarse, por ejemplo, para aislar ácidos nucleicos y proteínas conjugadas con biotina. También se utilizan opcionalmente partículas ferrimagnéticas, ferromagnéticas y superparamagnéticas. Las partículas de vidrio magnéticas y métodos relacionados que pueden adaptarse para la utilización en la puesta en práctica de los métodos descritos en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, la patente WO nº 01/37291.

VIa. Realizaciones preferentes de la invención

A continuación se describen realizaciones particularmente preferentes de la invención. Una realización preferente de la invención es un método para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica, en la que la expresión de SENP1 se encuentra incrementada en dicha muestra en comparación con una muestra que es conocido o se sospecha que no contiene células de cáncer, comprendiendo el método las etapas de determinar la cantidad de SENP1 mediante la detección del ARNm codificante de SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta o que se sospecha que presenta cáncer renal.

El metodo opcionalmente puede comprender la etapa de obtener la muestra biologica del individuo antes de determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biologica. Preferentemente, el método comprende además la etapa de registrar un diagnóstico de cáncer renal.

En una realizacion preferente, se determina la cantidad de SENP1 mediante la deteccion de un polinucleotido codificante de SENP1 en la muestra. Por lo tanto, preferentemente la etapa de determinar la cantidad de SENP1 comprende la etapa de detectar un polinucleótido codificante de SENP1 en la muestra. Esta etapa de detección puede comprender amplificar el polinucleótido en una reacción de amplificación. Preferentemente, la reacción de amplificación comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes, comprendiendo una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1. Preferentemente, se detecta el producto de amplificación de la reacción de amplificación en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el producto. Preferentemente, la reacción de amplificación comprende una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.

En una realización preferente, el método puede comprender además la etapa de determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica. Preferentemente, el método comprende además la etapa de comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y con un estándar de telomerasa, respectivamente, en donde el estándar de SENP1 representa SENP1 en células normales y el estándar de telomerasa representa las cantidades de telomerasa en células normales.

En resumen, en una realización preferente de la invención, se proporciona un método para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta o que se sospecha que presenta un cáncer renal, comprendiendo el método la determinación de la cantidad de SENP1 en la muestra biológica mediante:

a) la amplificación de un ARNm codificante de SENP1 en la muestra biológica en una reacción de amplificación, y

b) detectar la cantidad del producto de amplificación de la etapa a) para detectar la expresión de SENP1 en la muestra biológica.

Preferentemente, la reacción de amplificación comprende por los dos oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia idéntica por lo menos al 90% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1, o de un complemento de la misma, de manera que durante la reacción de amplificación los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de SEC ID nº 1.

Preferentemente, (la cantidad de) el producto de amplificación de la reacción de amplificación se detecta en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el producto. Preferentemente, la reacción de amplificación comprende además una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.

En una realización preferente, el método puede comprender además la etapa de determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica. Preferentemente, el método comprende además la etapa de comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y con un estándar de telomerasa, respectivamente, en donde el estándar de SENP1 representa SENP1 en células normales y el estándar de telomerasa representa las cantidades de telomerasa en células normales. El estándar preferentemente es una muestra biológica (que comprende células) procedente de un individuo de control que no presenta cáncer renal.

En otra realización preferente de la invención, se proporciona un método para determinar si una muestra biológica de un paciente comprende células de cáncer renal, comprendiendo las etapas de:

a) determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biológica, b) determinar la cantidad de SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo de control que no presenta cáncer renal,

una diferencia significativa entre la cantidad de SENP1 en la muestra biológica del paciente y la cantidad de SENP1 en la muestra biológica del individuo de control es una indicación de que la muestra biológica comprende células renales cancerosas.

Una diferencia significativa es preferentemente una diferencia de 1,5 veces o superior, más preferentemente una diferencia de dos veces o superior.

La etapa de determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biológica preferentemente comprende las etapas de:a) amplificar un polinucleótido codificante de SENP1 en la muestra biológica en una reacción de amplificación, yb) detectar la cantidad del producto de amplificación de la etapa a) con el fin de determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biológica.

En una realización preferente, el método puede comprender además la etapa de determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica. Preferentemente, el método comprende además la etapa de comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y con un estándar de telomerasa, respectivamente, en donde el estándar de SENP1 representa SENP1 en células normales y el estándar de telomerasa representa las cantidades de telomerasa en células normales. El estándar preferentemente es una muestra biológica (que comprende células) procedente de un individuo de control que no sufre cáncer renal.

VII. Kits

La presente invención proporciona además kits para el diagnóstico de cáncer mediante la detección de SENP1 y de telomerasa (por ejemplo polinucleótidos, polipéptidos, o actividad). Los kits de la invención generalmente comprenden reactivos para detectar polipéptidos SENP1 y/o telomerasa y/o polinucleótidos de SENP1 y/o de telomerasa, y opcionalmente contienen instrucciones escritas para su utilización.

En algunas realizaciones, los kits de la invención comprenden reactivos para amplificar polinucleótidos de SENP1 y/o de telomerasa. Entre dichos reactivos pueden incluirse, por ejemplo, cebadores específicos de SENP1 y/o de telomerasa y/o sondas detectablemente marcadas (por ejemplo 5' exonucleasa, baliza molecular o sondas Scorpion). Los kits opcionalmente pueden incluir reactivos de amplificación, tales como polimerasas termoestables, transcriptasa inversa, nucleótidos, tampones y sales, u otros componentes, tal como se describe en la presente memoria o que son conocidos de la técnica.

En algunos casos los kits comprenden por lo menos un oligonucleótido que comprende una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o de un complemento de la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1.

En algunos casos, los kits comprenden además el oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o de un complemento de la misma.

En algunos casos los kits comprenden por lo menos un oligonucleótido que comprende una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más nucleótidos contiguos de:

i) ARN de telomerasa humana (TERC),

ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),

iii) un complemento de TERC, oiv) un complemento de TERT, de manera que, al someter el oligonucleótido y TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de TERT.

En algunos casos, los kits comprenden el oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más nucleótidos contiguos de: i) ARN de telomerasa humana (TERC),

ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),

iii) un complemento de TERC, o

iv) un complemento de TERT,

En otras realizaciones, los kits de la invención comprenden reactivos que se unen específicamente a polipéptidos SENP1 o telomerasa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los kits de la invención comprenden un primer anticuerpo que se une específicamente a SENP1 o a telomerasa. Los kits también pueden comprender un segundo anticuerpo que se una al primer anticuerpo (es decir, de una especie diferente) y un marcaje detectable.

VIII. Cribado para antagonistas de SENP1

Pueden utilizarse varios protocolos de cribado diferentes para identificar agentes que modulan el nivel de actividad de SENP1 en las células, por ejemplo en células de mamífero, por ejemplo en células humanas. En términos generales, los métodos de cribado pueden implicar el cribado de una pluralidad de agentes para identificar un agente que interactúa con SENP1, por ejemplo uniéndose a SENP1 e impidiendo la actividad de SENP1 ó impidiendo que un activador de SENP1 active SENP1.

1. 1. Ensayos de unión de SENP1

Pueden llevarse a cabo cribados preliminares mediante cribado de agentes capaces de unirse a SENP1, debido a que por lo menos algunos de los agentes identificados de esta manera pueden ser antagonistas de SENP1. Los ensayos de unión habitualmente implican poner en contacto una proteína SENP1 con uno o más agentes de ensayo y dejar suficiente tiempo para que la proteína y los agentes de ensayo formen un complejo de unión. Puede detectarse cualquier complejo de unión formado utilizando cualquiera de entre varias técnicas analíticas establecidas. Entre los ensayos de unión a proteína se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los ensayos de unión inmunohistoquímicos, la citometría de flujo u otros ensayos que mantienen la conformación de SENP1. La SENP1 utilizada en dichos ensayos puede ser de expresión natural, clonada o sintética.

Los ensayos de unión también resultan útiles, por ejemplo, para identificar proteínas endógenas que interactúan con SENP1.

2. Células y reactivos

Los métodos de cribado de la invención pueden llevarse a cabo en forma de ensayos in vitro o basados en células. Los ensayos basados en células pueden llevarse a cabo en cualquier célula en la que se exprese un polipéptido SENP1 endógena o exógenamente. En algunas realizaciones, los ensayos basados en células pueden llevarse a cabo utilizando células que presentan una actividad o expresión de telomerasa reducida o indetectable y/o que presentan un fenotipo neoplásico. En algunas realizaciones, las líneas celulares inmortales negativas para la expresión de TERT se someten a ensayo para su susceptibilidad a inhibidores potenciales de SENP1. Estas líneas celulares negativas para telomerasa se propone que resultan útiles en dicho cribado debido a que probablemente replican sus telómeros mediante un mecanismo independiente de telomerasa (alargamiento alternativo de telómeros, o "ALT"). Sin pretensión del imitar el alcance de la invención a un mecanismo de acción particular, los presentes inventores proponen que SENP1 se encuentra implicado en el mantenimiento de ALT. La inhibición de ALT por un inhibidor de SENP1 en este caso se predice que resultaría en una alteración de la estructura telomérica, inhibiéndose finalmente la división de estas células. Por el contrario, en los casos en los que la telomerasa se encuentra activa en las líneas celulares, la telomerasa continuaría permitiendo la división celular incluso en presencia de un inhibidor de SENP1.

Son conocidos de la literatura ejemplos de células que no expresan telomerasa (células "ALT"). Ver, por ejemplo, Tsutsui T. et al., Carcinogenesis 24:953-965, 2003; Bryan T.M., Hum Mol Genet 6:921-926, 1997; Guilleret I. et al., Carcinogenesis 23:2025-2030, 2002. Entre los ejemplos de líneas celulares ALT se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las células SUSM-1, WI38 VA13/2RA, BET-3M, GM847, MeT-4A, IIICF/c, IIICF-T/A6, MDAH 087, Saos-2 y U-2.

La inhibición de ALT puede detectarse mediante ensayo de un cambio de la longitud de los telómeros (ver, por ejemplo, el ensayo de longitud de los telómeros TeloTAGGG, de Roche Applied Biosystems, o Tsutsui T. et al., Carcinogenesis 24:953-965, 2003), o en un cambio de marcadores morfológicos tales como la presencia de cuerpos PML que presenta una forma de "rosquilla" en células ALT en lugar de la apariencia normal puntiforme de los PML-NB en las células que no experimentan ALT (ver, por ejemplo, Yeager T.R. et al., Cancer Res. 59:4175-4179, 1999, la inhibición de la división celular (determinada mediante, por ejemplo, el recuento del número de células en diferentes puntos del tiempo (por ejemplo utilizando productos Guava TechnologyTM), la utilización de ensayos basados en agar blando para realizar un recuento del número de colonias en diferentes puntos del tiempo, la utilización de tecnología de estadificación para determinar el estadio del ciclo celular en el que se encuentran las células, el análisis visual de las células mediante microscopía, los análisis cromosómicos o la tecnología CellomicsTM o el análisis de la expresión de las proteínas, por ejemplo mediante transferencia western o análisis inmunohistoquímicos).

Los ensayos basados en células pueden implicar células completas o fracciones celulares que contengan SENP1 para cribar para un agente de unión o de modulación de la actividad de SENP1 por parte del agente. Las células utilizadas en los ensayos basados en células pueden ser células primarias o células tumorales, u otros tipos de líneas celulares inmortales. Evidentemente SENP1 puede expresarse en células que no expresan endógenamente SENP1.

3. Señalización de la actividad o sucesos posteriores

También puede realizarse un seguimiento de la actividad de señalización o de otros sucesos posteriores regulados por SENP1 para identificar los antagonistas de SENP1. De esta manera, en algunas realizaciones, se pone en contacto una pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1 y las células seguidamente se criban para un cambio de señalización o de un suceso posterior. El grupo de agentes que modulan un suceso posterior regulado por SENP1 típicamente se encuentra enriquecida en antagonistas de SENP1 debido a que por lo menos algunos de los agentes identificados probablemente son antagonistas directos de SENP1. Entre los sucesos posteriores se incluyen aquellas actividades o manifestaciones que se producen como resultado de la inhibición de SENP1, y entre ellos pueden incluirse, por ejemplo, un crecimiento celular reducido (medido, por ejemplo, como recuento de colonias en agar blando o utilizando sistemas de análisis celulares, tales como los de Guava Technologies, Hayward, CA),

cambios en el estadio del ciclo celular (medidos, por ejemplo, utilizando el análisis de imágenes de tinción de anticuerpos HT, por ejemplo de Cellomics, Pittsburg, PA, o mediante métodos citológicos estándares) o cambios en la expresión de proteínas, incluyendo, por ejemplo, la transferencia western o la microscopía.

Crecimiento en agar blando o formación de colonias en suspensión

Las células normales requieren un sustrato sólido para engancharse y crecer. Las células neoplásica han perdido este fenotipo y crecen desenganchadas del sustrato. Por ejemplo, las células neoplásicas pueden crecer en cultivo en suspensión agitada o suspendidas en medios semisólidos, tales como agar semisólido o blando. Las células neoplásicas, al transfectarse con genes de supresor tumoral o al entrar en contacto con un antagonista de SENP1, pueden regenerar el fenotipo normal y requerir un sustrato sólido para engancharse y crecer. De esta manera, el crecimiento en agar blando o la formación de colonias en ensayos en suspensión pueden utilizarse para identificar los agentes que reducen o eliminan la proliferación y transformación celulares anormales, incluyendo el crecimiento en agar blando.

Las técnicas para el crecimiento en agar blando o la formación de colonias en ensayos en suspensión se describen en Freshney, Culture of Animal Cells:a Manual of Basic Technique (3a edición, 1994), incorporada como referencia en la presente memoria.

Inhibición por contacto y limitación por densidad del crecimiento

Las células normales típicamente crecen en un patrón plano y organizado en una placa de Petri hasta que entran en contacto con otras células. Al entrar en contacto mutuo las células, resultan inhibidas por contacto y detienen su crecimiento. Sin embargo, al transformar las células, éstas no resultan inhibidas por contacto y continúan creciendo hasta densidades elevadas en focos desorganizados. De esta manera, las células transformadas crecen hasta una densidad de saturación más lata que las células normales. Esto puede detectarse morfológicamente por la formación de una monocapa desorientada de células o células redondeadas en focos dentro del patrón regular de las células circundantes normales. Alternativamente, puede utilizarse el índice de marcaje con (3H)-timidina a la densidad de saturación para medir la limitación por densidad del crecimiento. Ver Freshney, supra, 1994. Las células transformadas, al ser transfectadas por genes de supresión tumoral, regeneran un fenotipo normal y resultan inhibidas por contacto y crecerían hasta una densidad más baja.

Puede utilizarse el índice de marcaje con (3H)-timidina a la densidad de saturación para medir la limitación por densidad del crecimiento. Por ejemplo, las células huésped transformadas pueden ponerse en contacto con un candidato a antagonista de SENP1 y después cultivarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo 24 horas) hasta la densidad de saturación en condiciones de medio no limitante. El porcentaje de células marcadas con (3H)-timidina puede determinarse autorradiográficamente. Ver Freshney, supra, 1994.

Dependencia de factor de crecimiento o de suero

Las células transformadas presentan una dependencia del suero más baja que sus contrapartidas normales (ver, por ejemplo, Temin, J. Natl. Cancer Insti. 37:167-175, 1966; Eagle et al., J. Exp. Med. 131:836-879, 1970; Freshney, supra).Esto en parte se debe a la liberación de diversos factores de crecimiento por parte de las células transformadas. La dependencia de factor de crecimiento o de suero de las células que entran en contacto con un candidato a antagonista de SENP1 puede compararse con la de un control.

Niveles de marcadores específicos tumorales

Los tumores o las células neoplásicas liberan una cantidad incrementada de determinados factores (en lo sucesivo denominados "marcadores específicos tumorales") en comparación con sus contrapartidas normales. Por ejemplo, se libera un activador del plasminógeno (PA) del glioma humano a un nivel más alto que de las células cerebrales normales (ver, por ejemplo, Gullino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth, en: Biological Responses in Cancer, páginas 178 a 184 (Mihich (editor) 1985). De manera similar, se libera factor de angiogénesis tumoral (TAF) a un nivel más alto en las células tumorales que en sus contrapartidas normales. Ver, por ejemplo, Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem. Cancer Biol., 1992.

Se describen diversas técnicas que miden la liberación de dichos factores en Freshney, supra, 1994. Ver, además, Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305, 1974; Strickland y Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702, 1976; Whur et al., Br. J. Cancer 42:305-312, 1980; Gullino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth, en: Biological Responses in Cancer, páginas 178 a 184, Mihich (editor), 1985; Freshney, Anticancer Res. 5:111-130, 1985.

Invasividad en matrigel

El grado de invasividad en matrigel o en algún otro constituyente de la matriz extracelular puede utilizarse en un ensayo para identificar los antagonistas de SENP1. Las células tumorales muestran una buena correlación entre la malignidad y la invasividad de las células en matrigel o en algún otro constituyente de la matriz extracelular. En este ensayo pueden utilizarse células neoplásicas, en las que una invasividad reducida de las células tras entrar en contacto con un agente puede indicar que el agente es un antagonista de SENP1.

Pueden utilizarse las técnicas descritas en Freshney, supra, 1994. Brevemente, puede medirse el nivel de invasión de las células huésped mediante la utilización de filtros recubiertos con Matrigel o con algún otro constituyente de la matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través de la cara distal del filtro, se cuantifica como invasividad, y se estima histológicamente a partir del número de células y la distancia desplazada, o mediante marcaje previo de las células con I125 y recuento posterior de la radioactividad en la cara distal del filtro o en el fondo de la placa. Ver, por ejemplo, Freshney, supra, 1984.

4.: Validación

Los agentes identificados inicialmente mediante cualquier de los métodos de cribado anteriormente indicados pueden someterse a ensayo adicionalmente para validar la actividad aparente. En algunas realizaciones, dichos estudios se realizan utilizando modelos animales adecuados. El formato básico de dichos métodos implica administrar un compuesto cabeza de serie identificado durante un cribado inicial en un animal que sirve como modelo de la enfermedad humana que debe tratarse y después se determina si SENP1 se encuentra de hecho modulada y/o si la enfermedad o condición ha mejorado. Los modelos animales utilizados en los estudios de validación generalmente son mamíferos de cualquier tipo. Entre los ejemplos específicos de animales adecuados se incluyen, aunque sin limitación, primates, ratones y ratas.

5.: Agentes que interactúan con SENP1

Los agentes sometidos a ensayo como moduladores de SENP1 pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entidad biológica, tal como un polipéptido (por ejemplo un péptido), azúcar, ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, ARNip o polinucleótidos antisentido) o lípido. Puede utilizarse esencialmente cualquier compuesto químico como modulador potencial (por ejemplo antagonista) o ligando en los ensayos de la invención, aunque con más frecuencia se utilizan compuestos que pueden disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente basadas en DMSO). Los ensayos se diseñan para cribar bibliotecas químicas grandes mediante la automatización de las etapas e ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente para los ensayos, que típicamente se realizan en paralelo (por ejemplo en formatos de microtitulación, o en placas de microtitulación en ensayos robotizados). Se apreciará que existen muchos proveedores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St.Louis, MO), Aldrich (St.Louis, MO), Sigma-Aldrich (St.Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza) y similares.

En algunas realizaciones, los agentes presentan un peso molecular inferior a 1.500 daltons, y en algunos casos inferior a 1.000, 800, 600, 500 ó 400 daltons. El tamaño relativamente reducido de los agentes puede resultar deseable debido a que las moléculas más pequeñas presentan una probabilidad más alta de presentar propiedades físicoquímicas compatibles con buenas características farmacocinéticas, incluyendo la absorción oral, que los agentes que presentan un peso molecular más alto. Por ejemplo, los agentes que es menos probable que presenten éxito como fármacos basándose en la permeabilidad y solubilidad han sido descritos por Lipinski et al. de la manera siguiente: que presentan más de 5 donantes de enlaces de H (expresado como la suma de los OH y los NH), que presentan un peso molecular superior a 500, que presentan un logP superior a 5 (o un MLogP superior a 4,15) y/o que presentan más de 10 aceptores de enlaces de H (expresado como la suma de los N y los O). Ver, por ejemplo, Lipinski et al., Adv. Drug Delivery Res. 23:3-25, 1997.

En algunas realizaciones, los métodos de cribado de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca combinatorial química o de péptidos que contiene un gran número de potenciales compuestos terapéuticos (compuestos moduladores o ligandos potenciales). Dichas "bibliotecas químicas combinatoriales" o "bibliotecas de ligandos" seguidamente se criban en uno o más ensayos, tal como se describe en la presente memoria, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de esta manera pueden servir como "compuestos cabeza de serie" convencionales o pueden ser utilizados ellos mismos como terapéuticos potenciales o reales.

Una biblioteca química combinatorial es una colección de diversos compuestos químicos generados mediante síntesis química o síntesis biológica, mediante la combinación de varios "bloques constructivos" químicos, tales como reactivos. Por ejemplo, se forma una biblioteca química combinatorial lineal, tal como una biblioteca de polipéptidos, mediante la combinación de un conjunto de bloques constructivos químicos (aminoácidos) de todas las posibles maneras para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Pueden sintetizarse millones de compuestos químicos mediante dicha mezcla combinatorial de bloques constructivos químicos.

La preparación y cribado de bibliotecas combinatoriales químicas son bien conocidos para el experto en la materia. Entre dichas bibliotecas combinatoriales químicas se incluyen, aunque sin limitación, bibliotecas de péptidos (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.010.175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493, 1991, y Houghton et al., Nature 354:84-88, 1991). También pueden utilizarse otros compuestos quimicos para generar bibliotecas de diversidad química. Entre dichos compuestos químicos se incluyen, aunque sin limitación: peptoides (por ejemplo la publicación de patente PCT nº WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo la publicación de patente PCT nº WO 93/20242), biooligómeros aleatorios (por ejemplo la publicación de patente PCT nº WO 92/00091), las benzodiacepinas (por ejemplo la patente US nº 5.288.514), diversómeros, tales como hidantoínas, benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913, 1993), polipéptido vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568, 1992), peptidomiméticos no peptídicos con andamiaje de glucosas (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218, 1992), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661, 1994), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303, 1993) y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658, 1994), bibliotecas de ácidos nucleicos (ver Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra), bibliotecas de péptidos de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (ver, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996, y la patente PCT nº US 96/10287), bibliotecas de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang et al., Science 274:1520-1522, 1996, y la patente US nº 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver, por ejemplo, benzodiacepinas, patente US nº 5.549.974; pirrolidinas, patentes US nº 5.525.735 y nº 5.519.134; compuestos morfolino, patente US nº 5.506.337; benzodiacepinas, nº 5.288.514, y similares).

Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatoriales se encuentran comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem.Tech., Louisville, KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050; Plus, Millipore, Bedford, MA). Además, numerosas bibliotecas combinatoriales se encuentran ellas mismas comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J.; Tripos Inc., St.Louis, MO; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

SENP1 se encuentra estructuralmente relacionado con la familia de proteínas de la ubiquitina y esta similitud puede utilizarse para ayudar a diseñar antagonistas de SENP1. La familia de modificadores similares a ubiquitinas pequeñas (Ub1) (SUMO, revisadas en Muller S. et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2:202-210, 2001) y Yeh E.T. et al., Gene 248:1-14, 2000), de entre los que SENP1 es un miembro, se relaciona con la familia de las ubiquitinas. Aunque laidentidad de secuencias entre las dos familias es <20%, las estructurales globales son muy similares (2,1 Å rmsd para los residuos del núcleo [21 a 93 y 1 a 72 de SUMO-1 y de la ubiquitina, respectivamente] (Bayer P. et al., 280:275-286, 1998). Ambas proteínas se unen covalentemente mediante su grupo -COOH C-terminal al grupo ε-NH2 de una cadena lateral de una lisina (enlace isopeptídico) de la proteína diana. La ubiquitina y la SUMO presentan motivos diglicina conservados próximos al extremo C-terminal. La conjugación de ubiquitina y SUMO es un procedimiento complejo que implica varias etapas: corte de la cola de C, activación, y transferencia final (Johnson E.S. et al., Embo J. 16:5509-5519, 1997; Gong L. et al., FEBS Lett.

Al contrario que la ubiquitina, las SUMOs no forman uniones poliméricas debido a la sustitución del equivalente a Lys-48 de la ubiquitina por Gln. Las rutas de la SUMO y de la ubiquitina difieren principalmente en la consecuencia de la modificación: el resultado mejor caracterizado de la ubiquitinación es el direccionamiento de la proteína etiquetada al proteasoma 26S para la degradación.

Las proteínas SUMOiladas no se destinan a la degradación.

Se han identificado tres genes SUMO en el ser humano (ver la Tabla 1 para los números de acceso). Existe una similitud/identidad de secuencia de 62,0%/49,0% entre Smt3 y la SUMO-1 humana (ver la Tabla 2). Se ha obtenido la estructura solución para la SUMO-1 humana (Bayer P. et al., J. Mol. Biol. 280:275-286, 1988).

Tabla 1: Secuencias (números de acceso de SWISSPROT), motivos Pfam y estructuras (archivos PDB).

Secuencia/motivo/estructura: Descripción

YEASTGP:ULP1: Ulp1 de S. cerevisiae

YEASTGP:ULP2: Ulp1 de S. cerevisiae

SW_HUM:SEN1_HUMAN: SENP1 de H.sapiens

SW HUM:SEN2_HUMAN: SENP2 de H.sapiens

SW HUM:SEN3_HUMAN: SENP3 de H.sapiens

SW HUM:SEN5 HUMAN: SENP5 de H.sapiens

SW HUM:SEN6 HUMAN: SENP6 de H.sapiens

SW HUM:SEN7 HUMAN: SENP7 de H.sapiens

SW HUM:SEN8 HUMAN: SENP8 de H.sapiens

PF02902: Pfam Ulp1 C (familia de SENP)

leuv.pdb: Estructura de rayos X de Ulp1-Smt3 de levadura

PF00443: Hidrolasa ubiquitina carboxilo-terminal Pfam (familia de UCH)

SW_HUM:UBL3_HUMAN (P15374): Isozima L3 de hidrolasa ubiquitina carboxilo-terminal de H. sapiens

SW_ HUM:UBL1_HUMAN (P09936): Isozima L1 de hidrolasa ubiquitina carboxilo-terminal de H. sapiens

SW_HUM:UBL5_HUMAN (Q9y5k5): H.sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5

1 uch.pdb: Estructura de rayos X de UCH-L3 de H. sapiens

1 cmx.pdb: Estructura de rayos X de UCH-ubiquitina aldehído de levadura

SW_HUM:SM33 HUMAN: SUMO-1 de H. sapiens

SW_HUM:SM32 HUMAN: SUMO-? de H. sapiens (Sentrina 2)

SW_HUM: SM3 HUMAN: SUMO-? de H. sapiens

YEASTGP:SMT3: Smt3 de S. cerevisiae

SW_HUM:UBIQ_HUMAN: Ubiquitina de H. sapiens

PF00240: Familia de ubiquitinas Pfam

la5r.pdb: Estructura de RMN de SUMO-1 de H. sapiens (Sm33)

Tabla 2: Similitud de secuencias/matriz de identidad para Sm de H. sapiens (SUMO) y Smt3 de S. cerevisiae. Por ejemplo: Sm31 y Sm32 presentan una similitud de 98,94% y una identidad de 96,81%.

s s s 1 1 u m m m a e b 3 3 3 5 u i

1 2 3 r v q

h h h h

u u u u

m m m m

a a a a

n n n n

sm31_huma 96,81 48,96 48,96 48,10 15,79 3 huecos

n

sm32_huma 98,94 50,00 50,00 46,84 15,79 3 huecos

n

sm33_huma 65,62 64,89 100,00 50,63 18,42 3 huecos

n

la5r 65,62 64,89 100,00 50,63 18,42 2 huecos

leuv 62,03 63,29 65,82 65,82 13,33 4 huecos

ubiq_human 39,47 39,47 42,11 42,11 37,33 2 huecos

La SUMOilación es un procedimiento reversible y dinámico. El corte de SUMO de su diana (deSUMOilación) está catalizado por cisteína proteasas denominadas ULP (proteasas similares a ubiquitina) en levaduras y las SENP o SUSP en el ser humano (proteasas específicas de sentrina/SUMO) (Li S.J. y M. Hochstrasser, Nature 398:246-251, 1999; Bailey D. y P. O'Hare, J. Biol. Chem. 279:692-703, 2004). Se han identificado dos ULP en levaduras (Ulp1 y Ulp2) y por lo menos siete SENP en el ser humano (ver la Tabla 1). Dichas proteasas desempeñan un doble papel en la rutra de SUMOilación: el procesamiento de la cola C-terminal para generar el motivo diglicina y la desconjugación mediante hidrólisis del enlace isopeptídico Gly-Lys. No cortan los enlaces isopeptídicos de la ubiquitina. En la levadura, la función desconjugante de Ulp1 resulta esencial (Li S.J. y M. Hochstrasser, Nature 398:246-251, 1999). Resulta razonable conjeturar que las diversas SENP diferentes en los mamíferos han evolucionado para funcionar con diferentes formas de SUMO. Además, la localización subcelular supone una restricción fisiológicamente significativa de la especificidad de la isopeptidasa de SUMO. Por ejemplo, SENP1 puede desconjugar SUMO-1 de Ran GAP1 in vitro, pero no in vivo. Esto se atribuye al hecho de que Ran GAP1 se encuentra unido a las fibrillas citoplasmáticas del complejo del poro nuclear, mientras que SENP1 se localiza en el núcleo (Gong L. et al., J. Biol. Chem. 275:3355-3359, 2000). Se observa una señal de localización nuclear (NLS1) en SENP1 en la posición 171-177.

Una alineación de las siete secuencias humanas de SENP y las dos de ULP indica que existe conservación en el dominio catalítico C-terminal del núcleo (residuos 420 a 643 de SENP1, ver la Tabla 3), que presenta los residuos absolutamente conservados de Cys, His y Asp, los cuales forman la tríada catalítica, y un Gln que forma el orificio oxianión en el sitio activo (Gong L. et al., J. Biol. Chem. 275:3355-3359, 2000). El dominio N-terminal variable se cree que desempeña un papel regulador, ya que la expresión del dominio catalítico C-terminal por sí solo conduce a niveles más bajos de SUMO-1, lo que es indicativo de actividad catalítica constitutiva (Bailey D. y P. O'Hare, J. Biol. Chem. 279:692-703, 2004).

Tabla 3: Matriz (inferior/superior) de similitud/identidad de secuencias para las familias de SENP de H. sapiens y ULP de S. cerevisiae. Por ejemplo: SENP1 y SENP2 presentan una similitud de 73,71% y una identidad de 60,3%.

s
s
s
s
s
s
s: u 1

e
e
e
e
e
e
e: 1
e

n p 1: n p 2 n p 3 n p 5 n p 6 n p 7 n p 8 p 2 - u v

h
h
h
h
h
h
h: y

u
u
u
u
u
u
u: e

m
m
m
m
m
m
m: a

a
a
a
a
a
a
a: s

n
n
n
n
n
n
n: t

senpl_huma: 60,31 43,62 43,62 30,21 31,41 21,79 27,03 37,57

24 huecos

senp2_hum: 73,71 37,23 36,17 30,73 30,37 20,11 27,57 35,84

a 23 huecos

senp3_hum: 65,96 56,38 62,18 29,79 26,74 22,29 27,07 27,75

a 23 huecos

senp5_hum: 62,23 55,85 76,68 31,91 30,11 22,29 25,56 28,32

a 24 huecos

senp6_hum: 56,77 52,08 52,66 54,79 57,43 24,86 29,63 29,94

a 14 huecos

senp7_hum: 53,93 50,26 48,13 52,15 72,28 22,95 29,26 31,43

a 17 huecos

senp8_hum: 40,22 36,87 44,00 39,43 44,32 46,45 21,71 21,39

a 18 huecos

ulp2_yeast: 50,81 45,41 51,38 46,67 54,50 50,00 40,00 30,99

15 huecos

leuvhuecos: 19 54,34 54,91 46,24 46,82 48,02 51,43 38,73 47,95

La estructura de un complejo entre Ulp1 y Smt3 de levadura ha sido resuelta (ver, por ejemplo, Mossessova E. y C.D. Lima, Mol. Cell 5:865-876, 2000). Esta estructura y las alineaciones de secuencia indicadas anteriormente se utilizaron para generar modelos deh omología de SENP1 y SUMO-1 humanos utilizando Moloc (Gerber P.R. y K. Muller, J. Comput. Aided Mol. Des. 9:251-268, 1995). Las interacciones observadas en el sitio activo de la SENP1 humana modelada con el sustrato SUMO1 son muy similares en las estructuras experimental de levadura y modelada humana (ver la Tabla 4). Existen múltiples enlaces de hidrógeno en los que participan los residuos Glu93 y Gln94 de SUMO-1, pero muy poca interacción con Thr95. La Tabla 4 también lista los residuos homólogos en otros miembros de la familia SENP y realiza una predicción sobre la conservación o no de dichas interacciones de enlace hidrógeno con Glu93-Gln94. Basándose en este análisis, se ha predicho muy poca reactividad cruzada de SUMO-1 con otros miembros de la familia de SENP, ya que faltan dos de los cuatro enlaces de hidrógeno críticos. Concretamente, este análisis indica que un sustrato/inhibidor EOTGG resultaría altamente específico para SENP1 y Ulp1 y no reaccionaría cruzadamente con otros miembros de la familia de proteasas específicas de sentrina/SUMO humana. De esta manera, en algunas realizaciones, los antagonistas de SENP1 de la invención comprenden la secuencia EQTGG, o miméticos de la misma.

Tabla 4: Interacciones de enlace de hidrógeno del complejo SENP1/SUMO-1 modelado por homología con la secuencia parcial -EQTGG de sustrato/inhibidor propuesto En negrita se indica que la interacción de enlace de H se encuentra conservada con ese residuo.

Residuo de SENP1: N467 K455 T499 T495

Datos de la interacción (SENP1res:átomo-SUMOres:átomo): N467:N82-E93: Oε1 K455:Nζ-E93:Oε2 T499:Oδ1-Q94:Nε2 T495:Oδ1-Q94:Oε1

Residuo de SENP2: N412 G400 P444 T440

Residuo de SENP3: N403 D391 D431 S427

Residuo de SENP5: N584 D572 R612 S608

Residuo de SENP6: N683 E671 K716 S712

Residuo de SENP7: N711 E699 K744 S740

Residuo de SENP8: N28 S16 Q60 P56

Residuo de Ulp1: N450 R438 T477 S473

Tal como se ha indicado anteriormente, en vista de dicha información existen varios enfoques al desarrollo de un inhibidor para SENP1. En algunas realizaciones, debido a que las estructuras se encuentran disponibles tanto para la SUMO-1 humana (dominio C-terminal, RMN (Bayer P. et al., J. Mol. Biol. 280:275-286, 1998) como para el homólogo de levadura del complejo SENP1/SUMO-1 (rayos X (Mossessova E. y C.D. Lima, Mol. Cell. 5:865-876, 2000), el experto en la materia puede llevar a cabo un diseño de inhibidor basado en la estructura, así como el cribado virtual de compuestos para un efecto inhibidor predicho.

En algunas realizaciones, los antagonistas de SENP1 de la invención comprenden un aldehído. Los aldehídos son potentes inhibidores de las cisteína proteasa debido a que forman tiohemiacetales. Estos aductos covalentes estables mimetizan el estado de transición. Entre los ejemplos en los que se han utilizado aldehídos para elucidar el mecanismo de las cisteína proteasas se incluyen la papaína (Schroder E. et al., FEBS Lett. 315:38-42, 1993) y la hidrolasa ubiquitina carboxilo-terminal (Pickart C.M. y I.A. Rose, J. Biol. Chem. 261:10210-10217, 1986). La reducción del sustrato Smt3 por NaBH4 en el aldehído C-terminal se ha utilizado para generar un análogo estable de estado de transición para estudios de cocristalización de Ulp1 de levadura (Mossessova E. y C.D. Lima, Mol. Cell. 5:865-876, 2000). Por lo tanto, un aldehído Gly-Gly podría servir como potente inhibidor de la cisteína proteasa de SENP1.

Los tres aminoácidos situados cadena arriba del Gly-Gly C-terminal de SUMO-1 (Glu-Gln-Thr), o un mimético del mismo, pueden utilizarse en un inhibidor, ya que estos residuos contribuyen significativamente a la especificidad de la interacción SENP1/SUMO-1 (Tablas 4 y 5). Aunque Thr95 no interactúa fuertemente con SENP1, proporciona el espaciado correcto entre el enlace peptídico escindible y los residuos Glu93-Gln95.

Tabla 5: Secuencia C-terminal de las tres proteínas SUMO de H. sapiens. La secuencia correspondiente a x1-x3 en la figura 3 se encuentra subrayada; el motivo diglicina se señala en negrita.

Sm31: TIDVFQQQTGGVPESSLAGHSF

Sm32: TIDVFQQQTGGVY

Sm33: VIEVYQEQTGGHSTV

Smt3: IIEAHREQIGGATY

Aunque la estructura del complejo SENP1/SUMO-1 indica que la lisina y sus residuos flanqueantes de la proteína diana no interactúan con SENP1, un diseño alternativo de inhibidor podría incluir dichos aminoácidos o grupos para imitar sus grupos funcionales.

Un posible medio para validar la especificidad es cribar virtualmente para la unión del inhibidor de SENP1 propuesto a una familia de proteínas altamente relacionadas con SENP1 en su estructura, función y mecanismo, tal como las hidrolasas ubiquitina carboxilo-terminales (motivo UCH de Pfam; PF00443). Un búsqueda en la base de datos Swissprot revela tres secuencias pertenecientes a la familia de UCH en el ser humano (Tabla 1). Se ha resuelto la estructura de varias UCH, incluyendo el isozima UCH-L3 humano (Johnston S.C. et al., Embo J. 16(13):3787-96, 1997) y el enzima de levadura acomplejado con el aldehído C-terminal de la ubiquitina (Johnston S.C. et al., Embo J. 18:3877-3887, 1999). Podrían construirse modelos por homología para los demás miembros de la familia utilizando dichas estructuras de rayos X como molde. Un inhibidor altamente específico de SENP1 podría interactuar favorablemente con SENP1, pero no con ningún UCH. De esta manera, en algunas realizaciones, los métodos de cribado de la invención comprenden además seleccionar un agente que se une y/o inhibe SENP1 pero que no inhibe por lo menos una hidrolasa ubiquitina carboxilo-terminal.

La localización nuclear de SENP1 desempeña un papel en su especificidad de sustrato. Por lo tanto, en algunas realizaciones, con el fin de garantizar una reactividad cruzada mínima del inhibidor propuesto con otras cisteína proteasas, puede utilizarse la propia secuencia de localización nuclear de SENP1 (NLS1, PKKTQRR) como parte del inhibidor en un diseño de caballo de Troya. Esta secuencia heptapéptido, al modelarla en la estructura de SUMO-1 del complejo modelado por homología de SENP1-SUMO1, muestra únicamente un solapamiento estérico en el que participa la Arg6' del inhibidor con la Lys500 de SENP1. Sin embargo, existiría suficiente espacio para que el heptapéptido realizase ajustes conformacionales para evitar dichas interacciones estéricas o de carga desfavorables, ya que los primeros 92 aminoácidos de SUMO-1 no se encontrarían presentes. Por consiguiente, en algunos casos, un inhibidor de SENP1 comprende uno o más de los siguientes: 1) un aldehído Gly Gly, 2) la secuencia Glu-Gln-Thr, o un mimético de la misma, y/o 3) una señal de localización nuclear, tal como PKKTQRR.

IX. Composiciones farmacéuticas y administración

Las antagonistas de SENP1 pueden administrarse directamente en el sujeto mamífero para el tratamiento de cánceres, incluyendo, por ejemplo, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de colon, cáncer renal, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer pancreático y cáncer de intestino delgado. La administración puede realizarse por cualquiera de las vías utilizadas normalmente para introducir un fármaco quimioterapéutico u otro fármaco anticáncer en contacto íntimo con el tejido que debe tratarse. Aunque puede utilizarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular con frecuencia puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra vía. Los antagonistas de SENP1 pueden administrarse en un individuo a modo de ingrediente activo único o en combinación con agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticáncer.

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende un antagonista de SENP1 y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización de la invención, se proporciona un antagonista de SENP1 para la utilización médica. En otra realización de la invención, se utiliza un antagonista de SENP1 en la preparación de un medicamento o para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, en particular de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer pancreático y cáncer de intestino delgado. Resulta particularmente preferente el cáncer de vejiga.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables se encuentran determinados en parte por la composición particular que se administra, así como el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición, 1985).

Los antagonistas de SENP1, solos o en combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en forma de formulaciones de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden introducirse en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Entre las formulacinoes adecuadas para la administración se incluyen las soluciones acuosas y no acuosas, las soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que convierten la formulación en isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. En la práctica de la presente invención, pueden administrarse composiciones, por ejemplo por vía oral, nasal, tópica, intravenosa, intraperitoneal o intratecal. Las formulaciones de antagonistas pueden presentarse en recipientes sellados unidosis o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo anteriormente indicado. Los antagonistas también pueden administrarse como parte de un alimento o fármaco preparado.

La dosis administrada en un paciente, en el contexto de la presente invención debería resultar suficiente para producir una respuesta beneficiosa en el sujeto en el tiempo. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una diversidad de factores, entre ellos la eficacia del antagonista específico utilizado, la edad, peso corporal, actividad física y dieta del paciente, de una posible combinación con otros fármacos y de la severidad de la enfermedad particular. El tamaño de la dosis también se encontrará determinado por la existencia, naturaleza y extensión de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular.

Al determinar la cantidad efectiva del antagonista que debe administrarse, un médico podrá evaluar los niveles plasmáticos circulantes del antagonista, la toxicidad del antagonista y la producción de anticuerpos antiantagonista. En general, la dosis equivalente de un antagonista es de entre aproximadamente 1 ng/kg y 10 mg/kg para un sujeto típico. La administración puede llevarse a cabo mediante una dosis única o mediante dosis divididas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Asociación de la expresión de SENP1/telomerasa con el cáncer de vejiga

El trabajo de los presentes inventores demuestra que se observa un nivel incrementado del ARNm de la proteasa específica de sentrina/SUMO (SENP1) en el sedimento urinario de los pacientes de cáncer de vejiga, que presentan tumores que no expresan ARNm de telomerasa (TERT) medible en el sedimento urinario. De esta manera, puede utilizarse la medición de SENP1 para diagnosticar, seguir y evaluar un pronóstico del cáncer, particularmente, aunque no necesariamente de modo exclusivo, en casos en los que no se expresa TERT.

El trabajo actual de los presentes inventores demuestra que un incremento de la expresión del ARNm de SENP1 se encuentra asociado a células procedentes de tumores que no expresan niveles detectables de ARNm de telomerasa. Según el mejor conocimiento de los presentes inventores, ésta es la primera demostración de que el nivel de SENP1 se encuentra elevado en muestras negativas para telomerasa procedentes de pacientes de cáncer. En el presente contexto, SENP1 proporciona un marcador útil en los ensayos diagnósticos, de seguimiento y pronósticos del cáncer. Además, cabe indicar que la expresión de la telomerasa en los tumores no impide necesariamente la sobreexpresión de SENP1. Por lo tanto, la sobreexpresión de SENP1 es un marcador útil para la detección de algunos tumores que son positivos para la telomerasa.

Se obtuvo orina (100 ml) de sujetos humanos sanos o en los que se había diagnosticado cáncer de vejiga. Las células de estas muestras se recogieron mediante centrifugación a baja velocidad (700xg durante 10 minutos) y se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Se lisaron las células en el tampón de lisis proporcionado en el kit de ARN total HighPure de Roche. Se purificó el ARN total utilizando el kit de ARN total HighPure de Roche. Se sometieron a ensayo las muestras a reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real cuantitativa para la expresión del gen codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y la expresión de la proteína fosfatasa 1, subunidad catalítica, isoforma α (PPP1CA), un gen utilizado para realizar el seguimiento del rendimiento de ARN de las muestras.

Para el presente estudio, se analizaron diecinueve muestras negativas para la telomerasa procedentes de pacientes de cáncer de vejiga y diecinueve muestras negativas para la telomerasa procedentes de sujetos sanos mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa. Las condiciones experimentales en cada ensayo fueron las siguientes: Las reacciones de 100 μl contenían bicina 50 mM, pH 8,0, acetato potásico 115 mM, glicerol al 8%, acetato de manganeso 3 mM, 200 μM de cada desoxiadenosina trifosfato, desoxicitidina trifosfato, desoxiguanosina trifosfato y 500 μM de desoxiuridina trifosfato, 2 unidades de uracil-N-glucosilasa (UNG) de Applied Biosystems, 10 unidades de ADN polimerasa rTth (forma recombinante de ADN polimerasa de Thermus thermophilus, de Applied Biosystems), 10 nM de sonda 5'-nucleasa, 200 nM de cada cebador, directo e inverso. Se transcribió inversamente el ARN de SENP1, se amplificó y se detectó con una sonda marcada fluorescentemente.

Los ensayos se llevaron a cabo en ABI Prism 7700 bajo las siguientes condiciones de ciclado: Tras una etapa inicial de incubación a 50ºC durante 2 minutos para permitir la eliminación mediada por UNG de cualquier contaminación por productos de PCR arrastrados, desnaturalización durante 1 minuto a 95ºC y una etapa de transcripción inversa de 30 minutos a 60ºC, se llevaron a cabo 50 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 20 segundos y apareamiento/extensión a 60ºC durante 40 segundos. Cabe indicar que dichas condiciones de ensayo fijadas son arbitrarias y que podrían obtenerse los mismos resultados con una diversidad de tampones, sales, concentraciones de glicerol/DMSO, concentraciones de nucleótidos, concentraciones de cebador y sonda, transcriptasas inversas, enzimas de ADN polimerasa, métodos de dos enzimas/un tubo o de dos enzimas/dos tubos de RT-PCR, con y sin UNG, utilizando magnesio o manganeso como catión divalente, diversas concentraciones de cebador/sonda, secuencias y condiciones de termociclado. Las secuencias de los cebadores y sondas eran las siguientes: para SENP1: CAAGAAGTGCAGCTTATAATCCAA (SEC ID nº 6; cebador directo, de "sentido") y GTCTTTCGGGTTTCGAGGTAA (SEC ID nº 7; cebador inverso, "antisentido"), CTCAGACAGTTTTCTT-GGCTCAGGCG (SEC ID nº 8; sonda); para PPP1CA: GAGCACACCAGGTGGTAGAA (SEC ID nº 9; cebador directo), GGGCTTGAGGATCTGGAAA (SEC ID nº 10; cebador inverso), GAGTTTGACAATGCTGGCGCCATGATGAGT (SEC ID nº 11; sonda).

Se midieron los niveles de ARN de SENP1 mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa. Se determinó el número de copia relativo de SENP1 basándose en estándares de cuantificación de ARN. Estos estándares consisten de transcritos hasta el extremo del ADN (transcritos "run-off"), se transcribieron inversamente y se amplificaron por PCR bajo las mismas condiciones que las muestras experimentales. Se calcularon los valores umbral de ciclo (Ct) para proporcionar una medida de la cantidad de ARNm presente al inicio de la reacción de amplificación. Debido a que las eficiencias en las reacciones de amplificación raramente, o nunca, son exactamente iguales al utilizar diferentes conjuntos de cebador/sonda o en estándares y en muestras procedentes de sujetos humanos, debido a la posible presencia de inhibidores de la transcripción inversa que podrían ser arrastrados durante la preparación de las muestras en este último caso, los números de copia se indican como copias relativas de un transcrito dado en una muestra y no como un número absoluto de copia.

Tal como se muestra en la Tabla I, la mediana del número de copias de SENP1 en sujetos sanos es de 4; la mediana en pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa es de 1.899 copias. Se calcula la mediana y no la media con el fin de mitigar el efecto de los valores anómalos sobre los cálculos. La curva característica receptor-operador de estas muestras (figura 1) (determinada siguiendo los métodos de Agresti A., Categorical Data Analysis, páginas 228 a 230, 2002) demuestra que los pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa pueden distinguirse de los sujetos sanos negativos para la telomerasa basándose en SENP1. En una primera aproximación, este subconjunto de pacientes puede distinguirse entre sí con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 90%.

Tabla 1: Copias relativas de ARNm de SENP1 en sujetos sanos frente a pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa

Pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa: Sujetos sanos

Copias de SENP1
Copias de SENP1

125: 0

201: 0

240: 0

304: 0

322: 0

655: 0

1184: 0

1413: 0

1499: 3

1899: 4

2708: 4

2873: 5

4113: 10

4610: 10

5188: 12

5839: 21

6195: 26

9941: 380

14173: 1675

Mediana: 1899 4

Estos datos también pueden normalizarse respecto al nivel de un gen de mantenimiento presente en cada muestra.

5 Dicha normalización es un control de las variaciones del número de células en la muestra inicial, de cualquier degradación del ARN producida o de la presencia de inhibidores en la muestra. En este caso, para la normalización se utilizó el nivel de PPP1CA medido previamente, bajo las mismas condiciones. Los cálculos fueron los siguientes: el número relativo de copias de ARNm de SENP1 en una muestra dada se dividió por el número relativo de copias de ARNm de PPP1CA en la misma muestra. Para facilitar la manipulación y el registro, dicho número se multiplicó por

10 1x105. De esta manera, el número de copia normalizado de ARNm de SENP1 mostrado en la Tabla II representa el número de copias de ARN de SENP1 por cada 1x105 copias de ARNm de PPP1CA. La mediana del número de copia normalizado de ARNm de SENP1 en los sujetos sanos era de 1.096; la mediana en los pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa era de 11.994. La curva característica de receptor-operador para estos datos (figura 2) muestra que los pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa pueden distinguirse de los sujetos sanos

15 negativos para la telomerasa basándose en SENP1. En una primera aproximación, estos subconjuntos de pacientes pueden distinguirse entre sí con una sensibilidad del 90% y una especificidad del 70%.

Número de copia relativo de ARNm de SENP1 normalizado respecto a los niveles del gen de mantenimiento PPP1CA en sujetos sanos frente a pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa

Tabla II: pacientes

Pacientes de cáncer de vejiga negativos para la telomerasa: Sujetos sanos

Copias de SENP1
Copias de SENP1

2017: 0

2344: 0

3242: 0

3379: 0

3509: 0

5095: 0

6892: 0

8182: 0

10413: 137

11994: 1096

15370: 1445

16401: 1592

17827: 2257

22070: 3688

22378: 4561

23384: 7639

26195: 10591

33182: 19453

76298: 47093

Mediana: 11994 1096

Los resultados de los presentes inventores indican que SENP1 puede ser utilizado como marcador para diferenciar los pacientes de cáncer de los pacientes sanos basándose en el ARNm presente en las células en muestras de los 5 pacientes.

Ejemplo 2: Asociación de SENP1 y/o de la expresión de la telomerasa con el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer renal, el cáncer pulmonar, el cáncer ovárico, el cáncer pancreático y el cáncer de intestino delgado.

Se homogenizaron 100 mg de tejidos sólidos congelados en 7,5 ml de solución Ultraspec (Biotexc) durante 30 segundos. Se extrajo el ARN total utilizando el kit de ARN Ultraspec® de Biotecx. Se purificó adicionalmente el ARN 10 utilizando el minikit RNeasy de QIAGEN (para un máximo de 100 μg de ARN total), incluyendo un tratamiento de ADNasa de QIAGEN. Se sintetizó el ADNc utilizando 3 a 50 μg de ARN total en cada reacción, basándose en el método descrito en el kit de síntesis de ADNc de doble cadena SuperscriptTM de Invitrogen. Se obtuvieron los reactivos de Invitrogen, a menos que se indique lo contrario. En la reacción de síntesis de primera cadena, las concentraciones finales de los reactivos eran las siguientes: 5 pM de cebador poli-dT (Affymetrix nº 900375), 1X tampón de primera 15 cadena, DTT 0,01 M, 0,05 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 400 unidades de ARNasa H-transcriptasa inversa SuperScriptTM II (SSRT); el volumen de reacción total era de 20 μl. Se incubó el cebador de primera cadena (1 μl) con ARN total (más agua sin ARNasa, llevando el volumen a 10 μl) a 70ºC durante 10 minutos, seguido de la incubación sobre hielo durante 2 minutos. Se añadieron tampón de primera cadena, DTT y dNTP seguido de la incubación a 42ºC durante 2 minutos. Tras la adición de SSRT II, las muestras se incubaron durante 1 hora a 42ºC. A continuación, se

llevó a cabo la síntesis de la segunda cadena. A la reacción completa de 20 μl de la síntesis de la primera cadena, se añadieron los reactivos siguientes a las concentraciones finales indicadas: 1X tampón de segunda cadena, 0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 10 U de ADN ligasa de E. coli, 40 U de ADN polimerasa I de E. coli, 2 U de ARNasa H, 20 U de ADN polimerasa de T4; volumen de reacción total de 150 μl. Todos los reactivos excepto la ADN polimerasa de T4 se mezclaron y se incubaron durante 2 horas a 16ºC. A continuación se añadió la ADN Pol. de T4, seguido de una incubación a 16ºC durante 5 minutos.

Para cada muestra se purificó la totalidad de 150 μl de ADNc dc resultante mediante la utilización de gel Phase Lock (disponible de Brinkmann), de la manera siguiente: Se mezclaron 150 μl de ADNc dc con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se precipitó el ARN mediante métodos estándares utilizando acetato amónico y etanol, seguido de dos lavados con etanol al 100% helado. Se secó el pellet y se resuspendió en 2 a 10 μl de agua desionizada sin ARNasa. Se cuantificó el ADNc mediante medición de la DO260.

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa en las muestras bajo las condiciones siguientes: Se añadieron al mismo tubo de reacción 7 ng de ADNc, 1X mezcla Master Mix Universal TaqMan® (el stock obtenido disponible de Applied Biosystems se consideró 2X), 2,4 μM de cada cebador GAPDH humano directo e inverso, y 0,5 μM de sonda TaqMan GAPDH humana y los cebadores y sonda para un gen dado de interés, a las mismas concentraciones que las indicadas para los cebadores GAPDH y sondas. Las secuencias de estos cebadores y sondas eran las siguientes: para SENP1: CAAGAAGTGCAGCTTATAATCCAA (cebador directo, de "sentido") y GTCTTTCGGGTTTCGAGGTAA (cebador inverso, "antisentido"), CTCAGACAGTTTTCTTGGCTCAGGCG (sonda TaqMan); para TERT: TGGGCACGTCCGCA (directa), GGCGTGGTGGCACATGAA (inversa), TCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAATGAGG (sonda TaqMan). Todos los cebadores y sondas, incluyendo aquellos para un panel de siete genes de mantenimiento (ver posteriormente) se obtuvieron de ABI. El volumen total de cada ensayo era de 20 μl. El ciclado se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7900 HT. Tras una incubación inicial de 2 minutos a 50ºC se realizaron incubaciones de 10 minutos a 95ºC, seguido de 40 a 55 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.

Los niveles relativos de expresión de ARNm de SENP1 y TERT (denominados genes de interés, o GDI) se calcularon de la manera siguiente: se determinaron los valores umbral de ciclo (Ct) mediante RT-PCR para SENP1 y TERT, GAPDH y un panel de siete genes humanos "de mantenimiento". Los siete genes eran hipoxantina fosforibosiltransferasa, β-glucuronidasa, β2-microglobulina, fosfogliceratoquinasa, ciclofilina, β-actina y la proteína ribosómica de gran tamaño P0.

Basándose en los Ct del panel de genes de mantenimiento, se ajustó el Ct de GAPDH para proporcionar el valor esperado. Este ajuste compensa cualesquiera diferencias pequeñas inesperadas en el Ct de GAPDH que podrían explicarse porque GAPDH no se comporta como el gen de mantenimiento "medio" en una muestra particular. A continuación, se calculó el nivel de expresión relativa del GDI como:

2∆Ct = nivel relativo de expresión del GDI

Tal como se muestra en las figuras 3 a 11 y en la Tabla III, los datos actuales de los presentes inventores demuestran que, en una diversidad de cánceres, algunos, aunque no todos, los tumores muestran una expresión de la telomerasa (TERT) elevada respecto a la presente en las células normales. De manera similar, algunos tumores, aunque no todos, muestran un incremento de la expresión de SENP1. La utilización de tanto SENP1 como TERT en combinación a modo de marcadores moleculares para el cáncer permite identificar un mayor número de muestras de tejido tumoral como positivas para cáncer que la utilización de cualquiera de los marcadores por sí solo. De esta manera, un ensayo molecular en el que se puntuase la regulación positiva de cualquiera de los marcadores como positiva para el cáncer mostraría una sensibilidad incrementada para la detección del cáncer. Esta sensibilidad incrementada implicaría, no inesperadamente, una especificidad reducida en cierta medida (es decir, se identificaría un mayor número de sujetos que no presentan cáncer como presentando cáncer). En la utilización de un ensayo para un contexto diagnóstico dado, se seleccionarían valores estandarizados para los resultados positivos y negativos que maximicen los resultados correctos, maximizando de esta manera la sensibilidad y la especificidad. En los ejemplos mostrados, se seleccionaron valores umbrales que, para cada marcador individual, proporcionarían una especificidad de aproximadamente 80%. A menos que se muestre lo contrario, el umbral para la detección de TERT es cero.

La Tabla III proporciona un resumen del comportamiento de la telomerasa y de SENP1 como marcadores individuales

o como marcadores en combinación. La sensibilidad es el número de muestras positivas para cáncer de un tipo tisular dado que se consideran positivas para cáncer, dividido por el número total de muestras positivas para cáncer de dicho tipo tisular. La especificidad es el número de muestras negativas para cáncer (o normales) de un tipo tisular dado que se consideran negativas para cáncer, dividido por el número total de muestras negativas para cáncer de dicho tipo tisular. La "exactitud" de un ensayo dado se define como la suma de su sensibilidad y su especificidad.

Tabla II:

Telomerasa: SENP1 En combinación

Tipo de cáncer: Sensibilidad Especificidad Exactitud Sensibilidad Especificidad Exactitud Sensibilidad Especificidad Exactitud

Vejiga: 3/4 75% 7/8 87% 162% 2/4 50% 8/8 100% 150% 4/4 100% 7/8 87% 187%

Mama: 7/11 63% 7/7 100% 163% 1/11 9% 6/7 85% 94% 8/11 72% 6/7 85% 157%

Colon: 9/54 16% 14/17 82% 98% 14/54 26% 14/17 82% 108% 21/54 38% 13/17 76% 114%

Riñón: 0/7 0% 5/5 100% 100% 4/7 57% 5/5 100% 157% 4/7 57% 5/5 100% 157%

Pulmón: 3/14 21% 20/21 95% 116% 5/14 36% 17/21 80% 116% 7/14 50% 16/21 76% 126%

Ovario: 0/3 0% 4/5 80% 80% 113 33% 4/5 80% 113% 1/3 33% 3/5 60% 93%

Páncreas: 1/6 16% 1/1 100% 116% 3/6 50% 1/1 100% 150% 4/6 66% 1/1 100% 166%

Pancreático (2º grupo): 2/9 22% 10/10 100% 122% 4/9 44% 9/10 90% 134% 5/9 56% 9/10 90% 146%

Pancreático (metastásico): 5/6 83% 100% 183% 1/6 17% 90% 107% 5/6 83% 90% 173%

Intestino delgado: 0/2 0% 7/8 87% 87% 2/2 100% 7/8 87% 187% 2/2 100% 7/8 87% 187%

PARA TODOS LOS CÁNCERES: 30/116 26% 75/82 91% 117% 36/116 31% 71/82 87% 118% 59/116 51% 67/82 82% 133%

Se entiende que los ejemplos y realizaciones indicadas en la presente memoria se proporcionan únicamente a título ilustrativo y que el experto en la materia podrá concebir diversas modificaciones y cambios a la luz de la misma y que estos deben encontrarse comprendidos dentro del espíritu y alcance de la presente memoria y según el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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US 4,366,241

US 4,376,110

US 4,517,288

US 4,683,195

US 4,683,202

US 4,767,700

US 4,837,168

US 4,851,331

US 4,889,818

US 4,914,210

US 4,946,778

US 4,948,882

US 4,994,373

US 5,010,175 US 5,079,352 US 5,102,784 US 5,118,605 US 5,118,802 US 5,119,801 US 5,135,717 US 5,155,018 US 5,210,015 US 5,232,829 US 5,234,809 US 5,288,514 US 5,294,534 US 5,312,728 US 5,352,600 US 5,405,774 US 5,424,414 US 5,437,977 US 5,464,746 US 5,466,591 US 5,487,972 US 5,491,063 US 5,506,337 US 5,514,546 US 5,519,134 US 5,525,462 US 5,525,465 US 5,525,735 US 5,539,083 US 5,547,861 US 5,549,974 US 5,556,959 US 5,569,588 US 5,571,673 US 5,593,853 US 5,595,890 US 5,597,696 US 5,618,711 US 5,641,633 US 5,648,245

US 5,674,738 US 5,679,510 US 5,679,785 US 5,683,872 US 5,683,875 US 5,707,813 US 5,710,028 US 5,714,320 US 5,728,525 US 5,750,343 US 5,789,562 US 5,792,614 US 5,795,718 US 5,795,762 US 5,800,989 US 5,804,375 US 5,808,036 US 5,808,044 US 5,814,447 US 5,837,453 US 5,844,106 US 5,846,723 US 5,846,726 US 5,853,990 US 5,856,092 US 5,866,336 US 5,876,924 US 5,880,287 US 5,882,867 US 5,888,723 US 5,888,739 US 5,919,630 US 5,935,791 US 5,945,283 US 5,955,589 US 5,958,700 US 5,972,602 US 5,981,176 US 5,990,303 US 5,994,063 US 6,001,611 US 6,022,686 US 6,033,854 US 6,054,279 US 6,080,068 US 6,110,677 US 6,121,001 US 6,124,090 US 6,130,047 US 6,140,055 US 6,174,998 US 6,177,249 US 6,180,349 US 6,210,884 US 6,214,979 US 6,221,603 US 6,221,604 US 6,245,514 US 6,261,779 US 6,261,784 US 6,268,128 US 6,294,338 US 6,312,906 US 6,320,005 US 6,326,145 US 6,335,166 US 6,344,329 US 6,348,596 US 6,350,580 US 6,352,827 US 6,361,944 US 6,365,724 US 6,368,803 US 6,379,888 US 6,383,393 US 6,383,756 US 6,391,554 US 6,399,303 US 6,399,392 US 6,406,297 US 6,417,340 US 6,440,707 US 6,495,324 US 6,506,564 US 6,528,254 US 6,528,632 US 6,551,774 US 6,582,964 US 6,596,527 US 6,607,898 Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14 (1996) 309-314 Vogelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619 Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33 (1995) 1856-1859 Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20 (1992) 1691-1696 Walker, PCR Methods Appl 3 (1993) 1-6 Wang et al., Electroanalysis 10 (1998) 553-556 Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 8281-8282 Ward et al., Nature 341 (198) 544-546 Warrington, J.A. et al., Physiol. Genomics 2 (2000) 143 Wege et al., Nuc. Acids Res. 31 (2003) e3 Whur et al., Br. J. Cancer 42 (1980) 305-312 Wilson et al., Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12a edición, McGraw-Hill, Inc., 1991 WO 01/37291 WO 91/19735 WO 92/00091 WO 93/20242 WO 95/35390 Woodring et al., Nuc. Acids Res. 23 (1995) 3794-3795 Wu and Brand, Anal. Biochem. 218 (1994) 1-13 Yan, P. et al. Cancer Res. 59 (1999) 3166-3170 Yeager, T.R., et al., Cancer Res. 59 (1999) 4175-4179 Yeh, E.T., et al., Gene 248 (2000) 1-14 LISTADO DE SECUENCIAS

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<130> 22347EP1

<150> US 60/569,220

<151> 2004-05-06

<150> US 60/599,318 15 10 <151> 2004-08-05

<160> 20

<170> PatentIn Ver. 3.2

15 <210> 1

<211> 1932

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20 <220>

<223> proteasa 1 específica de sentrina/SUMO (SENP1)

<400> 1 <210> 2

<211> 643

<212>: PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<223> proteasa 1 específica de sentrina/SUMO (SENP1)

<210> 3

<211> 1132

<212>: PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<223> transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT)

<210> 4

<211> 4015

<212>: ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<223> transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT)

<210> 5

<211> 451

<212>: ADN 5 <213> Homo sapiens

10 <400> 2

10 <400> 3

10 <400> 4 <220>

<223> componente ARN de telomerasa humana (TERC)

10 <400> 5 <210> 6

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description of secuencia artificial: cebador directo "de sentido" de SENP1

<400> 6 caagaagtgc agcttataat ccaa 24

<210> 7

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description of secuencia artificial: cebador inverso "antisentido" de SENP1

<400> 7 gtctttcggg tttcgaggta a 21

<210> 8

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda TaqMan de SENP1

<400> 8 ctcagacagt tttcttggct caggcg 26

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador directo de PPP1CA

<400> 9

gagcacacca ggtggtagaa 20

<210> 10

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador inverso de PPP1CA

<400> 10 gggcttgagg atctggaaa 19

<210> 11

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda de PPP1CA

<400> 11 gagtttgaca atgctggcgc catgatgagt 30

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sustrato/inhibidor específico para la SENP1 proteasa, antagonista de SENP1

<400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de señal de localización nuclear (NLS1)

<400> 13

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia C-terminal de proteína modificadora pequeña Sm31 similar a ubiquitina (SUMO)

<400> 14

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia C-terminal de proteína modificadora pequeña Sm32 similar a ubiquitina

<400> 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia C-terminal de proteína modificadora pequeña Sm33 similar a ubiquitina

<400> 16

<210> 17

<211> 14 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia C-terminal de proteína modificadora pequeña Smt3 similar a ubiquitina

<400> 17

<210> 18

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de sSecuencia artificial: cebador directo de TERT

<400> 18 tgggcacgtc cgca 14

<210> 19

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador inverso de TERT

<400> 19 ggcgtggtgg cacatgaa 18

<210> 20

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda TaqMan de TERT

<400> 20 tcatcgagca gagctcctcc ctgaatgagg 30

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica, en el que la expresión de SENP1 se encuentra incrementada en dicha muestra en comparación con una muestra que es conocido o se sospecha que no contiene células de cáncer, comprendiendo el método las etapas de determinar la cantidad de SENP1 mediante la detección del ARNm codificante de SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta o que se sospecha que presenta cáncer renal.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además registrar un diagnóstico de cáncer renal.
3.

Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de detección comprende amplificar el ARN en una reacción de amplificación.
4.

Método según la reivindicación 3, en el que la reacción de amplificación comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes, comprendiendo una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1.
5.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en el que el producto de amplificación de la reacción de amplificación en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el producto.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la reacción de amplificación comprende una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta una actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método comprende además determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica.
8.

Método según la reivindicación 7, en el que el método comprende además comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de SENP1 y con un estándar de telomerasa, respectivamente, en el que el estándar de SENP1 representa SENP1 en células no de cáncer y el estándar de telomerasa representa cantidades de telomerasa en células no de cáncer.
9.

Método de detección de la expresión de SENP1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica es una biopsia renal.