ES2345720T3 - Senp1 como marcador de cancer. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar la expresión de SENP1 en una muestra biológica, comprendiendo el método: determinar la cantidad de SENP1 y de TERT o TERC en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta, o que se sospecha que presenta, cáncer de vejiga.
Description
SENP1 como marcador de cáncer.
La presente invención se refiere a un método
para detectar células de cáncer mediante la detección de la cantidad
de SENP1 y/o telomerasa en una muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de células en el cuerpo humano adulto
normal no se divide. Sin embargo, las células de cáncer escapan a
la regulación del crecimiento y se dividen sin restricciones. Para
ello, deben replicar sus cromosomas, incluyendo los extremos de
estos cromosomas, denominados telómeros. La activación del enzima,
la telomerasa, que añade secuencia telomérica a los extremos
cromosómicos (revisado en Collins K., Curr. Opin. Cell Biol.
12:378-382, 2000) puede superar esta senescencia
(ver BoADNr A.G. et al., Science 279:349-352,
1998; revisado en De Lange T., Science 279:334-335,
1998). Las líneas celulares con telomerasa activa se inmortalizan.
In vivo, las células anteriormente senescentes con
telomerasa activa crecen para convertirse en tumores. La actividad
de telomerasa se ha detectado en esencialmente la totalidad de los
tipos principales de cáncer (Shay J.W. y Bacchetti S., Eur. J.
Cancer 33:787-791, 1997; Cong Y.S. et al.,
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:407-425, 2002).
Hanahan y Weinberg consideran la expresión de la subunidad
catalítica de la telomerasa como uno de los seis sucesos clave
comunes al cáncer (Cell 100:57-70, 2000). La
expresión de los genes codificantes de la telomerasa (TERT y TERC)
se ha propuesto como marcador molecular para el diagnóstico,
seguimiento y pronóstico del cáncer.
La patente WO nº 2004/031412 da a conocer
SENP-1 como uno de entre 605 genes regulados en el
cáncer pancreático.
La patente EP nº 1 108 789 da a conocer métodos
para cuantificar la expresión de ARN de hTERT que resultan útiles
para el diagnóstico y el pronóstico de cáncer.
Sin embargo, no todos los tumores de un tipo
dado de cáncer contienen niveles detectables de actividad de
telomerasa (ver, por ejemplo, Shay J.W. y Bacchetti S., Eur. J.
Cancer 33:787-791, 1997; Yan P. et al.,
Cancer Res. 59:3166-3170, 1999). Por lo tanto,
resulta importante identificar los marcadores moleculares que
identifican los tumores inmortalizados por un mecanismo
independiente de telomerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona datos que
demuestran que existe una asociación entre el cáncer de vejiga y la
cantidad de expresión de SENP1. De esta manera, SENP1 proporciona un
marcador útil para la detección del cáncer de vejiga.
En algunas realizaciones, el método comprende
además la obtención de la muestra biológica a partir del
individuo.
En algunas realizaciones se determina la
secuencia del polinucleótido. En algunas realizaciones, la etapa de
detección comprende amplificar el polinucleótido en una reacción de
amplificación. En algunas realizaciones, la reacción de
amplificación comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes
que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de
amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por
lo menos un fragmento de la secuencia SEC ID nº 1. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de
amplificación cuantitativa. En algunas realizaciones, el producto de
amplificación de la reacción de amplificación se detecta en una
etapa que comprende hibridar con el producto un oligonucleótido
detectablemente marcado. En algunas realizaciones, el
oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo
fluorescente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido
detectablemente marcado comprende un grupo desactivador. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación comprende una ácido
nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5'
a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa
fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción en
cadena de polimerasa-transcriptasa inversa
(RT-PCR). En algunas realizaciones, la reacción de
RT-PCR es una reacción de RT-PCR
cuantitativa. En algunas realizaciones, se normaliza la cantidad del
polinucleótido.
En algunas realizaciones, se determina la
cantidad de SENP1 mediante la detección de un polipéptido SENP1 en
la muestra. En algunas realizaciones, el polipéptido se detecta
mediante la puesta en contacto del polipéptido con un
anticuerpo.
En algunas realizaciones, se detecta SENP1
mediante la detección de la actividad de SENP1.
\newpage
En algunas realizaciones, el método comprende
además determinar la cantidad de telomerasa en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, se detecta la telomerasa mediante la
detección de la actividad de telomerasa. En algunas realizaciones,
se detecta la actividad de telomerasa mediante la detección de
alargamiento de un oligonucleótido que comprende dos o más
repeticiones de TTAGG.
En algunas realizaciones, se detecta la
telomerasa mediante la detección de un componente de la telomerasa
en la muestra. En algunas realizaciones, el componente es ARN de
telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el componente
es proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT). En
algunas realizaciones, se detecta telomerasa mediante la detección
de ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa inversa
(TERT). En algunas realizaciones, el método comprende amplificar un
polinucleótido SENP1 y un polinucleótido telomerasa en una reacción
de amplificación multiplex. En algunas realizaciones, el
polinucleótido de telomerasa es ARN de telomerasa humana (TERC). En
algunas realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARNm de
proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT). En
algunas realizaciones, el método comprende además comparar la
cantidad de SENP1 y telomerasa en la muestra con un estándar de
SENP1 y una estándar de telomerasa, respectivamente, en la que el
estándar de SENP1 representa SENP1 en células no de cáncer y el
estándar de telomerasa representa cantidades de telomerasa en
células no de cáncer. En algunas realizaciones, los estándares son
valores predeterminados.
En algunas realizaciones, el individuo es un ser
humano. En algunas realizaciones, el método comprende además
registrar un pronóstico para el tratamiento del cáncer y/o la
supervivencia del individuo. En algunas realizaciones, el método
comprende además registrar la progresión del cáncer en el
individuo.
La presente exposición también proporciona
métodos para identificar un antagonista de SENP1. En algunas
realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto una
pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1, en donde la
célula no expresa telomerasa y la célula expresa un fenotipo
neoplásico, y seleccionar un agente que inhibe un fenotipo
neoplásico, identificando de esta manera un antagonista de SENP1. En
algunas realizaciones, la célula no expresa TERT. En algunas
realizaciones, los métodos comprende además someter a ensayo el
efecto del agente seleccionado sobre células de cáncer
seleccionadas de entre el grupo que consiste de cáncer de mama,
cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de
ovario, cáncer pancreático y cáncer de intestino delgado. En
algunas realizaciones, el fenotipo neoplásico es crecimiento celular
neoplásico. En algunas realizaciones, el fenotipo neoplásico es la
expresión de un polipéptido o ARN asociado al crecimiento
neoplásico. En algunas realizaciones, la célula expresa
endógenamente SENP1. En algunas realizaciones, la célula comprende
un casete de expresión exógena codificante de SENP1.
La presente exposición también proporciona
métodos de tratar un individuo que presenta un cáncer. En algunas
realizaciones, los métodos comprenden administrar en un ser humano
una cantidad terapéutica de un antagonista de SENP1, en donde el
individuo presenta un cáncer caracterizado por la expresión
incrementada de SENP1 en comparación con las células no de cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de entre el grupo
que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon,
cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de
páncreas y cáncer de intestino delgado. En algunas realizaciones, el
antagonista se identifica mediante las etapas de: poner en contacto
una pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1, en donde
la célula no expresa telomerasa y la célula expresa un fenotipo
neoplásico, y seleccionar un agente que inhibe un fenotipo
neoplásico, identificando de esta manera un antagonista de SENP1. En
algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica
que comprende un antagonista de SENP1 y un portador
farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones se
proporciona un antagonista de SENP1 para la utilización en medicina.
En algunas realizaciones se utiliza un antagonista de SENP1 en la
preparación de un medicamento o para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de cáncer, en particular de
cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón,
cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y cáncer de intestino delgado.
Resulta particularmente preferente el cáncer de vejiga.
La presente exposición también proporciona
inhibidores de la actividad de proteasa de SENP1. En algunas
realizaciones, los inhibidores comprenden una secuencia de
aminoácido que comprende
Glu-Gln-Thr-Gly-Gly,
o un mimético de la misma, en donde la Gly final termina en un
aldehído. En algunas realizaciones el inhibidor comprende una
secuencia de señal de localización nuclear. En algunas realizaciones
la secuencia de señal de localización nuclear comprende
Pro-Lys-Lys-Thr-Gln-Arg-Arg.
La presente invención también proporciona la
determinación de la cantidad de SENP1 y telomerasa en una muestra
biológica procedente de un individuo. En algunas realizaciones se
detecta la cantidad de SENP1 mediante la detección de un
polinucleótido codificante de SENP1 en la muestra. En algunas
realizaciones el polinucleótido es ARN.
En algunas realizaciones se determina la
secuencia del polinucleótido. En algunas realizaciones, la etapa de
detección comprende amplificar el polinucleótido en una reacción de
amplificación. En algunas realizaciones, la reacción de
amplificación comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes
que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de
amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de
amplificación cuantitativa. En algunas realizaciones, el producto de
amplificación de la reacción de amplificación se detecta en una
etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente
marcado con el producto. En algunas realizaciones, el
oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo
fluorescente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido
detectablemente marcado comprende un grupo desactivador. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación comprende una ácido
nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5'
a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa
fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.
En algunas realizaciones, la reacción de
amplificación es una reacción en cadena de
polimerasa-transcriptasa inversa
(RT-PCR). En algunas realizaciones, la reacción de
RT-PCR es una reacción de RT-PCR
cuantitativa.
En algunas realizaciones se normaliza la
cantidad del polinucleótido.
En algunas realizaciones se determina la
cantidad de SENP1 mediante la detección de un polipéptido SENP1 en
la muestra. En algunas realizaciones se detecta el polipéptido
mediante la puesta en contacto del polipéptido con un
anticuerpo.
En algunas realizaciones, se detecta SENP1
mediante la detección de la actividad de SENP1.
En algunas realizaciones, se detecta la
telomerasa mediante la detección de la actividad de telomerasa. En
algunas realizaciones, se detecta la actividad de telomerasa
mediante la detección del alargamiento de un oligonucleótido que
comprende dos o más repeticiones de TTAGG.
En algunas realizaciones, se detecta la
telomerasa mediante la detección de un componente de la telomerasa
en la muestra. En algunas realizaciones, el componente es ARN de
telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el componente
es proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT).
En algunas realizaciones, se detecta la
telomerasa mediante la detección de ARNm de proteína transcriptasa
inversa de telomerasa humana (TERT).
En algunas realizaciones, el método comprende
amplificar un polinucleótido SENP1 y un polinucleótido de telomerasa
en una reacción de amplificación multiplex. En algunas
realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARN de telomerasa
humana (TERC). En algunas realizaciones, el polinucleótido de
telomerasa es el ARNm de la proteína transcriptasa inversa de
telomerasa humana (TERT).
En algunas realizaciones, los métodos comprenden
además comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra
con un estándar de SENP1 y un estándar de telomerasa que representan
las cantidades de SENP1 y de telomerasa en las células no de
cáncer. En algunas realizaciones, los estándares son valores
predeterminados.
En algunas realizaciones el individuo es un ser
humano.
En algunas realizaciones, la muestra biológica
comprende un líquido corporal. En algunas realizaciones, el líquido
corporal es sangre. En algunas realizaciones, el líquido corporal es
orina. En algunas realizaciones, la muestra es de una biopsia de
tejido. En algunas realizaciones, el método comprende además obtener
una muestra biológica del individuo.
En algunas realizaciones, el individuo presenta,
o se sospecha que presenta cáncer. En algunas realizaciones, el
cáncer es cáncer de vejiga.
En algunas realizaciones, el método comprende
además registrar un diagnóstico de la presencia o ausencia de
cáncer en el individuo. En algunas realizaciones, el método
comprende además registrar un pronóstico para el tratamiento del
cáncer y/o la supervivencia del individuo. En algunas realizaciones,
el método comprende además registrar la progresión del cáncer en el
individuo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de
vejiga.
La presente invención también proporciona kits
para detectar una célula de cáncer en una muestra biológica de un
individuo. En algunas realizaciones, el kit comprende:
a) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 1, o un complemento
de la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un
polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción
de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1,
b) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma,
c) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT,
de manera que, al someter TERC o ARNm de TERT a
una reacción de amplificación, el oligonucleótido ceba la
amplificación de por lo menos un fragmento de TERC o de ARNm de
TERT, y
d) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT,
de manera que, al someter los oligonucleótidos y
TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, los
oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento
de TERC o de ARNm de TERT.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, el kit comprende
además transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, el kit
comprende además una ADN polimerasa termoestable.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos
detectablemente marcados comprenden un grupo fluorescente. En
algunas realizaciones, los oligonucleótidos detectablemente marcados
comprenden un grupo desactivador.
La presente invención también proporciona una
mezcla de reacción. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción
comprende:
a) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de
la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un
polinucléotido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción
de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1,
b) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma,
c) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, O
- iv)
- un complemento de TERT,
de manera que, al someter el oligonucleótido y
TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, el
oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento
de TERC o de ARNm de TERT, y
d) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, la mezcla de reacción
comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que
comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de
la misma, de manera que, al someter los oligonucleótidos y un
polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una
reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la
amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº
1, y por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que comprenden
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de:
i) ARN de telomerasa humana (TERC),
ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de
telomerasa humana (TERT),
iii) un complemento de TERC, o
iv) un complemento de TERT,
de manera que, al someter los oligonucleótidos y
TERC o ARNm de TERT a una reacción de amplificación, los
oligonucleótidos ceban la amplificación de por lo menos un fragmento
de TERC o de ARNm de TERT.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, la mezcla de reacción
comprende además una transcriptasa inversa. En algunas
realizaciones, la mezcla de reacción comprende además una ADN
polimerasa termoestable. En algunas realizaciones, la mezcla de
reacción comprende además los oligonucleótidos detectablemente
marcados que comprenden un grupo fluorescente. En algunas
realizaciones, la mezcla de reacción comprende además los
oligonucleótidos detectablemente marcados que comprenden un grupo
desactivador.
La presente invención también proporciona la
determinación de la cantidad de SENP1 y de telomerasa en una
muestra biológica procedente de un individuo. En algunas
realizaciones, la cantidad de SENP1 se detecta mediante la
detección de un polinucléotido codificante de SENP1 en la muestra.
En algunas realizaciones el polinucleótido es ARN.
En algunas realizaciones se determina la
secuencia del polinucleótido. En algunas realizaciones, la etapa de
detección comprende amplificar el polinucleótido en una reacción de
amplificación. En algunas realizaciones, la reacción de
amplificación comprende por lo menos dos oligonucléotidos diferentes
que comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de
amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de
amplificación cuantitativa. En algunas realizaciones se detecta el
producto de amplificación de la reacción de amplificación en una
etapa que comprende hibridar un oligonucleótido detectablemente
marcado con el producto. En algunas realizaciones, el
oligonucleótido detectablemente marcado comprende un grupo
fluorescente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido
detectablemente marcado comprende un grupo desactivador. En algunas
realizaciones, la reacción de amplificación comprende una ácido
nucleico polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5'
a 3' exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa
fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.
En algunas realizaciones, la reacción de
amplificación es una reacción en cadena de
polimerasa-transcriptasa inversa
(RT-PCR). En algunas realizaciones, la reacción de
RT-PCR es una reacción de RT-PCR
cuantitativa.
En algunas realizaciones, se normaliza la
cantidad del polinucleótido.
En algunas realizaciones, se determina la
cantidad de SENP1 mediante la detección de un polipéptido SENP1 en
la muestra. En algunas realizaciones, el polipéptido se detecta
poniendo en contacto el polipéptido con un anticuerpo.
En algunas realizaciones, SENP1 se detecta
mediante la detección de actividad de SENP1.
En algunas realizaciones, se detecta telomerasa
mediante la detección de actividad de telomerasa. En algunas
realizaciones se detecta la actividad de telomerasa mediante la
detección del alargamiento de un oligonucleótido que comprende dos
o más repeticiones de TTAGG.
En algunas realizaciones, la telomerasa se
detecta mediante la detección de un componente de telomerasa en la
muestra. En algunas realizaciones, el componente es ARN de
telomerasa humana (TERC). En algunas realizaciones, el componente
es proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (TERT).
En algunas realizaciones, la telomerasa se
detecta mediante la detección de ARNm de proteína transcriptasa
inversa de telomerasa humana (TERT).
En algunas realizaciones, el método comprende
amplificar un polinucleótido SENP1 y un polinucleótido de telomerasa
en una reacción de amplificación multiplex. En algunas
realizaciones, el polinucleótido de telomerasa es ARN de telomerasa
humana (TERC). En algunas realizaciones, el polinucleótido de
telomerasa es ARNm de proteína transcriptasa inversa de telomerasa
humana (TERT).
En algunas realizaciones, los métodos comprenden
además comparar la cantidad de SENP1 y telomerasa en la muestra a
un estándar de SENP1 y un estándar de telomerasa que representan las
cantidades SENP1 y de telomerasa en células no de cáncer. En
algunas realizaciones, los estándares son valores
predeterminados.
En algunas realizaciones, el individuo es un ser
humano.
En algunas realizaciones, la muestra biológica
comprende un líquido corporal. En algunas realizaciones, el líquido
corporal es sangre. En algunas realizaciones, el líquido corporal es
orina. En algunas realizaciones, la muestra procede de una biopsia
de tejido. En algunas realizaciones, el método comprende además
obtener una muestra biológica de un individuo.
En algunas realizaciones, el individuo presenta,
o se sospecha que presenta cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de
vejiga.
En algunas realizaciones, el método comprende
además registrar un diagnóstico de la presencia o ausencia de
cáncer en el individuo. En alguna realizaciones, el método
La figura 1 ilustra una curva típica de
receptor-operador del ARNm de SENP1 de sedimento
urinario de un paciente de cáncer de vejiga negativo para
telomerasa y de un sujeto sano.
La figura 2 ilustra una curva de
receptor-operador de SENP1 normalizado a la proteína
fosfatasa 1 de gen de mantenimiento, subunidad catalítica, isoforma
alfa (PPP1CA).
Las figuras 3A y 3B ilustran el nivel de
expresión de SENP1 y de TERT respecto a la expresión ajustada de
GAPDH en tejido de vejiga normal y tejido de vejiga tumoral.
Por conveniencia proporcionar los datos en el
gráfico a la misma escala, la expresión de TERT se ha multiplicado
por un factor de 1x10^{5}.
"SENP1" se refiere al polipéptido proteasa
específico de sentrina/SUMO o a un polinucleótido codificante del
polipéptido. Entre los polinucleótidos de SENP1 ejemplares se
incluyen, por ejemplo, el número de acceso de Genbank NM_014354
(SEC ID nº 1). Entre los polipéptidos SENP1 ejemplares se incluyen,
por ejemplo, el polipéptido ilustrado en el número de acceso
Genbank NP_055369 (SEC ID nº 2). El término "SENP1" pretende
incluir las variantes alélicas de aquellas secuencias
específicamente proporcionadas en la presente memoria, así como los
fragmentos y mutaciones de las mismas. Los polinucleótidos SENP
generalmente son por lo menos 90%, 95% o 99% idénticas a la
secuencia SEC ID nº 1, o 90%, 95% o 99% idénticas a las secuencias d
ADN codificantes de la secuencia SEC ID nº 2. Entre los
polinucleótidos de SENP1 se incluyen, por ejemplo, ARNm codificante
de polipéptidos SENP1, así como secuencias de ADN (por ejemplo ADNc
o ARN genómico) codificante de polipéptidos SENP1. Los polipéptidos
SENP1 generalmente son por lo menos 90%, 95% o 99% idénticos a la
secuencia SEC ID nº 2.
El término "telomerasa" se refiere a un
complejo riboproteico que mantiene los extremos de los cromosomas
(telómeros), o a polinucleótidos codificantes de componentes de la
riboproteína (ver, por ejemplo, Shippen-Lentz et
al., Science 247:546, 1990; Greiden et al., Nature
337:331, 1989). La telomerasa incluye dos componentes principales:
la proteína transcriptasa inversa de la telomerasa (codificada por
el gen TERT) y el componente ARN de la telomerasa
(codificado por el gen TERC). Los componentes humanos
equivalentes se conocen como TERT (por ejemplo secuencia de
proteína NP_003210 (SEC ID nº 3), codificada, por ejemplo, por la
secuencia de nucleótidos NM_003219 (SEC ID nº 4) y TERC (NR_001566,
SEC ID nº 5). Las variantes de procesamiento del ARN codificante de
TERT pretenden encontrarse comprendidas dentro de esta
definición.
La expresión "poner en contacto una pluralidad
de agentes con una célula" se refiere a poner en contacto por lo
menos dos agentes con una célula o células. Aunque pueden ponerse en
contacto múltiples agentes con una célula o grupo de células, la
expresión también comprende poner en contacto un primer agente con
una primera célula o grupo de células, y un segundo agente con una
segunda célula o grupo de células, por ejemplo de manera que cada
célula o grupo de células se ponga en contacto con un único
agente.
La expresión "determinar la cantidad de SENP1
o de telomerasa" se refiere a utilizar cualquier técnica conocida
por el experto en la materia para cuantificar la cantidad de SENP1
o polipéptido o polinucleótido de telomerasa (por ejemplo ARN
estructural, ARNm o ADNc), o SENP1 o actividad de telomerasa en una
muestra.
Un "fenotipo neoplásico" se refiere al
fenotipo de una célula neoplásica. Entre los fenotipos ejemplares se
incluyen, por ejemplo, el crecimiento celular en agar blando; la
independencia de anclaje; la inhibición por contacto reducido y/o
la limitación por densidad del crecimiento; la proliferación
celular; la transformación celular; la independencia de factor de
crecimiento o de suero; la acumulación de niveles de marcador
específico de tumor; la invasividad en Matrigel; el crecimiento
tumoral y la metástasis in vivo; los patrones de ARNm y de
expresión de proteínas de células que experimentan metástasis, y
otras características de las células de cáncer.
Una "reacción de amplificación" se refiere
a cualquier reacción (por ejemplo química o enzimática) que resulta
en un número incrementado de copias de una secuencia molde de ácidos
nucleicos o un nivel incrementado de señal que indica la presencia
del ácido nucleico molde. Las expresiones "amplificación
selectiva" o "amplificar selectivamente" se refieren a la
amplificación de secuencias particulares en una población de
secuencias.
La expresión "muestra biológica" comprende
una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un organismo, y
puede utilizarse en un ensayo diagnóstico o de seguimiento. La
expresión comprende orina, sedimento urinario, sangre, saliva y
otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido
sólido, tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o
células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. La
expresión comprende muestras que han sido manipuladas de cualquier
manera tras su recolección, tal como mediante tratamiento con
reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento para
determinados componentes. La expresión comprende una muestra
clínica, y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes
celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquidos corporales y
muestras de tejido.
Un "antagonista" se refiere a una molécula
que, al ponerse en contacto con una célula que expresa SENP1, inhibe
la actividad o expresión de SENP1. Los antagonistas son compuestos
que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente una
actividad, reducen, impiden, retrasan la activación, inactivan,
desensibilizan o regulan negativamente la actividad o expresión de
SENP1.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las
expresiones "ácido nucleico", "nucleótido",
"polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a
cebadores, sondas, fragmentos oligómeros que deben detectarse,
controles oligómeros y oligómeros de bloqueo no marcados y es
genérico para polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2-desoxi-D-ribosa),
de polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y
de cualquier otro N-glucósido de una purina o base
pirimidina, o bases purina o pirimidina modificadas.
Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u
oligonucleótido puede comprender enlaces fosfodiéster o enlaces
modificados, incluyendo, aunque sin limitación, fosfotriéster,
fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato,
carbamato, tioéter, fosforamidato puente, fosfonato de metileno
puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato,
fosforotioato puente o enlaces sulfona, y combinaciones de dichos
enlaces. Las expresiones comprenden ácidos nucleicos de péptidos
(APNs) y ácidos nucleicos intercalados (INAs).
Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido u
oligonucleótido puede comprender las cinco bases biológicamente
naturales (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o otras
bases aparte de las cinco bases biológicamente naturales. Estas
bases pueden presentar varios propósitos, por ejemplo estabilizar o
desestabilizar la hibridación; estimular o inhibir la degradación
de una sonda; o como puntos de unión para grupos detectables o
grupos desactivadores. Por ejemplo, un polinucleótido de la
invención puede contener uno o más grupos de bases modificadas, no
estándares o derivatizadas, incluyendo, aunque sin limitación,
N^{6}-metil-adenina,
N^{6}-terc-butil-benciladenina,
imidazol, imidazolas sustituidas, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroximetil)uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N^{6}-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina,
N^{6}-metiladenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N^{6}-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, metiléster de ácido
uracil-5-oxiacético,
3-(3-amino-3N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w,2,6-diaminopurina y
5-propinilpirimidina. Otros ejemplos de grupos de
bases modificadas, no estándares o derivatizadas pueden encontrarse
en las patentes US nº 6.011.611, nº 5.955.589, nº 5.844.106, nº
5.789.562, nº 5.750.343, nº 5.728.525 y nº 5.679.785, cada una de
las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.
Además, un ácido nucleico, nucleótido,
polinucleótido u oligonucleótido puede comprender uno o más grupos
sacáridos modificados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos,
arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y
hexosa.
No se pretende que la presente invención se
encuentra limitada por la fuente de un ácido nucleico, nucleótido,
polinucleótido u oligonucleótido. Un ácido nucleico, nucleótido,
polinucleótido u oligonucleótido puede proceder de un mamífero
humano o no humano, o de cualquier otro organismo, o derivarse a
partir de cualquier fuente recombinante, sintetizarse in
vitro u obtenerse mediante síntesis química. Un ácido nucleico,
nucleótido, polinucleótido u oligonucleótido puede ser ADN, ARN,
ADNc, ADN-ARN, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido
nucleico de péptido (APN), un híbrido o una mezcla de los mismos, y
puede existir en una forma de doble cadena, de una sola cadena o
parcialmente de doble cadena. Entre los ácidos nucleicos de la
invención se incluyen tanto ácido nucleicos como fragmentos de los
mismos, en formas purificadas o no purificadas, incluyendo genes,
cromosomas, plásmidos, los genomas de material biológico, tal como
microorganismos, por ejemplo bacterias, levaduras, virus, viroides,
mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos y similares.
No se pretende realizar ninguna distinción de
longitud entre las expresiones ácido nucleico, nucleótido,
polinucleótido y oligonucleótido, y estas expresiones se utilizarán
intercambiablemente. Estas expresiones incluyen ADN de doble cadena
y de una cadena, así como ARN de doble cadena y de una cadena.
Aunque los oligonucleótido pueden presentar cualquier longitud,
pueden presentar menos de 500 nucleótidos, por ejemplo 5 a 100, 10 a
100, 10 a 30, 15 a 30 ó 15 a 50 nucleótidos.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente
memoria para hacer referencia a un polímero de residuos
aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en
los que uno o más residuos aminoácidos es un mimético químico
artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a
polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no
naturales.
El término "aminoácido" se refiere a
aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de
aminoácidos y a miméticos de aminoácidos que funcionan de una
manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos
naturales son aquellos codificados por el código genético, así como
aquellos aminoácidos que resultan posteriormente modificados, por
ejemplo hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y
O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se
refieren a compuestos que presentan la misma estructura química
básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono que se
encuentra unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y
un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de
metionina, metilsulfonio de metionina. Dichos análogos presentan
grupos R modificados (por ejemplo norleucina) o esqueletos
peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química
básica del aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se
refieren a compuestos químicos que presentan una estructura que es
diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero
que funciona de una manera similar a un aminoácido natural.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en
la presente memoria por sus comúnmente conocidos símbolos de tres
letras, o por los símbolos de una letra recomendados por la comisión
de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB. De manera
similar, puede hacerse referencia a los nucleótidos por sus códigos
de una letra comúnmente aceptados.
La expresión "se hibrida selectivamente (o
específicamente)" se refiere a la unión, duplicación o
hibridación de una molécula predominantemente (por ejemplo por lo
menos 50% de la molécula hibridante) con una secuencia particular
de nucleótidos bajo condiciones astringentes de hibridación
encontrándose presente la secuencia en una mezcla compleja (por
ejemplo ADN o ARN total celular o de una biblioteca). Los
polinucleótidos cebadores se hibridan específicamente a un
polinucleótido molde en una reacción de amplificación (por ejemplo a
una temperatura de hibridación de aproximadamente 60ºC) al
amplificar los cebadores el molde en una mezcla de reacción que
comprende una mezcla compleja de polinucleótidos (por ejemplo
aislado a partir de una célula) para producir un producto de
amplificación que es por lo menos el producto de amplificación más
predominante Y preferentemente el único producto de amplificación
significativo (por ejemplo que represente por lo menos 90% a 95% de
todos los productos de amplificación en la muestra) de la
reacción.
La expresión "condiciones astringentes de
hibridación" se refiere a condiciones bajo las que una sonda se
hibridará predominantemente a su subsecuencia diana en una mezcla
compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones astringentes son
dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes
circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan
específicamente a temperaturas más altas. Puede encontrarse una guía
extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en: Tijssen,
Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization with Nucleico Probes,
"Overview of principles o hybridization and the strategy of
nucleic acid assays", 1993. Generalmente, las condiciones
astringentes se selecciona que sean aproximadamente 5ºC a 10ºC más
bajas que el punto de fusión térmica (T_{m}) de la secuencia
específica a un pH a una fuerza iónica definida. La T_{m} es la
temperatura (bajo una fuerza iónica, pH y concentración de ácidos
nucleicos definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a
la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (debido
a que las secuencias diana se encuentran presentes en exceso, a la
T_{m} 50% de las sondas se encuentran ocupadas en el equilibrio).
Las condiciones astringentes son aquéllas en las que la
concentración salina es inferior a aproximadamente 1,0 M de ión
sódico, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de
ión sódico (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, y la
temperatura es por lo menos aproximadamente 30ºC para las sondas
cortas (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y de por lo menos
aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo de más de 50
nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones astringentes
con la adición de agentes desestabilizadores, tales como la
formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal
positiva es por lo menos dos veces la señal de fondo, opcionalmente
10 veces la hibridación de fondo. Unas condiciones de hibridación
astringente ejemplares pueden ser las siguientes: formamida al 50%,
5x SSC, y SDS al 1%, incubación a 42ºC, o 5x SSC, SDS al 1%,
incubación a 65ºC, con lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí
bajo condiciones astringentes todavía son sustancialmente idénticos
en el caso de que los polipéptidos codificados sena sustancialmente
idénticos. Esto se produce, por ejemplo, en el caso de que se cree
una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de
codones permitida por el código genético. En estos casos los ácidos
nucleicos típicamente se hibridan bajo condiciones de hibridación
moderadamente astringentes. Entre las "condiciones de hibridación
moderadamente astringentes" ejemplares se incluyen la
hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a
37ºC, y un lavado en 1X SSC a 45ºC. Una hibridación positiva
presenta por lo menos dos veces el nivel de fondo. El experto
ordinario en la materia reconocerá fácilmente que pueden utilizarse
condiciones de hibridación y de lavado alternativas para
proporcionar condiciones de astringencia similares.
Para la PCR, una temperatura de aproximadamente
36ºC es típica para la amplificación de baja astringencia, aunque
la temperatura de hibridación puede variar entre aproximadamente
32ºC y 48ºC, dependiendo de la longitud del cebador. Para la
amplificación por PCR de alta astringencia, es típica una
temperatura de aproximadamente 62ºC, aunque las temperaturas de
hibridación de alta astringencia pueden encontrarse comprendidas
entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 65ºC, dependiendo de
la longitud y especificidad del cebador. Entre las condiciones de
ciclado ejemplares para amplificaciones tanto de alta como baja
astringencia se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una etapa
de desnaturalización de entre aproximadamente 30 segundos y
aproximadamente 2 minutos a una temperatura de entre 90ºC y 95ºC,
una etapa de hibridación de entre aproximadamente 5 segundos y
aproximadamente 2 minutos a una temperatura de entre 50ºC y 70ºC, y
una etapa de extensión de entre aproximadamente 1 minuto y
aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 70ºC.
El término "anticuerpo" se refiere a un
polipéptido que comprende una región marco de un gen de
inmunoglobulina o de fragmentos del mismo, que se une y reconoce
específicamente un antígeno. Entre los genes de inmunoglobulina
reconocidos se incluyen los genes de región constante kappa, lambda,
alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la multitud de genes de
región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se
clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican
como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las
clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE,
respectivamente.
Una unidad estructural de inmunoglobulina
(anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está
compuesto de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas,
presentando cada pareja una cadena "ligera" (de
aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de
aproximadamente 50 a 70 kDa). El extremo N-terminal
de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 ó
110, ó más, aminoácidos que es principalmente responsable del
reconocimiento de antígeno. Las expresiones cadena ligera variable
(V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se refieren a dichas
cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Existen anticuerpos, por ejemplo, en forma de
inmunoglobulinas intactas, o de varios fragmentos bien
caracterizados producidos por la digestión con diversas peptidasas.
De esta manera, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo
debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra, produciendo
F(ab')_{2}, un dímero de Fab que él mismo es una cadena
ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro.
El fragmento F(ab')_{2} puede reducirse bajo condiciones
suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra,
convirtiendo de esta manera el dímero F(ab')_{2} en un
monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la
región bisagra (ver Fundamental Immunology (Paul, editor, 3a
edición, 1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpo se definen
en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, el experto en
la materia apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de
novo químicamente o mediante la utilización de métodos de ADN
recombinante. De esta manera, el término "anticuerpo", tal
como se utiliza en la presente memoria, también incluye fragmentos
de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos
completos, o los sintetizados de novo utilizando métodos de
ADN recombinante (por ejemplo Fv de una sola cadena) o aquellos
identificados utilizando bibliotecas de expresión fágica (ver, por
ejemplo, McCafferty et al., Nature
348:552-554, 1990).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
o policlonales, puede utilizarse cualquier técnica conocida de la
técnica (ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature
256:495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology
Today 4:72, 1983; Cole et al., páginas 77 a 96, en:
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985). Las técnicas para
la producción de anticuerpos de una cadena (patente US nº 4.946.778)
pueden adaptarse para producir anticuerpos contra un polipéptido de
la presente invención. Además, pueden utilizarse ratones
transgénicos, u otros organismos, tales como otros mamíferos, para
expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, puede
utilizarse tecnología de expresión fágica para identificar
anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unan
específicamente a antígenos seleccionados (ver, por ejemplo,
McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990;
Marks et al., Biotechnology 10:779-783,
1992).
La expresión "se une específicamente (o
selectivamente)" a un anticuerpo, o "inmunorreactivo
específicamente (o selectivamente) con", en referencia a una
proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es
determinante de la presencia de la proteína en una población
heterogénea de proteínas y de otros compuestos biológicos. De esta
manera, los anticuerpos especificados se unen a una proteína
particular por lo veces dos veces más que el nivel de fondo, y no
se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras
proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un
anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que
se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Por
ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales cultivados
contra SENP1 para obtener únicamente aquellos anticuerpos
policlonales que son específicamente inmunorreactivos con SENP1 y
no con otras proteínas, excepto por variantes polimórficas y alelos
de SENP1. Esta selección puede conseguirse descartando los
anticuerpos que reaccionan cruzadamente con las moléculas de SENP1
procedentes de otras especies o que reaccionan cruzadamente con
proteínas que no son SENP1. Puede utilizarse una diversidad de
formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos
específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por
ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA de fase
sólida para seleccionar anticuerpos específicamente
inmunorreactivos con una proteína (ver, por ejemplo, Harlow &
Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, para una descripción
de formatos de inmunoensayo y de condiciones que pueden utilizarse
para determinar la inmunorreactividad específica). Típicamente, una
reacción específica o selectiva presentará por lo menos dos veces
la señal de fondo o de ruido, y más típicamente más de 10 a 100
veces la señal de fondo.
Las expresiones "idéntico" o "identidad
del 100%" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o
secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o
subsecuencias que presentan la misma secuencia. Dos secuencias son
"sustancialmente idénticas", o presentan un determinado
porcentaje de identidad en el caso de que dos secuencias presenten
un porcentaje especificado de residuos aminoácidos o nucleótidos que
son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad en una región especificada o,
en el caso de que no se especifique, en la totalidad de la
secuencia), en la comparación y alineación para máxima
correspondencia en una ventana de comparación, o región designada
para la medición utilizando uno de los algoritmos de comparación de
secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección
visual. La invención proporciona oligonucleótidos que son
sustancialmente idénticos a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 ó más
nucleótidos contiguos de polinucleótidos SENP1, o polinucleótidos
de telomerasa, o complementos de los mismos.
Para la comparación entre secuencias,
típicamente una secuencia actúa de secuencia de referencia, a la que
se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de
comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las
secuencias de ensayo y de referencia, se designan coordenadas de
subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del
programa del algoritmo de secuencias. Pueden utilizarse parámetros
de programa por defecto, o pueden fijarse parámetros alternativos. A
continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula los
porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo
respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros
del programa.
Una "ventana de comparación", tal como se
utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento
de cualquiera de entre varias posiciones contiguas seleccionadas de
entre el grupo que consiste de entre 5 y 600, habitualmente de
entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, más habitualmente de
entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50, en la que puede
compararse una secuencia a una secuencia de referencia del mismo
número de posiciones contiguas tras alinearse óptimamente las dos
secuencias. Los métodos de alienación de secuencias para la
comparación son bien conocidos de la técnica. La alienación óptima
de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por
ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970, mediante el algoritmo de
alineación por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson
y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 852:2444, 1988, mediante
implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics
Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (ver,
por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology (suplemento de 1995)).
Dos ejemplos de algoritmos que resultan
adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias
y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0,
que se describe en Altschul et al., Nuc. Acids Res.
25:3389-3402, 1977, y Altschul et al., J.
Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. Los
programas para llevar a cabo los análisis BLAST se encuentran
públicamente disponibles a través del National Center for
Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en
primer lugar las parejas de secuencias de elevada puntuación (HSPs)
mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la
secuencia de pregunta, que se corresponden o que satisfacen algún
umbral de puntuación T de valor positivo al alinearse con una
palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T
se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et
al., supra). Esa palabra vecina inicial actúa como
semilla para iniciar búsquedas de HSPs más largas que la contengan.
Estas palabras localizadas se extienden en ambas direcciones a lo
lago de cada secuencia en la medida en que se incremente la
puntuación acumulativa de alineación. Se calculan las puntuaciones
acumuladas utilizando, a modo de secuencias de nucleótidos, los
parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos
correspondientes, en todos los casos >0) y N (puntuación de
penalización para residuos no correspondientes; en todos los casos
<0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz
de puntuaciones para calcular la puntuación acumulada. La extensión
de las palabras localizadas en cada dirección se detiene en
cualquiera de los casos siguientes: la puntuación acumulada de
puntuación cae en una cantidad X respecto al valor máximo
alcanzado; la puntuación acumulada baja a cero o menos; debido a la
acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación
negativa; se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias.
Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la
sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (por
"secuencias de nucleótidos") utiliza como parámetros por
defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de
10, M=5, N=-4 y una comparación entre ambas cadenas. Para las
secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores
por defecto una longitud de palabra de 3 y un valor esperado (E) de
10, y alineaciones (B) de matriz de puntuación BLOSUM62 (ver
Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) de
50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación entre
ambas cadenas. Cualquiera de los programas se ejecuta con el filtro
de baja complejidad desactivado (en "off").
El algoritmo BLAST también lleva a cabo un
análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por
ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5887, 1993). Una medida de similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidades
mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad de que se produzca al azar una correspondencia entre
dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un
ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en
el caso de que la suma de probabilidades mínima en una comparación
entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia
sea inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a
aproximadamente 0,01, y todavía más preferentemente inferior a
aproximadamente 0,001.
No todos los tumores de un tipo de cáncer dado
contienen niveles detectables de actividad de telomerasa (ver, por
ejemplo, Shay J.W. y Bacchetti, S. Eur. J. Cancer
33:787-791, 1997; Yan P. et al., Cancer Res.
59:3166-3170, 1999). En general, 50% a 100% de los
tumores de diferentes tipos presentan una actividad medible de
telomerasa (Bryan T.M., Nature Medicine
3:1271-1274, 1997; Kim N.W. et al., Science
266:2011-2015, 1994; Bacchetti S. y Counter C.M.,
Int. J. Oncology 7:423-432, 1995). De esta manera,
aunque esta falta de detección de actividad de telomerasa podría
deberse a una incapacidad para medir niveles bajos, es más probable
que la expresión de telomerasa resulte suficiente para causar
cáncer, pero que no resulte necesaria. Es decir, algunos tumores
podrían no expresar telomerasa activa.
En efecto se ha encontrado que algunas líneas
celulares inmortalizadas y tumores son capaces de mantener telómeros
sin telomerasa (ver, por ejemplo, Bryan et al., Nature
Medicine 3:1271-1274, 1997; Scheel C. y Poremba C.,
Virchows Arch. 440:573-5782, 2002; McEachern M.J.
et al., Annu. Rev. Genet. 34:331-358, 2000).
Este alargamiento alternativo de los telómeros (ALT), por lo menos
en algunos casos, se produce mediante recombinación homóloga
(Dunham M.A. et al., Nature Genetics
26:447-450, 2000). Las células epiteliales
aparentemente resultan inmortalizadas por ALT mucho menos
frecuentemente que los fibroblastos (Bryan T.M. et al.,
Nature Medicine 3:1271-1274, 1997; Mehle C. et
al., Oncogene 13:161-166, 1996).
Resulta interesante que los cánceres en gran
parte son de origen epitelial, lo que podría explicar los
porcentajes generalmente altos de tumores que son positivos para
telomerasa. Si embargo, debido a que los telómeros de los tumores
en algunas poblaciones de pacientes se mantienen mediante un
mecanismo independiente de telomerasa, esto establece un límite
superior a la sensibilidad que puede alcanzarse con cualquier ensayo
basado en una telomerasa diseñado para el diagnóstico o el
seguimiento de la recurrencia de un cáncer. Determinados tumores
escaparían a la detección utilizando una telomerasa como único
marcador de cáncer.
Los inventores reconocieron una necesidad de un
método para detectar tumores que no expresan telomerasa. La
presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la
expresión incrementada de SENP1 es un marcador útil para
identificar cánceres que no presentan niveles detectables de
telomerasa. De esta manera, mediante la detección de tanto SENP1
como telomerasa en una muestra, resulta posible detectar un número
significativo de cánceres. Por consiguiente, la presente invención
proporciona métodos para detectar la presencia de células de cáncer
de vejiga en una muestra biológica mediante la determinación de la
cantidad de SENP1 y de TERT o TERC en la muestra.
Además, la presente invención se basa en parte
en el descubrimiento de que la expresión incrementada de SENP1
resulta un marcador útil para identificar el cáncer de vejiga.
Además, los inventores han demostrado que la utilización de tanto
SENP1 como TERC o TERC como marcadores puede proporcionar una mayor
sensibilidad y especificidad para detectar cánceres de vejiga que
la utilización de cualquiera de los marcadores individualmente. Por
consiguiente, la presente invención proporciona métodos para
detectar la presencia de células de cáncer de vejiga en una muestra
biológica mediante la determinación de la cantidad de SENP1 y,
opcionalmente, de TERT o TERC, en la muestra. De esta manera, en
algunas realizaciones de la invención se detectan tanto SENP1 como
TERT o TERC, en donde un incremento de cualquiera de los marcadores
indica la presencia de cáncer de vejiga.
La presente invención se basa en técnicas
rutinarias del campo de la genética recombinante. Entre los textos
básicos que proporcionan los métodos generales de utilización en la
presente invención se incluyen: Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Kriegler, Gene
Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 1990, y Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., editores,
2002).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención permite utilizar cualquier
método de cuantificación de polinucleótidos de SBNP1 y/o TERT o
TERC (incluyendo ARNm de SENP1, ADNc de SENP1, ARNm de TERT, ADNc de
TERT, ARN de TERC, ADNc de TERC, etc.) y/o polipéptidos ASENP1 y/o
TERT o TERC y/o la actividad de SENP1 y/o de TERT o TERC, conocido
por el experto en la materia, secuencial o simultáneamente en un
ensayo o en múltiples ensayos. Entre los enfoques ejemplares de la
detección de SENP1, TERT o TERC se incluyen, por ejemplo, (a) la
detección de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa, incluyendo
la utilización de ensayos basados en la hibridación y/o la reacción
de amplificación de polinucleótidos, (b) la detección de proteínas
SENP1 o telomerasa, incluyendo la utilización de ensayos basados en
un agente de afinidad que implican un agente que se une
específicamente a un polipéptido o polinucleótido de SENP1 o de
telomerasa, y/o (c) la detección de la actividad de SENP1 o de
telomerasa. La totalidad de estos métodos permite la cuantificación
directa o indirecta posterior de las dianas detectadas, es decir,
SENP1 y telomerasa.
Típicamente, los polinucleótidos o polipéptidos
SENP1 asociados a cáncer detectados en la presente invención son
por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% o más idénticos a la secuencia SEC ID nº 1 o a aquellos
polinucleótidos codificantes de la secuencia SEC ID nº 2 o a una o
más de las secuencias SENP1 disponibles, por ejemplo de GenBank
(ver, por ejemplo, la secuencia de ARNm de SENP en NMR_014554 y el
polipéptido SENP1 en NP_055369). De manera similar, los
polinucléotidos de telomerasa (por ejemplo ARN de TERT o TERC) o
los polipéptidos telomerasa (por ejemplo TERT) detectados en la
presente memoria son aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a un polinucleótido o polipéptido
de telomerasa. Los polinucleótidos o polipéptidos de SENP o de
telomerasa detectados pueden representar formas funcionales o no
funcionales del polinucleótido o polipéptido asociado a cáncer, o
cualquier variante, derivado o fragmento del mismo. Típicamente, se
detecta el nivel y/o presencia de polinucleótidos o polipéptidos
asociados a cáncer en una muestra biológica.
Entre los métodos para detectar la expresión de
telomerasa pueden incluirse métodos del mismo tipo utilizado para
detectar SENP1 (por ejemplo se detectan polinucleótidos tanto de
telomerasa como de SENP1) o diferentes métodos (por ejemplo se
detectan polinucleótidos de SENP1 y actividad de telomerasa). Sin
embargo, para comodidad del usuario, puede resultar deseable
utilizar el mismo ensayo de detección tanto para la telomerasa como
para SENP1. Por ejemplo en algunas realizaciones, puede utilizarse
una reacción multiplex cuantitativa de transcripción
inversa-en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) para cuantificar la expresión tanto de
SENP1 como de telomerasa en una muestra. En algunas realizaciones,
se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa en tiempo
real.
Pueden llevarse a cabo ensayos de detección en
preparaciones que contienen ARNm o ADNc generado a partir de ARNm
aislado de una manera que refleje los niveles relativos de
transcritos de ARNm en la muestra. Los métodos para detectar ARN de
telomerasa han sido descritos y pueden adaptarse generalmente para
detectar SENP1 (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.582.965, nº
5.846.723, nº 6.607.898; publicación de patente US nº 2002/0012969,
y Angelopoulou et al., Anticancer Res.
23:4821-4829, 2003).
En algunas realizaciones, pueden determinarse
los niveles de ARN utilizando reacciones de amplificación, tales
como la PCR. Por ejemplo, puede utilizarse uno o más cebadores
oligonucleótidos para amplificar una región de un polinucleótido
SENP1 (por ejemplo un ADNc de SENP1 o de telomerasa). Entre las
reacciones de amplificación que resultan útiles para la presente
invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa
(LCR) (ver las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202; PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications (Innit et al.,
editor, 1990)), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)
(Walker et al., Nucleic Acids Res.
20:1691-1696, 1992; Walker, PCR Methods Appl.
3:1-6, 1993), la amplificación mediada por la
transcripción (Phyffer et al., J. Clin. Microbiol.
34:834-841, 1996; Vuorinen et al., J. Clin.
Microbiol. 33:1856-1859, 1995), la amplificación
basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Compton, Nature
350:91-92, 1995), la amplificación de círculo
rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12:75-99,
1999; Hatch et al., Genet. Anal. 15:35-40,
1999), la amplificación de señal de ADN ramificado (ADNb) (ver, por
ejemplo, Iqbal et al., Mol. Cell Probes
13:315-320, 1999, y la replicasa
Q-beta (Lizardi et al., Biotechnology 6:1197,
1988).
Aunque puede utilizarse cualquier tipo de
reacción de amplificación, en algunas realizaciones se utiliza PCR
para amplificar ADNs molde. Los cebadores de PCR típicamente se
diseñan para hibridarse específicamente al polinucleótido de SENP1,
por ejemplo bajo condiciones utilizadas en una reacción de PCR. Por
ejemplo, los cebadores típicamente se hibridan en tampones de PCR
estándares (tales como, aunque sin limitación, aquellos que
contienen bicina 50 mM, pH 8,0, acetato de potasio 115 mM, glicerol
al 8%, acetato de manganeso 3 mM, 200 \muM de cada
desoxiadenosina trifosfato, desoxicitina trifosfato, desoxiguanosina
trifosfato y 500 \muM de desoxiuridina trifosfato, 2 unidades de
uracil-N-glucosilasa (UNG), 10
unidades de ADN polimerasa, 200 nM de cada cebador, directo e
inverso, y opcionalmente una sonda polinucleótida) a aproximadamente
60ºC. Generalmente los cebadores se diseñan y/o se someten a ensayo
para evitar una homología o hibridación significativa con otros
polinucleótidos probablemente presentes en la muestra biológica (por
ejemplo en el genoma humano). También se han descrito y pueden
utilizarse métodos alternativos de amplificación (por ejemplo LCR,
SDA, RCA, Q-beta, etc.).
En algunas realizaciones, puede detectarse ARN
de SENP1 o de telomerasa utilizando transcriptasa
inversa-reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR). Los métodos de RT-PCR son
bien conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo,
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.,
editores, 2002).
Los métodos de amplificación utilizados para
detectar polinucleótidos de SENP1 pueden implicar una metodología
de PCR cuantitativa tal como, por ejemplo, la PCR en tiempo real,
incluyendo la RT-PCR cuantitativa. Los métodos de
amplificación cuantitativa se dan a conocer en, por ejemplo, las
patentes US nº 6.180.349, nº 6.033.854 y nº 5.972.602, así como en,
por ejemplo, Gibson et al., Genoma Research
6:995-1001, 1996; DeGraves et al.,
Biotechniques 34:106-110, 112-115,
2003; Deiman B. et al., Mol. Biotechnol.
20:163-179, 2002). Para cuantificar la cantidad de
ARN específico en una muestra, puede generarse una curva estándar a
partir de la transcripción run-off de un plásmido
que contiene el gen de interés. Pueden generarse curvas estándar
utilizando los valores umbral (C_{t}), determinados en la PCR en
tiempo real, que se relacionan con la concentración inicial de ADNc
utilizada en el ensayo. Además, puede generarse una curva estándar
para un polinucleótido estándar (por ejemplo una secuencia
anteriormente cuantificada). Esto permite la estandarización del
contenido inicial de ARN de una muestra biológica respecto a la
cantidad de estándar con fines comparativos (ver, por ejemplo, The
PCR Technique: Quantitative PCR, J. Larrick (editor), 1997).
Un método de detección de productos de
amplificación es el ensayo de PCR de 5' nucleasa (utilizando, por
ejemplo, Cobas TaqMan 48 Analyzer^{TM} (Roche Molecular Systems,
Pleasanton, CA)) (ver, por ejemplo, Holland et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, 1991; Lee et
al., Nucleic Acids Res. 21:3761-3766, 1993;
patentes US nº 6.214.979, nº 5.804.375, nº 5.487.972 y nº
5.210.015). Este ensayo detecta la acumulación de un producto de
PCR específico mediante hibridación y corte de una sonda doblemente
marcada fluorigénica durante la reacción de amplificación. La sonda
fluorigénica puede consistir de un oligonucleótido (por ejemplo que
se hibrida a un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa o el
complemento del mismo) marcado con un pigmento informador
fluorescente y un pigmento desactivador. Durante la PCR, esta sonda
es cortada por la actividad 5' nucleasa de la ADN polimerasa, sólo
y sólo si se hibrida con el segmento que se amplifica. El corte de
la sonda genera un incremento de la intensidad de fluorescencia del
pigmento informador.
En algunas realizaciones, los enzimas con
actividad de 5' nucleasa son ácido nucleico polimerasas termoactivas
y termoestables. Entre dichas polimerasas termoestables se
incluyen, aunque sin limitación, formas nativas y recombinantes de
polimerasas procedentes de una diversidad de especies de los géneros
eubacterianos Thermus, Thermatoga y
Thermosipho. Por ejemplo, entre las polimerasas de las
especies de Thermus que pueden utilizarse en los métodos de
la invención se incluyen la ADN polimerasa de Thermus
aquaticus (Taq), la ADN polimerasa de Thermus
thermophilus (Th), la ADN polimerasa de Thermus especie
Z05 (Z05), la ADN polimerasa de Thermatoga maritima, la ADN
polimerasa de Thermatoga neapolitana y de la especie de
Thermus sps 17 (sps17), tal como se describe en las patentes
US nº 5.405.774, nº 5.352.600, nº 5.079.352, nº 4.889.818, nº
5.466.591, nº 5.618.711, nº 5.674.738 y nº 5.795.762.
Otro método de detección de productos de
amplificación que se basa en la utilización de transferencia de
energía es el método de la "baliza molecular" de Tyagi y
Kramer (Nature Biotech. 14:303-309, 1996) que
también es el objeto de las patentes US nº 5.119.801 y nº
5.312.728. Este método utiliza sondas oligonucleótidas de
hibridación que pueden formar estructuras de horquilla. En un
extremo de la sonda de hibridación (en el extremo 5' o 3') existe
un fluoróforo donante, y en el otro extremo, un grupo aceptor. En el
caso del método de Tyagi y Kramer, este grupo aceptor es un
desactivador, es decir, el aceptor absorbe la energía liberada por
el donante, pero él mismo no emite fluorescencia. De esta manera,
en el caso de que la baliza se encuentre en conformación abierta,
la fluorescencia del fluoróforo donante es detectable, mientras que,
en el caso de que la baliza se encuentre en la conformación de
horquilla (cerrada), se desactiva la fluorescencia del fluoróforo
donante. Al utilizarlas en una PCR, la baliza molecular que se
hibrida con una de las cadenas del producto de PCR se encuentra en
"conformación abierta" y se detecta la fluorescencia, mientras
que aquéllas que quedan no hibridadas no emiten fluorescencia
(Tyagi y Kramer, Nature Biotechnol. 14:303-306,
1996). Como resultado, la cantidad de fluorescencia se incrementa a
medida que se incrementa la cantidad de producto de PCR, y de esta
manera puede utilizarse como medida del progreso de la PCR. El
experto en la materia reconocerá que también se encuentran
disponibles otros métodos de amplificación cuantitativa. Entre otro
tipos de sondas útiles para los métodos de PCR en tiempo real se
incluyen las sondas Scorpion^{TM}, que se encuentran disponibles
en formatos "unimarcados"
y "bimarcados", de Proligo, C (Boulder, CO) (ver también Bates et al., Mol. Pliant Pathol. 2:275-280, 2001).
y "bimarcados", de Proligo, C (Boulder, CO) (ver también Bates et al., Mol. Pliant Pathol. 2:275-280, 2001).
En todavía otro ejemplo, pueden utilizarse dos
cebadores y una sonda de la invención para detectar y cuantificar
un ácido nucleico diana utilizando la amplificación basada en la
secuencia del ácido nucleico (NASBA). En algunos métodos de NASBA,
se utilizan tres enzimas, incluyendo la transcriptasa inversa, la
ARN polimerasa de T7 y la ARNasa H. El producto de amplificación
final es ARN de una cadena con una polaridad contraria a la del
ácido nucleico que debe detectarse. El producto de ARN amplificado
puede detectarse en algunas realizaciones mediante la utilización
de una sonda de captura específica de una diana unida a partículas
magnéticas conjuntamente con una sonda detectora marcada con
rutenio y un instrumento (NucliSens Reader, bioMérieux) capaz de
medir la electroquimioluminiscencia (ECL). Alternativamente, el ARN
amplificado mediante NASBA puede detectarse específicamente en
tiempo real mediante la inclusión de balizas moleculares en la
reacción de amplificación, tal como se ha indicado anteriormente.
Puede encontrarse directrices adicionales sobre la utilización de
los cebadores y sondas de la invención en artículos por Compton,
Nature 350:91-92, 1991, y Kievits et al., J.
Virol. Methods 35:273-286, 1991.
Otro ejemplo de métodos que utilizan un ácido
nucleico cebador y una sonda para detectar y cuantifica un ácido
nucleico diana implican la utilización de nanopartículas. En estos
métodos, dos oligonucleótidos, tales como un cebador o sonda de la
invención, que pueden hibridarse con regiones diferentes de un ácido
nucleico que debe detectarse, se unen covalentemente a una
nanopartícula. Las nanopartículas se ponen en contacto con un ácido
nucleico diana bajo condiciones de hibridación. En el caso de que el
ácido nucleico se encuentre presente, éste se unirá a los
oligonucleótidos unidos a las nanopartículas, produciendo un
complejo de gran peso molecular que puede detectarse. El complejo
puede detectarse mediante cualquier método conocido por el experto
en la materia sin limitación. En determinadas realizaciones, el
complejo se detecta mediante precipitación del complejo. En
determinadas realizaciones, se detecta el complejo mediante
precipitación del complejo. Pueden encontrarse directrices
adicionales sobre métodos de utilización de nanopartículas en
relación a los cebadores y sondas de la invención en Taton et
al., Science 289:1757-1760, 2000, y las patentes
US nº 6.506.564, nº 6.495.324, nº 6.417.340, nº 6.399.303 y nº
6.361.944.
En todavía otro ejemplo, puede utilizarse la
amplificación de círculo rodante ("RCA") como parte de un
método para detectar y cuantificar un ácido nucleico diana. En
determinadas realizaciones de métodos RCA, se amplifica un ADN
circular mediante extensión por polimerasa de un cebador
complementario. Puede utilizarse cualquiera de los cebadores o
sondas de la invención en dichos métodos. Los métodos de
circularización del ADN son bien conocidos de la técnica y entre
ellos se incluyen, por ejemplo, la ligación de los extremos de una
molécula de ADN bajo condiciones que favorecen la ligación
intramolecular. El producto concatámero de una cadena seguidamente
puede detectarse mediante cualquier método de detección de ácidos
nucleicos conocido por el experto en la materia sin limitación. Por
ejemplo, el producto concatámero puede detectarse utilizando una
sonda detectablemente marcada de la invención. Otros ejemplos de
métodos para detectar un ácido nucleico de secuencia conocida se
describe extensivamente en la presente memoria. En otras
realizaciones del RCA, puede utilizarse un segundo cebador que es
complementario al producto concatámero. Este cebador permite la
amplificación exponencial de las secuencias presentes en el ADN
molde circular. Los productos de la amplificación todavía pueden
detectarse, por ejemplo, mediante la utilización de una sonda
detectablemente marcada de la invención. Pueden encontrarse
directrices adicionales sobre la utilización de cebadores y sondas
de la invención en los métodos RCA para la detección de un ácido
nucleico diana en las patentes US nº 6.344.329, nº 6.350.580, nº
6.221.603, nº 6.210.884, nº 5.648.245 y nº 5.714.320 y la patente
WO nº 95/35390.
En otro ejemplo de dichos métodos, puede
detectarse y amplificarse un ácido nucleico diana utilizando la
amplificación por desplazamiento de cadena ("SDA"). En estos
métodos, se detectan los ácidos nucleicos amplificados mediante la
incorporación de un cebador de una cadena que comprende un grupo
fluorescente, un grupo desactivador, y un sitio de restricción
introducido que separa los dos grupos. El experto en la materia
podrá reconocer fácilmente cómo modificar cualquiera de los
cebadores o sondas de la invención para la utilización en la
SDA.
En una primera reacción de amplificación
utilizada en la SDA, el cebador se utiliza para amplificar un ácido
nucleico diana en presencia de, por ejemplo,
tio-dCTP, incorporando de esta manera el cebador en
el producto de amplificación. A continuación, puede utilizarse una
endonucleasa de restricción para cortar el sitio de restricción en
el cebador. La endonucleasa de restricción no puede cortar ambas
cadenas del producto de amplificación debido a la incorporación de
tio-dCTP en el producto de amplificación.
Finalmente, el extremo 3' del cebador creado por el corte puede
utilizarse para cebador una nueva reacción de polimerización,
desplazando de esta manera la parte de la cadena 3' respecto al
corte de la cadena de molde. El desplazamiento de la cadena separa
el grupo fluorescente del grupo desactivado, evitando de esta manera
la desactivación de la fluorescencia emitida por el grupo
fluorescente. De esta manera puede detectarse y/o cuantificarse un
polinucleótido de SENP1 o de telomerasa mediante la medición de la
presencia y/o cantidad de la fluorescencia. Pueden encontrarse
directrices adicionales sobre la selección y modificación de
cebadores y sondas para la utilización en la SDA en Little et
al., Clin. Chem. 45:777-784, 1999, y en las
patentes US nº 6.528.254 y nº 6.528.632.
En otro ejemplo, puede detectarse y
cuantificarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando
amplificación mediada por la transcripción ("TMA"). TMA es un
sistema de amplificación por transcripción de ARN que utiliza la
ARN polimerasa y la transcriptasa inversa para amplificar los ácidos
nucleicos que deben detectarse. En el método se utiliza un cebador
de la invención con un promotor para la ARN polimerasa para cebar la
transcripción inversa de un ARN diana. A continuación, la actividad
de ARNasa de la transcriptasa inversa degrada el molde de ARN,
liberando la cadena de ADNc. La síntesis de la segunda cadena se
ceba con un segundo cebador de la invención y es catalizada por una
transcriptasa inversa. La ARN polimerasa seguidamente reconoce el
promotor sintetizado en la segunda cadena y cataliza múltiples
ciclos de transcripción del ARN a partir de la segunda cadena. El
producto ARN seguidamente puede detectarse o puede servir como molde
para otra ronda de amplificación.
A continuación, el producto ARN de la TMA puede
detectarse y amplificarse mediante cualquier método conocido por un
experto en la materia. En determinadas realizaciones, el producto
ARN puede detectarse con una sonda de la invención. En otras
realizaciones, el producto ARN puede detectarse con una sonda de la
invención que ha sido marcada con un marcaje de éster de acridina
(Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Dichos marcajes
pueden eliminarse químicamente de la sonda no hibridada, mientras
que los marcajes en las sondas hibridadas no se alteran. De esta
manera, en este tipo de realizaciones, la presencia de un ácido
nucleico diana puede detectarse mediante la detección de la
presencia del marcaje de éster de acridina. Pueden encontrarse
directrices adicionales para la utilización de los cebadores y
sondas de la invención en métodos basados en TMA en Arnold et
al., Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989; Miller
et al., J. Clin. Microbiol. 32:393-397, 1994,
y en las patentes US nº 6.335.166 y nº 6.294.338. En otras
realizaciones, puede utilizarse cualquier ensayo conocido por un
experto en la materia que utiliza un único cebador o sonda de ácidos
nucleicos que puede hibridarse con un ácido nucleico para detectar
un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa. Por ejemplo, puede
detectarse un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando un
cebador para iniciar una reacción de extensión de cebador. La
extensión con éxito del cebador por parte de una ácido nucleico
polimerasa indica la presencia del polinucleótido de SENP1 o de
telomerasa. Otros ejemplos de métodos de detección de único cebador
o sonda que describen métodos que pueden utilizarse tal como se
describe, o ser adaptados por un experto en la materia, para
detectar un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa pueden
encontrarse en las patentes US nº 6.440.707, nº 6.379.888, nº
6.368.803, nº 6.365.724, nº 6.361.944, nº 6.352.827, nº 6.326.145,
nº 6.312.906, nº 6.268.128, nº 6.261.784, nº 6.177.249, nº
6.140.055, nº 6.130.047, nº 6.124.090, nº 6.121.001, nº 6.110.677,
nº 6.054.279, nº 6.022.686, nº 5.981.176, nº 5.958.700, nº
5.945.283, nº 5.935.791, nº 5.919.630, nº 5.888.739, nº 5.888.723,
nº 5.882.867, nº 5.876.924, nº 5.866.336, nº 5.856.092, nº
5.853.990, nº 5.846.726, nº 5.814.447, nº 5.808.036, nº 5.800.989,
nº 5.795.718, nº 5.792.614, nº 5.710.028, nº 5.683.875, nº
5.683.872, nº 5.679.510, nº 5.641.633, nº 5.597.696, nº 5.595.890,
nº 5.571.673, nº 5.547.861, nº 5.525.462, nº 5.514.546, nº
5.491.063, nº 5.437.977, nº 5.294.534, nº 5.118.605, nº 5.102.784,
nº 4.994.373, nº 4.851.331 y nº 4.767.700.
Los cebadores oligonucléotidos ejemplares pueden
comprender una secuencia por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%
o 100% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 u otro
número de nucleótidos contiguos de polinucleótidos de SENP1 o de
telomerasa (por ejemplo TERC o TERT) o de complementos de los
mismos.
La longitud y composición de la sonda puede
seleccionarse para proporcionar suficiente estabilidad termodinámica
para garantizar la hibridación de la sonda al ácido nucleico molde
bajo condiciones de reacción apropiadas, que dependen del método de
detección que se llevará a cabo. Por ejemplo, las sodas con
nucleótidos modificados, no estándares o derivatizados pueden ser
más largas o cortos que aquéllas con nucleótidos convencionales,
presentando propiedades termodinámicas de hibridación similares.
Pueden encontrarse ejemplos de dichas bases no estándares en las
patentes US nº 6.320.005, nº 6.174.998, nº 6.001.611 y nº 5.990.303.
A modo de otro ejemplo, las sondas con secuencias ricas en G/C
pueden hibridarse con secuencias diana a temperaturas más altas que
una sonda de longitud similar con secuencias ricas en A/T.
Las sondas oligonucleótidas detectablemente
marcadas ejemplares pueden comprender una secuencia por lo menos
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a por lo menos 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 30, 40, 50 u otro número de nucleótidos contiguos de
polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa (por ejemplo TERC o TERT)
o de complementos de los mismos.
Además de la secuencia de nucleótidos de la
sonda tal como se ha indicado en la presente memoria, la sonda
puede comprender secuencias de nucleótidos adicionales u otros
grupos que no inhiban los métodos de la presente invención. En
algunas realizaciones de la invención, la sonda puede comprender
secuencias de nucleótidos adicionales u otros grupos que faciliten
los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la sonda puede
bloquearse en su extremo 3' terminal para impedir el cebado no
deseado de polimerización de ácidos nucleicos por parte de la
sonda. Además, pueden encontrarse presentes grupos dentro de la
sonda que estabilicen o desestabilicen la hibridación de la sonda o
de fragmentos de la misma con la secuencia de nucleótidos. Las
sondas de la invención también pueden comprender nucleótidos
modificados, no estándares o derivatizados tal como se ha definido
anteriormente.
En determinadas realizaciones de la invención la
sonda puede comprender un grupo detectable. El grupo detectable
puede ser cualquier grupo detectable conocido por un experto en la
materia sin limitación. Además, el grupo detectable puede ser
detectable mediante cualquier medio conocido por el experto en la
materia sin limitación. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser
detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos,
inmunoquímicos o químicos.
Una diversidad de grupos detectables que pueden
utilizarse para detectar las sondas de la invención, así como
métodos para su unión a la sonda, son conocidos de la técnica, y
entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, grupos
fluorescentes, cromóforos, marcajes quimioluminiscentes, marcajes
electroquimioluminiscentes, tales como Origin^{TM} (Igen,
Rockville, MD), ligandos que presentan parejas de unión específicos,
o cualquier otro marcaje que pueda interactuar con para
incrementar, alterar o reducir una señal. Evidentemente, en el caso
de que se lleve a cabo una reacción de 5' nucleasa utilizando una
ADN polimerasa termoestable a temperaturas elevada, en algunas
realizaciones, el grupo detectable no se degrada o, de otro modo, se
convierte en indetectable por dichas temperaturas elevadas. En
determinadas realizaciones, el grupo detectable puede ser un grupo
fluorescente. El grupo fluorescente puede ser cualquier grupo
fluorescente conocido por el experto en la materia sin limitación.
En algunas realizaciones, se utilizan grupos fluorescentes con
desplazamientos de Stokes amplios, permitiendo la utilización
fluorímetros con filtros y no monocromómetros, e incrementar la
eficiencia de la detección. En determinadas realizaciones, el grupo
fluorescente puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de
los pigmentos de la familia de la fluoresceína (Integrated ADN
Technologies Inc., Coralville, IA), pigmentos de la familia de
polihalofluoresceína, pigmentos de la familia de la
hexaclorofluoresceína, pigmentos de la familia de la coumarina
(Molecular Probes Inc., Eugene, OR), pigmentos de la familia de la
rodamina (Integrated ADN Technologies Inc.), pigmentos de la
familia de la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina,
pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de
la escuaraína, pigmentos de la familia de los lantánidos quelados y
pigmentos de la familia de BODIPY® (Molecular Probes Inc.). En
algunas realizaciones, el grupo fluorescente es la
6-carboxifluoresceína (FAM^{TM}) (Integrated ADN
Technologies Inc.). Otros ejemplos de grupos fluorescentes que
pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de la invención
pueden encontrarse en las patentes US nº 6.406.297, nº 6.221.604,
nº 5.994.063, nº 5.808.044, nº 5.880.287, nº 5.556.959 y nº
5.135.717. En otras realizaciones, el grupo detectable puede ser un
grupo detectable diferente de un grupo fluorescente. Entre los
grupos radioactivos resultan preferentes los compuestos marcados con
^{32}P. Puede utilizarse cualquier método conocido por el experto
en la materia sin limitación para introducir ^{32}P en una sonda.
Por ejemplo, puede marcarse una sonda con ^{32}P mediante marcaje
5' con una quinasa o mediante inserción aleatoria mediante corte y
marcado ("nick translation"). Los grupos detectables que son
enzimas típicamente pueden detectarse a partir de su actividad. Pro
ejemplo, la fosfatasa alcalina puede detectarse mediante la
medición de la fluorescencia producida por la acción del enzima
sobre compuestos de sustrato apropiados. En el caso de que se
utilice un miembro de parejas de unión específicas como grupo
detectable, la presencia de la sonda puede detectarse mediante la
detección de la unión específica de una molécula al miembro de la
pareja de unión específica. Por ejemplo, puede unirse un antígeno a
la sonda, y utilizarse un anticuerpo monoclonal específico para ese
antígeno para detectar la presencia del antígeno y, por lo tanto, de
la sonda. Entre otras parejas de unión específica que pueden
utilizarse como grupos detectables se incluyen biotina y avidina o
estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosas otras parejas de
receptor-ligando bien conocidas de la técnica.
Todavía otros ejemplos de grupos detectables que no son grupos
fluorescentes pueden encontrarse en las patentes US nº 5.525.465,
nº 5.464.746, nº 5.424.414 y nº 4.948.882.
La descripción anteriormente proporcionada de
grupos detectables no pretende categorizar los diversos marcajes en
clases diferentes, debido a que el mismo marcaje puede servir en
varios modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como
grupo radioactivo o como reactivo electrodenso. La peroxidasa de
rábano picante puede servir como enzima o como antígeno para un
anticuerpo monoclonal. Además, pueden combinarse diversos grupos
detectables para un efecto deseado. Por ejemplo, puede marcarse una
sonda con biotina, y detectarse su presencia con avidina marcada
con ^{125}I, o con un anticuerpo monoclonal
anti-biotina marcado con peroxidasa de rábano
picante. Otras permutaciones y posibilidades resultarán fácilmente
evidentes para el experto ordinario en la materia, y se consideran
equivalentes comprendidos dentro del alcance de la presente
invención.
El método de unión o conjugación del grupo
detectable con la sonda depende, evidentemente, del tipo de grupo o
grupos detectables utilizados y de la posición del grupo detectable
en la sonda.
El grupo detectable puede unirse a la sonda
directa o indirectamente mediante una diversidad de técnicas.
Dependiendo del tipo exacto de grupo detectable utilizado, éste
puede localizarse en el extremo 5' o 3' de la sonda, internamente
en la secuencia de nucleótidos de la sonda, o unido a brazos
espaciadores de diversos tamaños y composiciones para facilitar las
interacciones de señales. Mediante la utilización de reactivos
fosforamidita disponibles comercialmente pueden producirse
oligonucleótidos que contienen grupos funcionales (por ejemplo
tioles o aminas primarias) en cualquiera de los extremos mediante
una fosforamidita apropiadamente protegida, y puede unirse a la
misma un grupo detectable utilizando protocolos descritos en, por
ejemplo, Innis et al. (editores), PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, 1990).
Los métodos para introducir reactivos
funcionalizadores de oligonucleótido para la introducción de uno o
más grupos sulfihidrilo, amino o hidroxilo en la secuencia de la
sonda oligonucleótido, típicamente en el extremo 5', se describen
en la patente US nº 4.914.210. Puede introducirse un grupo 5'
fosfato a modo de isótopo radioactivo mediante la utilización de
polinucleótido quinasa y [gamma-^{32}P]ATP
para proporcionar un grupo informador. Puede añadirse biotina en el
extremo 5' mediante la reacción de un residuo aminotimidina o de un
línker alquilamino, introducido durante la síntesis, con un
N-hidroxisuccinimida éster de biotina. Otros métodos
de unión de un grupo detectable, incluyendo un grupo fluorescente,
a la sonda pueden encontrarse en la patente US nº 5.118.802.
También resulta posible unir un grupo detectable
en el extremo 3' de la sonda mediante la utilización, por ejemplo,
de polinucleótido transferasa terminal para añadir un grupo deseado,
tal como, por ejemplo, cordicepín ^{35}S-dATP, y
dUTP biotinilado. Los derivados oligonucleótidos también son grupos
detectables que pueden utilizarse en las sondas, métodos y kits de
la presente invención. Por ejemplo, eteno-dA y
eteno-A son nucleótidos adenina fluorescentes
conocidos que pueden incorporarse en una sonda oligonucleótida. De
manera similar, eteno-dC es otro análogo que podría
utilizarse en la síntesis de una sonda. Las sondas que contienen
dichos derivados de nucleótidos pueden degradarse para liberar
mononucleótidos que son mucho más fuertemente fluorescentes que la
sonda intacta mediante, por ejemplo una actividad 5' a 3' nucleasa
de polimerasa.
En determinadas realizaciones de la invención,
puede marcarse una sonda con más de un grupo detectable. En algunas
de dichas realizaciones, cada grupo detectable puede unirse
individualmente a diferentes bases de la sonda. En otras
realizaciones, puede unirse más de un grupo detectable a la misma
base de la sonda.
En determinadas realizaciones, el grupo
detectable puede unirse al extremo 5' de la sonda. En otras
realizaciones, el grupo detectable puede unirse a la sonda en un
residuo que se encuentra a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, aproximadamente 35, aproximadamente 40 residuos u otro numero
de residuos del extremo 5' de la sonda. El grupo detectable puede
unirse a cualquier parte de un residuo de la sonda. Por ejemplo, el
grupo detectable puede unirse a un grupo azúcar, fosfato, o base de
un nucleótido en la sonda. En otras realizaciones, el grupo
detectable puede unirse entre dos residuos de la sonda.
En determinadas realizaciones de la invención,
la sonda puede comprender un grupo fluorescente y un grupo
desactivador. En dichas realizaciones, el grupo fluorescente puede
ser cualquier grupo fluorescente conocido por el experto en la
materia, tal como se ha indicado anteriormente. Además, el grupo
desactivador puede ser cualquier grupo desactivador conocido por el
experto en la materia sin limitación. En determinadas realizaciones,
el grupo desactivador puede seleccionarse de entre el grupo que
consiste de pigmentos de la familia de la fluoresceína, pigmentos
de la familia de la polihalofluoresceína, pigmentos de la familia de
la hexaclorofluoresceína, pigmentos de la familia de la coumarina,
pigmentos de la familia de la rodamina, pigmentos de la familia de
la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina, pigmentos de la
familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuaraína,
pigmentos de la familia de los lantánidos quelados, pigmentos de la
familia de BODIPY® y grupos desactivadores no fluorescentes. En
determinadas realizaciones, los grupos desactivadores no
fluorescentes pueden ser pigmentos de la familia de BHQ^{TM},
Iowa Black^{TM} o Dabcyl (Integrated ADN Technologies Inc.).
Entre otros ejemplos de grupos desactivadores específicos se
incluyen, por ejemplo, aunque no en modo limitativo, TAMRA
(N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina)
(Molecular Probes Inc.), DABCYL (ácido
4-(4'dimetilaminofeilazo)benzoico), Iowa Black TM
(Integrated ADN Technologies Inc.), Cy3^{TM} (Integrated ADN
Technologies Inc.) o Cy5^{TM} (Integrated ADN Technologies Inc.).
En una realización preferente, el grupo desactivador es Cy5^{TM}.
Otros ejemplos de grupos desactivadores que pueden utilizarse en
las sondas, métodos y kits de la invención pueden encontrarse en
las patentes US nº 6.399.392, nº 6.348.596, nº 6.080.068 y nº
5.707.813, cada una de las cuales se incorpora en la presente
memoria como referencia en su totalidad.
En determinadas realizaciones, el grupo
desactivador puede unirse al extremo 3' de la sonda. En otras
realizaciones, el grupo desactivador puede unirse a la sonda en un
residuo que se encuentra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
aproximadamente 35, aproximadamente 40 u otro número de residuos
del extremo 5' de la sonda. En una realización preferente, el grupo
fluorescente se encuentra unido al extremo 5' de la sonda y el
grupo desactivador se encuentra unido a un residuo que se encuentra
a aproximadamente 9 ó menos residuos del extremo 5' de la sonda. El
grupo desactivador puede unirse a cualquier parte de un residuo de
la sonda. Por ejemplo, el grupo desactivador puede unirse a un grupo
sacárido, fosfato o base de un nucleótido en la sonda. En otras
realizaciones, el grupo desactivador puede unirse entre dos
residuos de la sonda.
Aunque sin pretender restringirse a ninguna
teoría o mecanismo de acción en particular, se cree que, en el caso
de que la sonda se encuentre intacta, un fotón emitido por el grupo
fluorescente puede ser absorbido y de esta manera aceptado por el
grupo desactivador. El grupo desactivador seguidamente libera la
energía del fotón en forma de un fotón de diferente longitud de
onda o en forma de calor. De esta manera, el grupo desactivador
también puede ser un grupo fluorescente. Tal como se ha indicado
anteriormente, este fenómeno se denomina transferencia de energía
por resonancia fluorescente ("FRET"). El corte de la sonda
entre el grupo fluorescente y el desactivador resulta en una
reducción de la captación de la fluorescencia emitida por el grupo
fluorescente por parte del grupo desactivador.
Generalmente, la transferencia de energía entre
el grupo fluorescente y el grupo desactivador depende de la
distancia entre el grupo fluorescente y el grupo desactivador y de
la distancia crítica de transferencia de la pareja particular de
grupo fluorescente-grupo desactivador. La distancia
crítica de transferencia es tanto característica como constante
para un grupo fluorescente dado apareado con un grupo desactivador
dado. Además, la reacción espacial del grupo fluorescente en
referencia al grupo desactivador puede determinarse más
sensiblemente en el caso de que la distancia crítica de
transferencia de la pareja de grupo
fluorescente-grupo desactivador se encuentre
próxima a la distancia entre el grupo fluorescente y el grupo
desactivador. Por consiguiente, el experto en la materia puede
seleccionar el grupo fluorescente y el grupo desactivador para que
presenten una distancia crítica de transferencia que se encuentre
próxima a la distancia que separa el grupo fluorescente del grupo
desactivador en la sonda. Las distancias críticas de transferencia
de parejas particulares de grupo fluorescente-grupo
desactivador son bien conocidas del a técnica y pueden encontrarse,
por ejemplo, en un artículo de Wu y Brand, Anal. Biochem.
218:1-13, 1994.
Entre otros criterios para la selección de
parejas particulares de grupo fluorescente-grupo
desactivador se incluyen, por ejemplo, el rendimiento cuántico de
emisión fluorescente por parte del grupo fluorescente; la longitud
de onda de la fluorescencia emitida por el grupo fluorescente; el
coeficiente de extinción del grupo desactivador; la longitud de
onda de fluorescencia, en caso de existir, emitida por el grupo
desactivador; y el rendimiento cuántico de la emisión fluorescente,
en caso de existir, por parte del grupo desactivador. Además, en el
caso de que el grupo desactivador también sea un grupo fluorescente,
el grupo desactivador y el grupo fluorescente pueden seleccionarse
de manera que la fluorescencia emitida por uno pueda distinguirse
fácilmente de la fluorescencia emitida por el otro. Pueden
encontrarse directrices adicionales sobre la selección de parejas
particulares de grupo fluorescente-grupo
desactivador en un artículo de revisión de Klostermeier y Millar,
Biopolymers 61:159-179, 2002.
Entre las combinaciones ejemplares de grupos
fluorescentes y grupos desactivadores que pueden utilizarse en el
presente aspecto de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a
ellas, grupo fluorescente rodamina 590 y grupo desactivador cristal
violeta. Una combinación preferente de grupos fluorescente y
desactivador es el grupo fluorescente
6-carboxifluoresceína y el grupo desactivador
Cy5^{TM}. Otros ejemplos de parejas de grupo
fluorescente-grupo desactivador que pueden
utilizarse en las sondas, métodos y kits de la invención pueden
encontrarse en la patente US nº 6.245.514.
Entre los ejemplos de moléculas que pueden
utilizarse tanto como grupo fluorescente como desactivador en FRET
se incluyen fluoresceína, 6-carboxifluoresceína,
2'7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína,
rodamina, 6-carboxirrodamina,
6-carboxi-X-rodamina
y ácido
5-(2'-aminoetil)aminonaftalén-1-sulfónico
(EDANS). La definición de si un grupo fluorescente es un donante o
un aceptor se realiza a partir de sus espectros de excitación y de
emisión, y el grupo fluorescente con el que se encuentra apareado.
Por ejemplo, FAM TM resulta excitado más eficientemente por luz de
una longitud de onda de 488 nm, y emite luz que presenta un espectro
de 500 a 650 nm, y un máximo de emisión de 525 nm. Por
consiguiente, FAM TM es un grupo fluorescente adecuado para la
utilización con, por ejemplo, TAMRA como grupo desactivador, el
cual presenta su máximo de excitación en 514 nm.
Los métodos para detectar y/o cuantificar el
nivel de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa (ARN o ADNc
construido a partir del mismo) utilizando técnicas de hibridación de
ácidos nucleicos son conocidos del experto en la materia (ver
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a
edición, vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989).
Las muestras biológicas pueden cribarse utilizando una sonda
específica de SENP1 o de telomerasa. Dichas sondas corresponden en
secuencia a una región del ARN de SENP1 o de la telomerasa, o al
complemento de la misma. Bajo condiciones definidas, la hibridación
específica de dicha sonda con un ácido nucleico de ensayo es
indicativa de la presencia del polinucleótido de SENP1 o de
telomerasa en una muestra. Las condiciones definidas resultarán
suficientes para permitir la hibridación de la sonda con su diana
sin hibridarse significativamente a otros polinucleótidos en una
mezcla compleja (por ejemplo ADN genómico de una célula). Si se
desea, puede utilizarse más de una sonda en la muestra de ensayo. La
sonda puede comprender tan sólo 8, 15, 20, 50 ó 100, u otro número,
de nucleótidos de la secuencia de ARN de SENP1 o de telomerasa, o
el complemento de la misma, o puede comprender hasta 500, 1 kb o la
secuencia de ARN completa o su complemento. En algunas
realizaciones, la sonda presenta una longitud de entre 12 y 100
nucleótidos, o de entre 16 y 50 nucleótidos o de entre 18 y 40
nucleótidos.
Un método para evaluar la presencia, ausencia
y/o cantidad de polinucleótidos de SENP1 o de telomerasa implica
una transferencia northern: se aísla un ARNm a partir de una muestra
biológica dada, se separa mediante electroforesis y se transfiere
del gel a un soporte sólido (por ejemplo una membrana de
nitrocelulosa). A continuación, las sondas de SENP o de telomerasa
marcadas se hibridan con la membrana con el fin de identificar y/o
cuantificar el ARNm. La expresión de polinucleótidos de SENP1 o de
telomerasa también puede analizarse mediante otras técnicas
conocidas de la técnica, por ejemplo transferencia de puntos,
hibridación in situ, protección frente a la ARNasa,
microchips de sondeo de ADN, y similares.
Un método alternativo que resulta bastante útil
en el caso de que deba utilizarse un gran número de sondas
diferentes es un formato de transferencia por puntos "inverso",
en le que la secuencia amplificada contiene un marcaje, y la sonda
se encuentra unida al soporte sólido. Este formato resultaría útil
en el caso de que los métodos de ensayo de la presente invención se
utilizasen como uno de entre una batería de métodos realizados
simultáneamente en una muestra. En este formato, las sondas no
marcadas se unen a la membrana y se exponen a la muestra marcada
bajo condiciones astringentes de hibridación apropiadas. La muestra
marcada y no hibridada seguidamente se elimina mediante lavado bajo
condiciones convenientemente astringentes, y después se analiza el
filtro para la presencia de secuencias unidas.
Puede llevarse a cabo tanto el ensayo de
transferencia por puntos directo como inverso convenientemente en
una placa de microtitulación (ver la solicitud de patente US nº
07/695.072 y patente US nº 5.232.829). Las sondas pueden unirse a
albúmina de suero bovino (BSA), por ejemplo, que se adhiere a la
placa de microtitulación, inmovilizando de esta manera la sonda.
Otro ejemplo de un método de utilización de una sonda de la
invención para detectar un polinucleótido de SENP1 o de telomerasa
se describe en la patente US nº 6.383.756, que proporciona un
método para detectar un ácido nucleico unido a una membrana.
En otro ejemplo, puede detectarse un
polinucleótido de SENP1 o de telomerasa utilizando métodos basados
en ADN ramificado. En estos métodos, se construye un monómero
dendrímero de dos cadenas de ADN que comparten una región de
complementariedad de secuencia situada en la parte central de cada
cadena. Al hibridarse las dos cadenas para formar el monómero, la
estructura resultante presenta una parte central de doble cadena
circundada por cuatro extremos de una sola cadena. Puede
ensamblarse un dendrímero a partir de monómeros mediante hibridación
de los extremos de una cadena de los monómeros entre sí, dejando
todavía muchos extremos de una sola cadena libres. Estos extremos
de una cadena libres pueden presentar las secuencias de cualquiera
de los cebadores o sondas de la invención. Un dendrímero puede
marcarse detectablemente con cualquier grupo detectable conocido
por el experto en la materia, aunque sin limitación, tal como se ha
indicado anteriormente en referencia a las sondas de la
invención.
A continuación, pueden utilizarse dendrímeros
como sonda en, por ejemplo, los ensayos de "transferencia por
puntos" indicados posteriormente. Además, puede utilizarse un
dendrímero como sonda en cualquier método conocido por el experto
en la materia en el que la sonda se detecta directamente. Una sonda
se detecta directamente en el caso de que la presencia de la sonda
pueda determinarse sin ninguna reacción o modificación posterior,
tal como una transferencia por puntos o transferencia southern.
Pueden encontrarse directrices adicionales sobre la selección y la
utilización de dendrímeros como sondas en la patente US nº 6.261.779
y en Nilsen et al., J. Theoretical Biology
187:273-284, 1997; Capaldi et al., Nucleic
Acids Res. 28:21e, 2000; Wang et al., J. Am. Chem. Soc.
120:8281-8282, 1998; y Wang et al.,
Electroanalysis 10:553-556, 1998.
En algunos casos, resulta ventajoso detectar y
analizar ADN genómico codificante de SENP1. Por ejemplo, puede
resultar útil determinar la estructura y/o la secuencia de
nucleótidos de una secuencia genómica codificante de SENP1 o que
comprende secuencias reguladoras de SENP1 para identificar
mutaciones asociadas con cáncer u otras enfermedades. De manera
similar, pueden analizarse secuencias de ADNc de SENP1 y/o
secuenciarse los nucleótidos.
En algunos casos, las secuencias genómicas de
SENP1 se analizan para identificar polimorfismos (por ejemplo
variantes) entre alelos comunes y alelos asociados a cáncer. Entre
los tipos de análisis moleculares se incluye, aunque sin limitarse
a ellos, análisis RFLP, análisis basado en PCR, análisis de SNP,
etc.
Además de la detección de polinucleótidos de
SENP1 o de telomerasa, también pueden utilizarse ensayos de
afinidad, tales como inmunoensayos, para detectar polipéptidos
SENP1 o telomerasa. Los inmunoensayos típicamente se utilizan para
cuantificar los polipéptidos SENP1 o telomerasa en una muestra.
Puede encontrarse una visión general de la tecnología aplicable en
Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988.
Los métodos de producción de anticuerpos
policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con
polipéptidos SENP1 o telomerasa son conocidos por el experto en la
materia (ver, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in
Immunology, 1991; Harlow y Lane, supra; Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice (2a edición, 1986); y Kohler y
Milstein, Nature 256:495-497, 1975). Entre dichas
técnicas se incluyen la preparación de anticuerpos mediante
selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes
en vectores fágicos o similares, así como la preparación de
anticuerpos policlonales y monoclonales mediante la inmunización de
conejos o ratones (ver, por ejemplo, Huse et al., Science
246:1275-1281, 1989; Ward et al., Nature
341:544-546, 198).
Pueden utilizarse polipéptidos SENP1 y/o
telomerasa para producir anticuerpos reactivos específicamente con
SENP1 o con telomerasa, respectivamente. Por ejemplo, se aísla y se
purifica un SENP1 recombinante o un fragmento antigénico del mismo,
por ejemplo tras la expresión recombinante en células eucarióticas o
procarióticas. A continuación, el producto se inyecta en un animal
capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos
monoclonales o policlonales, para la utilización posterior en
inmunoensayos para medir la proteína.
Puede recogerse anticuerpos monoclonales y
sueros policlonales y titularse frente a la proteína inmunogénica
en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo de fase sólida con
el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Típicamente se
seleccionan antisueros policlonales con un título de 10 4 o superior
y se someten a reacción para su reactividad cruzada contra
proteínas no SENP1 o telomerasa utilizando un inmunoensayo de unión
competitiva. Los anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales
específicos habitualmente se unen con una K_{d} de por lo menos
aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente de por lo menos
aproximadamente 1 \muM, opcionalmente de por lo menos
aproximadamente 0,1 \muM o mejor, y opcionalmente 0,01 \muM o
mejor.
Tras disponer de los anticuerpos específicos de
SENP1 y/o de telomerasa, pueden detectarse polipéptidos SENP1 o
telomerasa mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para
una revisión del os procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo,
ver Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, editores, 7a
edición, 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención
pueden llevarse a cabo en cualquiera de entre varias
configuraciones, que se revisan extensivamente en Enzyme
Immunoassay (Maggio, editor, 1980) y en Harlow y Lane,
supra.
Pueden detectarse y/o cuantificarse polipéptidos
SENP1 y/o telomerasa utilizando cualquiera de entre varios ensayos
de unión inmunológico bien conocidos (ver, por ejemplo, las patentes
US nº 4.366.241, nº 4.376.110, nº 4.517.288 y nº 4.837.168). Para
una revisión de los inmunoensayos generales, ver Methods in Cell
Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, editor,
1993); Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, editores, 7a
edición, 1991). Los ensayos de unión inmunológica (o inmunoensayos)
típicamente utilizan un anticuerpo que se une específicamente a una
proteína o antígeno de elección (en este caso los polipéptidos SENP1
o telomerasa o subsecuencia antigénica de los mismos). El
anticuerpo (por ejemplo anti-SENP1 o
anti-telomerasa) pueden producirse mediante
cualquiera de entre varios medios bien conocidos por el experto en
la materia y tal como se ha indicado anteriormente.
Los inmunoensayos con frecuencia también
utilizan un agente de marcaje para unirse específicamente y marcar
el complejo formado por anticuerpo y antígeno. El agente de marcaje
mismo puede ser uno de los grupos que comprende el complejo de
anticuerpo/antígeno. De esta manera, el agente de marcaje puede ser
un polipéptido SENP1 o telomerasa marcado o un anticuerpo
anti-SENP1 o anti-telomerasa
marcado. Alternativamente, el agente de marcaje puede ser un tercer
grupo, tal como un anticuerpo secundario, que se une específicamente
al complejo de anticuerpo/SENP1 o de anticuerpo/telomerasa (un
anticuerpo secundario que típicamente es específico de anticuerpos
de la especie a partir de la que se derivó el primer anticuerpo).
Otras proteínas capaces de unirse específicamente a las regiones
constantes de inmunoglobulina, tales como la proteína A o la
proteína G también pueden utilizarse como el agente de marcaje.
Estas proteínas muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con
las regiones constantes de inmunoglobulina de una diversidad de
especies (ver, por ejemplo, Kronval et al., J. Immunol.
111:1401-1406, 1973; Akerstrom et al., J.
Immunol. 135:2589-2542, 1985). El agente de marcaje
puede modificarse con un grupo detectable, tal como biotina, al que
puede unirse específicamente otra molécula, tal como
estreptavidina. Es bien conocida por el experto en la materia una
diversidad de grupos detectables.
Durante los ensayos, pueden resultar necesarias
etapas de incubación y/o de lavado tras cada combinación de
reactivos. Las etapas de incubación pueden durar entre
aproximadamente 5 segundos y varias horas, opcionalmente entre
aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 24 horas. Sin embargo,
el tiempo de incubación depende del formato de ensayo, antígeno,
volumen de solución, concentraciones y similares. Habitualmente, los
ensayos se llevan a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden
llevarse a cabo en un intervalo de temperaturas, tal como entre
10ºC y 40ºC.
Los inmunoensayos para detectar polipéptidos
SENP1 o telomerasa en muestras puede ser competitiva o no
competitiva. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los
que se mide directamente la cantidad de antígeno. En los ensayos
"sándwich", por ejemplo, los anticuerpos
anti-SENP1 o anti-telomerasa pueden
unirse directamente a un sustrato sólido sobre el que se
inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados seguidamente capturan
los polipéptidos SENP1 o telomerasa presentes en la muestra de
ensayo. El polipéptido SENP1 o telomerasa inmovilizado de esta
manera seguidamente se une a un agente de marcaje, tal como un
segundo anticuerpo anti-SENP1 o
anti-telomerasa que porta un marcaje.
Alternativamente, el segundo anticuerpo puede no presentar un
marcaje pero puede, a su vez, unirse a un tercer anticuerpo marcado
específico de anticuerpos de la especie a partir de la que se
derivó el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo
típicamente se modifica con un grupo detectable, tal como biotina,
a la que se une específicamente otra molécula, por ejemplo
estreptavidina, para proporcionar un grupo detectable.
En los ensayos competitivos, se mide
indirectamente la cantidad de polipéptido SENP1 o telomerasa
presente en la muestra mediante la medición de la cantidad de un
polipéptido conocido añadido (exógeno) SENP1 o telomerasa
desplazado (competitivamente) de un anticuerpo
anti-SENP1 o anti-telomerasa por el
polipéptido SENP1 o telomerasa desconocido presente en una muestra.
En un ensayo competitivo, se añade una cantidad conocida de
polipéptido SENP1 o telomerasa a una muestra y seguidamente ésta se
pone en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido SENP1 o telomerasa. La cantidad de polipéptido SENP1 o
telomerasa exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporciona
a la concentración de polipéptido SENP1 o telomerasa presente en la
muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo se inmoviliza
sobre un sustrato sólido. La cantidad de polipéptido SENP1 o
telomerasa unido al anticuerpo puede determinarse mediante la
medición de la cantidad de polipéptido SENP1 o de telomerasa
presente en un complejo SENP1/anticuerpo o telomerasa/anticuerpo, o
alternativamente mediante la medición de la cantidad de proteína no
acomplejada remanente.
También puede utilizarse el análisis de
transferencia western (inmunotransferencia) para detectar y
cuantificar la presencia de polipéptidos SENP1 o de telomerasa en
la muestra. La técnica generalmente comprende separar proteínas de
la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso
molecular, transfiriendo las proteínas separadas a un soporte
sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de
nilón o un filtro de nilón derivatizado) e incubar la muestra con
los anticuerpos que se unen específicamente a SENP1 o a telomerasa.
Los anticuerpos anti-SENP1 o
anti-telomerasa se unen específicamente a SENP1 o a
telomerasa sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden
marcarse directamente o, alternativamente, pueden detectarse
posteriormente utilizando anticuerpo marcados (por ejemplo
anticuerpos antiratón de oveja marcados) que se unen específicamente
a los anticuerpos anti-SENP1 o
anti-telomerasa.
El experto en la materia apreciará que con
frecuencia resulta deseable minimizar la unión no específica en
inmunoensayos. Particularmente en el caso de que el ensayo implique
un antígeno o anticuerpo inmovilizado sobre un sustrato sólido
resulta deseable minimizar la cantidad de unión no específica al
sustrato. Los medios para reducir dicha unión no específica son
bien conocidos por el experto en la materia. Típicamente esta
técnica implica recubrir el sustrato con una composición proteica.
En particular, se utilizan ampliamente las composiciones de
proteínas, tales como la albúmina de suero bovino (BSA), la leche
desnatada en polvo y la gelatina.
El marcaje o grupo detectable particular
utilizado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención,
con la condición de que no interfiera significativamente con la
unión específica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo
detectable puede ser cualquier material que presente una propiedad
física o química detectable. Este tipo de marcajes detectables han
sido bien desarrollados en el campo de los inmunoensayos y, en
general, puede aplicarse en la presente invención la mayoría de
marcajes útiles en dichos métodos. De esta manera, un marcaje es
cualquier composición detectable por medios espectroscópicos,
fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o
químicos. Entre los marcajes útiles en la presente invención se
incluyen perlas magnéticas, pigmentos fluorescentes, marcajes
radioactivos, enzimas y marcajes colorimétricos, tales como el oro
coloidal, el vidrio coloreado o las perlas plásticas.
La cantidad de SENP1 o de telomerasa también
puede determinarse mediante la detección de la actividad de las
proteínas.
SENP1 es una proteasa que elimina las sentrinas
de las proteínas (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.596.527;
Gong et al., J. Biol. Chem. 275:3355-3359,
2000, y Bailey et al., J. Biol. Chem.
279:692-703, 2004). Por ejemplo, la actividad de
SENP1 puede detectarse mediante la detección de la eliminación de
las sentrinas de una cantidad conocida de proteína sentrinizada en
la muestra.
La actividad de telomerasa puede medirse
mediante cualquier ensayo de entre los ensayos conocidos de la
técnica (ver, por ejemplo, Hiyama et al., Cancer Lett.
194:221-233, 2003). Por ejemplo, puede utilizarse
TRAP (protocolo de amplificación por repetición telomérica) para
detectar la actividad de telomerasa con una elevada sensibilidad
mediante la utilización de PCR (ver Kim N.W. et al., Science
206:2011-2015, 1994; Piatyszek M.A. et al.,
Meth. Cell Sci. 17:1-15, 1995; Woodring et
al., Nuc. Acids Res. 23:3794-3795, 1995;
patentes US nº 6.551.774, nº 6.391.554 y nº 5.837.453). Este método
implica la detección de telomerasa mediante un sistema de ensayo de
extensión de un único cebador y se divide en líneas generales en
tres etapas. En primer lugar se extrae telomerasa de las células. A
continuación, se lleva a cabo una reacción de extensión de una
cadena TTAGGG mediante la telomerasa y los productos de reacción se
amplifican mediante PCR utilizando dos cebadores. Finalmente, los
productos amplificados se someten a electroforesis para detectar la
actividad de telomerasa mediante confirmación de escaleras en una
autorradiografía.
Una variación de TRAP implica verde SYBR en
tiempo real para cuantificar la actividad de telomerasa (ver, por
ejemplo, Wege et al., Nuc. Acids Res. 31:e3, 2003).
Otra variación de TRAP se denomina PCR por
extensión telomérica (PTEP) (ver, por ejemplo, Chen et al.,
Biotechniques 35:158-162, 2003). De manera similar a
TRAP, este método se basa en la amplificación por PCR tras la
reacción in vitro de la telomerasa, mientras que la reacción
in vitro de la telomerasa en el presente caso se termina
prematuramente, y no aleatoriamente. Aparte de lo anterior, los
productos de extensión telomérica se utilizan como cebadores
iniciales, en lugar de como moldes, para inducir la amplificación
con un plásmido de ADN especialmente construido como molde que no
puede amplificarse directamente con el cebador de telomerasa. Este
producto final es un fragmento específico de ADN que refleja la
actividad de la telomerasa. El experto en la materia reconocerá que
también pueden utilizarse otros métodos para detectar la actividad
de telomerasa (ver, por ejemplo, la publicación de patente US nº
2002/0025518).
En muchas realizaciones de la invención, la
cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra biológica se
compara con uno o más valores estándares. En general, el valor
estándar representa la cantidad de SENP1 o de telomerasa encontrada
en muestras biológicas procedentes de un individuo sano (por ejemplo
no diagnosticado de cáncer y/o que no contiene un número
significativo de células de cáncer). Resultarán apropiados
diferentes valores estándares dependiendo de varios factores. Por
ejemplo, la cantidad de SENP1 o de telomerasa en una muestra
procedente de un individuo sano puede variar dependiendo del método
utilizado para cuantificar SENP1 o telomerasa. Además, el valor
estándar puede variar dependiendo de la proporción de falsos
positivos y de falsos negativos proporcionados en un ensayo
diagnóstico. Por ejemplo, en el caso de que el valor estándar se
fije en un valor bajo, el número de falsos negativos se reducirá,
pero la proporción de falsos positivos (aquellos sin cáncer que se
puntúan como presentando células de cáncer) se incrementará. De esta
manera, un usuario puede comparar la cantidad de SENP1 o de
telomerasa en una mues-
tra con diferentes valores estándares dependiendo de la tolerancia para resultados falsos negativos o falsos positivos.
tra con diferentes valores estándares dependiendo de la tolerancia para resultados falsos negativos o falsos positivos.
En algunos casos, el valor estándar se
determinará basándose en la media, la mediana u otro cálculo
estadístico basado en una pluralidad de muestras que es conocido
que no presentan células de cáncer o que es conocido que presentan
células de cáncer. El valor estándar no es necesario que sea
recalculado para cada ensayo, sino que puede ser un único valor o
un intervalo predeterminado. El valor estándar puede almacenarse en
una memoria de ordenador y accederse según resulte necesario. En
otras realizaciones, el valor estándar se determinada para cada
muestra biológica cada vez que se procesa un conjunto de muestras
biológicas. En estos casos, el valor estándar es la cantidad de
SENP1 o de telomerasa en una muestra que es conocido, o de la que
por lo menos se sospecha, que contiene células de cáncer. En
algunas realizaciones, estas muestras estándares se recogen del
mismo individuo y se someten a ensayo para cáncer. Por ejemplo,
pueden obtenerse un tumor sólido y una muestra que no contenga
cáncer del mismo individuo y la cantidad de SENP1 y/o de telomerasa
en la muestra que no contiene cáncer puede formar la base del valor
estándar. En otras realizaciones, las muestras estándares se
obtienen de otro individuo o individuos.
En algunos casos, las cantidades de SENP1 o de
telomerasa (tanto de la muestra biológica de interés como del
estándar de no cáncer) se normalizan respecto a un segundo valor. La
normalización resulta útil, por ejemplo, para eliminar o minimizar
errores introducidos por un usuario o por ensayos en las cantidades
detectadas o para minimizar errores causados por números variables
de células en una muestra. La normalización típicamente se basa en
un valor que incorpora algunos de los mismos errores. Por ejemplo,
la cantidad de un segundo transcrito en la misma muestra biológica
puede utilizarse para normalizar los valores de SENP1 o de
telomerasa. Típicamente se conoce o se sospecha que el segundo
transcrito se encuentra afectado por la presencia o ausencia de
células de cáncer en la muestra. Entre los "transcritos
normalizadores" ejemplares (también conocidos como transcritos
de "genes de mantenimiento") se incluyen, aunque sin limitarse
a ellos, las proteínas humanas siguientes: proteína fosfatasa 1,
subunidad catalítica, isoforma alfa (PPP1CA), proteína de unión a
caja TATA (por ejemplo M55654), HPRT1 (por ejemplo M26434),
\beta-glucuronidasa,
\beta2-microblogulina, fosfoglicerol quinasa 1
(por ejemplo NM-000291),
\beta-actina (por ejemplo NM_001141), receptor de
transferrina (por ejemplo NM_003234),
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (por ejemplo NM_002046), albúmina de suero humano
(por ejemplo NM_000477), tubulina, hipoxantina
fosforibosiltransferasa (por ejemplo NM_000194), proteína ribosómica
mitocondrial L32 (por ejemplo NM_031903), ARN 28S, ARN 18S,
5-aminolevulinato sintasa, y porfobilinógeno
desaminasa (ver también el kit de selección de gen de mantenimiento
h LightCycler, Roche Applied Sciences, nº de catálogo 3310159;
Thellin O. et al., J. Biotechnol. 75:291, 1999; Warrington
J.A. et al., Physiol. Genomics 2:143, 2000). El experto en
la materia reconocerá que muchos genes de mantenimiento, entre
otros, proporcionarán valores normalizadores equivalentes. Los
valores pueden normalizarse según cualquiera de los métodos
estadísticos generalmente conocidos, incluyendo la simple división
de los valores por la cantidad de transcrito o de proteína
normalizadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de la invención pueden implicar
registrar la cantidad de SENP1 y/o de telomerasa en una muestra y/o
un diagnóstico, pronóstico o estadio de cáncer, incluyendo, por
ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y
cáncer de intestino delgado.
Dicha información puede registrarse en forma de
texto o datos y puede almacenarse en una forma legible por
ordenador. Este sistema informático típicamente comprende
subsistemas principales, tales como un procesador central, una
memoria de sistema (típicamente RAM), un controlador de
entrada/salida (I/O), un dispositivo externo, tal como una pantalla
de visualización mediante un adaptador de pantalla, puertos en
serie, un teclado, una unidad fija de disco mediante un interfaz de
almacenamiento y un dispositivo de lectura de disquete para recibir
un disquete, y un dispositivo CD-ROM (o
DVD-ROM) operativo para recibir un
CD-ROM. Pueden conectarse muchos otros
dispositivos, tales como un interfaz de red conectado mediante un
puerto en serie.
El sistema informático también puede conectarse
a una red, comprendiendo una pluralidad de dispositivos informáticos
conectados mediante un enlace de datos, tal como un cable Ethernet
(coaxial o 10BaseT), una línea telefónica, línea ISDN, red
inalámbrica, fibra óptica u otro medio de transmisión de señales
adecuado, en el que por lo menos un dispositivo de red (por ejemplo
un ordenador, matriz de discos, etc.) comprende un patrón de
dominios magnéticos (por ejemplo un disco magnético) y/o dominios
de carga (por ejemplo una matriz de celdas DRAM) que componen un
patrón de bits codificante de datos captados de un ensayo de la
invención.
El sistema informático puede comprender código
para interpretar los resultados de cuantificación de SENP1 o de
telomerasa en una muestra biológica. De esta manera, en una
realización ejemplar, los resultados de genotipo se proporcionan a
un ordenador en el que un procesador central ejecuta un programa
informático para determinar un diagnóstico, pronóstico o
determinado de estadio de un cáncer particular, por ejemplo
seleccionado de entre cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer
de páncreas y cáncer de intestino delgado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes métodos pueden utilizarse en el
diagnóstico, pronóstico, clasificación y tratamiento de varios
tipos de cáncer. Puede detectarse un cáncer en cualquier estado de
progresión, tal como cáncer primario, metastásico y recurrente. La
información referente a numerosos tipos de cáncer puede obtenerse,
por ejemplo, de la American Cancer Society (www.cancer.org) o de,
por ejemplo, Wilson et al., Harrison's Principles of Internal
Medicine, 12a edición, McGraw-Hill Inc., 1991.
La presente invención proporciona métodos para
determinar si un mamífero (por ejemplo un ser humano) presente
cáncer de vejiga, si una muestra biológica contiene células de
vejiga cancerosas o no, para estimar la probabilidad de que un
mamífero desarrolle cáncer de vejiga, y para realizar un seguimiento
de la eficacia del tratamiento anticáncer en un mamífero que
presenta cáncer de vejiga. Dichos métodos se basan en el
descubrimiento de que las células de cáncer presentan un nivel
elevado de polinucleótido y/o polipéptido SENP1. Por consiguiente,
mediante la determinación de si una célula contiene niveles elevados
de SENP1 o TERT o TERC resulta posible determinar si la célula de
vejiga es cancerosa. Además, la presencia de células cancerosas de
vejiga puede determinarse indirectamente, pro ejemplo en
determinadas realizaciones, una muestra biológica que no contiene
ella misma células de vejiga cancerosas, pero que se ha obtenido de
un animal que presenta células cancerosas en otras partes de su
cuerpo, puede contener niveles elevados de SENP1 o TERT o TERC,
reflejando la presencia de las células cancerosas.
En numerosas realizaciones de la presente
invención, el nivel y/o presencia de SENP1 o TERT o TERC se detecta
en una muestra biológica, detectando de esta manera la presencia o
ausencia de células de vejiga cancerosas en la muestra biológica o,
en determinadas realizaciones, en el mamífero a partir del que se
extrajo la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra
biológica comprende una muestra de tejido procedente de un tejido
que se sospecha que contiene células de vejiga cancerosas. Por
ejemplo, en un individuo que se sospecha que presenta cáncer de
vejiga, se biopsia tejido de vejiga o se obtiene orina. En otras
realizaciones, se determina la cantidad de SENP1 o TERT o TERC en
un líquido corporal (pro ejemplo sedimento urinario; ver, por
ejemplo, Melissourgos et al., Urology
62:362-367, 2003), saliva, sangre, semen, etc.). En
otras realizaciones, se analiza una muestra de tejido que es
conocido que contiene células de vejiga cancerosas, por ejemplo
procedentes de un tumor, para medir los niveles de SENP1 o TERT o
TERC para determinar información sobre el cáncer de vejiga, por
ejemplo la eficacia de determinados tratamientos, la esperanza de
supervivencia del animal, etc. Con frecuencia, los métodos se
utilizan conjuntamente con métodos diagnósticos adicionales, por
ejemplo la detección de otros marcadores de cáncer de vejiga,
etc.
Además, los presentes métodos pueden utilizarse
para evaluar la eficacia de un curso de tratamiento. Por ejemplo,
en un mamífero con cáncer de vejiga del que se ha encontrado que una
muestra biológica contiene una cantidad elevada de SENP1 o TERT o
TERC, puede evaluarse la eficacia de un tratamiento anticáncer
mediante el seguimiento de los niveles de SENP1 o TERT o TERC
durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, una reducción de los
niveles de SENP1 o TERT o TERC en una muestra biológica obtenida de
un mamífero tras un tratamiento en comparación con un nivel en una
muestra obtenida del mamífero antes del tratamiento, o anteriormente
durante el mismo, indica un tratamiento eficaz.
Los métodos para detectar cáncer de vejiga
pueden comprender la detección de una o más secuencias de
polinucleótido o de polipéptido asociadas al cáncer. Por
consiguiente, puede utilizarse SENP1 o TERT o TERC solos,
conjuntamente o en combinación con otros marcadores para el
diagnóstico o pronóstico del cáncer de vejiga.
Los métodos de la presente invención pueden
utilizarse para determinar el curso óptimo de tratamiento en un
mamífero que presenta cáncer de vejiga. Por ejemplo, la presencia de
un nivel elevado de SENP1 o TERT o TERC puede indicar una esperanza
de supervivencia reducida de un mamífero que presenta cáncer de
vejiga, indicando de esta manera un tratamiento más agresivo para
el mamífero. Además, puede establecerse fácilmente una correlación
entre los niveles de SENP1 o TERT o TERC o la presencia o ausencia
de una presencia diagnóstica de SENP1 o TERT o TERC (es decir, una
cantidad de SENP1 o TERT o TERC superior al valor estándar) y la
eficacia relativa de uno u otro agente anticáncer. Estos análisis
pueden llevarse a cabo, por ejemplo, retrospectivamente, es decir,
mediante la detección de los niveles de SENP1 o TERT o TERC en
muestras obtenidas anteriormente de mamíferos que posteriormente se
han sometido a uno o más tipos de terapia anticáncer, y
correlacionar los niveles de SENP1 o TERT o TERC con la eficacia
conocida del tratamiento.
Al realizar un diagnóstico, pronóstico o
evaluación de riesgo o clasificación basada en la expresión de SENP1
y TERT o TERC, la cantidad de expresión de SENP1 y/o TERT o TERC
puede compararse con un valor estándar, tal como se ha comentado
anteriormente. En algunos casos, puede realizarse un diagnóstico o
pronóstico del cáncer de vejiga en el caso de que la expresión de
SENP1 y TERT o TERC en la muestra biológica sea más alta que el
valor estándar. En algunos casos, la cantidad de expresión de SENP1
y/o de telomerasa en la muestra biológica es por lo menos 10% más,
25% más, 50% más, 75% más, 90% más, 2 veces más, 3 veces más, 5
veces más, 10 veces más, 50 veces más o más de 100 veces más que el
valor estándar (o de un valor que represente la expresión de SENP1
y TERT o TERC en una muestra que no contiene cáncer).
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras generalmente se derivan o se aíslan
a partir de sujetos, típicamente sujetos mamíferos, más típicamente
sujetos humanos. Opcionalmente se utiliza esencialmente cualquier
técnica para obtener estas muestras, incluyendo, por ejemplo,
biopsia, raspado, venipunción, exudados u otras técnicas conocidas
de la técnica.
Los métodos para almacenar especimenes, cultivar
células, aislar y preparar ácidos nucleicos a partir de estas
fuentes son generalmente conocidos de la técnica y muchos de ellos
se describen adicionalmente en las referencias y/o ejemplos
proporcionados en la presente memoria.
A título de ilustración adicional, antes de
analizar los ácidos nucleicos diana indicados en la presente
memoria, dichos ácidos nucleicos pueden purificarse o aislarse a
partir de muestras que típicamente incluyen mezclas complejas de
diferentes componentes. Las células en las muestras recogidas
típicamente se lisan para liberar el contenido celular. Por
ejemplo, las células en el sedimento urinario pueden lisarse
mediante su puesta en contacto con diversos enzimas o compuestos
químicos, y/o lisarse mediante otros enfoques conocidos de la
técnica. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se analizan
directamente en el lisado celular. En otras realizaciones, los
ácidos nucleicos se purifican o extraer adicionalmente a partir de
los lisados celulares antes de la detección. Puede utilizarse
esencialmente cualquier método de extracción de ácidos nucleicos
para purificar los ácidos nucleicos en las muestras utilizadas en
los métodos de la presente invención. Entre las técnicas ejemplares
que pueden utilizarse para purificar ácidos nucleicos se incluyen,
por ejemplo, la cromatografía de afinidad, la hibridación a sondas
inmovilizadas sobre soporte sólidos, la extracción
líquido-liquido (por ejemplo la extracción
fenol-cloroformo, etc.), la precipitación (por
ejemplo utilizando etanol, etc.), la extracción con papel de
filtro, la extracción con reactivos formadores de micelas (por
ejemplo
cetil-trimetilamonio-bromuro,
etc.), la unión a pigmentos intercalantes inmovilizados (por ejemplo
bromuro de etidio, acridina, etc.), la adsorción a gel de sílice o
a tierras diatomáceas, la adsorción a partículas de vidrio
magnéticas o a partículas de organosilano bajo condiciones
caotrópicas, y/o similares. El procesamiento de muestras también se
describe en, por ejemplo, las patentes US nº 5.155.018, nº
6.383.393 y nº 5.234.809.
A título de ejemplo adicional, los ácidos
nucleicos no modificados pueden unirse a un material con una
superficie de sílice. Muchos de los procedimientos que se adaptan
opcionalmente para la utilización en la puesta en práctica de los
métodos de la presente invención se encuentran descritos en la
técnica. A título ilustrativo, Vogelstein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619, 1979, describe la
purificación de ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa en
presencia de yoduro sódico utilizando vidrio al plomo molido. Marko
et al., Anal. Biochem. 121:382-387, 1982,
describen la purificación de ácidos nucleicos a partir de bacterias
sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato sódico. En el
documento DE nº A-3734442, se aíslan ácidos
nucleicos sobre filtros de fibra de vidrio. Los ácidos nucleicos
unidos a estos filtros de fibra de vidrio se lavan y después se
eluyen con un tampón Tris/EDTA que contiene metanol. Se describe un
procedimiento similar en Jakobi et al., Anal. Biochem.
175.196-201, 1988. En particular, Jakobi et
al. describen la unión selectiva de ácidos nucleicos a
superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas y la
separación de ácidos nucleicos de contaminantes, tales como
agarosa, proteínas y residuos celulares. Para separar las partículas
de vidrio de los contaminantes, las partículas pueden centrifugarse
o pueden pasarse líquidos a través de los filtros de fibra de
vidrio. Además, la utilización de partículas magnéticas para
inmovilizar los ácidos nucleicos tras la precipitación mediante la
adición de sal y etanol se describe en, por ejemplo, Alderton et
al., Anal. Biochem. 201:166-169, 1992, y en la
patente PCT nº GB91/00212. En este procedimiento, los ácidos
nucleicos se aglutinan conjuntamente con las partículas magnéticas.
El aglutinado se separa del solvente original mediante la
aplicación de un campo magnético y realizando una o más etapas de
lavado. Tras por lo menos una etapa de lavado, los ácidos nucleicos
típicamente se disuelven en un tampón Tris.
Las partículas magnéticas en una matriz de
vidrio poroso que se cubre con una capa que incluye, por ejemplo,
estreptavidina también puede utilizarse en determinadas
realizaciones de la invención. Estas partículas pueden utilizarse,
por ejemplo, para aislar ácidos nucleicos y proteínas conjugadas con
biotina. También se utilizan opcionalmente partículas
ferrimagnéticas, ferromagnéticas y superparamagnéticas. Las
partículas de vidrio magnéticas y métodos relacionados que pueden
adaptarse para la utilización en la puesta en práctica de los
métodos descritos en la presente memoria también se describen en,
por ejemplo, la patente WO nº 01/37291.
Las realizaciones particularmente preferentes de
la invención se describen a continuación. Una realización
preferente de la invención es un método para detectar la expresión
de SENP1 en una muestra biológica, comprendiendo el método las
etapas de determinar la cantidad de SENP1 en una muestra biológica
procedente de un individuo que presenta o que se sospecha que
presenta un cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste de
cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón,
cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de intestino
delgado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En una realización preferente, la cantidad de
SENP1 se determina mediante la detección de un polinucleótido
codificante de SENP1 en la muestra. Por lo tanto, preferentemente la
etapa de determinar la cantidad de SENP1 comprende la etapa de
detectar un polinucleótido codificante de SENP1 en la muestra. Esta
etapa de detección puede comprender amplificar el polinucleótido en
una reacción de amplificación.
Preferentemente, el método comprende además la
etapa de comparar la cantidad de SENP1 y de telomerasa en la
muestra con un estándar de SENP1 y con un estándar de telomerasa,
respectivamente, en donde el estándar de SENP1 representa SENP1 en
células normales y el estándar de telomerasa representa las
cantidades de telomerasa en células normales.
En resumen, en una realización preferente de la
invención, se proporciona un método para detectar la expresión de
SENP1 en una muestra biológica procedente de un individuo que
presenta o que se sospecha que presenta un cáncer de vejiga,
comprendiendo el método la determinación de la cantidad de SENP1 o
de TERT o TERC en la muestra biológica mediante:
a) la amplificación de un polinucleótido
codificante de SENP1 en la muestra biológica en una reacción de
amplificación, y
b) detectar la cantidad del producto de
amplificación de la etapa a) para detectar la expresión de SENP1 en
la muestra biológica,
c) determinar la cantidad de TERC o TERT en la
muestra biológica.
Preferentemente, la reacción de amplificación
comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes,
comprendiendo una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de
amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1.
Preferentemente, el producto de amplificación
(la cantidad del mismo) de la reacción de amplificación se detecta
en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido
detectablemente marcado con el producto. Preferentemente, la
reacción de amplificación comprende además una ácido nucleico
polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3'
exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa
fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.
Preferentemente, el método comprende además la etapa de comparar la
cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de
SENP1 y con un estándar de telomerasa, respectivamente, en donde el
estándar de SENP1 representa SENP1 en células de vejiga normales y
el estándar de telomerasa representa las cantidades de telomerasa
en células de vejiga normales. El estándar es preferentemente una
muestra biológica (que comprende células) procedente de un
individuo de control que no sufre cáncer de vejiga.
El método opcionalmente puede comprender la
etapa de obtener la muestra biológica del individuo antes de
determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biológica.
Preferentemente, el método comprende además la etapa de registrar
un diagnóstico de cáncer de vejiga.
En otra realización preferente de la invención,
se proporciona un método para determinar si una muestra biológica
de un paciente comprende células de cáncer de vejiga, comprendiendo
las etapas siguientes:
a) determinar la cantidad de SENP1 en la muestra
biológica,
b) determinar la cantidad de SENP1 en una
muestra biológica de un individuo de control que no sufre cáncer de
vejiga,
c) determinar la cantidad de TERT o TERC en la
muestra biológica,
siendo una diferencia significativa entre la
cantidad de SENP1 en la muestra biológica del paciente y la cantidad
de SENP1 en la muestra biológica del individuo de control una
indicación de que la muestra biológica comprende células de cáncer
de vejiga.
Una diferencia significativa es preferentemente
una diferencia de 1,5 veces o superior, más preferentemente una
diferencia de dos veces o superior.
La etapa de determinar la cantidad de SENP1 en
la muestra biológica preferentemente comprende las etapas
siguientes:
a) amplificar un polinucleótido codificante de
SENP1 en la muestra biológica en una reacción de amplificación,
y
b) detectar la cantidad de producto de
amplificación de la etapa a) para determinar la cantidad de SENP1 en
la muestra biológica.
Preferentemente, la reacción de amplificación
comprende por lo menos dos oligonucleótidos diferentes que
comprenden una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos
10 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma, de manera que, durante la reacción de
amplificación, los oligonucleótidos ceban la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1.
Preferentemente, el producto de amplificación
(la cantidad del mismo) de la reacción de amplificación se detecta
en una etapa que comprende hibridar un oligonucleótido
detectablemente marcado con el producto. Preferentemente, la
reacción de amplificación comprende además una ácido nucleico
polimerasa dependiente de molde que presenta actividad 5' a 3'
exonucleasa bajo condiciones que permiten que la polimerasa
fragmente el oligonucleótido detectablemente marcado.
Preferentemente, el método comprende además la etapa de comparar la
cantidad de SENP1 y de telomerasa en la muestra con un estándar de
SENP1 y con un estándar de TERT o TERC, respectivamente, en donde
el estándar de SENP1 representa SENP1 en células de vejiga normales
y el estándar de TERT o TERC representa las cantidades de TERT o
TERC en células de vejiga normales.
El estándar preferentemente es una muestra
biológica (que comprende células) de un individuo de control que no
sufre cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de
riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer de páncreas.
El método opcionalmente puede comprender la
etapa de obtención de la muestra biológica del individuo antes de
determinar la cantidad de SENP1 en la muestra biológica.
Preferentemente, el método comprende además la etapa de registrar
un diagnóstico de un cáncer seleccionado de entre el grupo que
consiste de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón,
cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de
intestino delgado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona kits
para el diagnóstico de cáncer mediante la detección de SENP1 y de
telomerasa (por ejemplo polinucleótidos, polipéptidos, o actividad).
Los kits de la invención generalmente comprenden reactivos para
detectar polipéptidos SENP1 y/o telomerasa y/o polinucleótidos de
SENP1 y/o de telomerasa, y opcionalmente contienen instrucciones
escritas para su utilización.
En algunas realizaciones, los kits de la
invención comprenden reactivos para amplificar polinucleótidos de
SENP1 y/o de telomerasa. Entre dichos reactivos pueden incluirse,
por ejemplo, cebadores específicos de SENP1 y/o de telomerasa y/o
sondas detectablemente marcadas (por ejemplo 5' exonucleasa, baliza
molecular o sondas Scorpion). Los kits opcionalmente pueden incluir
reactivos de amplificación, tales como polimerasas termoestables,
transcriptasa inversa, nucleótidos, tampones y sales, u otros
componentes, tal como se describe en la presente memoria o que son
conocidos de la técnica.
En algunos casos los kits comprenden por lo
menos un oligonucleótido que comprende una secuencia por lo menos
70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a por lo menos 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más
nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de
la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un
polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción
de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1.
En algunos casos, los kits también comprenden el
oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia
por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo menos
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35,
50 ó más nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma.
En algunos casos los kits comprenden por lo
menos un oligonucleótido que comprende una secuencia por lo menos
70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo meno 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 50 ó más
nucleótidos contiguos de:
i) la ARN de telomerasa humana (TERC),
ii) el ARNm de la proteína transcriptasa inversa
de la telomerasa humana (TERT),
iii) un complemento de TERC, o
iv) un complemento de TERT,
de manera que, al someter el oligonucleótido y
el ARNm de TERC o de TERT, a una reacción de amplificación, el
oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento
de ARNm de TERC o de TERT.
En algunos casos, los kits comprenden el
oligonucleótido detectablemente marcado que comprende una secuencia
por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntica a por lo menos
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35,
50 ó más nucleótidos contiguos de:
i) ARN de telomerasa humana (TERC),
ii) ARNm de proteína transcriptasa inversa de
telomerasa humana (TERT),
iii) un complemento de TERC, o
iv) un complemento de TERT.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otras realizaciones, los kits de la invención
comprenden reactivos que se unen específicamente a polipéptidos
SENP1 o telomerasa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los kits
de la invención comprenden un primer anticuerpo que se une
específicamente a SENP1 o a telomerasa. Los kits también pueden
comprender un segundo anticuerpo que se una al primer anticuerpo
(es decir, de una especie diferente) y un marcaje detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden utilizarse varios protocolos de cribado
diferentes para identificar agentes que modulan el nivel de
actividad de SENP1 en las células, por ejemplo en células de
mamífero, por ejemplo en células humanas. En términos generales,
los métodos de cribado pueden implicar el cribado de una pluralidad
de agentes para identificar un agente que interactúa con SENP1, por
ejemplo uniéndose a SENP1 e impidiendo la actividad de SENP1 o
impidiendo que un activador de SENP1 active SENP1.
Pueden llevarse a cabo cribados preliminares
mediante cribado de agentes capaces de unirse a SENP1, debido a que
por lo menos algunos de los agentes identificados de esta manera
pueden ser antagonistas de SENP1. Los ensayos de unión
habitualmente implican poner en contacto una proteína SENP1 con uno
o más agentes de ensayo y dejar suficiente tiempo para que la
proteína y los agentes de ensayo formen un complejo de unión. Puede
detectarse cualquier complejo de unión formado utilizando cualquiera
de entre varias técnicas analíticas establecidas. Entre los ensayos
de unión de proteínas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los
ensayos de unión inmunohistoquímica, la citometría de flujo u otros
ensayos que mantienen la conformación de SENP1. La proteína SENP1
utilizada en dichos ensayos puede ser de expresión natural, clonada
o sintética.
Los ensayos de unión también resultan útiles,
por ejemplo, para identificar proteínas endógenas que interactúan
con SENP1.
Los métodos de cribado de la invención pueden
llevarse a cabo en forma de ensayos in vitro o basados en
células. Los ensayos basados en células pueden llevarse a cabo en
cualquier célula en la que se exprese un polipéptido SENP1 endógena
o exógenamente. En algunas realizaciones, los ensayos basados en
células pueden llevarse a cabo utilizando células que presentan una
actividad o expresión de telomerasa reducida o indetectable y/o que
presentan un fenotipo neoplásico. En algunas realizaciones, las
líneas celulares inmortales negativas para expresión de TERT se
someten a ensayo para su susceptibilidad a inhibidores potenciales
de SENP1. Estas líneas celulares negativas para telomerasa se
propone que resultan útiles en dicho cribado debido a que
probablemente replican sus telómeros mediante un mecanismo
independiente de telomerasa (alargamiento alternativo de telómeros,
o "ALT"). Sin pretensión del imitar el alcance de la invención
a un mecanismo de acción particular, los presentes inventores
proponen que SENP1 se encuentra implicado en el mantenimiento de
ALT. La inhibición de ALT por un inhibidor de SENP1 en este caso se
predice que resultaría en una alteración de la estructura
telomérica, inhibiéndose finalmente la división de estas células.
Por el contrario, en los casos en los que la telomerasa se
encuentra activa en las líneas celulares, la telomerasa continuaría
permitiendo la división celular incluso en presencia de un
inhibidor de SENP1.
Los ejemplos de células que no expresan
telomerasa (células "ALT") son conocidos de la literatura (ver,
por ejemplo, Tsutsui T. et al., Carcinogenesis
24:953-965, 2003; Bryan T.M., Hum Mol. Genet.
6:921-926, 1997; Guilleret I. et al.,
Carcinogenesis 23:2025-2030, 2002). Entre los
ejemplos de líneas celulares ALT se incluyen, aunque sin
limitación, las células SUSM-1, WI38 VA13/2RA,
BET-3M, GM847, MeT-4A, IIICF/c,
IIICF-T/A6, MDAH 087, Saos-2 y
U-2.
La inhibición de ALT puede detectarse mediante
ensayo de un cambio de la longitud de los telómeros (ver, por
ejemplo, el ensayo de longitud de los telómeros TeloTAGGG, de Roche
Applied Biosystems, o Tsutsui T. et al., Carcinogenesis
24:953-965, 2003), o en un cambio de marcadores
morfológicos tales como la presencia de cuerpos PML que presenta
una forma de "rosquilla" en células ALT en lugar de la
apariencia normal puntiforme de los PML-NB en las
células que no experimentan ALT (ver, por ejemplo, Yeager T.R. et
al., Cancer Res. 59:4175-4179, 1999, la
inhibición de la división celular (determinada mediante, por
ejemplo, el recuento del número de células en diferentes puntos del
tiempo (por ejemplo utilizando productos Guava Technology^{TM}),
la utilización de ensayos basados en agar blando para realizar un
recuento del número de colonias en diferentes puntos del tiempo, la
utilización de tecnología de estadificación para determinar el
estadio del ciclo celular en el que se encuentran las células, el
análisis visual de las células mediante microscopía, los análisis
cromosómicos o la tecnología Cellomics^{TM} o el análisis de la
expresión de las proteínas, por ejemplo mediante transferencia
western o análisis inmunohistoquímicos).
Los ensayos basados en células pueden implicar
células completas o fracciones celulares que contengan SENP1 para
cribar para un agente de unión o de modulación de la actividad de
SENP1 por parte del agente. Las células utilizadas en los ensayos
basados en células pueden ser células primarias o células tumorales,
u otros tipos de líneas celulares inmortales. Evidentemente SENP1
puede expresarse en células que no expresan endógenamente
SENP1.
También puede realizarse un seguimiento de la
actividad de señalización o de otros sucesos posteriores regulados
por SENP1 para identificar los antagonistas de SENP1. De esta
manera, en algunas realizaciones, se pone en contacto una
pluralidad de agentes con una célula que expresa SENP1 y las células
seguidamente se criban para un cambio de señalización o de un
suceso posterior. La agrupación de agentes que modulan un suceso
posterior regulado por SENP1 típicamente se encuentra enriquecida
en antagonistas de SENP1 debido a que por lo menos algunos de los
agentes identificados probablemente son antagonistas directos de
SENP1. Entre los sucesos posteriores se incluyen aquellas
actividades o manifestaciones que se producen como resultado de la
inhibición de SENP1, y pueden incluir, por ejemplo, un crecimiento
celular reducido (medido, por ejemplo, como recuentos de colonias
en agar blando o utilizando sistemas de análisis celular tales como
los de Guava Technologies, Hayward, CA), cambios del estadio del
ciclo celular (medidos, por ejemplo, utilizando análisis de imágenes
teñidas con anticuerpo HT, por ejemplo de Cellomics, Pittsburgh,
PA, o mediante métodos citológicos estándares), o cambios de la
expresión de proteínas, incluyendo, por ejemplo, la transferencia
western o la microscopía.
Las células normales requieren un sustrato
sólido para engancharse y crecer. Las células neoplásica han perdido
este fenotipo y crecen desenganchadas del sustrato. Por ejemplo,
las células neoplásicas pueden crecer en cultivo en suspensión
agitada o suspendidas en medios semisólidos, tales como agar
semisólido o blando. Las células neoplásicas, al transfectarse con
genes de supresor tumoral o al entrar en contacto con un antagonista
de SENP1, pueden regenerar el fenotipo normal y requerir un
sustrato sólido para engancharse y crecer. De esta manera, el
crecimiento en agar blando o la formación de colonias en ensayos en
suspensión pueden utilizarse para identificar los agentes que
reducen o eliminan la proliferación y transformación celulares
anormales, incluyendo el crecimiento el agar
blando.
blando.
Las técnicas para el crecimiento en agar blando
o la formación de colonias en ensayos en suspensión se describen en
Freshney, Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique (3a
edición, 1994), incorporada como referencia en la presente
memoria.
Las células normales típicamente crecen en un
patrón plano y organizado en una placa de Petri hasta que entran en
contacto con otras células. Al entrar en contacto mutuo las células,
resultan inhibidas por contacto y detienen su crecimiento. Sin
embargo, al transformar las células, éstas no resultan inhibidas por
contacto y continúan creciendo hasta densidades elevadas en focos
desorganizados. De esta manera, las células transformadas crecen
hasta una densidad de saturación más lata que las células normales.
Esto puede detectarse morfológicamente por la formación de una
monocapa desorientada de células o células redondeadas en focos
dentro del patrón regular de las células circundantes normales.
Alternativamente, puede utilizarse el índice de marcaje con
(^{3}H)-timidina a la densidad de saturación para
medir la limitación por densidad del crecimiento (ver Freshney,
supra, 1994). Las células transformadas, al ser transfectadas
por genes de supresión tumoral, regeneran un fenotipo normal y
resultan inhibidas por contacto y crecerían hasta una densidad más
baja.
El índice de marcaje con
(^{3}H)-timidina a la densidad de saturación puede
utilizarse para medir la limitación por densidad del crecimiento.
Por ejemplo, las células huésped transformadas pueden ponerse en
contacto con un candidato a antagonista de SENP1 y después
cultivarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo 24 horas)
hasta la densidad de saturación en condiciones de medio no
limitante. El porcentaje de células marcadas con
(^{3}H)-timidina puede determinarse
autorradiográficamente (ver Freshney, supra, 1994).
Las células transformadas presentan una
dependencia del suero más baja que sus contrapartidas normales (ver,
por ejemplo, Temin, J. Natl. Cancer Insti.
37:167-175, 1966; Eagle et al., J. Exp. Med.
131:836-879, 1970; Freshney, supra). Esto en
parte se debe a la liberación de diversos factores de crecimiento
por parte de las células transformadas. La dependencia de factor de
crecimiento o de suero de las células que entran en contacto con un
candidato a antagonista de SENP1 puede compararse con la de un
control.
Los tumores o las células neoplásicas liberan
una cantidad incrementada de determinados factores (en lo sucesivo
denominados "marcadores específicos tumorales") en comparación
con sus contrapartidas normales. Por ejemplo, se libera un
activador del plasminógeno (PA) del glioma humano a un nivel más
lato que de las células cerebrales normales (ver, por ejemplo,
Gullino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential
interference with tumor growth, en: Biological Responses in Cancer,
páginas 178 a 184, Mihich (editor), 1985). De manera similar, se
libera factor de angiogénesis tumoral (TAF) a un nivel más lato en
las células tumorales que en sus contrapartidas normales (ver, por
ejemplo, Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem. Cancer Biol.,
1992).
\newpage
Se describen diversas técnicas que miden la
liberación de estos factores en Freshney, supra, 1994. Ver,
además, Unkless et al., J. Biol. Chem.
249:4295-4305, 1975; Strickland y Beers, J. Biol.
Chem. 251:5694-5702, 1976; Whur et al., Br.
J. Cancer 42:305-312, 1980; Gullino, Angiogenesis,
tumor vascularization, and potential interference with tumor
growth, en: Biological Responses in Cancer, páginas 178 a 184,
Mihich (editor), 1985; Freshney, Anticancer Res.
5:111-130, 1985.
El grado de invasividad en matrigel o en algún
otro constituyente de la matriz extracelular puede utilizarse en un
ensayo para identificar los antagonistas de SENP1. Las células
tumorales muestran una buena correlación entre la malignidad y la
invasividad de las células en matrigel o en algún otro constituyente
de la matriz extracelular. En este ensayo pueden utilizarse células
neoplásicas, en las que una invasividad reducida de las células
tras entrar en contacto con un agente puede indicar que el agente es
un antagonista de SENP1.
Pueden utilizarse las técnicas descritas en
Freshney, supra, 1994. Brevemente, puede medirse el nivel de
invasión de las células huésped mediante la utilización de filtros
recubiertos con matrigel o con algún otro constituyente de la
matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través de la cara
distal del filtro, se cuantifica como estimación de invasividad, y
se estima histológicamente a partir del número de células y la
distancia desplazada, o mediante marcaje previo de las células con
^{125}I y realización posterior de un recuento de la
radioactividad en la cara distal del filtro o en el fondo de la
placa (ver, por ejemplo, Freshney, supra, 1994).
Los agentes identificados inicialmente mediante
cualquier de los métodos de cribado anteriormente indicados pueden
someterse a ensayo adicionalmente para validar la actividad
aparente. En algunas realizaciones, dichos estudios se realizan
utilizando modelos animales adecuados. El formato básico de dichos
métodos implica administrar un compuesto cabeza de serie
identificado durante un cribado inicial en u animal que sirve como
modelo de la enfermedad humana que debe tratarse y después se
determina si SENP1 se encuentra de hecho modulada y/o si la
enfermedad o condición mejora. Los modelos animales utilizados en
los estudios de validación generalmente son mamíferos de cualquier
tipo. Entre los ejemplos específicos de animales adecuados se
incluyen, aunque sin limitación, primates, ratones y ratas.
Los agentes sometidos a ensayo como moduladores
de SENP1 pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una
entidad biológica, tal como un polipéptido (por ejemplo un péptido),
azúcar, ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, ARNsi o
polinucleótidos antisentido) o lípido. Puede utilizarse
esencialmente cualquier compuesto químico como modulador potencial
(por ejemplo antagonista) o ligando en los ensayos de la invención,
aunque con más frecuencia se utilizan compuestos que pueden
disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente basadas
en DMSO). Los ensayos se diseñan para cribar bibliotecas químicas
grandes mediante la automatización de las etapas e ensayo y
proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente para los
ensayos, que típicamente se realizan en paralelo (por ejemplo en
formatos de microtitulación, o en placas de microtitulación en
ensayos robotizados). Se apreciará que existen muchos proveedores
de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich
(St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO),
Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza) y
similares.
En algunas realizaciones, los agentes presentan
un peso molecular inferior a 1.500 daltons, y en algunos casos
inferior a 1.000, 800, 600, 500 ó 400 daltons. El tamaño
relativamente reducido de los agentes puede resultar deseable
debido a que las moléculas más pequeñas presentan una probabilidad
más alta de presentar propiedades físicoquímicas compatibles con
buenas características farmacocinéticas, incluyendo la absorción
oral, que los agentes que presentan un peso molecular más alto. Por
ejemplo, los agentes que es menos probable que presenten éxito como
fármacos basándose en la permeabilidad y solubilidad han sido
descritos por Lipinski et al. de la manera siguiente: que
presentan más de 5 donantes de enlaces de H (expresado como la suma
de OHs y NHs), que presentan un peso molecular superior a 500, que
presentan un logP superior a 5 (o un MLogP superior a 4,15) y/o que
presentan más de 10 aceptores de enlaces de H (expresado como la
suma de Ns y Os) (ver, por ejemplo, Lipinski et al., Adv.
Drug Delivery Res. 23:3-25, 1997).
En algunas realizaciones, los métodos de cribado
de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca
combinatorial química o de péptidos que contiene un gran número de
potenciales compuestos terapéuticos (compuestos moduladores o
ligandos potenciales). Dichas "bibliotecas químicas
combinatoriales" o "bibliotecas de ligandos" seguidamente
se criban en uno o más ensayos, tal como se describe en la presente
memoria, para identificar aquellos miembros de la biblioteca
(especies o subclases químicas particulares) que muestran una
actividad característica deseada. Los compuestos identificados de
esta manera pueden servir como "compuestos cabeza de serie"
convencionales o pueden ser utilizados ellos mismos como
terapéuticos potenciales o reales.
Una biblioteca química combinatorial es una
colección de diversos compuestos químicos generados mediante
síntesis química o síntesis biológica, mediante la combinación de
varios "bloques constructivos" químicos, tales como reactivos.
Por ejemplo, se forma una biblioteca química combinatorial lineal,
tal como una biblioteca de polipéptidos, mediante la combinación de
un conjunto de bloques constructivos químicos (aminoácidos) de todas
las posibles maneras para una longitud de compuesto dada (es decir,
el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Pueden
sintetizarse millones de compuestos químicos mediante dicha mezcla
combinatorial de bloques constructivos químicos.
La preparación y cribado de bibliotecas
combinatoriales químicas son bien conocidos para el experto en la
materia. Entre dichas bibliotecas combinatoriales químicas se
incluyen, aunque sin limitación, bibliotecas de péptidos (ver, por
ejemplo, la patente US nº 5.010.175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res.
37:487-493, 1991, y Houghton et al., Nature
354:84-88, 1991). También pueden utilizarse otras
compuestos químicos para generar bibliotecas de diversidad química.
Entre dichos compuestos químicos se incluyen, aunque sin limitación:
peptoides (por ejemplo la publicación de patente PCT nº WO
91/19735), péptidos codificados (por ejemplo la publicación de
patente PCT nº WO 93/20242), biooligómeros aleatorios (por ejemplo
la publicación de patente PCT nº WO 92/00091), las benzodiacepinas
(por ejemplo la patente US nº 5.288.514), diversómeros, tales como
hidantoínas, benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913, 1993),
polipéptido vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc.
114:6568, 1992), peptidomiméticos no peptídicos con andamiaje de
glucosas (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc.
114:9217-9218, 1992), síntesis orgánicas análogas
de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer.
Chem. Soc. 116:2661, 1994), oligocarbamatos (Cho et al.,
Science 261:1303, 1993) y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et
al., J. Org. Chem. 59:658, 1994), bibliotecas de ácidos
nucleicos (ver Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra),
bibliotecas de péptidos de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, la
patente US nº 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (ver, por
ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology
14:309-314, 1996, y la patente PCT nº US 96/10287),
bibliotecas de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang et
al., Science 274:1520-1522, 1996, y la patente
US nº 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver,
por ejemplo, benzodiacepinas, patente US nº 5.549.974; pirrolidinas,
patentes US nº 5.525.735 y nº 5.519.134; compuestos morfolino,
patente US nº 5.506.337; benzodiacepinas, nº 5.288.514, y
similares).
Los dispositivos para la preparación de
bibliotecas combinatoriales se encuentran comercialmente disponibles
(ver, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech.,
Louisville, KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied
Biosystems, Foster City, CA, 9050; Plus, Millipore, Bedford, MA).
Además, numerosas bibliotecas combinatoriales se encuentran ellas
mismas comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, ComGenex,
Princeton, N.J.; Tripos Inc., St. Louis, MO; 3D Pharmaceuticals,
Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).
SENP1 se encuentra estructuralmente relacionado
con la familia de proteínas de la ubiquitina y esta similitud puede
utilizarse para ayudar a diseñar antagonistas de SENP1. La familia
de modificadores similares a ubiquitinas pequeñas (Ub1) (SUMO,
revisadas en Muller S. et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.
2:202-210, 2001) y Yeh E.T. et al., Gene
248:1-14, 2000), de entre los que SENP1 es un
miembro, se relaciona con la familia de las ubiquitinas. Aunque la
identidad de secuencias entre las dos familias es <20%, las
estructurales globales son muy similares (2,1 \ring{A} rmsd para
los residuos del núcleo [21 a 93 y 1 a 72 de SUMO-1
y de la ubiquitina, respectivamente] (Bayer P. et al., J.
Mol. Biol. 280:275-286, 1998). Ambas proteínas se
unen covalentemente mediante su grupo -COOH
C-terminal al grupo
\varepsilon-NH_{2} de una cadena lateral de una
lisina (enlace isopeptídico) de la proteína diana. La ubiquitina y
la SUMO presentan motivos diglicina conservados próximos al extremo
C-terminal. La conjugación de ubiquitina y SUMO es
un procedimiento complejo que implica varias etapas: corte de la
cola de C, activación, y transferencia final (Johnson E.S. et
al., Embo J. 16:5509-5519, 1997; Gong L. et
al., FEBS Lett. 448:185-189, 1999).
Al contrario que la ubiquitina, las SUMOs no
forman uniones poliméricas debido a la sustitución del equivalente
a Lys-48 de la ubiquitina por Gln. Las rutas de la
SUMO y de la ubiquitina difieren principalmente en la consecuencia
de la modificación: el resultado mejor caracterizado de la
ubiquitinación es el direccionamiento de la proteína etiquetada al
proteasoma 26S para la degradación. Las proteínas SUMOiladas no se
destinan a la degradación.
Se han identificado tres genes SUMO en el ser
humano (ver la Tabla 1 para los números de acceso). Existe una
similitud/identidad de secuencia de 62,0%/49,0% entre Smt3 y la
SUMO-1 humana (ver la Tabla 2). Se ha obtenido la
estructura solución para la SUMO-1 humana (Bayer P.
et al., J. Mol. Biol. 280:275-286, 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La SUMOilación es un proceso reversible
dinámico. El corte de SUMO respecto de su diana (la deSUMOilación)
se encuentra catalizada por las cisteína proteasas denominadas ULP
("proteasas de tipo ubiquitina") en levaduras y SENPs o SUSPs
("proteasas específicas de sentrina/SUMO") en el ser humano (Li
S.J. y M. Hochstrasser, Nature 398:246-251, 1999;
Bailey D. y P. O'Hare, J. Biol. Chem. 279:692-703,
2004). Se han identificado dos ULPs en la levadura (Ulp1 y Ulp2) y
por lo menos siete SENPs en el ser humano (ver la Tabla 1). Dichas
proteasas desempeñan un papel doble en la ruta de la SUMOilación:
el procesamiento de la cola C-terminal para generar
el motivo diglicina, y la desconjugación mediante hidrólisis del
enlace isopeptídico Gly-Lys. No cortan los enlaces
isopeptídicos de la ubiquitina. En la levadura, la función
desconjugadora de Ulp1 resulta esencial (Li S.J. y M. Hochstrasser,
Nature 398:246-251, 1999). Resulta razonable
conjeturar que las diversas y diferentes SENPs en mamíferos han
evolucionado para funcionar con diferentes formas de SUMO. Además,
la localización subcelular ejerce una limitación fisiológicamente
significativa de la especificidad de la SUMO isopeptidasa. Por
ejemplo, SENP1 puede desconjugar SUMO-1 de Ran GAP1
in vitro, pero no in vivo. Esto se atribuye al hecho
de que Ran GAP 1 se encuentra unida a las fibrillas citoplasmáticas
del complejo poro nuclear, mientras que SENP1 se localiza en el
núcleo (Gong L. et al., J. Biol. Chem.
275:3355-3359, 2000). Una señal de localización
nuclear (NLS1) en SENP1 se encuentra situada en la posición
171-177.
Una alineación de las siete SENP humanas y de
dos secuencias ULP indica conservación en el dominio catalítico
C-terminal nuclear (residuos 420 a 643 en SENP1, ver
la Tabla 3) que presenta los residuos absolutamente conservados
Cys, His y Asp, que forman la tríada catalítica, y un Gln que forma
el agujero oxianión en el sitio activo (Gong L. et al., J.
Biol. Chem. 275:3355-3359, 2000). El dominio
N-terminal variable se cree que desempeña un papel
regulador, debido a que la expresión del dominio catalítico
C-terminal por sí solo conduce a niveles más bajos
de SUMO-1, indicativos de actividad catalítica
constitutiva (Bailey D. y P. O'Hare, J. Biol. Chem.
279:692-703,
2004).
2004).
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de un complejo entre Ulp1 y Smt3
de levadura ha sido resuelta (ver, por ejemplo, Mossessova E. y
C.D. Lima, Mol. Cell 5:865-876, 2000). Esta
estructura y las alineaciones de secuencias indicadas anteriormente
se utilizaron para generar modelos de homología de la SENP1 y la
SUMO-1 humanas utilizando Moloc (Gerber P.R. y K.
Muller, J. Comput. A ided Mol. Des. 9:251-268,
1995). Las interacciones observadas en el sitio activo de la SENP1
humana modelada con el sustrato SUMO-1 son muy
similares en las estructuras experimental de levadura y modelada
humana (ver la Tabla 4). Existen múltiples enlaces de hidrógeno que
implican los residuos Glu93 y Gln94 de SUMO-1, pero
muy poca interacción con Thr95. La Tabla 4 también lista los
residuos homólogos en otros miembros de la familia de SENP y
realiza una predicción sobre si estas interacciones de enlace de
hidrógeno con Glu93-Gln94 se encuentran
conservadas. Basándose en este análisis, se predice muy poca
reactividad cruzada para SUMO-1 con otros miembros
de la familia de SENP1, debido a que faltan dos de los cuatro
enlaces de hidrógeno críticos. Específicamente, este análisis
indica que un sustrato/inhibidor EQTGG resultaría altamente
específico para SENP1 y Ulp1 y no reaccionaría cruzadamente con
otros miembros de la familia de proteasas específicas de
sentrina/SUMO humana. De esta manera, en algunas realizaciones, los
antagonistas de SENP1 de la invención comprenden la secuencia
EQTGG, o miméticos de la misma.
Tal como se ha indicado anteriormente, en vista
de dicha información, existen varios enfoques para desarrollar un
inhibidor de SENP1. En algunas realizaciones, debido a que las
estructuras se encuentran disponibles tanto para la
SUMO-1 humana (dominio C-terminal,
RMN (Bayer P. et al., J. Mol. Biol.
280:275-286, 1998) y para el homólogo de levadura
del complejo SENP1/SUMO-1 (rayos X (Mossessova E. y
C.D. Lima, Mol. Cell 5:865-876, 2000), el experto
en la materia podrá realizar el diseño de un inhibidor basándose en
la estructura, así como realizar un cribado virtual de los
compuestos para un efecto inhibidor predicho.
En algunas realizaciones, los antagonistas de
SENP1 de la invención comprenden un aldehído. Los aldehídos son
inhibidores potentes de las cisteína proteasas debido a que forman
tiohemiacetales. Estos compuestos covalentes estables imitan el
estado de transición. Entre los ejemplos en los que se han utilizado
aldehídos para elucidar el mecanismo de las cisteína proteasas se
incluyen la papaína (Schroder E. et al., FEBS Lett.
315:38-42, 1993) y la ubiquitina hidrolasa
carboxilo-terminal (Pickart C.M. y I.A. Rose, J.
Biol. Chem. 261:10210-10217, 1986). Se utilizó la
reducción del sustrato Smt3 con NaBH_{4} para formar el aldehído
C-terminal con el fin de generar un estado de
transición estable análogo para estudios de cocristalización con
Ulp1 de levadura (Mossessova E. y C.D. Lima, Mol. Cell
5:865-876,
2000). Por lo tanto, un aldehído Gly-Gly podría servir como potente inhibidor de la SENP1 cisteína proteasa.
2000). Por lo tanto, un aldehído Gly-Gly podría servir como potente inhibidor de la SENP1 cisteína proteasa.
Los tres aminoácidos situados cadena arriba del
Gly-Gly C-terminal de
SUMO-1 (Glu-Gln-Thr)
o de un mimético del mismo, pueden utilizarse en un inhibidor
debido a que estos residuos contribuyen significativamente a la
especificidad de la interacción SENP1/SUMO-1 (Tablas
4 y 5). Aunque Thr95 no interactúa fuertemente con SENP1,
proporciona el espaciado correcto entre el enlace peptídico
escindible y los residuos Glu93-Gln95.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la estructura del complejo
SENP1/SUMO-1 indica que la lisina y sus residuos
flanqueantes de la proteína diana no interactúan con SENP1, un
diseño alternativo de inhibidor podría incluir estos aminoácidos o
grupos para imitar sus grupos funcionales.
Un posible medio para validar la especificidad
es cribar virtualmente para la unión del inhibidor de SENP1
propuesto a una familia de proteínas altamente relacionadas con
SENP1 en estructura, función y mecanismo, tal como las ubiquitina
hidrolasas carboxilo-terminales (motivo UCH de Pfam,
PF00443). Una búsqueda de la base de datos Swissprot revela tres
secuencias pertenecientes a la familia UCH humana (Tabla 1). Se ha
resuelto la estructura de varias UCHs, incluyendo el isozima
UCH-L3 humano (Johnston S.C. et al., Embo J.
16(13):3787-96, 1997) y el enzima de
levadura acomplejado con el aldehído C-terminal de
la ubiquitina (Johnston S.C. et al., Embo J.
18:3877-3887, 1999). Pudieron construirse los
modelos de homología para los demás miembros de la familia
utilizando estas estructuras de rayos X a modo de molde. Un
inhibidor altamente específico del inhibidor de SENP1 podría
interactuar favorablemente con SENP1, pero no con cualquier UCH. De
esta manera, en algunas realizaciones, los métodos de cribado de la
invención comprenden además la selección de un agente que se une
y/o inhibe SENP1 pero que no inhibe por lo menos una ubiquitina
hidrolasa carboxilo-terminal.
La localización nuclear de SENP1 desempeña un
papel en su especificidad de sustrato. Por lo tanto, en algunas
realizaciones, para garantizar la mínima reactividad cruzada del
inhibidor propuesto con otras cisteína proteasas, puede utilizarse
la secuencia de localización nuclear propia de SENP1 (NSL1, PKKTQRR)
como parte del inhibidor en un diseño de caballo de Troya. Esta
secuencia heptapéptido, al ser modelada en la estructura de
SUMO-1 del complejo modelado por homología
SENP1-SUMO1, muestra únicamente un solapamiento
estérico que implica la Arg6' del inhibidor con la Lys500 de
SENP1. Sin embargo, existe suficiente espacio para que el
heptapéptido realice los ajustes conformacionales que eviten dichas
interacciones estéricas o de carga no deseadas debido a que
faltarían los primeros 92 aminoácidos de SUMO-1. Por
consiguiente, en algunos casos, un inhibidor de SENP1 comprende uno
o más de los siguientes: 1) un aldehído Gly-Gly, 2)
la secuencia Glu-Gln-Thr, o un
mimético de la misma, y/o 3) una señal de localización nuclear, tal
como PKKTQRR.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden administrarse directamente en el sujeto
mamífero antagonistas de SENP1 para el tratamiento de cánceres,
incluyendo, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer
de páncreas y cáncer de intestino delgado. La administración puede
realizarse mediante cualquiera de las vías utilizadas normalmente
para introducir un quimioterapéutico u otro fármaco anticáncer en
contacto final con el tejido que debe tratarse. Aunque puede
utilizarse más de una vía para administrar una composición
particular, una vía particular con frecuencia proporciona una
reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Los antagonistas
de SENP1 pueden administrarse en un individuo en forma de único
ingrediente activo o en combinación con agentes quimioterapéuticos
u otros agentes anticáncer.
Por lo tanto, es un objetivo de la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende un
antagonista de SENP1 y un portador farmacéuticamente aceptable. En
otra realización del a invención, se proporciona un antagonista de
SENP1 para la utilización en medicina. En otra realización de la
invención, se utiliza un antagonista de SENP1 en la preparación de
un medicamento o para la fabricación de un medicamento destinado al
tratamiento del cáncer, en particular de cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer
de páncreas, y cáncer de intestino delgado. Resulta particularmente
preferente el cáncer de vejiga.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Los
portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte a
partir de la composición particular que se administra, así como por
el método particular utilizado para administrar la composición. Por
consiguiente, existe una amplia diversidad de formulaciones
adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención
(ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición,
1985).
Los antagonistas de SENP1, solos o en
combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en
formulaciones de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para
administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol
pueden introducirse en propelentes aceptables presurizados, tales
como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similar.
Entre las formulaciones adecuadas para la
administración se incluyen soluciones acuosas y no acuosas,
soluciones isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes,
tampones, bacteriostáticos y solutos que conviertan la formulación
en isotónica, y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que
pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes
espesantes, estabilizadores y conservantes. En la práctica de la
presente invención, pueden administrarse composiciones, por
ejemplo, por vía oral, nasal, tópica, intravenosa, intraperitoneal
o intratecal. Las formulaciones de antagonistas pueden presentarse
en recipientes sellados unidosis o multidosis, tales como ampollas
y viales. Pueden prepararse soluciones y suspensiones a partir de
polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo anteriormente
indicado. Los antagonistas también pueden administrarse como parte
de un alimento preparado o fármaco.
La dosis administrada en un paciente, en el
contexto de la presente invención, debería resultar suficiente para
producir una respuesta beneficiosa en el sujeto durante un periodo
de tiempo. El nivel óptimo de dosis para cada paciente dependerá de
una diversidad de factores, incluyendo la eficacia del antagonista
específico utilizado, la edad, peso corporal, actividad física y
dieta del paciente, de una posible combinación con otros fármacos,
y de la severidad de la enfermedad particular. El tamaño del a dosis
también estará determinada por la existencia, naturaleza y grado de
los efectos
secundarios adversos que acompañan a la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular.
secundarios adversos que acompañan a la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular.
Al determinar la cantidad eficaz del antagonista
que debe administrarse, el médico puede evaluar los niveles
plasmáticos circulantes del antagonista, la toxicidad del mismo y la
producción de anticuerpos anti-antagonista. En
general, la dosis equivalente de un antagonista es de entre
aproximadamente 1 ng/kg y 10 mg/kg para un sujeto típico. La
administración puede realizarse mediante dosis únicas o
divididas.
El trabajo de los presentes inventores demuestra
la presencia de un nivel incrementado de ARNm de la proteasa
específica de sentrina/SUMO (SENP1) en el sedimento urinario de
pacientes con cáncer de vejiga, quienes presentan tumores que no
expresan niveles medibles de ARNm de telomerasa (TERT) en el
sedimento urinario. De esta manera, la medición de SENP1 puede
utilizarse para diagnosticar, realizar un seguimiento y evaluar el
pronóstico de cánceres, particularmente, aunque no necesariamente
de manera exclusiva, en casos en los que no se expresa TERT.
El trabajo actual de los presentes inventores
demuestra que un incremento de la expresión de ARNm de SENP1 se
asocia a células procedentes de tumores que no expresan niveles
detectables de ARNm de telomerasa. Al saber de los presentes
inventores, ésta es la primera demostración de que SENP1 presenta un
nivel incrementado en muestras negativas para telomerasa
procedentes de pacientes de cáncer. En el presente contexto, SENP1
proporciona un marcador útil en ensayos diagnósticos, de
seguimiento y pronósticos del cáncer. Además, debe indicarse que la
expresión de la telomerasa en tumores no excluye necesariamente la
sobreexpresión de SENP1. Por lo tanto, la sobreexpresión de SENP1
es un marcador útil para la detección de algunos tumores que son
positivos para la telomerasa.
Se obtuvo orina (100 ml) de sujetos humanos que
se encontraban sanos o se les había diagnostica cáncer de vejiga.
Se recogieron células de estas muestras mediante centrifugación a
baja velocidad (700xg durante 10 minutos) y se enjuagaron dos veces
con solución salina tamponada con fosfato. Las células se lisaron en
tampón de lisis proporcionado en el kit de ARN total Roche
HighPure. El ARN total se purificó utilizando el kit de ARN total
Roche HighPure. Las muestras se sometieron a ensayo mediante
reacción en cadena de la polimerasa-transcripción
inversa (RT-PCR) cuantitativa en tiempo real para la
expresión del gen codificante de la transcriptasa inversa de la
telomerasa (TERT), y la expresión de la proteína fosfatasa 1,
subunidad catalítica, isoforma alfa (PPP1CA), un gen utilizado para
realizar el seguimiento del rendimiento de ARN de las muestras.
Para el presente estudio, se analizaron
diecinueve muestras negativas para telomerasa procedentes de
pacientes de cáncer de vejiga y diecinueve muestras negativas para
telomerasa procedentes de sujetos sanos mediante
RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Las condiciones
experimentales en cada ensayo fueron las siguientes: reacciones de
100 \mul que contenían bicina 50 mM, pH 8,0, acetato de potasio
115 mM, glicerol al 8%, acetato de manganeso 3 mM, 200 \muM de
cada uno de desoxiadenosina trifosfatos, desoxicitidina trifosfato,
desoxiguanosina trifosfato, y 500 \muM de desoxiuridina
trifosfato, 2 unidades de
uracil-N-glucosilasa (UNG) de
Applied Biosystems, 10 unidades de ADN polimerasa rTth (forma
recombinante de la ADN polimerasa de Thermus thermophilus, de
Applied Biosystems), sonda 5' nucleasa 10 nM, 200 nM de cada
cebador, directo e inverso. Se transcribió inversamente el ARN de
SENP1, se amplificó y se detectó con una sonda marcada
fluorescentemente.
Se corrieron ensayos en el ABI Prism 7700 con
las condiciones de ciclado siguientes: una etapa inicial de
incubación a 50ºC durante 2 minutos para permitir la eliminación
mediada por UNG de cualquier contaminación cruzada de producto de
PCR, desnaturalización durante 1 minuto a 95ºC, y una etapa de
transcripción inversa de 30 minutos a 60ºC, seguido de 50 ciclos de
desnaturalización a 95ºC durante 20 segundos de
hibridación/extensión a 60ºC durante 40 segundos. Debe indicarse
que dichas condiciones fijas de ensayo son arbitrarias, y que
podrían obtenerse los mismos resultados con una diversidad de
concentraciones de tampones, sales, glicerol/DMSO, nucleótidos,
cebadores y sondas, transcriptasa inversas, enzimas ADN polimerasa,
métodos de dos enzimas/un tubo o de dos enzimas/dos tubos para
RT-PCR, con o sin UNG, utilizando magnesio o
manganeso como catión divalente, diversas concentraciones de
cebador/sonda, o secuencias y condiciones de termociclado. Las
secuencias de los cebadores y sondas fueron las siguientes: para
SENP1, CAAGAAGTGCAGCTTATAATCCAA (SEC ID nº 6, cebador "sentido"
directo) y GTCTTTCGGGTTTCGAGGTAA (SEC ID nº 7, cebador
"antisentido" inverso), CTCAGACAGTTTTCTTGGCT
CAGGCG (SEC ID nº 8, sonda); para PPP1CA, GAGCACACCAGGTGGTAGAA (SEC ID nº 9, cebador directo), GGGCTTGAGGATCTGGAAA (SEC ID nº 10, cebador inverso), GAGTTTGACAATGCTGGCGCCATGATGAGT (SEC ID nº 11, sonda).
CAGGCG (SEC ID nº 8, sonda); para PPP1CA, GAGCACACCAGGTGGTAGAA (SEC ID nº 9, cebador directo), GGGCTTGAGGATCTGGAAA (SEC ID nº 10, cebador inverso), GAGTTTGACAATGCTGGCGCCATGATGAGT (SEC ID nº 11, sonda).
Se midieron los niveles de ARNm de SENP1
mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Se
determinaron los números de copia relativos de SENP1 basándose en
los estándares de cuantificación de ARN. Estos estándares consisten
de transcritos run-off de PPP1CA de concentraciones
conocidas, que han sido transcritos inversamente y amplificados
mediante PCR bajo las mismas condiciones que las muestras
experimentales. Se calcularon los valores umbral de ciclo (C_{t})
para proporcionar una medida de la cantidad de ARNm que se
encontraba presente al inicio de la reacción de amplificación.
Debido a que las eficiencias de las reacciones de amplificación
raramente son exactamente iguales, en caso de serlo alguna vez, al
utilizar diferentes conjuntos de cebador/sonda o de estándares
frente a muestras procedentes de sujetos humanos, debido a la
posible presencia de inhibidores de la transcripción inversa que
podrían contaminar la preparación de muestras en el último caso, los
números de copia se indican como copias relativas de un transcrito
dado en una muestra y no como un número de copia absoluto.
Tal como se muestra en la Tabla 1, la mediana
del número de copias de SENP1 en sujetos sanos es 4, la mediana en
pacientes de cáncer de vejiga negativos para telomerasa es 1.899
copias. Se calcula la mediana y no la media con el fin de mitigar
el efecto de los valores extremos sobre los cálculos. La curva
característica de receptor-operador para estas
muestras (figura 1) (según determinación mediante los métodos de
Agresti A., Categorical Data Analysis, páginas 228 a 230, 2002)
muestra que los pacientes de cáncer de vejiga negativos para
telomerasa pueden distinguirse de los sujetos sanos negativos para
telomerasa basándose en SENP1. En una primera aproximación, este
subconjunto de pacientes puede distinguirse entre dichos grupos con
una sensibilidad de 100% y una especificidad de 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos también pueden normalizarse al nivel
de un gen de mantenimiento presente en cada muestra. Dicha
normalización contra las variaciones del número de células en la
muestra inicial, cualquier degradación del ARN, o la presencia de
inhibidores en la muestra. En este caso, se utilizó el nivel de
PPP1CA medido previamente, bajo las mismas condiciones, para la
normalización. Los cálculos fueron los siguientes: se dividió el
número relativo de copias de ARNm de SENP1 en una muestra dada por
el número relativo de copias de ARNm de PPP1CA en la misma muestra.
Para facilitar la manipulación y el registro, este número se
multiplicó por 1x10^{5}. De esta manera, el número de copias
normalizado para el ARNm de SENP1 mostrado en la Tabla II representa
el número de copias de ARNm de SENP1 por 1x10^{5} copias de ARNm
de PPP1CA. La medida del número normalizado de copias de ARNm de
SENP1 en sujetos sanos era de 1.096 y la mediana en pacientes de
cáncer de vejiga negativos para telomerasa, de 11.994. La curva
característica de receptor-operador para estos datos
(figura 2) muestra que los pacientes de cáncer de vejiga negativos
para telomerasa pueden distinguirse de los sujetos sanos negativos
para telomerasa basándose en SENP1. En una primera aproximación,
este subconjunto de pacientes puede distinguirse entre chicos
grupos con una sensibilidad de 90% y una especificidad de 70%.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los presentes inventores
indican que SENP1 puede utilizarse como marcador para diferenciar
los pacientes de cáncer de los pacientes sanos basándose en el ARNm
encontrado en las células en muestras procedentes de los
pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se homogeneizaron 100 g de tejidos sólidos
congelados, en 7,5 ml de solución Ultraspec (Biotexc) durante 30
segundos. Se extrajo el ARN total utilizando el kit de ARN Biotecx
Ultraspec®. El ARN se purificó adicionalmente utilizando el kit
RNeasy mini de QIAGEN (para un máximo de 100 \mug de ARN total),
incluyendo un tratamiento de ADNasa de QIAGEN. Se sintetizó ADNc
utilizando 3 a 50 \mug de ARN total por reacción, basándose en el
método descrito en el kit de síntesis de ADNc de doble cadena
Superscript^{TM} de Invitrogen. Los reactivos se adquirieron de
Invitrogen, a menos que se indique lo contrario. En la reacción de
síntesis de la primera cadena, las concentraciones finales de los
reactivos fueron las siguientes: cebador polidT 5 pM (Affymetrix nº
900375), 1X tampón de primera cadena, DTT 0,01 M, 0,5 mM de cada uno
de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 400 unidades de ARNasa
H-transcriptasa inversa SuperScript^{TM} (SSRT),
volumen total de reacción: 20 \mul. Se incubó el cebador de
primera cadena (1 \mul) con ARN total (añadiendo agua libre de
ARNasa para llevar el volumen a 10 \mul) a 70ºC durante 10
minutos, seguido de la incubación sobre hielo durante 2 minutos. Se
añadió tampón de primera cadena, DTT y dNTPs, seguido de la
incubación a 42ºC durante 2 minutos. Tras la adición de SSRT II,
las muestras se incubaron durante 1 hora a 42ºC. A continuación, se
llevó a cabo la síntesis de la segunda cadena. A la reacción
completa de 20 \mul procedente de la síntesis de la primera cadena
se añadieron los reactivos siguientes a las concentraciones finales
indicadas: 1X tampón de segunda cadena, 0,2 mM de cada uno de dATP,
dCTP, dGTP y dTTP, 10 U de ADN ligasa de E. coli, 40 U de ADN
polimerasa I de E. coli, 2 U de ARNasa H, 20 U de ADN
polimerasa de T4, volumen total de reacción: 150 \mul. Todos los
reactivos excepto la ADN polimerasa de T4 se mezclaron y se
incubaron durante 2 horas a 16ºC. A continuación, se añadió la ADN
pol. de T4, seguido de una incubación a 16ºC durante 5 minutos.
Para cada muestra, se purificaron los 150 \mul
completos de ADNc de doble cadena resultante mediante la
utilización de Phase Lock gel (disponible de Brinkmann), de la
manera siguiente: se mezclaron 150 \mul de ADNc de doble cadena
con un volumen igual de
fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.
La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se precipitó el ARN
mediante métodos estándares utilizando acetato amónico y etanol,
seguido de dos lavados con etanol helado al 100%. Se secó el pellet
y se resuspendió en 2 a 10 \mul de agua desionizada libre de
ARNasa. Se cuantificó el ADNc mediante la medición de la
DO_{260}.
Se realizó una PCR cuantitativa de las muestras
bajo las condiciones siguientes: 7 ng de ADNc, 1X mezcla TaqMan®
Universal Master Mix (la solución madre adquirida disponible de
Applied Biosystems se consideró 2X), 2,4 \muM de cada cebador
GAPDH humano directo e inverso, y 0,5 \muM de sonda TaqMan GAPDH
humana, y los cebadores y sondas para un gen dado de interés se
añadieron en el mismo tubo de reacción a las concentraciones
indicadas para los cebadores y sondas GAPDH. Las secuencias de
estos cebadores y sondas fueron: para SENP1, CAAGAAGTG
CAGCTTATAATCCAA (cebador "sentido" directo) y GTCTTTCGGGTTTCGAGGTAA (cebador "antisentido" inverso), CTCAGACAGTTTTCTTGGCTCAGGCG (sonda TaqMan); para TERT, TGGGCACGTCCGCA (directo), GGCGTGGTGGCACATGAA (inverso), TCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAATGAGG (sonda TaqMan). Todos los cebadores y sondas, incluyendo aquellos de un panel de siete genes de mantenimiento (ver posteriormente) se obtuvieron de ABI. El volumen total de cada ensayo fue de 20 \mul. El ciclado se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7900 HT. Tras una incubación inicial de 2 minutos a 50ºC, se realizó una incubación de 10 minutos a 95ºC, y después 40 a 55 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
CAGCTTATAATCCAA (cebador "sentido" directo) y GTCTTTCGGGTTTCGAGGTAA (cebador "antisentido" inverso), CTCAGACAGTTTTCTTGGCTCAGGCG (sonda TaqMan); para TERT, TGGGCACGTCCGCA (directo), GGCGTGGTGGCACATGAA (inverso), TCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAATGAGG (sonda TaqMan). Todos los cebadores y sondas, incluyendo aquellos de un panel de siete genes de mantenimiento (ver posteriormente) se obtuvieron de ABI. El volumen total de cada ensayo fue de 20 \mul. El ciclado se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7900 HT. Tras una incubación inicial de 2 minutos a 50ºC, se realizó una incubación de 10 minutos a 95ºC, y después 40 a 55 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
Se calcularon los niveles relativos de expresión
de ARNm de SENP1 y de TERT (a los que se hace referencia como genes
de interés, o GOI), de la manera siguiente: se determinaron los
valores umbral de ciclo (C_{t}) de la RT-PCR para
SENP1, TERT, GAPDH y un panel de siete genes humanos "de
mantenimiento". Los siete genes eran: hipoxantina
fosforibosiltransferasa, \beta-glucuronidasa,
\beta2-microglobulina, fosfogliceratoquinasa,
ciclofilina, \beta-actina y la proteína ribosómica
de gran tamaño PO. Basándose en los C_{t}s del panel de genes de
mantenimiento, se ajustó el C_{t} de GAPDH para proporcionar el
valor esperado. Este ajuste compensa cualquier pequeña diferencia
inesperada en el C_{t} de GAPDH que pudiese explicarse porque
GAPDH no se comporta como un gen de mantenimiento "medio" en
una muestra particular. A continuación, se calculó el nivel de
expresión relativo del GOI:
Tal como se muestra en las figuras 3 a 11 y en
la Tabla II, los datos actuales de los presentes inventores
muestran que, en una diversidad de cánceres, algunos, aunque no
todos, los tumores muestran un nivel de expresión de telomerasa
(TERT) incrementado respecto al de las células normales. De manera
similar, algunos tumores, aunque no todos, muestran un incremento
de la expresión de SENP1. La utilización de tanto SENP1 como TERT
en combinación como marcadores moleculares de cáncer permite
identificar un número de muestras de tejido tumoral como positivas
para cáncer que es mayor que el obtenido mediante la utilización de
cualquiera de los dos marcadores de manera individual. De esta
manera, un ensayo molecular en el que la regulación positiva de
cualquiera de los marcadores se puntuase como positiva para cáncer
mostraría una sensibilidad incrementada para la detección de
cáncer. Esta sensibilidad incrementada supondría, no
inesperadamente, un coste de una especificidad en cierta medida
menor (es decir, se identificarían como presentando cáncer un número
incrementado de sujetos que realmente no presentan cáncer). Para la
utilización de un ensayo en un contexto diagnóstico dado, se
utilizarían valores estandarizados para los resultados positivos y
negativos que maximizarían los resultados correctos, maximizando de
esta manera la sensibilidad y la especificidad. En los ejemplos
mostrados, se seleccionaron los valores umbral que, para cada
marcador individual, proporcionasen una especificad de
aproximadamente 80%. A menos que se muestre lo contrario, el umbral
de detección de TERT es cero.
La Tabla III proporciona un resumen del
comportamiento de la telomerasa y SENP1 como marcadores individuales
o como marcadores en combinación. La sensibilidad es el número de
muestras positivas para cáncer de un tipo de tejido dado que se
denominan positivas para cáncer, dividido por el número total de
muestras positivas para cáncer de ese tipo de tejido. La
especificidad es el número de muestras negativas para cáncer (o
normales) de un tipo de tejido dado que se denominan negativas para
cáncer, dividido por el número total de muestras negativas para
cáncer de ese tipo de tejido. La "exactitud" de un ensayo dado
se define como la suma de su sensibilidad y especificidad.
\global\parskip1.000000\baselineskip
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US 5.549.974
US 5.556.959
US 5.569.588
US 5.571.673
US 5.593.853
US 5.595.890
US 5.597.696
US 5.618.711
US 5.641.633
US 5.648.245
US 5.674.738
US 5.679.510
US 5.679.785
US 5.683.872
US 5.683.875
US 5.707.813
US 5.710.028
US 5.714.320
US 5.728.525
US 5.750.343
US 5.789.562
US 5.792.614
US 5.795.718
US 5.795.762
US 5.800.989
US 5.804.375
US 5.808.036
US 5.808.044
US 5.814.447
US 5.837.453
US 5.844.106
US 5.846.723
US 5.846.726
US 5.853.990
US 5.856.092
US 5.866.336
US 5.876.924
US 5.880.287
US 5.882.867
US 5.888.723
US 5.888.739
US 5.919.630
US 5.935.791
US 5.945.283
US 5.955.589
US 5.958.700
US 5.972.602
US 5.981.176
US 5.990.303
US 5.994.063
US 6.001.611
US 6.022.686
US 6.033.854
US 6.054.279
US 6.080.068
US 6.110.677
US 6.121.001
US 6.124.090
US 6.130.047
US 6.140.055
US 6.174.998
US 6.177.249
US 6.180.349
US 6.210.884
US 6.214.979
US 6.221.603
US 6.221.604
US 6.245.514
US 6.261.779
US 6.261.784
US 6.268.128
US 6.294.338
US 6.312.906
US 6.320.005
US 6.326.145
US 6.335.166
US 6.344.329
US 6.348.596
US 6.350.580
US 6.352.827
US 6.361.944
US 6.365.724
US 6.368.803
US 6.379.888
US 6.383.393
US 6.383.756
US 6.391.554
US 6.399.303
US 6.399.392
US 6.406.297
US 6.417.340
US 6.440.707
US 6.495.324
US 6.506.564
US 6.528.254
US 6.528.632
US 6.551.774
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<110> Roche Diagnostics GmbH F.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> SENP1 como marcador de cáncer
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22347WO
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/569,220
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-05-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/599,318
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-08-05
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1932
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteasa 1 específica de
sentrina/SUMO (SENP1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteasa 1 específica de
sentrina/SUMO (SENP1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> transcriptasa inversa de la
telomerasa humana (TERT)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4015
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> transcriptasa inversa de la
telomerasa humana (TERT)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> componente ARN de la telomerasa
humana (TERC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador "sentido" directo de SENP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagaagtgc agcttataat ccaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador "antisentido" inverso de SENP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctttcggg tttcgaggta a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sonda TaqMan de SENP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagacagt tttcttggct caggcg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo PP1CA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcacacca ggtggtagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador inverso PPP1CA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcttgagg atctggaaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sonda PPP1CA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtttgaca atgctggcgc catgatgagt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sustrato/inhibidor específico de proteasa de SENP1, antagonista de
SENP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia de señal de localización nuclear (NLS1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia C-terminal Sm31 de la proteína
modificadora de pequeño tamaño de tipo ubiquitina (SUMO)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia C-terminal Sm32 de proteína modificadora
de pequeño tamaño (SUMO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia C-terminal Sm33 de proteína modificadora
de pequeño tamaño (SUMO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia C-terminal Smt3 de proteína modificador de
pequeño tamaño (SUMO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo de TERT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcacgtc cgca
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador inverso de TERT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtggtgg cacatgaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sonda TaqMan de TERT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcgagca gagctcctcc ctgaatgagg
\hfill30
Claims (12)
1. Método para detectar la expresión de SENP1 en
una muestra biológica, comprendiendo el método:
determinar la cantidad de SENP1 y de TERT o TERC
en una muestra biológica procedente de un individuo que presenta, o
que se sospecha que presenta, cáncer de vejiga.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el método comprende además registrar un diagnóstico de cáncer de
vejiga.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que la cantidad de SENP1 se determina
mediante la detección de un polinucleótido codificante de SENP1 en
la muestra.
4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en
el que la etapa de detección comprende amplificar el polinucleótido
en una reacción de amplificación.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la reacción de amplificación comprende por lo menos dos
oligonucleótidos diferentes que comprenden una secuencia por lo
menos 90% idéntica a por lo menos 10 nucleótidos contiguos de
secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de la misma, de manera que,
durante la reacción de amplificación, los oligonucleótidos ceban la
amplificación de por lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº
1.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 y/o 5, en el que el producto de amplificación de
la reacción de amplificación se detecta en una etapa que comprende
hibridar un oligonucleótido detectablemente marcado con el
producto.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la reacción de amplificación
comprende una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que
presenta actividad 5' a 3' exonucleasa bajo condiciones que
permiten que la polimerasa fragmente el oligonucleótido
detectablemente marcado.
8. Método según las reivindicaciones 1 a 7, en
el que la cantidad de SENP1 se estima mediante la detección de un
ARN codificante de SENP1 en la muestra.
9. Método según las reivindicaciones 1 a 8, en
el que el método comprende además comparar la cantidad de SENP1 y
TERT o TERC en la muestra con un estándar de SENP1 y un estándar de
TERT o TERC, respectivamente, en el que el estándar de SENP1
representa las cantidades de SENP1 en células normales y TERT o TERC
representa las cantidades de TERT o TERC en células normales.
10. Método según las reivindicaciones 1 a 9, en
el que la muestra biológica es orina.
11. Kit para detectar una célula de cáncer de
vejiga en una muestra biológica procedente de un individuo,
comprendiendo el kit:
a) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de
la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un
polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción
de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1,
b) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma,
c) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT,
de manera que, al someter el oligonucleótido y
el ARNm de TERC o de TERT a una reacción de amplificación, el
oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento
de ARNm de TERC o TERT, y
d) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Mezcla de reacción que comprende:
a) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un complemento de
la misma, de manera que, al someter el oligonucleótido y un
polinucleótido que comprende la secuencia SEC ID nº 1 a una reacción
de amplificación, el oligonucleótido ceba la amplificación de por
lo menos un fragmento de secuencia SEC ID nº 1,
b) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia SEC ID nº 1, o un
complemento de la misma,
c) por lo menos un oligonucleótido que comprende
una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo menos 10
nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT,
de manera que, al someter el oligonucleótido y
ARNm de TERC o de TERT a una reacción de amplificación, el
oligonucleótido ceba la amplificación de por lo menos un fragmento
de ARNm de TERC o de TERT, y
d) un oligonucleótido detectablemente marcado
que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a por lo
menos 10 nucleótidos contiguos de:
- i)
- ARN de telomerasa humana (TERC),
- ii)
- ARNm de proteína transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT),
- iii)
- un complemento de TERC, o
- iv)
- un complemento de TERT.
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